ניתוח של לוקליזציה של הספולקסיזומאואליזציה של האדם בתאי הלה באמצעות מיקרו הזרקה

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ביוגנזה של snRNAs של הספנסאוסיס הוא תהליך מורכב הכולל תאים סלולריים שונים. כאן, אנחנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שוכרים snRNAs כדי לפקח על ההובלה שלהם בתוך התא.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ביוגנזה של snRNAs התחתית הוא תהליך מורכב הכרוך הן בשלבים גרעינית, cytoplasmic והשלב האחרון מתרחש בתוך תא גרעיני בשם הגוף Cajal. עם זאת, רצפים הישירים לוקליזציה snRNA למבנה זה תת גרעיני לא ידוע עד לאחרונה. כדי לקבוע רצפים חשובים עבור הצטברות של snRNAs בגופים Cajal, אנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שלהם snRNAs ואחריו הלוקליזציה שלהם בתוך תאים. ראשית, הכנו snRNA מוטנטים מוטציות, מסונתז תבניות דנ א עבור תמלול ושעתוק והעתק snRNAs בנוכחות של UTP ביחד עם Alexa488. מתויג snRNAs היו מעורבים עם 70 kDa-Dextran מצועם TRITC, ו מיקרווזרק לגרעין או ציטופלסמה של תאי הלה האדם. תאים היו מודבטים עבור 1 h ו קבוע את הסמן הגוף Cajal לאסוף היה דמיינו על ידי immunofluorescence עקיף, בעוד snRNAs ו dextran, אשר משמש כסמן של הזרקה גרעינית או cytoplasmic, נצפו ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת בדיקה יעילה ומהירה של איך רצפים שונים להשפיע לוקליזציה RNA בתוך תאים. כאן, אנו מראים את החשיבות של רצף מחייב-Sm ללוקליזציה יעיל של snRNAs לתוך הגוף Cajal.

Introduction

שחבור ה-RNA הוא אחד השלבים הקריטיים בביטוי הגנים, אשר מזרז על ידי מתחם ribonucleoprotein גדול הנקרא מתחת לתחתית. בסך הכל, יותר מ 150 חלבונים ו-5 RNAs גרעיני קטן (snRNAs) משולבים לתוך מתחת שלבים בשלבים שונים של המסלול השחבור. U1, U2, U4, U5 ו U6 snRNAs משתתפים בהשתתפות של introns הגדולות גו-AG. SnRNAs אלה להצטרף המאחדים כמו טרום בנוי חלקיקים גרעיניים גרעינית קטנה (Snrnas) המכילים snRNA, שבעה חלבונים Sm הקשורים snRNA (או כמו-Sm חלבונים, אשר מקשרים עם U6 snRNA) ו 1-12 חלבונים ספציפיים עבור כל Snrnas.

הרכבת של snRNPs כוללת cytoplasmic ושלבים גרעיניים. שופץ לאחרונה snRNA מיוצא אל הציטופלסמה שבו הוא רוכש טבעת שנאספו מתוך שבעה חלבונים Sm. הטבעת Sm משמש לאחר מכן כאות לייבא snRNA מחדש חזרה לגרעין. SnRNAs פגומים שאינם משייכים עם חלבונים Sm נשמרים בציטופלסמה1. מיובא snrnps החדש להופיע לראשונה בגוף cajal שבו הם פוגשים snrnps-ספציפיים חלבונים ולסיים את ההבשלה שלהם (נבדקו בהתייחסות2,3). לאחרונה הראינו כי עיכוב של שלבי ההבשלה הסופי תוצאות בקיבוע על של snrnps בוגר בגוף cajal4,5. הצעת מודל שבו ההבשלה snRNP הסופי הוא תחת שליטה איכותית כי מפקחת תוספת של חלבונים ספציפיים snRNP והיווצרות Snrnp פעיל. עם זאת, פרטים מולקולריים של האופן שבו תאים מבחינים בין חלקיקים בוגרים שאינם מפותחים בצורה נכונה, נותרים חמקמקים.

כדי לקבוע רצפים snRNA כי הם חיוניים עבור המיקוד והצטברות של snRNAs בגופים הגרעין Cajal, החלטנו להעסיק מיקרוהזרקה של הסימון מתויג של snRNAs. מיקרוהזרקה היתה שיטה של בחירה כי: 1) זה לא דורש תג רצף נוסף כדי להבחין snRNAs סינתטי טופס עמיתיהם האנדוגניים שהוא חשוב במיוחד עבור RNAs קצר עם מעט מקום להוספה של רצף תג נוסף; 2) הוא מאפשר ניתוח רצפים החשובים עבור biogenesis. לדוגמה, רצף Sm חיוני להרכבת הטבעת Sm ולייבא מחדש לתוך הגרעין6. כאשר snRNAs מבוטא בתא, snRNAs חסר הרצף Sm מושפל בציטופלסמה ולא להגיע הגרעין הגופים Cajal7. עם זאת, snRNAs ללא רצף Sm יכול להיות ישירות מיקרו לתוך הגרעין ולכן תפקיד פוטנציאלי של רצף Sm ב Cajal לוקליזציה של הגוף.

כאן, אנו מתארים בפירוט שיטת מיקרו הזרקה שאנו מיושמים כדי לקבוע רצפים snRNA הנחוצים למקד snRNAs לתוך הגוף Cajal5. הראנו כי האתרים מחייב Sm ו SMN הם ביחד הכרחי ומספיק כדי להתאים לא רק snRNAs, אך שונים RNAs ללא קידוד קצר לתוך הגוף Cajal. מבוסס על הזרקת מיקרו כמו גם ראיות אחרות, הציעו כי טבעת Sm התאספו על האתר מחייב Sm הוא אות הגוף Cajal לוקליזציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מיקרונס למיקרו-מזרקה

  1. הכנת תבנית DNA המכילה את הגירסה באורך מלא או מעוגל/מוטציה של snRNA על ידי ה-PCR באמצעות ההתקנה הבאה PCR: 98 ° c עבור 60 s, 98 ° צ' עבור 15 s, 68 ° c עבור 30, 72 ° c עבור 1 דקות, 98 ° צ' עבור 15 s עבור 35x , ו 72 ° c עבור 5 דקות.
  2. התחל הקדמי חייב להכיל רצף מיזם עבור שעתוק מבחנה בדיוק במעלה הזרם של הנוקלאוטיד הראשון ששועתק. החזק U2 ברצף snRNA באמצעות פריימר קדימה המכיל את היזם T7 ואת פריימר הפוכה, אשר מסתיים עם נוקלאוטיד האחרון העתק (ראה טבלת חומרים לפרטים).
  3. סינתזה snRNA באמצעות ערכה עבור סינתזה RNA קצר (ראה טבלת חומרים לפרטים) המכיל T7 RNA פולימראז. להוסיף 1 מ"מ ATP, 1 מ"מ CTP, 1 מ"מ GTP, 0.8 mM UTP, 0.2 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM trimethylguanosine כובע אנלוגי (m32, 2, 7G) ppp (5 ') G), 1 מ ל של מעכב RNA ו 500-700 של תבנית ה-DNA לתערובת התגובה והדגירה ב 37 ° c לילה.
  4. הוסף 1 μL (2U) של DNase לתוך התגובה ואת הדגירה עבור 15 דקות נוספות ב 37 ° c.
  5. בודד snRNA על ידי מיצוי פנול חומצי/כלורופורם. להסיר את שלב המים העליון ולהוסיף 1/10 של הנפח המקורי של 3 מז נתרן אצטט (pH = 5.2), 3 μL של גליקוגן עבור הדמיית גלולה טובה יותר ו 2.5 כרכים של 100% אתנול. דגירה עבור 1 h ב-80 ° צ', צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 14,000 x g ו 4 ° c.
  6. לשטוף את הגלולה עם 70% אתנול ולפזר 12 μL של מים חינם של nuclease. התשואה הרגילה של RNA הייתה סביב 600 ng/mL. חנות ב-80 ° c.
  7. עקוב אחר היושרה של העתק מחוץ למבחנה באמצעות מוצרי החשמל של agarose.
  8. לפני microinjection, לדלל RNA לריכוז הסופי 200 ng/mL במים המכילים 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa.

2. תאים

  1. לפני השימוש, לטפל coverslips עם הHCl 1 M עבור 1 h, לשטוף ביסודיות מים מזוקקים ולאחסן ב 100% אתנול. טיפול חומצי מקדמת תאים הדבקה כדי למנוע פילינג תא במהלך או לאחר ההזרקה. לזיהוי קל יותר של תאים מוזרק, להשתמש coverslip עם רשת.
  2. זרע חלה או תאים חסיד אחרים 1 יום לפני מיקרוהזרקה על 12 מ"מ coverslips (מס ' 1 או no. 1.5) כדי להגיע 50% השטף בזמן מיקרוהזרקה.

3. הזרקה

הערה: תאי הלה הוזרקו במדיום הנשר השונה של Dulbecco (D-הגברת, 4.5 g/L D-גלוקוז הכולל אדום פנול ואנטיביוטיקה). הזריקה בוצעה באמצעות מזרק ומיקרומניפולציה מצויד במחט סטרילית (ראה טבלת חומרים לפרטים). מערכת מיקרוסקופית/מיקרומניפולציה שלמה הייתה מחוממת מראש עד 37 ° c לפחות 4 שעות כדי למנוע תנודות של חלקים בודדים של המיקרוסקופ והמיקרו-מזרק.

  1. שים את צלחת פטרי (30 מ"מ) המכיל 2 מ ל של מדיית תרבות עם שמיכות באמצע למחזיק של המיקרוסקופ. טען 3 μL של תערובת snRNA לתוך המחט באמצעות microloader. התקינו את המחט למחזיק המיקרו מזרק ב 45 ° ביחס למשטח של צלחת פטרי.
  2. כדי למצוא את המחט, להשתמש ביעד 10x במרחק רב. ראשית, להגדיר את מהירות גסה על מזרק ולהוריד את המחט עד שהוא נוגע במדיום התרבות. באמצעות משקפת המיקרוסקופ, למצוא את הנקודה הבהירה, אשר הוא המקום שבו המחט נוגעת במדיום התרבות.
  3. לשנות את המהירות לקנס ועוד להנמיך את המחט תוך כדי להסתכל לתוך המיקרוסקופ עד קצה המחט הוא נצפתה. להעביר את המחט באמצע השדה החזותי ולעבור ליעד 40x במרחק רב.
  4. לאחר שינוי המטרה, בחר את התא והזז את המחט מעל תא זה. הגדר את הלחצים והזמן עבור איש הקשר של התא (ראה עצות ופתרון בעיות בדיון).
  5. הזז את המחט אל התא ולאחר מכן הגדר את המגבלה הנמוכה על המיקרומניפולציה. להיזהר לא להזיז את המחט מתחת לתא.
  6. לאחר הגדרת הגבול התחתון, להזיז את המחט בחזרה מעל התא ולחץ על כפתור ההזרקה על מוט ההיגוי של מזרק. המחט נעה באופן אוטומטי בתוך התא למקום שבו המגבלה מוגדר מזריק את תערובת RNA.
  7. כדי לסיים, ללחוץ על תפריט הלחצן על מזרק ולהסיר את המחט מן המחזיק. ואז לנתק את הצינורית מן הזרק לפני החלפת מזרק ומיקרומניפולציה.

4. קיבוע תא וצביעת

  1. לאחר המיקרו הזרקה, להחזיר את התאים לתוך CO2 אינקובטור ו-דגירה ב 37 ° c עבור 1 h.
  2. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם התמיסה מלוחים באגירה פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר, לתקן עבור 20 דקות עם 4% פאראמפורמלדהיד ב 0.1 M צינורות pH 6.9, ולשטוף שלוש פעמים עם טמפרטורת החדר PBS. אם רק snRNA לוקליזציה מנותח, בקצרה לשטוף את התאים במים להר במדיום הרכבה עם DAPI.
  3. במקרה של לוקליזציה נוספת של חלבון, החדיר את התאים עם 0.5% טריטון-X100 ב-PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלושה טיפות עם PBS, מודיית את התאים עם נוגדנים הראשי והמשני לאחר שוטף הסופי ב-PBS ושטיפה קצרה במים, הר במדיום גובר עם dapi.

5. מיקרוסקופיה

  1. אם לא מתמונה מייד לאחר הטעינה, אחסן את השקופיות ב-4 ° צ' עד להדמיה.
  2. לרכוש תמונות באמצעות מערכת מיקרוסקופיים פלואורסצנטית high-end מצויד מטרה טבילה (60X או 100x/1.4 NA).
  3. לאחר תאים מיקרו מוזרק מזוהים, לאסוף ערימה של 20 z-סעיפים עם 200 ננומטר z שלבים לכל מדגם ובכפוף לפירוק מתמטי. הוצגו לאחר מכן בתחזיות מכסימלי או בערימות בודדות של z.
  4. כדי לכמת את האות פלורסנט, לצייר את אזור הריבית (ROI) סביב גוף Cajal המזוהה על ידי הצווארון החיסוני. למדוד את עוצמת האות snRNA ב-ROI מוגדר האוסף. הבא לקבוע את עוצמת הזריחה snRNA ב ROI באופן אקראי ממוקם בתוך הנואופלזמה ולחשב את היחס של האות RNA של הגוף Cajal ו נוקלאואופלזיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לנטר snRNA לוקליזציה ואת התפקיד של האתר מחייב Sm מיקוד הגוף Cajal, הכנו תבנית DNA המכילה את היזם T7 או באורך מלא U2 snRNA או U2 snRNA חסר שבעת נוקלאוטידים (AUUUUUG) להרכיב את האתר מחייב Sm. , מבודדים ומעורבבים בעזרת טריTC. עם דקטרן-70kDa אנו מזריקים את התערובת המכילה בתוך מבחנה מתורבת snRNA לתוך הגרעין או ציטופלסמה של תאי הלה.

כבר הוכח בעבר כי האתר מחייב Sm הוא הכרחי עבור ייבוא גרעיני6. כדי לבדוק אם האתר Sm חשוב גם עבור הצטברות הגוף Cajal, אנו מזריקים snRNA חסר באתר Sm ישירות לתוך הגרעין (איור 1A). הזרקה לתוך הציטופלסמה שימשה כפקד (איור 1B). בתור שליטה חיובית, אנו מזריקים באורך מלא snRNA (איור 1C,D). לאחר 60 מינימום של דגירה בחממה2 שיתוף, תאים microinjected היו קבועים ומסמן הגוף cajal לאסוף היה דמיינו על ידי immunofluorescence עקיף. SnRNA באורך מלא שנצבר בגוף Cajal לאחר זריקות גרעיניות וcytoplasmic. לעומת זאת, snRNA חסר באתר Sm נשאר בציטופלסמה לאחר ההזרקה לתוך תא זה, אשר עקבית עם ממצאים קודמים6. ההזרקה הגרעינית של snRNA ללא אתר Sm חשף כי רצף מחייב Sm חשוב לוקליזציה של הגוף Cajal. U2 snRNA חסר באתר Sm נשאר בגרעין אך לא להצטבר בגופי Cajal (איור 1A).

לפעמים, ההזרקה לתוך תא תאי אחד בלבד נכשל ו TRICT-דטרן-70kDa נמצא הן בגרעין והן בציטופלסמה (איור 2A). תאים אלה נמחקו מניתוח נוסף. למרות העובדה שהזוהר מתויג snRNAs מאוחסנים ב-80 ° צ' לפני הזריקה, השפלה RNA יכול להתרחש. מושפל snRNA מוזרק לתוך הציטופלסמה לא מועבר לתוך הגרעין ונשאר מקומי בציטופלסמה (איור 2B). כזה snRNA צריך להיות מושלך, ו snRNA חדש צריך להיות מסונתז.

Figure 1
איור 1: לוקליזציה של snRNAs מיקרו. Alexa488-מתויג U2 snrna או חסר באתר Sm (A,B) או באורך מלא (C,D) היו מיקרו בציטופלסמה או בגרעין של תאי הלה. הגופים הקאחאל (חיצים) מסומנים על-ידי האוסף אימונואולבלינג (אדום); snRNAs מתוארים בירוק. Dextran-TRITC-70kDa (צהוב) שימש לניטור הזרקה גרעינית או cytoplasmic; ה-DNA היה מוכתם על ידי DAPI (כחול). ראשי חץ מסמן לוקליזציה cytoplasmic של snRNA. סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הנפילה הפוטנציאלית של הגישה למיקרו-הזרקה. (A) מיקרוהזרקה לתוך תא אחד נכשל ו-WT U2 snrna היה microinjection לתוך הציטופלסמה והגרעין. שימו לב כי Dextran-TRITC-70kDa (צהוב) נמצא בשני התאים הסלולריים. (ב) WT U2 snrna הוזרק לתוך הציטופלסמה של תאי הלה (ירוק) אבל כמות משמעותית של snrna נשאר בציטופלסמה (ראשי חץ), אשר מצביע על השפלה חלקית של snrna מוזרק ואובדן של אתר מחייב Sm. הגופים הקאחאל (חיצים) מסומנים על-ידי האוסף באמצעות חיסוללינג (אדום). ה-DNA היה מוכתם על ידי DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו המועסקים מיקרוהזרקה של המסומנת מתויג snRNAs כדי לקבוע רצפים חשובים עבור snRNA לוקליזציה לתוך הגופים הגרעיניים Cajal. בשל הכנה מהירה ופשוטה למדי של RNAs מתויג (הכנת תבנית ה-DNA על ידי PCR ואחריו שעתוק מבחנה) השיטה מציעה ניתוח אפקטיבי של איך רצפים שונים תורמים ללוקליזציה של RNA. בזמן קצר יחסית, הצלחנו לנתח עשרה מחיקות שונות או החלפות של U2 snRNA (התייחסות5 ונתונים לא הראו). עבור RNAs עם מסלול biogenesis מורכבים, גישה זו גם מאפשרת רצפי בדיקות כי הם חיוניים להבשלה. במקרה של snRNAs, מחיקה של רצפי כריכת Sm, אשר נדרשים עבור תוצאות ההרכבה של טבעת Sm ב קיבוע על והשפלה של snRNAs מוטציה בציטופלסמה7. יתרון נוסף כולל שניתן להזריק לשני משתמשים שונים RNAs במקביל והלוקליזציה שלהם ישירות לעומת תא אחד. עם זאת, כמו fluorochromes שונים עשויים לשנות התנהגות RNA, כל fluorochrome צריך להיבדק בודדים לפני ניסויים כפול תוויות. RNAs של כמה מאות נוקלאוטידים באורך כבר הוזרק בהצלחה ואת הלוקליזציה שלהם מערכות מודל שונות (נבדקו בהתייחסות8). הצעד המגביל במקרה של RNAs ארוך יותר הוא בדרך כלל סינתזה של מבחנה באורך מלא של RNA. כמו כן, הזרקה של RNAs עם חלבונים מראש התאספו ניתן להחיל כדי לבדוק את ההשפעה של חלבונים בודדים על לוקליזציה RNAS. בפרויקטים שלנו, הזרקנו snRNA הקשורים עם חלבונים Sm כדי לאשר את התפקיד של הטבעת Sm ב לוקליזציה של הגוף Cajal5. בסופו של דבר, הזרקת מיקרוסקופים של RNAs המסומנת מאפשרת כימות ישירה ללא שלבים נוספים, כפי שהוחל בעבר עבור snRNAs9.

יש גם כמה חסרונות של שיטות שיש לשקול לפני השקת פרויקט מיקרוהזרקה. ראשית, למרות מספר היצרניות של תהליך המיקרוהזרקה, השיטה עדיין דורשת כישורים וניסיון ידניים, והחוקרים צריכים לשקול זמן הכרחי להכשרה. החלקים הקריטיים של הפרוטוקול הם הכנת RNAs שלמים, מיקרוהזרקה ולאחר מכן מציאת תאים מוזרק במיקרוסקופ (ראה טיפים ופתרון בעיות להלן). שנית, מיקרוהזרקה מייצגת מתח משמעותי ותאים רבים אינם שורדים למשך פרק זמן ארוך יותר. אמנם יש כמה ניסיונות מוצלחים לעקוב RNAs מיקרו מוזרק בתוך תאים על ידי חי-cell הדמיה10, הבחנו גידול משמעותי של מוות תאים כאשר אנו משולבים מיקרוהזרקה עם הדמיה תא חי באמצעות מיקרוסקופ הזריחה. שלישית, כמות ה-RNA המוזרקים לתאים אנושיים נמוך מאוד אשר מונע ניתוח ביוכימיים של RNAs מוזרק. זה גם אומר שקשה לעקוב אחר כיצד שילוב של כלומר נוקלאוטידים המסומנת באופן משפיע על פונקציות RNA. לכן, יחס שונים של מתויג-NTP: NTP צריך להיות משולב לתוך RNA סוג פראי ולוקליזציה שלה לקבל את היחס האידיאלי בין האות הזריחה ואת הפונקציונליות של RNA המסומנת. כמו כן, טבעו של fluorochrome עשוי להשפיע על לוקליזציה של RNA. בידינו, Alexa488-UTP עבד הרבה יותר טוב מאשר Alexa546-UTP. אנחנו לא חקרו את ההבדלים האלה יותר, אבל סיבה אחת יכולה להיות בגודל גדול יותר וצורה שונה של Alexa546 בהשוואה Alexa488.

לקיחת יחד, RNA מיקרוהזרקה היא שיטה רבת עוצמה עבור לוקליזציה של RNA, אבל צריך להיות תמיד בשילוב עם גישות חלופיות. במקרה שלנו, הצגנו בהצלחה MS2-binding באתר לתוך U2 snRNA, בפיקוח על הלוקליזציה שלה באמצעות MS2-YFP ואישר כמה תוצאות מפתח שהתקבלו על ידי snRNA מיקרוהזרקה עם מערכת MS25.

עצות ופתרון בעיות
לחץ הזרקה, הלחץ פיצוי וזמן ההזרקה צריך להיות הקבוע ניסויים עבור כל קו תא. החלת לחץ הזרקה (Pi) 170 hPa והלחץ פיצוי (Pc) 50 hPa במקרה של מיקרוהזרקה cytoplasmic ו-Pi = 200 hPa ו-Pc = 80 hPa במקרה של מיקרו הזרקה גרעינית. זמן הזריקה היה בשני המקרים שנקבעו ל 0.2 s. לעתים ניתן להבחין בתנועה קלה של חומר בתוך התא, שהוא אינדיקציה לזריקה מוצלחת. אם התא מתפוצץ, אתה צריך להקטין את לחץ ההזרקה. אתה צריך גם לבדוק את הלחץ פיצוי באמצעות ערוץ הזריחה TRITC. כאשר אתה רואה את הזרם החזק יוצא מקצה המחט, ואז להקטין את הלחץ פיצוי.

בין זריקות, לבדוק תמיד אם התאים מוזרק בהצלחה. זיהוי התאים המיקרומוזרקים דרך Dextran-TRITC מוזרק באמצעות ערוץ הזריחה TRITC. אם אתה לא רואה כל תאים microinjected, תחילה להגדיל את הלחץ ההזרקה ואת זמן ההזרקה. שנית, בדוק אם המחט אינה מחוברת באמצעות ערוץ הזריחה (TRITC). אם אתה רואה Dextran-TRITC חלש הזרמת מקצה המחט, אז המחט הוא פונקציונלי, והבעיה היא ככל הנראה במסגרת הגבול התחתון להזרקה. ההגדרה של המגבלה היא צעד מסובך וחשוב מאוד. כל תא יש צורה שונה ואתה תהיה לשנות את המגבלה לעתים קרובות מאוד כדי להבטיח מיקרו הזרקה נכונה.

במקרה האידיאלי, אחד צריך להיות מסוגל מיקרו הזרקת ~ 50 תאים לפני קצה המחט מחובר עם פסולת תא. בדוק אם הזריחה יוצאת מהקצה באופן קבוע, ואם אינך רואה כל הזרמה של Dextran-TRITC מהקצה, המחט חסומה. כדי לנקות אותו, להחזיק את לחצן נקי על מזרק עבור 3 s, אשר מגביר את הלחץ וצריך להסיר את הבלוק. אם זה לא עוזר, אז אתה יכול לנסות לשבור את קצה המחט על ידי להכות את החלק התחתון של צלחת פטרי. עם זאת, זהו הליך מסובך מאוד, אשר דורש כמות משמעותית של ניסיון ואין ערובה להצלחה. לכן, למתחילים, מומלץ להחליף את המחט.

לפני שאתה מחליף את המחט, ללחוץ על כפתור התפריט על מזרק. קח את המחט קצת למעלה ולחץ על הבית על המיקרומניפולציה. המחט ילך כל הדרך למעלה מן המדיום, אבל המיקרומניפולציה זוכר את המיקום המקורי של המחט ואתה לא צריך למצוא את המחט שוב. כאשר המחט מוחלף, לחץ על כפתור הבית ואת המחט ילכו לתנוחה המקורית ואתה צריך להיות מסוגל לראות את הקצה של המחט במיקרוסקופ. לאחר שינוי המחט, עליך לכוונן את המגבלה. אז, ללחוץ על הכפתור בתפריט על המזרק שוב את המחט מוכן מיקרו הזרקה.

במהלך ההדמיה, החלק הtrickiest הוא למצוא את התאים המיקרומוזרקים. כדי לאתר אותם, השתמש בערוץ TRITC, שבו מצוואת Dextran-70kDa הוא הרבה יותר נראה טוב יותר מאשר האות Alexa488 חלש של מיקרו מוזרק snRNAs. הכיסויים עם הרשת. מועילים כאן

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן המדע הצ (18-10035S), התוכנית הלאומית לקיימות I (LO1419), תמיכה מוסדית (RVO68378050), הקרן האירופית לפיתוח אזורי (COM. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) וסוכנות המענק של אוניברסיטת צ'רלס (GAUK 134516). אנו מכירים בנוסף את מתקן הליבה של מיקרוסקופ האור, IMG CAS, פראג, צ'כיה (נתמך על ידי מענקים (צ'כית-Bioimaging-LM2015062).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42, (4), 2708-2724 (2014).
  2. Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14, (6), 671-679 (2017).
  3. Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
  4. Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
  5. Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46, (7), 3774-3790 (2018).
  6. Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12, (2), 573-583 (1993).
  7. Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111, (32), E3277-E3286 (2014).
  8. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20, (7), 380-390 (2010).
  9. Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17, (12), 4972-4981 (2006).
  10. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33, (6), 1902-1912 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics