미세 주입을 사용하여 인간 헬라 세포에서 스플리세오소말 snRNA 국소화 분석

Neuroscience

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Summary

스플리케오소말 snRNA의 생물 발생은 다양한 세포 구획을 포함하는 복잡한 과정입니다. 여기에서, 우리는 세포 안쪽에 그들의 수송을 감시하기 위하여 형광으로 표지된 snRNAs의 마이크로 주입을 이용했습니다.

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Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

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Abstract

스플리케오소말 snRNA의 생물 발생은 핵 및 세포질 상과 마지막 단계가 카잘 바디에게 불린 핵 구획에서 생기는 둘 다 관련시키는 복잡한 프로세스입니다. 그러나, 이 비핵화 구조로 snRNA 국소화를 지시하는 서열은 최근까지 알려지지 않았다. Cajal 바디에 있는 snRNAs의 축적을 위해 중요한 순서를 결정하기 위하여는, 우리는 형광으로 표지된 snRNAs의 미세 주입을 세포 안쪽에 그들의 현지화에 선행했습니다. 첫째, 우리는 snRNA 결실 돌연변이를 준비, 생체 외 전사에 대한 DNA 템플릿을 합성하고 Alexa488와 결합 된 UTP의 존재에 snRNAs를 전사. 표지된 스노르나스를 TRITC와 결합한 70 kDa-Dextran과 혼합하고, 인간 HeLa 세포의 핵 또는 세포질에 미세주입하였다. 세포는 1시간 동안 배양하고 고정하고 카잘 체 마커 코일린을 간접 면역형광에 의해 가시화하였고, 핵 또는 세포질 주입의 마커 역할을 하는 snRNA 및 dextran은 형광 현미경을 사용하여 직접 관찰되었다. 이 방법은 다양한 서열이 세포 내부의 RNA 국소화에 미치는 영향을 효율적이고 신속하게 테스트 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 Cajal 바디로 snRNA의 능률적인 현지화를 위한 Sm 결합 순서의 중요성을 보여줍니다.

Introduction

RNA 접합은 스플리세오좀이라고 불리는 큰 리보뉴클레오단백질 복합체에 의해 촉매되는 유전자 발현의 중요한 단계 중 하나입니다. 총 150개 이상의 단백질과 5개의 작은 핵 RNA(snRNAs)가 접합 경로의 다른 단계에서 스플리세오좀에 통합됩니다. U1, U2, U4, U5 및 U6 snRNAs는 주요 GU-AG 인트론의 접합에 참여하고 있습니다. 이러한 snRNAs는 snRNA, snRNA(또는 U6 snRNA와 연관된 유사 Sm 단백질)와 연관된 7개의 Sm 단백질을 포함하는 미리 형성된 작은 핵 리보핵단백질 입자(snRNPs)와 각 snRNP에 특이적인 1-12개의 단백질로 스플리세오좀을 결합한다.

snRNPs의 집합은 세포질과 핵 단계를 관련시킵니다. 새로 전사된 snRNA는 세포질로 수출되어 7개의 Sm 단백질로부터 조립된 고리를 획득합니다. Sm 링은 이후에 핵으로 다시 수입되는 snRNA에 대한 신호로서 작용한다. Sm 단백질과 연관시키지 못하는 결함이 있는 snRNAs는 세포질1에서 유지됩니다. 새로 수입된 snRNPs는 먼저 snRNP 특이적 단백질을 만나고 그들의 성숙을 완료하는 Cajal바디에서 나타납니다 (참조 2,3에서검토). 우리는 최근에 최종 성숙 단계의 억제가 카잘 바디4,5에있는 미성숙한 snRNPs의 격리 귀착된다는 것을 보여주었습니다 . 우리는 최종 snRNP 성숙이 snRNP 특이적 단백질의 추가 및 활성 snRNPs의 형성을 감시하는 품질 관리의 밑에 있는 모형을 제안했습니다. 그러나, 세포가 정확하게 조립된 성숙한 미성숙한 입자를 구별하는 방법의 분자 세부사항은 애매한 남아 있습니다.

핵 카잘 바디에 있는 snRNA의 표적으로 하고 축적을 위해 필수적인 snRNA 순서를 결정하기 위하여는, 우리는 형광으로 표지된 snRNA의 미세 주입을 채택하기로 결정했습니다. 미세 주주사는 선택의 방법이었다: 1) 합성 snRNAs를 구별하기 위해 추가 서열 태그를 필요로하지 않는 것은 여분의 태그 서열의 삽입을위한 작은 공간과 짧은 RNA에 특히 중요하다 자신의 내인성 대응을 형성; 2) 생물 발생에 중요한 서열을 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, Sm 서열은 SM 링 어셈블리및핵6으로 재가져오기에 필수적이다. snRNAs가 세포에서 발현될 때, Sm 서열이 결여된 snRNAs는 세포질에서 분해되고 핵및 카잘 바디 7에 도달하지 않는다. 그러나, Sm 서열이 없는 snRNAs는 핵 내로 직접 미세주입될 수 있고 따라서 Cajal 체국화에서 Sm 서열의 잠재적인 역할은 분석되었다.

여기서, 우리는 카잘 바디 5로 snRNA를 표적으로 하는 데 필요한 snRNA 서열을결정하기 위하여 적용한 미세 주입 방법을 상세히 기술합니다. Sm및 SMN 바인딩 사이트가 함께 필요하고 snRNA뿐만 아니라 다양한 짧은 비 코딩 RNA를 Cajal 본문에 지역화하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다. 미세 주입뿐만 아니라 다른 증거에 기초하여, 우리는 SM 결합 부위에 조립 된 SM 링이 Cajal 몸 국소화 신호라고 제안했다.

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Protocol

1. 미세 주입을위한 snRNAs의 준비

  1. 다음 PCR 설정을 사용하여 PCR에 의한 snRNA의 전체 길이 또는 잘린/돌연변이 버전을 포함하는 DNA 템플릿을 준비합니다: 60s의 경우 98°C, 15초의 경우 98°C, 30초동안 68°C, 1분동안 72°C, 15초용 98°C35x , 5 분 동안 72 °C.
  2. 순방향 프라이머는 제1 전사 뉴클레오티드의 상류에 대한 시험관내 전사에 대한 프로모터 서열을 포함해야 한다. T7 프로모터 및 역프라이머를 함유하는 순방향 프라이머를 사용하여 U2 snRNA 서열을 증폭시키고, 이는 마지막 전사된 뉴클레오티드로 끝난다(자세한 내용은 재료표 참조).
  3. T7 RNA 폴리머라제 함유 짧은 RNA 합성을 위한 키트를 사용하여 snRNA를 합성합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP, 0.2 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM 트리메틸과노신 캡 아날로그(m32,2,7G(5')ppp(5')G), RNA 억제제의 1 mL 및 500-700 ng의 DNA 템플릿을 혼합물및 인큐베큐라에 밤새 혼합하여 300-700 ng의 반응및 인큐베이트에.
  4. 반응에 DNase 1 μL (2U)를 넣고 37 °C에서 추가로 15 분 동안 배양하십시오.
  5. 산성 페놀 /클로로폼 추출에 의해 snRNA를 분리하십시오. 상부 수상을 제거하고 3M 나트륨 아세테이트 (pH = 5.2), 더 나은 펠릿 시각화를위한 글리코겐 3 μL, 100 % 에탄올 2.5 부피의 원래 부피의 1/10을 추가하십시오. -80 °C에서 1 시간 동안 배양하고, 10 분 동안 14,000 x g 및 4 °C에서 원심 분리기를 배양합니다.
  6. 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 12 μL의 뉴클레아제 없는 물에 용해시다. 일반적인 RNA 수율은 약 600 ng/mL이었다. -80 °C에서 보관하십시오.
  7. 아가로즈 겔 전기 영동에 의한 시험관 내 전사 snRNAs의 무결성을 모니터링합니다.
  8. 미세 주입 전에 RNA를 10 μg/μl dextran-TRITC 70 kDa를 함유하는 물에 최종 농도 200 ng/mL로 희석합니다.

2. 세포

  1. 사용하기 전에 커버슬립을 1 HCl으로 1 시간 동안 다루고 증류수로 철저히 씻고 100 % 에탄올로 보관하십시오. 산성 처리는 주입 도중 또는 후에 세포 박리를 방지하기 위하여 세포 접착을 승진시냅니다. 주입 된 세포를 쉽게 식별할 수 있도록 그리드가있는 덮개 슬립을 사용하십시오.
  2. 종자 HeLa 또는 다른 부착 세포는 미세 주입 시 50 % 동률에 도달하기 위해 12 mm 커버 슬립 (1 번 또는 1.5 호)에 미세 주입 1 일 전에.

3. 주입

참고: HeLa 세포는 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (D-MEM, 4.5 g / L D-포도당 페놀 적색 및 항생제를 함유함)에서 미세 주입되었다. 분사는 멸균 바늘을 장착한 인젝터 및 마이크로조작자를 사용하여 수행하였다(자세한 내용은 재료표 참조). 전체 현미경/미세 조작기 시스템은 현미경 및 마이크로 인젝터의 개별 부분의 변동을 방지하기 위해 적어도 4 시간 동안 37 °C로 예열되었습니다.

  1. 2 mL의 배양 배지를 포함하는 페트리 접시(30 mm)를 중간에 커버슬립을 현미경홀더에 넣는다. 마이크로 로더를 사용하여 바늘에 snRNA 혼합물 3 μL을 로드합니다. 페트리 접시의 표면에 대하여 45°의 마이크로 인젝터 홀더에 바늘을 설치합니다.
  2. 바늘을 찾으려면 10배 의 장거리 목표를 사용하십시오. 먼저, 인젝터에 속도를 COARSE로 설정하고 배양 배지에 닿을 때까지 바늘을 낮춥시킵니다. 현미경 쌍안경을 사용하여 바늘이 배양 매체에 닿는 곳인 밝은 반점을 찾습니다.
  3. 속도를 FINE로 변경하고 바늘 끝이 관찰 될 때까지 현미경을 보면서 바늘을 더 낮춥니다. 시야 중간에 바늘을 이동하고 40 배 장거리 목표로 전환합니다.
  4. 목표를 변경한 후 셀을 선택하고 바늘을 이 세포 위로 이동합니다. 셀 접촉에 대한 압력과 시간을 설정합니다(토론의 팁 및 문제 해결 참조).
  5. 바늘을 셀로 이동한 다음 미세 조작기의 하한을 설정합니다. 바늘을 세포 아래로 움직이지 않도록 주의하십시오.
  6. 하한을 설정한 후 바늘을 셀 위로 뒤로 이동하고 인젝터의 조이스틱에서 주입 버튼을 누릅니다. 바늘은 한계가 설정된 장소로 세포 안쪽으로 자동이동하고 RNA 혼합물을 주입합니다.
  7. 완료하려면 인젝터의 버튼 MENU를 누르고 홀더에서 바늘을 제거합니다. 그런 다음 인젝터와 마이크로 매니더를 끄기 전에 인젝터에서 튜브를 분리합니다.

4. 세포 고정 및 염색

  1. 미세 주입 후, 세포를 CO2 인큐베이터로 되돌리고 1시간 동안 37°C에서 배양한다.
  2. 배양 후, 실온에서 인산완식염액(PBS)으로 세포를 3회 헹구고, 0.1 M PIPES pH 6.9에 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고치고, 실온 PBS로 3회 세척한다. snRNA 국소화만 분석되면, 잠시 물에 세포를 헹구고 DAPI를 가진 마운팅 매체에 장착하십시오.
  3. 추가적인 단백질 국소화의 경우, 실온에서 5분 동안 PBS에서 0.5% 트리톤-X100으로 세포를 투과시한다. PBS로 3 번 헹구고 나서, 1 차 및 이차 항체로 세포를 배양하고 PBS에서 최종 헹구고 물에 짧은 헹구고 DAPI를 장착 매체에 장착하십시오.

5. 현미경 검사법

  1. 장착 직후에 이미지화되지 않은 경우, 이미징이 될 때까지 슬라이드를 4°C로 보관하십시오.
  2. 침수 목표(60X 또는 100x/1.4NA)가 장착된 고급 형광 현미경 시스템을 사용하여 이미지를 수집합니다.
  3. 일단 미세 주입된 세포가 확인되면, 견본 당 200 nm z 단계와 20 z 단면도의 스택을 수집하고 수학 적인 deconvolution의 대상이 됩니다. 그런 다음 최대 투영 또는 개별 z 스택을 제시했습니다.
  4. 형광 신호를 정량화하려면 코일 면역 염색으로 확인된 카잘 몸 주위의 관심 영역(ROI)을 그립니다. 코일린 정의 ROI에서 snRNA 신호의 강도를 측정합니다. 다음으로 핵소동에 무작위로 배치된 ROI에서 의 snRNA 형광의 강도를 결정하고 카잘 체및 핵소플라즘에서 RNA 신호의 비율을 계산한다.

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Representative Results

snRNA 국소화 및 Cajal 바디 표적화에서 Sm 결합 부위의 역할을 모니터링하기 위해, 우리는 Sm 결합 부위를 형성하는 7개의 뉴클레오티드(AUUUUUG)가 결여된 T7 프로모터 및 전신 U2 snRNA 또는 U2 snRNA를 포함하는 DNA 템플릿을 준비하였다. snRNAs는 시험관 내 전사, 고립 및 TRITC 결합 된 덱스트란-70kDa와 혼합되었다. 우리는 체외에서 전사된 snRNA를 HeLa 세포의 핵 또는 세포질로 포함하는 혼합물을 미세주입했습니다.

그것은 이전에 Sm 바인딩 사이트가 핵 수입6에필요한 것으로 나타났습니다. Sm 부위가 Cajal 바디 축적을 위해 또한 중요한지 시험하기 위하여는, 우리는 핵으로 Sm 사이트를 결여된 snRNA를 마이크로주입했습니다 (그림1A). 세포질 내로의 주사는 대조군으로 작용하였다(도1B). 양성 대조군으로서, 우리는 전신 snRNA (그림1C,D)를 마이크로인드했다. CO2 인큐베이터에서 60분 간 배양한 후, 미세주입된 세포를 고정시키고 카잘 체 마커 코일린을 간접 면역형광에 의해 가시화시켰다. 전길이 snRNA는 핵 및 세포질 주사 후 카잘 체에 축적되었다. 대조적으로, SnRNA 결여된 SnRNA는 이 구획으로 미세 주입 후에 세포질에남아 있었고, 이는 이전 의견 6과 일치한다. Sm 부위없이 snRNA의 핵 미세 주사는 Sm 결합 서열이 Cajal 신체 국소화에 중요하다는 것을 밝혔다. Sm 부위가 결여된 U2 snRNA는 핵에 남아 있었지만카잘 체에 축적되지 않았다(도 1A).

때때로, 하나의 세포 구획내로의 미세 주입이 실패하고 TRICT-dextran-70kDa는 핵 및세포질 둘 다에서 발견되었다(도 2A). 이들 세포는 추가 분석으로부터 폐기되었다. 형광표지된 snRNAs가 주사 전에 -80°C에 저장된다는 사실에도 불구하고 RNA 분해가 발생할 수 있습니다. 세포질 내로 주입된 분해된 snRNA는 핵내로 수송되지 않고 세포질에서 국소화상태를유지한다(도 2B). 이러한 snRNA는 폐기되어야 하며, 새로운 snRNA는 합성되어야 한다.

Figure 1
그림 1: 미세 주입 된 snRNAs의 국소화. Alexa488-표지된 U2 snRNA는 Sm부위(A,B)또는 전신(C, D)이 결여되어 세포질 또는 HeLa 세포의 핵내로 미세주입되었다. 카잘 바디(화살표)는 코일린 면역라벨링(빨간색)으로 표시되어 있다. snRNAs는 녹색으로 묘사됩니다. 덱스트렌-TRITC-70kDa (노란색)는 핵 또는 세포질 주입을 모니터링하기 위해 사용되었고; DNA는 DAPI(파랑)에 의해 염색되었다. 화살촉은 snRNA의 세포질 국소화를 표시합니다. 배율 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 미세 주입 접근법의 잠재적인 함정. (a) 1개의 구획내로 미세주입이 실패하고 WT U2 snRNA를 세포질 및 핵 둘 다에 미세주입하였다. Dextran-TRITC-70kDa (노란색)는 두 셀룰러 구획에 존재한다는 점에 유의하십시오. (B) WT U2 snRNA는 HeLa 세포(녹색)의 세포질 내로 미세주입되었지만 상당한 양의 snRNA가 세포질(arrowheads)에 남아 있었으며, 이는 주입된 snRNA의 부분적인 분해 및 Sm 결합 부위의 손실을 나타낸다. 카잘 바디(화살표)는 코일린 면역 표지(빨간색)로 표시됩니다. DNA는 DAPI(파랑)에 의해 염색되었다. 배율 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 핵 카잘 바디로 snRNA 현지화를 위해 중요한 순서를 결정하기 위하여 형광표지된 snRNAs의 미세 주입을 이용했습니다. 라벨이 붙은 RNA의 신속하고 다소 간단한 제제로 인해 (PCR에 의한 DNA 템플릿의 준비와 시험관 내 전사) 이 방법은 다양한 서열이 RNA 국소화에 어떻게 기여하는지에 대한 효과적인 분석을 제공합니다. 비교적 짧은 시간에, 우리는 U2 snRNA의 10개의 상이한 삭제 또는 치환을 분석할 수 있었다(참조5 및 데이터가 나타내지 않음). 복잡한 생물 발생 경로를 가진 RNA를 위해, 이 접근은 또한 성숙을 위해 필수적인 시험 순서를 허용합니다. snRNA의 경우, SM 링 어셈블리에 필요한 SM 결합 서열의 결실은 세포질7에서돌연변이된 snRNAs의 격리 및 분해를 초래한다. 다른 유리한 것은 2개의 상이하게 표지된 RNA가 동시에 주입될 수 있고 그들의 현지화가 1개의 세포 내의 직접 비교될 수 있다는 것을 포함합니다. 그러나 다양한 불소가 RNA 동작을 수정할 수 있기 때문에 각 불소화는 이중 라벨링 실험 전에 개별을 테스트해야 합니다. 길이가 수백 개의 뉴클레오티드의 RNA가 성공적으로 주입되고 이들의 국소화가 다양한 모델시스템에서 분석되었다(참조 8에서 검토됨). 더 긴 RNA의 경우에 제한 단계는 일반적으로 전신 RNA의 시험관 내 합성입니다. 또한, 미리 조립된 단백질을 가진 RNA의 주입은 RNP 현지화에 개별 적인 단백질의 효력을 시험하기 위하여 적용될 수 있습니다. 우리의 프로젝트에서, 우리는 Cajal 바디 현지화에 있는 Sm 반지의 역할을 확인하기 위하여 Sm 단백질과 관련되었던 snRNA를 주입했습니다5. 마지막으로, 형광성 으로 표지된 RNA의 미세 주입은 이전에 snRNAs 9를 위해 적용된것과 같이 어떤 추가 단계 도 없이 직접 정량화를 허용합니다.

또한 미세 주입 프로젝트를 시작하기 전에 고려해야 할 방법의 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 미세 주입 공정의 일부 자동화에도 불구하고이 방법은 여전히 수동 기술과 경험이 필요하며 연구원은 교육에 필요한 시간을 고려해야합니다. 프로토콜의 중요한 부분은 그대로 RNA의 준비, 미세 주입 다음 현미경에서 주입 된 세포를 찾는 것입니다 (아래 팁 및 문제 해결 참조). 둘째, 미세 주사는 상당한 스트레스를 나타내며 많은 세포가 더 오랜 기간 동안 생존하지 못합니다. 살아있는 세포 화상 진찰10에의하여 세포 안쪽에 microinjected RNA를 따르는 몇몇 성공적인 시도가 있는 동안, 우리는 형광 현미경 검사법을 사용하여 살아있는 세포 화상 진찰과 마이크로 주입을 결합할 때 세포 죽음의 중요한 증가를 관찰했습니다. 셋째, 인간 세포에 주입 된 RNA의 양은 주입 된 RNA의 생화학적 분석을 방지하는 매우 낮습니다. 이것은 또한 형광표지된 뉴클레오티드의 혼입이 RNA 기능에 어떻게 영향을 미치는지 감시하는 것이 어렵다는 것을 의미합니다. 따라서, 라벨링된 NTP:NTP의 다양한 비율은 형광 신호와 표지된 RNA의 기능 사이의 이상적인 비율을 얻기 위해 야생형 RNA 및 그 국소화 분석에 통합되어야 한다. 또한, 불소의 특성은 RNA 국소화에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 손에, 알렉사488-UTP는 알렉사546-UTP보다 훨씬 더 일했다. 우리는 더 이상 이러한 차이 탐험 하지 않은, 하지만 한 가지 이유는 Alexa488에 비해 Alexa546의 더 큰 크기와 다른 모양이 될 수 있습니다.

함께 복용, RNA 미세 주입은 RNA 국소화를위한 강력한 방법이지만 항상 대체 접근법과 결합되어야한다. 우리의 경우에, 우리는 성공적으로 U2 snRNA에 MS2 결합 사이트를 소개하고, MS2-YFP를 사용하여 그것의 현지화를 감시하고 MS2시스템 5를 가진 snRNA 미세 주입에 의해 얻어진 몇몇 중요한 결과를 확인했습니다.

팁 및 문제 해결
사출 압력, 보상 압력 및 사출 시간은 각 세포주마다 실험적으로 결정되어야 합니다. 우리는 세포질 미세 주입및 Pi = 200 hPa 및 Pc = 80 hPa의 경우 핵 미세 주입의 경우 주입 압력 (Pi) 170 hPa 및 보상 압력 (Pc) 50 hPa를 적용했습니다. 주사 시간은 두 경우 모두 0.2s로 설정되었다. 때로는 세포 내부의 물질의 약간의 움직임을 관찰 할 수 있으며, 이는 성공적인 주사의 표시입니다. 세포가 파열되면 사출 압력을 줄이어야합니다. 또한 TRITC 형광 채널을 통해 보상 압력을 확인해야 합니다. 바늘 끝에서 강한 스트림이 나오는 것을 볼 때 보상 압력을 줄입니다.

주사 사이, 항상 세포가 성공적으로 주입 여부를 확인. TRITC 형광 채널을 사용하여 주입된 Dextran-TRITC를 통해 미세 주입 된 세포를 확인합니다. 미세 주입 된 세포가 보이지 않으면 먼저 주입 압력과 주입 시간을 늘리는 것입니다. 둘째, 바늘이 형광 채널 (TRITC)을 통해 연결되지 않은지 확인하십시오. Dextran-TRITC가 바늘 끝에서 약하게 스트리밍되는 것을 보면 바늘이 기능적이며 주입에 대한 하한의 설정에서 문제가 발생할 수 있습니다. 제한 설정은 매우 까다롭고 중요한 단계입니다. 각 세포는 다른 모양을 가지고 있으며 적절한 미세 주입을 보장하기 위해 한계를 매우 자주 변경해야합니다.

이상적인 경우에, 바늘의 끝이 세포 파편으로 연결되기 전에 ~ 50 세포를 마이크로 주입 할 수 있어야합니다. 팁에서 형광이 정기적으로 나오는지 확인하고 팁에서 Dextran-TRITC 스트리밍이 보이지 않으면 바늘이 차단됩니다. 청소하려면 인젝터의 CLEAN 버튼을 3s로 누르고 압력을 높이고 블록을 제거해야합니다. 도움이되지 않으면 페트리 접시의 바닥을 쳐서 바늘 끝을 부러 뜨리려고 시도 할 수 있습니다. 그러나 이것은 상당한 양의 경험이 필요하며 성공을 보장하지 않는 매우 까다로운 절차입니다. 따라서 초보자에게는 바늘 교환이 좋습니다.

바늘을 교환하기 전에 인젝터의 MENU 버튼을 누를 수 있습니다. 바늘을 조금 위로 가져 가서 마이크로 매니더서에 홈을 누릅니다. 바늘은 매체에서 위로 모든 방법을 갈 것입니다, 그러나 마이크로 매니터는 바늘의 원래 위치를 기억하고 당신은 바늘을 다시 찾을 필요가 없습니다. 바늘이 교체되면 HOME 버튼을 누르면 바늘이 원래 위치로 이동하여 현미경으로 바늘 끝을 볼 수 있어야합니다. 바늘을 변경 한 후, 당신은 한계를 조정해야합니다. 그런 다음 인젝터의 MENU 버튼을 다시 누르면 바늘이 미세 주입을 위해 준비됩니다.

화상 진찰 도중, 가장 까다로운 부분은 microinjected 세포를 찾아내기 입니다. 그들을 찾기 위해, TRITC-접합 Dextran-70kDa는 마이크로 주입 snRNA의 약한 Alexa488 신호보다 훨씬 더 잘 볼 곳 TRITC 채널을 사용합니다. 그리드가 있는 커버슬립은 여기에 도움이 됩니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 체코 과학 재단 (18-10035S), 국가 지속 가능성 프로그램 I (LO1419), 기관 지원 (RVO68378050), 유럽 지역 개발 기금 (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775)에 의해 지원되었습니다. 찰스 대학 (GAUK 134516). 우리는 또한 빛 현미경 코어 시설, IMG CAS, 프라하, 체코 (보조금에 의해 지원됩니다 (체코 - 바이오 이미징 - LM2015062)를 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42, (4), 2708-2724 (2014).
  2. Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14, (6), 671-679 (2017).
  3. Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
  4. Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
  5. Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46, (7), 3774-3790 (2018).
  6. Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12, (2), 573-583 (1993).
  7. Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111, (32), E3277-E3286 (2014).
  8. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20, (7), 380-390 (2010).
  9. Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17, (12), 4972-4981 (2006).
  10. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33, (6), 1902-1912 (2005).

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