Pre-klinisch model van cardiale donatie na circulatie dood

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol toont een eenvoudige en flexibele aanpak voor de evaluatie van nieuwe conditionerings agenten of-strategieën om de haalbaarheid van cardiale donatie na het overlijden van de bloedsomloop te verhogen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Aceros, H., Joulali, L., Borie, M., Ribeiro, R. V., Badiwala, M. V., Der Sarkissian, S., Noiseux, N. Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death. J. Vis. Exp. (150), e59789, doi:10.3791/59789 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De vraag naar harttransplantatie stijgt; de beschikbaarheid van organen is echter beperkt vanwege een gebrek aan geschikte donoren. Orgaandonatie na bloedsomloop dood (DCD) is een oplossing om deze beperkte beschikbaarheid aan te pakken, maar als gevolg van een periode van langdurige warme ischemie en het risico op weefsel letsel, wordt het routine gebruik bij harttransplantatie zelden gezien. In dit manuscript geven we een gedetailleerd protocol dat de huidige klinische praktijken nauwgezet nabootsen in de context van DCD met continue monitoring van de hartfunctie, waardoor de evaluatie van nieuwe cardioprotective strategieën en interventies te verminderen ischemie-reperfusie letsel.

In dit model, de DCD protocol wordt geïnitieerd in verdoofd Lewis ratten door het stoppen van de ventilatie te induceren bloedsomloop dood. Wanneer de systolische bloeddruk daalt onder 30 mmHg, de warme ischemische tijd wordt geïnitieerd. Na een vooraf ingestelde warme ischemische periode, harten worden gespoeld met een normothermic cardioplegic oplossing, aangekocht, en gemonteerd op een Langendorff ex vivo hart perfusie systeem. Na 10 minuten initiële reperfusie en stabilisatie wordt cardiale reconditionering voortdurend geëvalueerd voor 60 min met behulp van intraveneuze triculaire Drukbewaking. Een hart letsel wordt beoordeeld door het meten van cardiale troponine T en de infarct grootte wordt gekwantificeerd door histologische kleuring. De warme ischemische tijd kan worden gemoduleerd en op maat gemaakt om de gewenste hoeveelheid structurele en functionele schade te ontwikkelen. Dit eenvoudige protocol voorziet in de evaluatie van verschillende cardioprotective conditionerings strategieën geïntroduceerd op het moment van cardioplegia, initiële reperfusie en/of tijdens ex vivo perfusie. De bevindingen van dit protocol kunnen in grote modellen worden gereproduceerd, wat de klinische vertaling vergemakkelijkt.

Introduction

Vaste orgaantransplantatie in het algemeen en harttransplantatie, in het bijzonder, zijn in de stijging van de wereldwijde1,2. De standaardmethode voor orgel aankopen is donatie na hersendood (DBD). Gezien de strikte Inclusiecriteria van DBD, wordt minder dan 40% van de aangeboden harten3geaccepteerd, waardoor het aanbod wordt beperkt in het voordeel van toenemende vraag en verlenging van de wachtlijst voor orgel. Om dit probleem aan te pakken, het gebruik van organen geschonken na de bloedsomloop dood (DCD) wordt beschouwd als een potentiële oplossing4.

In DCD donoren, echter, een agonale fase na terugtrekking van de zorg en een periode van onbeschermde warme ischemie voor reanimatie zijn onvermijdelijk5. De potentiële orgaan blessure na de dood van de bloedsomloop kan leiden tot orgaandisfunctie, waarin de terughoudendheid wordt uitgelegd om routinematig DCD-harttransplantaties aan te nemen. Er wordt gerapporteerd dat slechts 4 centra gebruik DCD harten klinisch, met strenge criteria die zeer korte warme ischemie tijden en jonge donoren zonder chronische pathologieën6,7omvat. Om ethische en juridische redenen kunnen er beperkte of geen cardioprotective interventies worden toegepast bij donoren voorafgaand aan de bloedsomloop dood5,8,9. Dus, elke beperking ter verlichting van de ischemie-reperfusie (IR) letsel is beperkt tot cardioprotective therapieën geïnitieerd tijdens vroege reperfusie met cardioplegic oplossingen, en niet toestaan voor de juiste functionele beoordeling. Ex vivo hart perfusie (evhp) en reconditionering van het DCD hart met behulp van dedicated platforms is voorgesteld als een alternatieve oplossing en bestudeerd door verschillende wetenschappers10,11,12,13 . EVHP biedt een unieke kans om post-conditioning agenten te leveren aan DCD Hearts om functioneel herstel te verbeteren. Voor een efficiënte klinische vertaling moeten echter nog veel technische en praktische kwesties worden aangepakt, en dit wordt nog verergerd door een gebrek aan consensus over een reeks van perfusie-en functionele criteria om de transplanteer baarheid te bepalen6, 8.

Hierin rapporteren we de ontwikkeling van een reproduceerbaar preklinisch klein dier DCD-protocol in combinatie met een ex vivo hart perfusie systeem dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van orgaan post-conditionering geïnitieerd op het moment van aankoop, tijdens de initiële reperfusie, en /of in EVHP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierenverzorging en experimentele protocollen die zijn geconformeerd aan de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door het institutionele Dierenzorg-en gebruiks Comité van het Centre Hospitalier de l'Université de Montréal Research Center.

1. voorbereidende preparaten

  1. Zet het waterbad aan om het cardioplegia toedieningssysteem (Figuur 1a) en het Langendorff ex vivo perfusie systeem (Figuur 1b) te verwarmen. Stel de watertemperatuur in op 38,5 °C voor een oplossings temperatuur van 37 °C. Installatie Foto's zijn te zien in aanvullende figuur 1a, B.
  2. Bereid 1 L van de cardioplegische oplossing. Voeg 1 mL van 2% lidocaïne hydrochloride en 10 mL van 2 mM KCl (eindconcentratie 20 mM) toe aan 1 L plasma-Lyte A (140 mM na, 5 mM K, 1,5 mM mg, 98 mM cl, 27 mM acetaat, 23 mM gluconaat). Corrigeer de pH naar 7,4 met 6 N HCl.
    Let op: Dit model is zeer gevoelig voor pH. Een verkeerde pH-correctie (buiten het fysiologische bereik van 7,3-7,4) of pH-instabiele oplossingen kan het experiment in gevaar brengen of onbetrouwbare gegevens leveren.
  3. Bereid 4 liter Krebs-oplossing (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH2po4, 1,25 mm CACL2, 1 mm MgCl2∙ 6H2O, 5,5 mm D-glucose, 25 mm NaHCO3). Substraat massa's per 1 L oplossing moeten als volgt zijn: 6,1 g NaCl, 0,3355 g KCl, 0,2035 g van MgCl2∙ 6h2O, 0,192 g van Nah2po4, 0,1387 g van CACL2, 0,99 g D-glucose, 2,1 g van NaHCO3 , eindvolume van 1 L in ultrapuur gedeïoniseerd water. Voeg de NaHCO toe 3 laatste om neerslag te voorkomen. Filter de oplossing met behulp van een 0,22 μm filter en bewaar 's nachts. Corrigeer de pH tot 7,4 wanneer de oplossing 37 °C is en bel met 5% CO2/95% O2.
  4. Vul het Langendorff-circuit met Krebs-oplossing en start de systeem pomp. Zorg ervoor dat er geen bellen in de slang achterblijven. Stel de peristaltische pompsnelheid in op 80 RPM (equivalent aan 1 L/min). Gebruik de twee richtings stopkraan om de stroom aan te passen om een langzame druppel door de aorta canule te handhaven totdat het hart is bevestigd (Figuur 1b). Houd een monster van Krebs-oplossing (15 ml) in een Kegelsnede-buis van 50 ml op ijs voor hart transport.
  5. Vul het cardioplegia toedieningssysteem met de cardioplegic oplossing. Zodra de bellen zijn verwijderd, zet u het circuit op een zoutoplossing met een 3-weg stop Haan (Figuur 1a). Stel de druppel snelheid in. Zoutoplossing moet langzaam worden druppelt van de punt van de katheter om ervoor te zorgen dat er geen cardioplegic wordt geïnjecteerd vóór de dood van het dier.

2. voorbereiding van dieren

  1. Met behulp van een inhalatie kamer, induceren van anesthesie met 3% isoflurane. Zodra het dier niet reageert, voert u een intraperitoneale injectie van ketamine (75 mg/kg) en xylazine (5 mg/kg) of op vergelijkbare wijze verdoving, volgens lokale voorschriften, om anesthesie te handhaven voor de rest van de procedure. Zorg voor de diepte van de anesthesie door geen reactie op Teen knijpen en palpebrale reflex.
  2. Intuberen het dier met behulp van een 14 G, 2-inch I.V. katheter. Start de ventilatie op 50 ademingen per min, met luchtweg druk beperkt tot 20 cmH2O.
  3. Plaats het dier op een verwarmingskussen ingesteld op "medium" en dek af met een absorberend kussentje om de lichaamstemperatuur te behouden. Plaats een rectale temperatuursonde en bevestig een transdermale Pulse Oximeter sensor aan een van de voeten. Behoud de rectale temperatuur bij 37 °C gedurende de gehele procedure.
  4. Vasculaire toegang
    1. Maak een 3 tot 4 cm middellijn huid incisie in de nek met behulp van een schaar. Met behulp van bot Tip gebogen schaar, stomp ontleden het subcutane weefsel en bloot de juiste sternohyoid spier. Met behulp van niet-traumatische Tang, verplaats de spier lateraal totdat de juiste halsslagader (pulserend), halsader ader (niet-pulserende) en de nervus nervus vagus (wit) visueel worden geïdentificeerd (aanvullende Figuur 2a). Scheid voorzichtig de nervus nervus vagus van de halsslagader met behulp van een Blunt Tip gebogen schaar.
    2. Injecteer heparine (2.000 IE/kg) via de rechter halsader ader. Pas de druk op de injectieplaats toe na het terugtrekken van de naald om bloed lekkage te voorkomen.
    3. Met behulp van gebogen Tang, passeren twee 5-0 zijde hechtingen rond de halsslagader. Bevestig een distale hechting om de halsslagader te occlueren bij het superieure aspect van de blootgestelde slagader. Houd de proximale hechting ongebonden. Het trekken van de proximale hechting zal worden gebruikt voor het bloeden controle in de volgende stap (aanvullende figuur 2b). De afstand tussen hechtingen moet ongeveer 2 cm zijn.
    4. Met behulp van een stereomicroscoop voor betere visualisatie, zorgvuldig maken een 1 mm incisie met microchirurgie schaar over de voorste wand van de halsslagader. Plaats een 22 G, 1-inch gesloten I.V. katheter naar de aortaboog. De katheter is aangesloten op een 2-weg stop haan, waardoor verbinding met een druk transducer voor constante controle, met de mogelijkheid van het injecteren van zoutoplossing of cardioplegia via de cardioplegia levering systeem (Figuur 1a).

3. initiatie van cardiale donatie na circulatoire Death (DCD) protocol

Opmerking: Een volledige protocol tijdlijn is te zien in afbeelding 2.

  1. Re-Asses de verdoving diepte door het uitvoeren van een teen knijpen en evalueren palpebrale reflex. Als er een reactie wordt waargenomen, voert u een intraperitoneale injectie met ketamine (37,5 mg/kg) en xylazine (2,5 mg/kg) uit. Na 5 minuten opnieuw evalueren. Als er geen reactie wordt waargenomen, gaat u verder met de procedure. Tracheale klem mag alleen worden uitgevoerd bij voldoende verdoende dieren.
  2. Schakel de ventilator uit en extubate van het dier. Met behulp van muggen Tang, klem de luchtpijp. Dit moment wordt beschouwd als het begin van de agonale fase. Begin met het tellen van de functionele warme ischemische tijd (WIT) wanneer de piek systolische bloeddruk daalt onder 30 mmHg, of als Asystolie of ventrikelfibrillatie verschijnt, wat eerst komt (Figuur 3).
    Opmerking: Schade omvang moet in verhouding staan tot WIT. Experimenten zijn nodig om de tijd te optimaliseren volgens verdoving gebruikt, dier stam, geslacht en gewicht gekozen. In de controledieren, onmiddellijk na halsslagader vasculaire toegang is beveiligd, cardioplegia wordt geïnjecteerd en het hart wordt verkregen zoals beschreven in de volgende stap (Figuur 2). De start van perfusie met cardioplegia wordt beschouwd als het einde van WIT.
  3. Aan het einde van WIT, voeren een mediale sternotomie. Houd de thorax open met een ALM-oprolmechanisme. Open met een schaar de inferieure Vena Cava en beide atria om myocardiale distensie of cardioplegia recirculatie te voorkomen (aanvullend figuur 3). Klem de aorta boven het diafragma. Via de eerder gecatheteriseerd halsslagader, bezielen de cardioplegic oplossing bij een constante druk van 60 mmHg voor 5 min met behulp van de cardioplegia levering systeem. De infusie druk kan worden gewijzigd door de hoogte van de waterkolom te wijzigen.
  4. Aan het einde van de cardioplegische infusie, ontleden de stijgende proximale aorta uit de longslagader met behulp van gebogen Tang (aanvullende figuur 4a). Snijd de aorta distale naar de linker subclavia slagader. Zorg voor een aorta lengte van ten minste 0,5 cm voor de cannulatie voor het Langendorff-apparaat.
  5. Houd het hart van de aorta, voltooi de cardiectomie door het hart van de pulmonale aderen en andere thoracale structuren te scheiden (aanvullende figuur 4b). Snel het hart onderdompelen in ijskoude Krebs-oplossing voor snel transport naar het ex vivo-systeem. Houd de dissectie en transporttijden zo kort mogelijk (5 min).

4. ex vivo hart perfusie systeem (EVHP) en cardiale functionele beoordeling

  1. Open het aorta lumen met behulp van een tang. DeAIR de aorta door het vullen van het lumen met de druipend Krebs oplossing om te voorkomen dat bellen in de coronaire vaten. Verlaag de canule in de aorta, Zorg er niet voor dat u de aortawortel passeert of de aortaklep folders beschadigt. Bevestig de installatie met een kleine klem.
  2. Met behulp van de 2-weg stopcock, Verhoog de stroom om te zoeken naar mogelijke lekken in de aorta. Als er geen worden gedetecteerd, bevestig de aorta stevig aan de canule met behulp van een 2-0 zijde hechtmiddel. Open de toevoer naar de canule volledig. Houd de aorta druk bij een fysiologische druk van 60-70 mmHg (aangepast door de hoogte van het systeem te wijzigen). Op dit moment wordt de initiële reperfusie en stabilisatietijd gestart. Aorta druk kan worden aangepast volgens het experimentele plan van de onderzoeker.
  3. Draai het hart zodat de basis van het hart (atria) wordt geconfronteerd met de druksensor. Verbreding van de linker ventriculaire atriale opening door het ontleden van de pulmonale aderen. Plaats de latex ballon die is aangesloten op een druksensor. Zorg ervoor dat de ballon door visuele inspectie volledig in de ventrikel is geplaatst. Vul de ballon langzaam met zoutoplossing tot de eind diastolische druk (EDP) is ingesteld op 15 mmHg. Pas zo nodig aan om EDP constant te houden (vooraf bepaalde fysiologische EDP). De EDP kan worden aangepast op basis van de experimentele doelstellingen van elke onderzoeker.
  4. Steek de pacing elektrode in het voorste gezicht van het hart (rechter ventriculaire uitstroomkanaal). Vermijd het prikken van de coronaire vaten. Zodra spontaan kloppen wordt waargenomen, start je pacing op 300 beats per min. vereiste spanning kan variëren tussen experimenten en rat stammen.
  5. Na 10 min van stabilisatie, initiëren van continue intraveneuze triculaire drukmeting opname. Dit moment wordt beschouwd als het begin van de reconditionerings-en beoordelingsfase (tijd 0) die zal duren voor 1 h (Figuur 2). Reconditionering kan worden verlengd, maar een tijdafhankelijke afname van de contractiliteit wordt verwacht in alle harten.
  6. Bij het begin van reconditionering, verzamelen cardiale effluent uit de hart aderen voor 5 min voor Baseline coronaire stroom beoordeling en biochemische analyses. Voor troponine T Herhaal elke 15 min (tijden 0, 15, 30, 45 en 60 min). Voor andere analyses is individualisering van afhaaltijden nodig (Figuur 2).

5. einde van de ervaring

  1. Haal het hart uit het Langendorff-apparaat.
  2. Met behulp van een recht hoog koolstofstaal Blade (microtome Blade of vergelijkbaar), verwijder de basis van het hart (met inbegrip van aorta en pulmonale slagader).
  3. Met de rechter ventrikel naar beneden, gesneden dwarse ventriculaire dia's van 1-2 mm dikte. In een representatieve sectie (normaalgesproken de derde) accijnzen de rechter ventrikel en snap bevriezen de linker ventrikel. Dit monster kan worden gebruikt voor biochemische analyses.
  4. Dompel de overgebleven secties onder in vers bereide 5% 2, 3, 5-trifenyl-tetrazoliumchloride in commerciële fosfaatbuffer Saline pH 7,4 gedurende 10 min bij 37 °C. Levensvatbare weefsels zijn gekleurd rode baksteen.
  5. Was tweemaal met fosfaatbuffer Saline pH 7,4 en fixeer met 10% formaline bij 4 °C 's nachts. Was tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing pH 7,4 en houd elk segment ondergedompeld.
  6. Zuig overtollige vloeistof en gewicht elke dia. Neem digitale kleuren afbeeldingen van beide kanten. Gebruik planimetrische analyses om percentage infarct grootte te berekenen en correct voor segment en totale ventriculaire gewicht. Kleur vervaagt met de tijd. Foto's moeten zo snel mogelijk worden genomen.

6. gegevensanalyses

  1. Bewaar alle drukgegevens in een nieuw bestand per dier.
  2. Voor druk analyses selecteert u ten minste 200 drukcycli per tijdspunt. Analyses kunnen off-line worden uitgevoerd (na voltooiing van het experiment) met behulp van speciale software (d.w.z. LabChart). Gemeenschappelijke cardiovasculaire parameters beschikbaar zijn: maximale gegenereerde druk, eind diastolische druk, + dP/DT (steilste helling tijdens de opwaartse slag van de druk curve, een indicator van ventriculaire contractiele vermogen),-dP/DT (steilste helling tijdens de neerwaartse slag van de druk curve, een indicator van de ventriculaire ontspannings capaciteit) onder andere.
    Opmerking: voor troponine-analyses wordt een toename van de troponine-release bij reperfusie verwacht. Na 1 uur reperfusie in het EVHP-systeem kunnen troponine-niveaus afnemen tot baseline, waarbij de nadruk wordt gelegd op de noodzaak van zorgvuldige timing bij het verzamelen en hanteren van deze monsters.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Na extubatie daalt de bloeddruk snel in een voorspelbaar patroon (Figuur 3). De verwachte tijd tot de dood is minder dan 5 min.

Figuur 4 toont een gemiddelde druk/tijd curve aan het begin van de reconditionering na 0, 10 en 15 min wit. Contractile-functie zal in de loop van de tijd verbeteren. Het gebruik van korte periodes van WIT zal contractiliteit mogelijk maken om terug te keren naar normaal, en morfologische schade zal niet detecteerbaar zijn (Figuur 5 en Figuur 6).

Proof-of-concept gebruik van een conditionerings middel toegevoegd met de cardioplegia en in de stabilisatiefase tonen aan dat de schade gegenereerd door 15 min van WIT in dit model zijn vatbaar voor modulatie door cardioprotective agenten (Figuur 4, Figuur 5 en Figuur 6).

Figure 1
Figuur 1: vereiste uitrustings schema's. Minimale vereisten voor een (a) cardioplegia toedieningssysteem en een (B) Langendorff ex vivo hart perfusie systeem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: protocol tijdlijn. Tijdlijn vanaf het moment van extubatie tot het einde van het protocol. Bij controledieren wordt cardioplegia gestart zonder DCD of warme ischemische tijd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Intracarotid bloeddruk/tijd plot. Typische evolutie van de intracarotid bloeddruk na extubatie. Warme ischemie tijd sterren wanneer de piek systolische bloeddruk daalt onder 30 mmHg, of als Asystolie of ventrikelfibrillatie verschijnt, wat eerst komt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: ex vivo gemiddelde Beat-to-beat ventriculaire druk tijd curve. Afbeelding afgeleid van analyses van gegevens na 10 min stabilisatie en perfusie (tijd 0 in figuur 2) met of zonder het gebruik van een experimentele farmacologische cardioprotective conditioning agent. Ischemische tijd verwijst naar warme ischemische tijden (WIT). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: ex vivo terugwinning en functionele analyses. A) continue ventriculaire druk tijd curve na 10 min stabilisatie en perfusie met of zonder het gebruik van een experimentele farmacologische cardioprotective conditionerings middel. Pijlen tonen artefacten als gevolg van handmatige modificatie van EDP. (B) maximum (+ DP/DT) en minimum (-DP/DT) drukverandering in de LV versus tijd plot afgeleid van (A) het tonen van een tijdafhankelijke verbetering van de contractiliteit zonder behandeling (groene lijn). Korte WIT (rode lijn) of behandelde (gele) harten tonen een patroon vergelijkbaar met de controlegroep (blauwe lijn). Gegevenspunten zijn het gemiddelde van ten minste 200 individuele beats. Staven tonen de standaardfout van het gemiddelde van elk gegevenspunt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6:2, 3, 5-Trifenyl-tetrazoliumchloride kleuring aan het einde van de experimenten. Infarct gebied waargenomen na diverse warme ischemische tijden (WIT) en het gebruik van een farmacologische cardioprotective conditioning agent. Baksteen rood: levensvatbaar weefsel. Licht geel: niet-levensvatbaar weefsel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend figuur 1: installatie foto. (A) foto die de opstelling van het cardioplegia toedieningssysteem weergeeft. Genummerde apparatuur komt overeen met: cardioplegia container (1), Bubble Trap (2), druksensor en katheter (3), peristaltische pomp (4), polygraaf aangesloten op de druksensor (5) en kleine dierlijke ventilator (6). B) foto die de opstelling van het Langendorff ex vivo hart perfusie systeem weergeeft. Genummerde apparatuur komt overeen met: Perfusate container (1), conditioning agent container (2) en hartkamer (3). Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend figuur 2: nekdissectie. A) fotografie met de blootgestelde jugulaire ader (Arrow) voorafgaand aan de injectie met heparine. (B) toont de ontleed halsslagader (pijl) met de hechtingen die zijn geplaatst voor bloedings controle. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend figuur 3: opening van de atria om recirculatie te voorkomen. A) fotografie die de opening van het linker atriale aanhangsel toont (1). Op de achtergrond wordt de aorta (2) boven het diafragma geklemd (3). B) toont de opening van het rechter atriale aanhangsel (1). Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend figuur 4: hart aankoop. A) fotografie toont het gebruik van gebogen tang om de aorta (pijl) en de longslagader te scheiden. B) fotografie met cardiale dissectie en aanbesteding. Het hart is vasthouden door de aorta met behulp van de Tang. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol hier gepresenteerd introduceert een eenvoudig, handig en veelzijdig model van cardiale DCD, biedt de mogelijkheid om te beoordelen van cardiale functionele herstel, weefselschade en het gebruik van post-conditioning cardioprotective agenten ter verbetering van de terugwinning van donor harten anders weggegooid voor transplantatie. Ex vivo Heart perfusie Systems (evhp) systemen zijn geoptimaliseerd om een platform te bieden voor de evaluatie van de hartfunctie en bieden een unieke kans om gemodificeerde oplossingen te leveren en te testen, aangevuld met farmacologische middelen na de conditionering om bewaren en repareren van DCD harten in kleine15 en grote dieren16,17 modellen van cardiale DCD. Niettemin zijn de protocollen vaak onvoldoende gedetailleerd en niet altijd klinisch relevant, waardoor klinische vertaling moeilijk is.

Op het gebied van DCD-modellen, hebben ex vivo DCD-modellen, zoals die beschreven door Sanz18, geen agonale fase. Door het induceren van hartstilstand door het stoppen van mechanische ventilatie, het sympathische zenuwstelsel is overactiveerd, leidt tot een "Catecholamine Storm"19. Deze toename van catecholamines wijzigt de kenmerken van de donororganen en is gekoppeld aan een verminderde functionele status van experimentele DCD-organen19. Bovendien, de progressieve daling van de functie voorafgaand aan Asystolie leidt tot rechter ventriculaire distensie en daaruit voortvloeiende letsel. In ons protocol hebben we de bloedsomloop dood veroorzaakt met behulp van een klinisch relevant verstikking model, dat deze reacties handhaaft.

Twee belangrijkste in vivo cardiale DCD-modellen worden beschreven in de literatuur: open Chest15 en gesloten borst20 modellen. Cardiale fysiologie wordt veranderd door de open borst aanpak door het verminderen van de mechanische Long/hart interactie en voorladen. Bovendien, in open borst procedures, lichaam warmteverlies wordt versneld, verdere gevolgen functionele resultaten21. Daarom is het beter om een gesloten borst benadering te handhaven die warmteverlies voorkomt. Een andere verfijning is het minimaliseren van de variabiliteit van tijd tot bloedsomloop dood. Kearns et al. meldde dat de tijd tot overlijden (tijd tot niet-pulsatile of gemiddelde bloeddruk minder dan 30 mmHg) tussen 3 tot 11 minuten was. In de 10 en 20 min WIT, 40% en 60% van de harten niet herstellen functie, respectievelijk, op een ex vivo werk hart apparaat, het maken van gegevens interpretatie moeilijker15. Een alternatief voor het verminderen van de tijd tot de bloedsomloop dood is het gebruik van Paralytische agenten20; Niettemin, enig bewijs wijst naar directe cardiale effecten van Vecuronium, als gevolg van de effecten ervan op sympathische en parasympathische innervatie22. Om de reproduceerbaarheid te verhogen, hebben we gekozen voor tracheale opspanning, gecombineerd met een precieze arteriële druk monitorisatie, waardoor een meer homogene agonale tijd (< 5 min). Het is bekend dat orgaanschade begint voor het moment van de bloedsomloop dood; met sommige auteurs die overwegen een cut-off systolische bloeddruk onder 50 mmHg als het begin van functionele WIT6, uitleggen van de terughoudendheid voor transplantatie organen na een lange periode intrekken van levensondersteunende maatregelen tot reperfusie. In dit protocol, de WIT definitie gebruikt volgt de huidige experimentele standaard15, niettemin, verdere studies zijn nodig om te verduidelijken van de exacte set van hemodynamische parameters die de inductie van orgel schade markeren om te verbeteren wit berekening, waardoor betere informatie voor de klinische praktijk wordt aangeboden.

De infusie van cardioplegische oplossing bij constante fysiologische druk en temperatuur biedt een unieke kans om hart conditionering en weefsel bescherming te initiëren met een farmacologisch agens of met andere middelen. Technische verfijningen omvatten het klemmen van de thoracale aorta, het beperken van perfusie tot het hart en daardoor het verminderen van de hoeveelheid oplossing die nodig is voor elk essay. Zodra het hart op het EVHP-systeem staat, is gestandaardiseerde functionele evaluatie noodzakelijk. Het is aangetoond dat het gebruik van een evhp-systeem het potentieel heeft om de reanimatie van harten die eerder als niet transplanteerbaar waren beschouwd, te verbeteren23,24. Belangwekkend, het klinisch beschikbare evhp systeem evalueert cardiale levensvatbaarheid alleen met behulp van seriële lactaat metingen8,23. Lactaat metingen zijn niet gerelateerd aan cardiale prestaties van DCD-harten24,25, dus aanvullende metingen om de transplanteer baarheid te evalueren zijn noodzakelijk. Deze experimentele Setup zorgt voor een volledige functionele evaluatie, met inbegrip van gegenereerde druk en myocardiale contractiliteit metingen, waaronder + DP/DT en – DP/DT, waardoor een meer grondige evaluatie van de hartfunctie vóór de uiteindelijke transplantatie besluit wordt genomen. Bovendien, metingen van cardiale troponïne, een marker van myocardiale schade direct gecorreleerd aan ischemische infarct maat26, en release kinetiek zijn gerelateerd aan de omvang van cardiale ischemie in een Langendorff ischemie/reperfusie systeem. In het bijzonder, met lange ischemische tijden (60 min), troponine niveaus worden gehandhaafd na 1 h reperfusie, terwijl LDH en creatinine kinase aanzienlijk afnemen, en niet gerelateerd zijn aan de omvang van de hart schade27,28, dus het gebruik van seriële troponine-maatregelen waarborgt een volledige evaluatie van de levensvatbaarheid van de organen vóór de transplantatie. Een belangrijke verstorende variabele in cardiale functionele evaluatie is de hartslag. Spontane hartslag is omgekeerd gerelateerd aan lengte van ischemie29, en hartslag direct correleert met + dP/DT in geïsoleerde rat harten30 en in diermodellen31. Interessant, in recent gepubliceerde werk op knaagdieren modellen van DCD harten en evhp conditionering, pacing werd niet gebruikt en cardiale tarieven waren variabel en opgenomen in hun protocollen15,18,20. Om de fysiologische hartslag te behouden, werd pacing gebruikt zodra het hart de ritmische contractie had hersteld. De gekozen 300 BPM frequentie is vergelijkbaar met die van gezonde, niet-gestreste ratten32.

Beperkingen van dit protocol omvatten het gebruik van vluchtige anesthetica voor inductie. Deze agenten is aangetoond dat het verlenen van ischemische conditionering33. Niettemin, de korte tijd van inhalatie anestheticum gebruik had geen observeerbaar effect in dit protocol en progressieve myocardiale dysfunctie werd nog steeds opgemerkt met toenemende WIT. Het gebruik van normothermic cardioplegia kan ook worden gezien als een beperking. Het gebruik van normothermic cardioplegia maakt een optimale vertaling mogelijk van de in vitro-omstandigheden die worden gebruikt voor de ontwikkeling van farmacologische conditionerings middelen, omdat cellen meestal worden gehandhaafd op 37 °C. Niettemin, in deze opstelling kan cardioplegia temperatuur gemakkelijk worden gereguleerd volgens de eisen van de onderzoeker. Aan de andere kant, het gebruik van een Langendorff preparaat versus een werk hart voorbereiding voor reconditionering kan ook worden gezien als een beperking. De werk hart voorbereiding zorgt voor continue opname van een druk/volume-lus12,15, met gecontroleerde voor-en afterload, waardoor volledige functionele evaluatie mogelijk is. Het belangrijkste voordeel van een Langendorff-preparaat is dat het een constante aorta-en perfusiedruk handhaaft, vooral tijdens de eerste reperfusie, wanneer de gegenereerde druk minimaal is. Bovendien is de evaluatie-instelling eenvoudiger voor het Langendorff-hart in vergelijking met een werk hart preparaat. Niettemin, deze opstelling kan worden omgezet in een werk hart voorbereiding indien nodig. Als alternatief kan cardiale reanimatie in situ worden uitgevoerd met behulp van de regionale perfusie van normothermic, waarbij de cardiale prestaties direct worden gemeten door het gebruik van een Millar-katheter34, waardoor uitgebreide hemodynamische en myocardiale functionele beoordeling vóór orgaan aanbesteding. Bij mensen zijn zowel in situ als ex vivo reconditionerings strategieën beschreven6, dus de ontwikkeling van beide modellen maakt experimentele vergelijkingen mogelijk die kunnen vertalen naar optimalisatie van de klinische praktijk. Ten slotte kan de geringe omvang en hoge hartslag van dit diermodel worden beschouwd als een beperking als gevolg van de mogelijke technische moeilijkheden die zijn waargenomen tijdens het uitvoeren van deze experimenten, en de onvermijdelijke fysiologische verschillen tussen rat en menselijk hart. Als de EVHP evaluatie is al gestandaardiseerd, een onderzoeker kan worden vertrouwd met deze techniek door het uitvoeren van zo weinig als 3 experimenten. Aan de andere kant zorgt het gebruik van dit kleine diermodel voor een gemakkelijke screening tegen een redelijke prijs, waarbij het reserveren van grotere en duurdere diermodellen zoals het varkens model, tot therapieën met een hoog menselijk translationeel potentieel.

Kortom, het protocol dat hier wordt beschreven, houdt rekening met de beste praktijken die uit verschillende groepen afkomstig zijn die DCD-harten onderzoeken. Dit protocol geeft volledige controle over WIT, waardoor een uitgebreide structurele en functionele evaluatie van cardioprotective conditionerings behandeling strategieën bij ratten. Dit protocol kan worden opgewaardeerd en overgebracht naar grote diermodellen, waardoor onderzoeksresultaten naar de klinische realiteit kunnen worden vertaald en uiteindelijk de ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk wordt, waardoor de kwaliteit en beschikbaarheid van levensreddende organen die veel nodig zijn door Patiënten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs melden geen eigen of commerciële belangstelling voor een product dat wordt genoemd of concept dat in dit artikel wordt besproken.

Acknowledgments

Delen van dit werk werden gesteund door een genereuze bijdrage van de Fondation Marcel et Rolande Gosselin en de Fondation Mr Stefane Foumy. Nicolas Noiseux is geleerde van de FRQ-S.

De schrijvers willen Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi en Catherine Scalabrini bedanken voor hun ondersteuning bij het verzamelen van gegevens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag Baxter Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter Jelco 4098 To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Milipore-Sigma T8877 Vital coloration
22 G 1" I.V catheter BD 383532 I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr Skalar 50-3147 Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" Skalar 22-9027 Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp ADinstruments FE221 Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride Milipore-Sigma C1016 CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose Milipore-Sigma G8270 D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer ADinstruments MLAC06 Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock) ADinstruments MLT0670 Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS Gibco 14190-144 Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" Skalar 66-2740 Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10% Milipore-Sigma HT501128 Fixative solution
Heating Pad Sunbean 756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL Sandoz For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% Fisher scientific A144-500 Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine Bimeda Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart ADinstruments Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon Radnoti 170404 In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution AstraZeneca Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS ACP Chemicals M-0460 MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor Radnoti 159905 Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker Biotronik Reliaty Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter Fisher scientific AE150
Physiological monitor Kent Scientific Physiosuite For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A Baxter Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride Milipore-Sigma P4504 KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml Hospira Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph ADinstruments Electronic polygraph
Silk 2-0 Ethicon A305H Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0 Ethicon A302H Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation Hallowell EMC 000A2770 Small animal ventilator
Sodium bicarbonate Milipore-Sigma S5761 NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride Milipore-Sigma S7653 NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets ACP chemicals S3700 Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic Milipore-Sigma S0751 NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" Skalar 22-1240 Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades Thomas scientific 6727C18 Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" CardinalHealth 8881511235 For heparin injection
Veterinary General Surgery Set Skalar 98-1275 Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set Skalar 98-1311 Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system Radnoti 120101BEZ Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine Bayer Sedative. 20 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gass, A. L., et al. Cardiac Transplantation in the New Era. Cardiology in Review. 23, (4), 182-188 (2015).
  2. von Dossow, V., Costa, J., D'Ovidio, F., Marczin, N. Worldwide trends in heart and lung transplantation: Guarding the most precious gift ever. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 31, (2), 141-152 (2017).
  3. Hornby, K., Ross, H., Keshavjee, S., Rao, V., Shemie, S. D. Non-utilization of hearts and lungs after consent for donation: a Canadian multicentre study. Canadian Journal Of Anaesthesia. 53, (8), 831-837 (2006).
  4. Manyalich, M., Nelson, H., Delmonico, F. L. The need and opportunity for donation after circulatory death worldwide. Current Opinion In Organ Transplantation. 23, (1), 136-141 (2018).
  5. Shemie, S. D., et al. National recommendations for donation after cardiocirculatory death in Canada: Donation after cardiocirculatory death in Canada. CMAJ : Canadian Medical Association Journal. 175, (8), S1 (2006).
  6. Page, A., Messer, S., Large, S. R. Heart transplantation from donation after circulatory determined death. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7, (1), 75-81 (2018).
  7. Monteagudo Vela, M., Garcia Saez, D., Simon, A. R. Current approaches in retrieval and heart preservation. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7, (1), 67-74 (2018).
  8. Dhital, K. K., Chew, H. C., Macdonald, P. S. Donation after circulatory death heart transplantation. Current Opinion In Organ Transplantation. 22, (3), 189-197 (2017).
  9. McNally, S. J., Harrison, E. M., Wigmore, S. J. Ethical considerations in the application of preconditioning to solid organ transplantation. Journal of Medical Ethics. 31, (11), 631-634 (2005).
  10. Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 16, (6), 667-673 (1997).
  11. Ramzy, D., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24, (10), 1665-1672 (2005).
  12. Xin, L., et al. A New Multi-Mode Perfusion System for Ex vivo Heart Perfusion Study. Journal of Medical Systems. 42, (2), 25 (2017).
  13. Messer, S., Ardehali, A., Tsui, S. Normothermic donor heart perfusion: current clinical experience and the future. Transplant International. 28, (6), 634-642 (2015).
  14. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Academic Press. 77-108 (2016).
  15. Kearns, M. J., et al. A Rodent Model of Cardiac Donation After Circulatory Death and Novel Biomarkers of Cardiac Viability During Ex vivo Heart Perfusion. Transplantation. 101, (8), e231-e239 (2017).
  16. Sandha, J. K., et al. Steroids Limit Myocardial Edema During Ex vivo Perfusion of Hearts Donated After Circulatory Death. The Annals of Thoracic Surgery. 105, (6), 1763-1770 (2018).
  17. Iyer, A., et al. Increasing the tolerance of DCD hearts to warm ischemia by pharmacological postconditioning. American Journal of Transplantation. 14, (8), 1744-1752 (2014).
  18. Sanz, M. N., et al. Cardioprotective reperfusion strategies differentially affect mitochondria:studies in an isolated rat heart model of donation after circulatory death (DCD). American Journal of Transplantation. (2018).
  19. Van de Wauwer, C., et al. The mode of death in the non-heart-beating donor has an impact on lung graft quality. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 36, (5), 919-926 (2009).
  20. Quader, M., et al. Determination of Optimal Coronary Flow for the Preservation of "Donation after Circulatory Death" in Murine Heart Model. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs : 1992). 64, (2), 225-231 (2018).
  21. Priebe, H. J. The acute open-chest model. British Journal Of Anaesthesia. 60, (8 Suppl 1), 38-41 (1988).
  22. Narita, M., et al. Cardiac effects of vecuronium and its interaction with autonomic nervous system in isolated perfused canine hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 19, (6), 1000-1008 (1992).
  23. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet (London, England). 385, (9987), 2585-2591 (2015).
  24. Messer, S. J., et al. Functional assessment and transplantation of the donor heart after circulatory death. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35, (12), 1443-1452 (2016).
  25. White, C. W., et al. Assessment of donor heart viability during ex vivo heart perfusion. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, (10), 893-901 (2015).
  26. Mayr, A., et al. Cardiac troponin T and creatine kinase predict mid-term infarct size and left ventricular function after acute myocardial infarction: a cardiac MR study. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33, (4), 847-854 (2011).
  27. Remppis, A., et al. Intracellular compartmentation of troponin T: release kinetics after global ischemia and calcium paradox in the isolated perfused rat heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27, (2), 793-803 (1995).
  28. Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff Perfused Isolated Mouse Heart Model of Global Ischemia-Reperfusion Injury: Impact of Ischemia and Reperfusion Length on Infarct Size and LDH Release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21, (3), 286-295 (2016).
  29. Dornbierer, M., et al. Early reperfusion hemodynamics predict recovery in rat hearts: a potential approach towards evaluating cardiac grafts from non-heart-beating donors. PloS One. 7, (8), e43642 (2012).
  30. Henry, P. D. Positive staircase effect in the rat heart. The American Journal of Physiology. 228, (2), 360-364 (1975).
  31. Markert, M., et al. Evaluation of a method to correct the contractility index LVdP/dt(max) for changes in heart rate. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66, (2), 98-105 (2012).
  32. Azar, T., Sharp, J., Lawson, D. Heart rates of male and female Sprague-Dawley and spontaneously hypertensive rats housed singly or in groups. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (2), 175-184 (2011).
  33. Bonney, S., Hughes, K., Eckle, T. Anesthetic cardioprotection: the role of adenosine. Current Pharmaceutical Design. 20, (36), 5690-5695 (2014).
  34. Ali, A. A., et al. Rat model of veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation. Journal of Translational Medicine. 12, 37 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics