Характеризуй связанных с болезнями мутантов семейки RAF Kinases с помощью набора практических и осуществимых методов

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

В этой статье мы представили набор практических и осуществимых методов для характеристики связанных с болезнями мутантов семейных киназ RAF, которые включают в себя анализ in vitro киназы, анализ совместной активации RAF и дополнительный анализ сплит-люциферазы.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Быстро ускоренная фиброзаркома (RAF) семейные киназы играют центральную роль в клеточной биологии и их дисфункция приводит к раку и нарушениям развития. Характеристика связанных с болезнями мутантов RAF поможет нам выбрать соответствующие терапевтические стратегии для лечения этих заболеваний. Недавние исследования показали, что семейные киназы RAF имеют как каталитическую, так и аллостерную деятельность, которая жестко регулируется димеризацией. Здесь мы построили набор практических и осуществимых методов для определения каталитической и аллостерической деятельности и относительной сродства/стабильности киназов семейства RAF и их мутантов. Во-первых, мы внесли изменения в классический анализ in vitro kinase, снизив концентрацию моющего средства в буферах, используя нежную процедуру быстрой стирки и используя фьюжн-передатчик (GST) для предотвращения разъединения RAF димеров во время Очистки. Это позволяет адекватно измерять каталитическую активность constitutively активных мутантов RAF. Во-вторых, мы разработали новый RAF совместной активации анализ для оценки аллостерической активности киназы мертвых мутантов RAF с помощью N-терминала усеченных белков RAF, устраняя требование активного Раса в текущих протоколах и тем самым достигая более высокого Чувствительность. Наконец, мы создали уникальный дополнительный анализ разделенной люциферазы для количественного измерения относительной сродства/стабильности различных мутантов RAF, которая является более надежной и чувствительной по сравнению с традиционным анализом совместного иммунопреципиции. Таким образом, эти методы имеют следующие преимущества: (1) удобный для пользователя; (2) в состоянии эффективно осуществлять без современного оборудования; (3) рентабельно; (4) очень чувствительны и воспроизводимы.

Introduction

Семейные киназы RAF являются ключевым компонентом каскада сигнализации RAS/RAF/MEK/ERK, которые передают сигнал от РАН для активации митоген-активированного протеина киназы (MEK)1,2,3,4. Это семейство киназ играет решающую роль в росте клеток, выживании и дифференциации, и их изменения вызывают многие заболевания, в частности, рак5,6,7,8. В последнее время геномные секвенирования выявили много связанных с болезнью мутантов RAF, которые обладают различными свойствами в передаче сигнала RAS/RAF/MEK/ERK каскад9,10,11. Тщательная характеристика мутантов RAF поможет нам понять молекулярные механизмы того, как мутанты RAF изменяют сигнальный выход каскада RAS/RAF/MEK/ERK, в конечном итоге выбирая подходящие подходы для лечения различных мутантов, управляемых RAF.

Семьи киназы RAF включают в себя три члена, CRAF, BRAF, и ARAF, которые имеют аналогичные молекулярные структуры, но различные способности, чтобы активировать вниз по течению сигнализации1,2,3,4. Среди этих паралогов, BRAF имеет самую высокую активность в силу своей составно фосфорилированной NtA (N-тerminal cidic) мотив12,13 ,14, в то время как ARAF имеет самый низкий деятельность, вытекающая из его неканонического мотива APE15. Это может объяснить различные частоты мутаций паралогов RAF при заболеваниях: BRAF-gt;CRAF-gt;ARAF. Кроме того, в рамках одного и того же паралога RAF мутации на разных участках могут вызывать сигнализацию вниз по течению в различных манерах, что добавляет еще один уровень сложности к регулированию семейных киназ RAF. Недавние исследования показали, что все киназы RAF имеют как каталитическую, так и аллостерную деятельность13,14,16,17,18. В соответствии с действующими мутантами RAF включить вниз по течению сигнализацию непосредственно фосфорилирование МЭК, в то время как киназы мертвых мутантов RAF могут трансактивировать свои аналоги дикого типа через боковую-стороннюю димеризацию и активировать MEK-ERK сигнализации16 ,19,20. Димер сродство / стабильность является ключевым параметром, который не только определяет аллостерную активность киназы мертвых мутантов RAF, но и влияет на каталитическую активность constitutively активных мутантов RAF15,21, 22. Киназа-мертвые мутанты RAF с высоким dimer сродством/стабильностью могут transactivate endogenous wild-type RAFs сразу15, пока те с промежуточными dimer сродством/стабильностью требует координации активного Ras или повышенный уровень молекул RAF дикого типа для функции13,15,20,21,23. Аналогичным образом, в совокупности активных raf мутантов фосфорилат MEK в димер-зависимым образом, и те, с низким димер омрачитель близость / стабильность теряют свою каталитическую активность в пробирке на иммунопрециптом, что перерывы слабых RAF dimers15, 21,22. Димер сродство / стабильность также определяет чувствительность raf мутантов к их ингибиторы, и положительно коррелирует с сопротивлением ингибиторов RAF24. Поэтому, чтобы охарактеризовать связанные с болезнями мутанты RAF, необходимо измерить их каталитическую и аллостерную деятельность, а также димерную сродство/стабильность.

В последние годы наша лаборатория и другие разработали различные методы для характеристики семейства киназов RAF и их мутантов. Согласно нашему опыту лаборатории и другим, мы считаем, что следующие три анализа имеют преимущества в определении связанных с болезнью мутантов RAF: (1) анализ in vitro киназы, который может быть проведен с легкостью для обнаружения каталитическая активность составно активные мутанты RAF15; (2) RAF совместноактивации ассс, который является надежным и удобным методом для измерения аллостерической активности киназы мертвых мутантов RAF13,15,21,22,23, 25; (3) бесплатный анализ разделенной люциферазы, который имеет гораздо более высокую чувствительность в измерении относительной сродства димера/стабильности мутантов RAF в отличие от традиционного совместного иммунопреципции, и способен осуществлять без передового оборудования в в отличие от количественных аналитических методов, таких как SPR (Surface Plasmon Resonance) анализ15,22. Сочетая эти три анализа, мы можем легко понять, как связанные с болезнью RAF мутант изменяет вниз по течению сигнализации и тем самым использовать соответствующую терапевтическую стратегию для лечения болезни, вызванной этой мутации RAF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. In Vitro Kinase Assay для измерения каталитическая активность мутантов RAF

  1. Построить векторы, кодируя мутантов RAF(рисунок 1A) с тегом FLAG (DYKDDDDK) на C-terminus с помощью Gibson Assembly или традиционных методов молекулярного клонирования.
    1. Введите тег FLAG и мутации в последовательности кодирования RAF по ПЦП, а затем вставьте целые последовательности в вектор pCDNA3.1 () с помощью гибсонской сборки или перевязки ДНК T4 и следуя протоколам производства. Используйте следующие условия для реакций ПЦР: (1) 95 градусов по Цельсию, 2 мин; (2) 95 градусов по Цельсию, 30 с; (3) 59 градусов по Цельсию, 30 с; (4) 68 кв.к., 3 мин; (5) 20 циклов (от 2 до 4); (6) 4 градуса по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР праймеры для клонирования: 5- AAATTAATACGACTACTACTAGAGGAGACCC-3 и 5-CAGCGGGGGTTAACGGGTCTA-3.
    2. Вставьте последовательность кодирования GST вверх по течению последовательности кодирования мутантов RAF для генерации векторов, кодирующих мутации RAF, скоторыми GST, используя те же методы, что описаны в шаге 1.1.1.
    3. Проверка всех векторов по секвенированию ДНК перед трансфекцией.
  2. Плита 293T клетки в 6-колодных пластин при плотности 5 х 105 клеток / хорошо за один день до трансфекции. Когда плотность клеток достигает 80-90% слияния на второй день, трансфект с переносчиками, кодируя ФЛАГМАН-тегами RAF киназы или их мутантов от шага 1.1 в клетки, следуя протоколу производства трансфекционных реагентов (Таблица материалов).
  3. Замените культуру среды 24 ч после трансфекции.
  4. Аспирировать культуру среды 48 ч после трансфекции и добавить 400 л/ну буфера лисиса (25 мм Трис) HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ этиленденеамитететраацетической кислоты (ЭДТА), 0,25% NP-40, рН 7,2) дополнены протеазой и ингибиторами фосфатазы для лизиклетой на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация NP-40 в буфере лизиса имеет решающее значение для обнаружения каталитическая активность мутантов RAF с умеренной димерной сродством/стабильностью в пробирке. Высокая концентрация моющего средства или сильного моющего средства в буфере лизиса может сломать DIMers RAF и тем самым убить каталитической активности киназы RAF или их мутантов.
  5. Перенесите щелочи клетки в трубку 1,5 мл и снесите вниз на 12 000 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы истощить клеточный мусор.
  6. Перенесите 300 л/л на образец чистых цельных клеточных лисатов в 1,5 мл трубок, добавьте 20 л на образец бусинса сродства против FLAG и поверните в холодной комнате (4 кВ) на 1 ч. Также возьмите 40 qL на образец чистого цельного клеточного лисата в сторону для обнаружения экспрессии и активности (фосфо-ERK1/2) из raf мутантов иммуноблотов, как описано ниже.
  7. Вымойте анти-FLAG бусы один раз с буфером лисиса, затем один раз с буфером реакции киназы (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0.5 mM Na3VO4, 0.5 mM DTT, pH 7.2), и добавить 20 qL смеси реакции киназы (2 мкг MEK1 (K97A) и 100M буфер действия) на выборку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мытье бисера должно быть завершено мягко и быстро, остаточный буфер должен быть аспирирован полностью перед добавлением смеси реакции киназы, и все операции на этом этапе должны быть выполнены при 4 градусах По цельсию в холодной комнате.
  8. Инкубировать реакции киназы при комнатной температуре (25 градусов по Цельсию) в течение 10 минут, и переверните трубки, содержащие реакции киназы пальцами каждую минуту во время инкубации.
  9. Добавить 5 л 5x sDS образец буфера (375 мм Трис HCl, 9% сульфат натрия dodecyl (SDS), 50% Глицерол, 0.03% Бромофенол синий) на образец, чтобы остановить киназы реакций, а затем тепло образцов на 90 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
  10. Запустите образцы в 9-12% полиакриламида геля электрофорез (PAGE) с 0,1% SDS, передать белки мембраны нитроцеллюлозы, и обнаружить уровни фосфо-MEK и RAF мутантов в образцах иммуноблотов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фосфо-MEK также может быть количественно спомощью 32 P-ATP включения. Кратко, 10 ЗМNo 32P-ATP добавляется в буфер реакции киназы, и количество фосфорилированного MEK затем количественно после разделения PAGE с помощью стандартной ауторадиографии, фосфорографии, или жидких методов подсчета сцинтилляции как Соответствующие.

2. RAF Со-активации Асса для оценки Аллостерической деятельности Кинасе мертвых RAF мутантов

  1. Конструкция векторов кодирования приемника RAF (CRAF киназы домена с нефосфорилируемым мотивом NTA, AAFF) или киназы мертвых RAF активаторов (RAF киназы домен с фосфорилированием-мимикрированный мотив NTA, SSDD, DDEE или DGEE) (Рисунок 1A) как описано в шаге 1.1.
  2. Transfect 293T-клетки с двумя векторами, кодирующие как приемник RAF, так и активатор RAF, умерший от киназы, или единый вектор, кодируя один из белков, как описано в шагах 1.2 и 1.3.
  3. Замените среду культуры на 24 ч после трансфекции, и урожай 293T трансфектантов на 48 ч, чтобы подготовить всю клетку lysates, как описано в шагах 1.4 и 1.5.
  4. Смешайте чистый образец всей клетки с 5x SDS образец буфера быстро при комнатной температуре (25 градусов по Цельсию), а затем кипятить при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
  5. Запустите вареные образцы целую клетку лизата в 9'12% PAGE с 0,1% SDS, перенесите белки в мембрану нитроцеллюлозы, и определить уровни фосфо-ERK1/2 и контролировать белки иммуноблотами.

3. Комплиментарный Сплит Luciferase Асссая для измерения относительного Dimer Affinity / Стабильность RAF мутантов

  1. Построить векторы кодирования FLAG помечены RAF мутантов сливается с N-терминов Nluc (N-терминф из светлячок luciferase, aa2-416) или C-терминов Cluc (C-терминус светлячка luciferase, aa398-550), как описано в шаге 1.1.
  2. Transfect 293T ячейки с парой векторов кодирования различных nluc-RAF мутантов и Cluc-RAF мутантов, как описано в шаге 1.2.
  3. На 24 ч после трансфекции, replate 293T клеточных трансфектонов в Krystal черные пластины изображения при плотности клеток 2x105 в хорошо с цветом среды (т.е., DMEM без фенола красный).
  4. 24 ч спустя, добавить D-люциферин (0,2 мг/мл) до 293T клеточных трансфектонов, инкубировать в течение 30 минут, и измерить сигналы люциферазы с помощью многофункциональная система обнаружения (Таблица материалов).
  5. После измерения сигналов люциферазы, аспирировать средние и лиза 293T трансфектантов с буфером излишеств асис подготовить всю клетку lysates, как описано в шагах 1.4 и 1.5.
  6. Запустите все образцы клеточного лисата в 9-12% PAGE с 0,1% SDS и обнаружить уровни экспрессии nluc-RAF мутантов и Cluc-RAF мутантов анти-FLAG иммуноблот, как описано в шаге 2.5. Относительные уровни экспрессии как мутантов Nluc-RAF, так и мутанта Cluc-RAF в 293T трансфектонах количественно оцениваются с помощью изображения J с их иммуноблотов.
  7. Нормализация люциферазы сигналов 293T клеточных трансфектонов в соответствии с уровнем экспрессии мутантов Nluc-RAF и Cluc-RAF мутантов. Короче говоря, это достигается путем деления необработанного сигнала люциферазы на относительные уровни экспрессии мутантов Nluc-RAF и Cluc-RAF с 3,6 ступени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Семьи киназы RAF имеют как каталитические, так и аллостерные виды деятельности, которые позволяют их связанных с болезнью мутантов, чтобы включить вниз по течению сигнализации через различные механизмы13,14,16,17 ,18. В обязательном составно активных мутантов RAF непосредственно фосфорилат их субстраты, в то время как киназы мертвых мутантов RAF выполняют свою функцию путем осуществления аналогов дикого типа. Как показано на рисунке 1B, оба constitutively активных мутантов RAF (таких как регуляторный позвоночник (R-позвоночник) мутантов (BRAF (L505M), CRAF (DDEE/L397M), и ARAF (DGEE/L358M))13,23,25 , 26, BRAF (V600E), и BRAF (NVTAP)) и киназы мертвых мутантов RAF (таких, как каталитический позвоночник (C-позвоночник) сливается BRAF (NVTAP/V471F)15) активирует ERK, когда выражается в 293T клеток. Таким образом, способность мутантов RAF активировать ERK сигнализации в клетках не может служить стандартом, чтобы отличить constitutively активный мутант от киназы мертвых мутантов, хотя некоторые киназы мертвых мутантов с умеренной димер сродство / стабильность включается вниз по течению сигнализации только с сотрудничеством активных Рас. Три метода, которые мы представили здесь, могут помочь нам эффективно охарактеризовать всех связанных с болезнями мутантов RAF. Биологические свойства всех мутантов RAF показали с помощью этих анализов в наших предыдущих исследованиях были обобщены в таблице 1.

Первый метод, который мы можем использовать, чтобы отличить constitutively активных мутантов RAF от киназы мертвых мутантов RAF является анализ in vitro киназы. В этом анализе мутанты RAF были очищены иммунопрецицией, а каталитические реакции проводились в пробирке с кино-мертвым и мертвым meK1 (K97A) и АТФ в качестве субстратов. Каталитической активности мутантов RAF измерялась как AL(Activation Loop)-фосфорилирование MEK1 (K97A) в смесях реакции киназы иммуноблотом. Как показано на рисунке 1C, этот ассс может эффективно зондировать каталитическую активность R-позвоночника мутантов BRAF, CRAF и ARAF13,15,23, BRAF (V600E)9, и BRAF ( NVTAP)15, но не то, что из киназы мертвых BRAF (V471F / NVTAP)15, который имеет слитый C-позвоночник. Тем не менее, каталитическая активность constitutively активных мутантов RAF со слабым димером сродства / стабильности, таких как ARAF R-позвоночник мутант (ARAF (DGEE/L358M)) (Рисунок 1C, переулок 4), CRAF и ARAF мутантов с измененным димер интерфейс (CRAF (DDEE/ L397M/R401H), ARAF (DGEE/L358M/APE/R362H))15,22 (Рисунок1D,E) не может быть исследован с помощью этого исследования, так как их димеры были сломаны во время очистки, особенно когда очистка была осуществляется с буферами, содержащими сильные или высококонцентрационные моющие средства. Чтобы избежать потери каталитической активности мутантов RAF со слабым сродством/стабильностью димера, мы обычно сплавляли этих мутантов с GST(glutathione S-transferase), димерическим белком с сильным сродством/стабильностью до проведение анализа in vitro киназы, который может спасти каталитическую активность этих raf мутантов15,22 (Рисунок1E). В целом, большинство мутантов RAF могут быть классифицированы как constitutively активных или киназы мертвых мутантов с помощью этого просачителя.

Второй метод, который мы описали здесь RAF совместной активации ассс, который может быть использован для оценки аллостерной активности киназы мертвых мутантов RAF13,15,21,22,23 , 25. Хотя несколько киназы мертвых мутантов RAF с очень высоким димером сродства / стабильности, такие как BRAF (V471F / NVTAP)15, может непосредственно активировать эндогенные молекулы RAF, когда выражается в клетках (Рисунок 1B, переулок 7), большинство киназа мертвых мутанов RAF требуют сотрудничества активных Рас трансактивировать дикого типа RAFs. Однако активный Ras является прямым активатором сигнализации ERK, внедрение которого повысит базальный уровень активной ЭРК. Чтобы избежать вмешательства активных Рас, мы использовали N-терминов-truncated RAF мутантов в этом ассее(Рисунок 2A). Как показано на рисунке 2B, киназа мертвых мутантов BRAF, CRAF, и RAF с кислым мотивом NtA и C-позвоночника слияния (BRAF (V471F, aa431-766), CRAF (DDEE/V363F, aa323-648), и ARAF (DGEE/V324F, aa284-606)) функционировал как аллостерические актеры к алостериваторам вызвать каталитической активности CRAF с нефосфорилируемым мотивом NTA (приемник CRAF, CRAF (AAFF, aa323-648)) при совместном выражении в 293T-клетках. В отличие от этого, киназа мертвых BRAF мутант (V471F / NVTAP, aa431-766), которые имеют очень высокую dimer сродство / стабильность (см. ниже) включен ERK сигнализации, запуская эндогенных RAFs, даже без совместного выражения приемника CRAF. В целом, этот ассеможно использовать для оценки трансактивации способности всех киназы мертвых мутантов RAF.

Димеризация киназов семейства RAF не только регулирует их способность активировать ниже по течению сигнализации MEK-ERK, но и определяет их чувствительность к ингибиторам RAF15 лет,16 Год,20,22 Г.,24,27,28,29,30 год,31 год,32 год. В отличие от других белково-белковых взаимодействий между этим путем33,34,35 лет, димеризация киназы семейства RAF и их мутантов является относительно слабым и трудно поддающихся оценке с помощью традиционных биохимии assays, таких как со-иммунопрецитация. Чтобы решить эту проблему, мы недавно разработали бесплатный сплит luciferase тест для измерения относительной сродство димера / стабильности семейство киназы RAF и их мутантов15 лет,22 Г.,36. Как показано вРисунок 3A, RAF киназы доменов (aa431-766 для BRAF, aa323-648 для CRAF, и aa284-606 для ARAF) были слиты соответственно с N-терминов (aa2-416) или C-терминов (aa398-550) огня luciferase (Nluc) люциферазы на RAF димеризации. Активность люциферазы в этом ассее напрямую коррелирует с количеством dimers RAF. Этот ассс очень чувствителен и может обнаружить даже очень слабую димеризацию мутантов RAF. Как мы сообщали ранее15 лет, онкогенный BRAF (V600E) функционирует как димер, и только соединение мутации с Arg-к-Его мутации (R509H) в димер интерфейс и неканонические изменения APE (P622A в мотиве APE) может полностью отменить его димеризации и тем самым блокировать его каталитическое деятельности (Рисунок 3B). Используя in vitro kinase assay, мы также обнаружили, что вариант BRAF(V600E) с измененным мотивом APE, BRAF(V600E/AAE), но не то, что с арг-к-Его мутации в димер интерфейс, BRAF (V600E/R509H), потерял свою каталитическую активность при очистке (Рисунок 3C), предполагая, что первый вариант имеет гораздо меньше dimer сродство / стабильность, чем второй. Чтобы непосредственно измерить склонность этих вариантов BRAF (V600E) к форме димеров, мы провели бесплатный сплит luciferase асссс, и подтвердил, что эти варианты были совершенно разные dimer сродство / стабильность с BRAF (V600E) выше, чем BRAF (V600E / R509H), чем BRAF (V600E/AAe), чем BRAF (V600E/R509H/AAE) (Рисунок 3D). Сигнал люциферазы, производимый мономерным BRAF (V600E/R509H/AAE), был сопоставим с нетрансфицированным 293T-контролем (Рисунок 3D, левая панель переулок 5), указывая, что этот процесс имеет очень низкий фон. Для дальнейшего определения эффективности бесплатного разделения luciferase асссе, мы затем измеряется с помощью этого исследования относительной сродство димер / стабильность группы онкогенных мутаций BRAF с в кадре удаления no 3- QC петли, которая была определена нами и другими Группы15 лет,37,38. Как мы уже знаем, хотя все эти мутанты активировали ERK сигнализации, когда выражается в 293T-клеток (Рисунок 3E), они продемонстрировали довольно дифференцированную каталитической активность в пробирке (Рисунок 3F). БРАФ(aa484-486 del)) и BRAF (NVTAP (aa486-490 del)) были очень активны при очищении иммунопреципиционом, в то время как BRAF (NVTAPT (aa486-491 del)) и BRAF (За(aa496-497 del)) потеряли свою каталитическую активность при том же состоянии, хотя это может быть спасен с помощью синтеза GST. Кроме того, киназа-мертвая версия BRAF (NVTAP), BRAF (V471F/'NVTAP) продемонстрировала сильную потенцию для активации эндогенных RAFs, когда выражается в клетках (Рисунок 1Bпереулок 7). Эти данные свидетельствуют о том, что эта группа мутантов BRAF имеет совершенно иную димерную сродство/стабильность с BRAF (NVTAP) выше, чем BRAF (MМЛН), чем BRAF (NVTAPT) и BRAF (ЗА). Действительно, результат от бесплатного раскола luciferase асссе полностью поддержал наш вывод (Рисунок 3Г). Взятые вместе, наши данные показывают, что бесплатный анализ разделенной люциферазы является надежным методом для измерения относительной сродства/стабильности мутантов RAF.

Figure 1
Рисунок 1 : Проанализировать каталитической активности мутантов RAF с помощью анализа in vitro киназы. (A) Схема схематическая диаграмма для RAF мутаций, используемых в этом исследовании. (B) Оба constitutively активные и киназы мертвых мутантов RAF может активировать ERK сигнализации, когда выражается в клетках. 293T-клетки были трансфицированы переносчиками, которые кодируют различные мутанты RAF, а активность ЭРК была обнаружена с помощью иммуноблота антифосфо-ЭРК1/2. (C) Конспиранно активные мутанты RAF с низким dimer сродством/стабильностью, так же как киназы-мертвые мутанты RAF не могут фосфорилат MEK in vitro на очищении иммунопрецицией. Мутанты RAF в B были очищены с помощью анти-FLAG бисера, и их каталитической деятельности был зондирован с помощью in vitro киназы анализа, как описано в протоколе. (D-E) Каталитическая активность in vitro constitutively активных мутантов RAF с низким сродством/стабильностью димера может быть спасена слиянием GST. (D) Constitutively активных мутантов RAF и их слитых в GST аналогов были выражены в 293T клетках и их активность была измерена иммуноблотом антифосфо-ERK1/2. (E) RAF мутантов в D были очищены иммунопрецицией, и их в пробирке каталитической активности был зондирован с помощью in vitro киназы анализа, как описано в протоколе. RAF R-позвоночникмутов: BRAF (L505M), CRAF (DDEE/L397M), и ARAF (DGEE/L358M). "NVTAP" представляет для удаления aa486-490 в BRAF. Мутация APE ARAF означает A475P, который генерирует канонический мотив APE в ARAF. "KD" представляет для "киназы домена" в полном тексте. BRAF (KD) означает aa431-766 фрагмент BRAF, в то время как CRAF (KD) и ARAF (KD) представляют соответственно для aa323-648 фрагмент CRAF и aa284-606 фрагмент ARAF. Результаты в этом показателе были сообщены ранее15,22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Оцените способность мутантов RAF трансактивировать RAFs дикого типа с помощью совместного активации RAF. (A) Диаграмма, иллюстрирующая RAF совместной активации ассс. (B) Kinase-мертвые мутанты RAF с кислым мотивом NTA были совместно выражены с катализ-компетентным приемником CRAF в 293T клетках, и деятельность ERK1/2 в трансфектотах 293T была измерена антифошо-ERK1/2 иммуноблотом. Большинство киназы мертвых мутантов RAF, за исключением BRAF (V471F /NVTAP), который имеет очень высокую димерную близость/стабильность, требовало совместного выражения экзогенного приемника RAF, чтобы включить сигнализацию ERK. Результаты в этом показателе были сообщены ранее15,22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Измерьте относительную сродство димера/стабильность мутантов RAF с помощью бесплатного разделения проверки люциферазы. (A) Диаграмма, иллюстрирующая бесплатный раскол luciferase асссе. (B-D) Для их каталитического действия in vivo и in vitro требуется димеризация вариантов BRAF(V600E). (B) Вариант мономерного BRAF (V600E), BRAF(V600E/R509H/AAE) не имеет каталитической активности in vivo, которая может быть восстановлена при слиянии GST. Варианты BRAF(V600E) и их слитые аналоги GST были выражены в 293T-клетках, и их активность измерялась антифосфо-ERK1/2. (C) Вариант BRAF(V600E) с низким dimer сродством/стабильностью, BRAF(V600E/AAE) потерял свою каталитическую активность in vitro после очистки, которую можно спасти слиянием GST. Варианты BRAF(V600E) от B были очищены иммунопрецицией, а их каталитической активностьбыла исмоцирована с помощью анализа in vitro kinase, как описано в протоколе. (D) Относительная dimer сродство / стабильность BRAF (V600E) варианты были измерены с помощью бесплатного разделения luciferase асссе, как описано в протоколе. (E-G) BraF мутантов с в кадре удаления no 3- qC функции цикла как димеры для активации ERK сигнализации. (E) BRAF мутантов с в кадре удаления в кадре цикла No3 - КК активировать ERK сигнализации, когда выражается в клетках. BRAF мутантов были выражены в 293T клеток и их активность была измерена, как описано в B. (F) BRAF мутантов с низким dimer сродство / стабильность от E потеряли свою каталитической активности в пробирке, которые могут быть спасены с помощью синтеза GST. Каталитическая активность мутантов BRAF in vitro и их слитых в GST аналогов из Е была измерена как в C. (G) BRAF мутантов с в кадре удаления no 3 - QC цикла имеют совершенно разные dimer сродство / стабильность. Относительная сродство/стабильность мутантов BRAF с удалением в кадре цикла З3- КК была измерена как в D. Ошибки баров в D и G представляют s.d., чтобы показать разницу между независимыми экспериментами (n No 4). Мутация AAE BRAF означает P622A в мотиве APE, который генерирует неканонический мотив APE. «ЗМОМ», «NVTAPT» и «ЗА» представляют собой соответственно для удаления aa484-486, aa486-491, aa496-497 в петле BRAF. Некоторые результаты в этой цифре были сообщены ранее15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Table 1
Таблица 1: Биологическое свойство различных мутантов RAF. В этой таблице приведены итоги каталитической активности, аллостерической активности и относительной димерной сродства/стабильности всех мутантов RAF, используемых в данном исследовании. "Y" означает "Да", в то время как "N" означает "Нет". "Nq" указывает на то, что эти мутанты имеют каталитическую активность, если слиться с GST. "Я", "Я", "Я", "Я", "Я" и "-" представляют соответственно для "очень сильный", "сильный", "промежуточный", "слабый", и "никто".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы представили три метода для характеристики связанных с болезнями мутантов RAF, которые включают в пробирке киназы анализ, RAF совместной активации анализа, и бесплатный анализ раскола luciferase. Так как киназы RAF имеют как каталитическую активность, так и аллостерическую активность, различные мутанты RAF могут активировать вниз по течению сигнализации через два различных механизма13,14,16,17, 18. Constitutively активные мутанты RAF непосредственно фосфорилат вниз по течению эффектор MEK, в то время как киназа мертвых мутантов RAF вызвать вниз по течению сигнализации через трансактивацию их дикий тип коллег. Тем не менее, как составно активных и киназы мертвых мутантов RAF требуют димеризации, чтобы выполнить свою функцию15,16,17,19,20, и димер склонность мутантов RAF определяет не только каталитическую или аллостерную активность мутантов RAF, но и их чувствительность к ингибиторам RAF15,24. Анализ in vitro киназы, анализ совместной активации RAF и бесплатный анализ сплит-люциферазы предоставляют нам набор простых, эффективных и надежных методов для различения купание активных мутантов из киназы-мертвых мутантов, а также оценки их возможность активации нисходящего сигнала.

Анализ in vitro kinase является классическим методом обнаружения каталитическая активность белковых киназ. Чтобы принять этот метод измерения каталитическая активность мутантов RAF, мы внесли ряд существенных изменений в реагенты и процедуры15,21,22. Так как семейные киназы RAF функционируют как димеры для фосфорилата их субстрата, MEK, и их dimer сродство/стабильность относительно низка, мы снизили концентрацию моющего средства NP-40 с 1% до 0,25% в буферах для очистки белков RAF для того, чтобы предотвратить RAF dimers от диссоциации. В то же время мы также использовали нежную процедуру быстрой стирки для очистки белка RAF. Эти изменения имеют решающее значение для обнаружения каталитическая активность constitutively активных мутантов RAF с очень слабым dimer сродство / стабильность, которые могут быть определены как "киназа-мертвых" RAF мутантов классическим анализом in vitro киназы. Кроме того, мы продемонстрировали, что слияние GST является хорошим альтернативным способом предотвращения RAF dimers от диссоциации во время очистки в этом ассоциации15,21,22. Что касается киназы мертвых мутантов RAF, даже если они слиты с GST, они не проявляют никакой каталитической активности в этом тесте.

RAF совместноактивации ассси был разработан нами для оценки способности киназы мертвых мутантов RAF трансактивировать их дикий тип аналогов13,15,21,22,23 , 25. В этом романе анализ, мы используем N-терминус усеченных белков RAF и тем самым не нуждаются в со-выражении активных мутантов РАН или активации РАН, что делает этот анализ очень чувствительным. Кроме того, аллостерный активатор (киназа-мертвый мутант RAF) и приемник (катализ-компетентный мутант RAF) в этом анализе могут быть легко изолированы и очищены для исследования молекулярных событий в процессе димеризации управляемых трансактивации 13.

Как мы уже упоминали выше, dimer сродство / стабильность является ключевым фактором, который регулирует функцию RAF семьи киназы и их мутантов, а также определяет их чувствительность к ингибиторам RAF13,14,15, 16,17,18,24. Тем не менее, dimer сродство / стабильность RAF семьи киназы и их наиболее связанных с болезнями мутантов очень низка. Для измерения этого параметра традиционные биохимические анализы требуют усложнять экспериментальные процедуры и современное оборудование (например, анализ SPR), или вряд ли производят надежные и воспроизводимые данные (такие как анализ иммунопреципиции). В отличие от этого, бесплатный анализ разделенной люциферазы является простым, чувствительным, последовательным и экономически эффективным методом для измерения относительной сродства/стабильности семейных киназ RAF и их мутантов15,21, 22,36. Этот ассес может исследовать тонкие различия dimer сродство / стабильность среди различных мутантов RAF. Как мы сообщали до15, BRAF (V600E/AAE) имеет очень слабую сродство димера/стабильность и его dimers будут полностью сломаны при очищении, даже если с помощью очень мягкой процедуры. Используя этот ассс, мы можем отличить слабые dimer сродство / стабильность BRAF (V600E/AAE) от мономерных BRAF (V600E/AAE/R509H) (Рисунок 3).

Таким образом, этот набор практических и осуществимых методов может выполнить требования определения всех связанных с болезнью мутантов RAF, и тем самым помочь нам выбрать соответствующие стратегии для лечения различных RAF мутантов инициативе заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы отметить волосатые клетки лейкемии стипендий для поддержки Yuan Jimin. Эта работа была поддержана Азиатского фонда онкологических исследований (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Мост Финансирование премии (Дюк-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF преодоление гранта (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF пилотный грант (NCCRF-YR2017-PG- Исследовательский грант (AM/TP011/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15, (5), 463-469 (2003).
  2. Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, (11), 875-885 (2004).
  3. Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579, (15), 3271-3277 (2005).
  4. Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, (5), 281-298 (2015).
  5. Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119, (10), 2261-2271 (2006).
  6. Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26, (22), 3291-3310 (2007).
  7. McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773, (8), 1263-1284 (2007).
  8. Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7, (4), 295-308 (2007).
  9. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, (6892), 949-954 (2002).
  10. Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6, (4), 313-319 (2004).
  11. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39, (8), 1007-1012 (2007).
  12. Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18, (8), 2137-2148 (1999).
  13. Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154, (5), 1036-1046 (2013).
  14. Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161, (5), 967-970 (2015).
  15. Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37, (43), 5719-5734 (2018).
  16. Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116, (6), 855-867 (2004).
  17. Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34, (9), 1538-1546 (2014).
  18. Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41, (4), 981-986 (2013).
  19. Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461, (7263), 542-545 (2009).
  20. Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140, (2), 209-221 (2010).
  21. Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11, (554), 6795 (2018).
  22. Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293, (37), 14276-14284 (2018).
  23. Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35, (1), 264-276 (2015).
  24. Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480, (7377), 387-390 (2011).
  25. Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (15), 6067-6072 (2011).
  26. Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36, (2), 65-77 (2011).
  27. Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383, (6596), 178-181 (1996).
  28. Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383, (6596), 181-185 (1996).
  29. Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61, (9), 3595-3598 (2001).
  30. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20, (6), 963-969 (2005).
  31. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, (7287), 431-435 (2010).
  32. Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464, (7287), 427-430 (2010).
  33. Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
  34. Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588, (15), 2398-2406 (2014).
  35. García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4, (9), 616-633 (2018).
  36. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (33), 12288-12293 (2004).
  37. Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6, (3), 300-315 (2016).
  38. Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29, (4), 477-493 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics