Анализ Spliceosomal snRNA Локализация в клетках гели человека с использованием микроинъекции

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Биогенез spliceosomal snRNAs является сложным процессом с участием различных клеточных отсеков. Здесь мы использовали микроинъекцию флуоресцентно маркированных snRNAs для того, чтобы контролировать их транспортировку внутри клетки.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Биогенез spliceosomal snRNAs представляет собой сложный процесс, включающий как ядерные, так и цитоплазмические фазы, и последний шаг происходит в ядерном отсеке под названием тело Каджала. Однако последовательности, которые направляют локализацию snRNA в эту субнуклеарную структуру, не были известны до недавнего времени. Для определения последовательностей, важных для накопления snRNA в телах Cajal, мы использовали микроинъекции флуоресцентно помечены snRNAs следуют их локализации внутри клеток. Во-первых, мы подготовили snRNA удаления мутантов, синтезированные шаблоны ДНК для транскрипции в пробирке и транскрибированные snRNAs в присутствии UTP в сочетании с Alexa488. Маркированные snRNAs были смешаны с 70 kDa-Dextran спрягались с TRITC, и микровводили к ядру или цитоплазме клеток человека HeLa. Клетки были инкубированы в течение 1 ч и фиксированной и cajal маркер каулин был визуализирован косвенным иммунофлуоресценции, в то время как snRNAs и dextran, который служит маркером ядерной или цитоплазматической инъекции, наблюдались непосредственно с помощью флуоресценционного микроскопа. Этот метод позволяет эффективно и быстро проверить, как различные последовательности влияют на локализацию РНК внутри клеток. Здесь мы показываем важность Последовательности Sm-связывания для эффективной локализации snRNAs в тело Cajal.

Introduction

РНК сращивания является одним из важнейших шагов в экспрессии генов, который катализируются большой рибонуклеопротеин комплекс называется spliceosome. В общей сложности, более 150 белков и 5 небольших ядерных РНК (SnRNAs) интегрированы в spliceosome на различных стадиях сплайсинга пути. U1, U2, U4, U5 и U6 snRNA участвуют в сращивании крупных интронов GU-AG. Эти snRNAs присоединиться к spliceosome как предварительно сформированные небольшие частицы ядерного рибонуклеопротеина (snRNPs), которые содержат snRNA, семь Sm белков, связанных с snRNA (или Like-Sm белков, которые ассоциируются с U6 snRNA) и 1-12 белков, специфичных для каждого snRNP.

Сборка snRNPs включает цитоплазмамические и ядерные этапы. Недавно транскрибируемая snRNA экспортируется в цитоплазму, где она приобретает кольцо, собранное из семи белков Sm. Кольцо Sm впоследствии служит сигналом для повторного импорта snRNA обратно в ядро. Дефектные snRNAs, которые не связаны с белками Sm сохраняются в цитоплазме1. Недавно импортированные snRNPs впервые появляются в организме Cajal, где они отвечают snRNP-специфических белков и закончить их созревания (рассмотрено в ссылке2,3). Недавно мы показали, что ингибирование окончательных шагов созревания приводит к секвестрации незрелых snRNPs в телах Cajal4,5. Мы предложили модель, в которой окончательное созревание snRNP находится под контролем качества, который отслеживает добавление белков, специфических snRNP, и формирование активных snRNPs. Однако молекулярные детали того, как клетки различают правильно собранные зрелые и аномальные незрелые частицы, остаются неуловимыми.

Для определения последовательностей snRNA, которые необходимы для ориентации и накопления snRNAs в ядерных телах Cajal, мы решили использовать микроинъекцию флуоресцентно маркированных snRNAs. Микроинъекция была методом выбора, потому что: 1) она не требует дополнительной последовательности тега, чтобы различать синтетические snRNAs форме их эндогенных аналогов, что особенно важно для коротких РНК с небольшим пространством для включения дополнительных последовательность тегов; 2) он позволяет анализе последовательностей, которые важны для биогенеза. Например, последовательность Sm имеет важное значение для сборки кольца Sm и реимпорта в ядро6. Когда snRNAs выражены в клетке, snRNAs не хватает Sm последовательность деградируют в цитоплазме и не достигают ядра и Cajal органов7. Тем не менее, snRNAs без последовательности Sm может быть непосредственно микровисван в ядро и, таким образом, потенциальную роль последовательности Sm в локализации тела Cajal анализ.

Здесь мы подробно описываем метод микроинъекций, который мы применили для определения последовательностей snRNA, необходимых для целевой snRNAs в тело Cajal5. Мы показали, что Sm и SMN связывания сайты вместе необходимы и достаточны для локализации не только snRNAs, но различные короткие некодирования РНК в тело Cajal. Основываясь на микроинъекциях, а также других доказательствах, мы предположили, что кольцо Sm, собранное на месте связывания Sm, является сигналом локализации тела Cajal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка срнНА для микроинъекций

  1. Подготовьте шаблон ДНК, содержащий полнометражную или усеченную/мутировавую версию snRNA по PcR, используя следующую установку ПЦР: 98 градусов по Цельсию для 60 с, 98 градусов по Цельсию для 15 с, 68 градусов по Цельсию на 30 с, 72 кс на 1 мин, 98 градусов по Цельсию для 15 s для 35x , и 72 кк в течение 5 мин.
  2. Передняя грунтовка должна содержать последовательность промоутера для транскрипции in vitro только вверх по течению первого транскрибированного нуклеотида. Усиль u2 snRNA последовательности с помощью переднего грунтовки, содержащей промоутер T7 и обратный грунтовка, которая заканчивается с последней транскрибированной нуклеотидов (см. Таблица материалов для деталей).
  3. Синтезировать snRNA с помощью комплекта для короткого синтеза РНК (см. Таблица материалов для деталей), содержащих T7 РНК-полимераза. Добавить 1 мМ АТП, 1 мМ CTP, 1 мМ GTP, 0,8 мМ UTP, 0,2 мМ UTP-Alexa488, 1,8 мм триметилгуанозин колпачок аналог (m32,2,7G (5')ppp (5')G), 1 мл ингибитора РНК и 500-700 нг шаблона ДНК в реакционную смесь и в ночь на 3.
  4. Добавьте 1 кЛ (2U) DNase в реакцию и инкубировать в течение дополнительных 15 минут при 37 градусах Цельсия.
  5. Изолировать snRNA путем экстракта кислой фенола/хлороформа. Удалите верхнюю фазу воды и добавьте 1/10 исходного объема 3 М ацетата натрия (рН 5,2), 3 Л гликогена для лучшей визуализации гранул и 2,5 тома 100% этанола. Инкубировать в течение 1 ч при -80 градусах По цельсии, центрифуге в течение 10 мин при 14 000 х г и 4 градусах Цельсия.
  6. Вымойте гранулы с 70% этанола и растворить в 12 зл и без нуклеазы воды. Обычный выход РНК был около 600 нг/мл. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
  7. Мониторинг целостности in vitro транскрибированных snRNAs агарозным гелем электрофорезами.
  8. Перед микроинъекцией разбавить РНК до конечной концентрации 200 нг/мл в воде, содержащей 10 мкг/л dextran-TRITC 70 кДА.

2. Клетки

  1. Перед использованием, лечить крышки с 1 M HCl в течение 1 ч, тщательно промыть в дистиллированной воде и хранить в 100% этанола. Кислотное лечение способствует спарению клеток, чтобы предотвратить клеточный пилинг во время или после инъекции. Для облегчения идентификации инъекционных клеток используйте крышку с сеткой.
  2. Семена HeLa или других клеток адептов за 1 день до микроинъекции на 12 мм крышки (No 1 или No 1.5) достигают 50% стопроцентности во время микроинъекции.

3. Инъекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HeLa были микровводились в модифицированный eagle Medium Dulbecco (D-MEM, 4.5 г/L D-глюкозы, содержащей фенол красный и антибиотики). Инъекция проводилась с помощью инжектора и микроманипулятора, оснащенного стерильной иглой (подробнее см. Таблицу Материалов). Вся микроскопическая/микроманипуляторная система была предварительно нагрета до 37 градусов по Цельсию в течение по крайней мере 4 ч для предотвращения колебаний отдельных частей микроскопа и микроинжектора.

  1. Положите чашку Петри (30 мм), содержащую 2 мл культурных носителей с обложкой в середине в держатель микроскопа. Загрузите 3 злимых срнРН смеси в иглу с помощью микрозагрузчика. Установите иглу в держатель микроинжектора в 45 "по отношению к поверхности чашки Петри.
  2. Чтобы найти иглу, используйте 10-раз дальний объектив. Во-первых, установите скорость COARSE на инжектор и опустите иглу, пока она не коснется среды культуры. Используя бинокули микроскопа, найдите яркое пятно, которое является местом, где игла касается культуры среды.
  3. Изменение скорости на FINE и дальнейшего снижения иглы при взгляде в микроскоп, пока кончик иглы наблюдается. Переместите иглу в середине поля зрения и переключитесь на 40-ю цель на большие расстояния.
  4. После изменения цели, выберите ячейку и переместить иглу над этой клеткой. Установите давление и время для контакта клетки (см. Советы и устранение неполадок в обсуждении).
  5. Переместите иглу вниз в ячейку, а затем установите нижний предел на микроманипуляторе. Будьте осторожны, чтобы не переместить иглу ниже клетки.
  6. После установки нижнего предела, переместить иглу обратно выше клетки и нажмите кнопку инъекции на джойстик инжектор. Игла автоматически перемещается внутри клетки к месту, где установлен предел, и вводит РНК-смесь.
  7. Чтобы закончить, нажмите кнопку MENU на инжектор и удалить иглу из держателя. Затем отключите трубку от инжектора, прежде чем выключить инжектор и микроманипулятор.

4. Фиксация и окрашивание клеток

  1. После микроинъекции верните клетки в инкубатор CO2 и инкубируют при 37 градусах по Цельсию в течение 1 ч.
  2. После инкубации, промыть клетки три раза с фосфатом буферного солей (PBS) при комнатной температуре, исправить в течение 20 мин с 4% параформальдегида в 0,1 м PIPES pH 6,9, и мыть три раза с комнатной температурой PBS. Если анализировать только локализацию snRNA, ненадолго промойте клетки в воде и установите в монтажной среде с помощью DAPI.
  3. В случае дополнительной локализации белка, permeabilize клетки с 0,5% Triton-X100 в PBS в течение 5 минут при комнатной температуре. После трех полосканий с PBS, инкубировать клетки с первичными и вторичными антителами и после окончательного мойка в PBS и краткопромыть в воде, монтировать в монтажной среде с DAPI.

5. Микроскопия

  1. Если не изображен сразу после монтажа, хранить слайды на 4 градусов по Цельсию до изображения.
  2. Приобретайте изображения с помощью высококлассной микроскопической системы флуоресценции, оснащенной целью погружения (60X или 100x/1.4NA).
  3. После того, как микроинъекционные клетки определены, собрать стек из 20 z-секций с 200 нм z шаги на образец и при условии математического деконволуции. Затем были представлены максимальные прогнозы или отдельные стеки z.
  4. Чтобы количественно флуоресцентный сигнал, нарисуйте Регион интереса (ROI) вокруг тела Cajal, идентифицированного путем иммуностоинга катушки. Измерьте интенсивность сигнала snRNA в определяемой катушки рентабельности инвестиций. Далее определите интенсивность флуоресценции snRNA в рентабельности инвестиций случайным образом помещается в нуклеоплазму и вычисляйте соотношение РНК-сигнала в теле Каджаля и нуклеоплазме.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для мониторинга локализации snRNA и роли сайта связывания Sm в таргетинге тела Cajal, мы подготовили шаблон ДНК, содержащий промоутер T7 и либо полнометражный U2 snRNA или U2 snRNA, не хватает семи нуклеотидов (AUUUUG), образующих сайт связывания Sm. snRNAs были в пробирке транскрибированы, изолированы и смешаны с TRITC-связанных dextran-70kDa. Мы микровводили смесь, содержащую in vitro транскрибированной snRNA в ядро или цитоплазму клеток HeLa.

Ранее было показано, что Sm binding сайт необходим для ядерного импорта6. Чтобы проверить, является ли sm сайт также имеет важное значение для накопления тела Cajal, мы микроинъекционных snRNA не хватает Sm сайт непосредственно в ядро(Рисунок 1A). Инъекции в цитоплазму служили элементом контроля(рисунок 1B). В качестве положительного контроля, мы микроинъекционных полнометражный snRNA(Рисунок 1C,D). После 60 минут инкубации в инкубаторе CO 2, микроинъекционные клетки были зафиксированы и катушки маркера тела Cajal был визуализирован косвенным иммунофлуоресценции. Полноразмерная срнНА, накопленная в телах Каджала после ядерных и цитоплазмических инъекций. В отличие от этого, snRNA не хватает Sm сайт остался в цитоплазме после микроинъекции в этом отсеке, который согласуется с предыдущими выводами6. Ядерная микроинъекция snRNA без места Sm показала, что связывающая последовательность Sm важна для локализации тела Cajal. U2 snRNA не хватает Sm сайт остался в ядре, но не накапливаются в телах Cajal (Рисунок 1A).

Иногда микроинъекция только в один клеточный отсек не удалось и TRICT-dextran-70kDa был найден как в ядре и цитоплазмы(рисунок 2A). Эти клетки были удалены из дальнейшего анализа. Несмотря на то, что флуоресцентно маркированные snRNAs хранятся при -80 градусов по Цельсию до инъекции, деградация РНК может произойти. Деградированная snRNA впрыскивается в цитоплазму не транспортируется в ядро и остается локализованной в цитоплазме(рисунок 2B). Такая snRNA должна быть отброшена, и новая snRNA должна быть синтезирована.

Figure 1
Рисунок 1: Локализация микроинъекционных сРНК. Alexa488 помечены U2 snRNA либо не хватает Sm сайте (A,B) или полнометражный (C,D) были микровводили в цитоплазму или ядро клеток HeLa. Тела каджала (стрелки) отмечены иммуномаркировкой катушки (красный); snRNAs изображены зеленым цветом. Для мониторинга ядерных или цитоплазмических инъекций использовался Dextran-TRITC-70kDa (желтый); ДНК была запятнана DAPI (синий). Стрелы отмечают цитоплазмамическую локализацию snRNA. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Потенциальная ловушка подхода микроинъекций. (A) Микроинъекция в один отсек не удалось и WT U2 snRNA был микровведен в цитоплазму и ядро. Обратите внимание, что Dextran-TRITC-70kDa (желтый) присутствует в обоих сотовых отсеках. (B) WT U2 snRNA был микровведен в цитоплазму клеток HeLa (зеленый), но значительное количество snRNA осталось в цитоплазме (стрелка), что указывает на частичную деградацию инъекционных snRNA и потерю Места связывания Sm. Тела каджала (стрелки) отмечены иммуномаркировкой катушки (красный). ДНК была запятнана DAPI (синий). Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы использовали микроинъекцию флуоресцентно маркированных snRNAs для определения последовательностей, важных для локализации snRNA в ядерные тела Cajal. Благодаря быстрой и довольно простой подготовке маркированных РНК (подготовка шаблона ДНК ПЦР с последующим транскрипцией in vitro) метод предлагает эффективный анализ того, как различные последовательности способствуют локализации РНК. За относительно короткое время мы смогли проанализировать десять различных удаления или замены U2 snRNA (ссылка5 и данные не показаны). Для РНК со сложным биогенезом, этот подход также позволяет тестирования последовательностей, которые необходимы для созревания. В случае snRNAs удаление последовательности связывания Sm, которые необходимы для сборки кольца Sm, приводит к секвестру и деградации мутировавших snRNA в цитоплазме7. Другие выгодные включают в себя, что два по-разному помечены РНК могут быть введены одновременно и их локализации непосредственно по сравнению в одной ячейке. Однако, поскольку различные фторхромы могут изменить поведение РНК, каждый флюорохром должен быть протестирован индивидуально перед экспериментами двойной маркировки. РНК длиной в несколько сотен нуклеотидов были успешно введены, а ихлокализация проверена в различных модельных системах (рассмотрено в ссылке 8). Ограничивающим шагом в случае более длинных РНК обычно является в ипроцосьмысинтез полной длины РНК. Также для проверки влияния отдельных белков на локализацию РНК можно применять инъекции РНК с предварительно собранными белками. В наших проектах, мы вводили snRNA, связанные с белками Sm, чтобы подтвердить роль кольца Sm в локализации тела Cajal5. Наконец, микроинъекция флуоресцентно маркированных РНК позволяет прямую количественную оценку без каких-либо дополнительных шагов, как это было ранее применено для snRNAs9.

Есть также несколько недостатков методов, которые следует рассмотреть перед запуском проекта микроинъекций. Во-первых, несмотря на некоторую автоматизацию процесса микроинъекций, метод по-прежнему требует ручных навыков и опыта, и исследователи должны рассмотреть время, необходимое для обучения. Критическими частями протокола являются подготовка нетронутых РНК, микроинъекция, а затем поиск инъекционных клеток в микроскоп (см. Советы и Устранение неполадок ниже). Во-вторых, микроинъекция представляет собой значительный стресс, и многие клетки не выживают в течение более длительного периода времени. Хотя Есть некоторые успешные попытки следовать микроинъекционных РНК внутри клеток с помощью живой клетки изображения10, мы наблюдали значительное увеличение клеточной смерти, когда мы объединили микроинъекции с живой клеточной визуализации с помощью флуоресценции микроскопии. В-третьих, количество инъекционной РНК в клетки человека очень низкое, что предотвращает биохимический анализ инъекционных РНК. Это также означает, что трудно контролировать, как включение флуоресцентно маркированных нуклеотидов влияет на функции РНК. Таким образом, различные соотношения маркировки-NTP:NTP должны быть включены в РНК дикого типа и его локализации анализ, чтобы получить идеальное соотношение между сигналом флуоресценции и функциональность помеченной РНК. Кроме того, характер фторхрома может повлиять на локализацию РНК. В наших руках Alexa488-UTP работал гораздо лучше, чем Alexa546-UTP. Мы не исследовали эти различия дальше, но одна из причин может быть большего размера и различной формы Alexa546 по сравнению с Alexa488.

В совокупности микроинъекция РНК является мощным методом локализации РНК, но всегда должна сочетаться с альтернативными подходами. В нашем случае мы успешно внедрили MS2-связывающий сайт в U2 snRNA, проконтролировали его локализацию с помощьюMS2-YFP и подтвердили некоторые ключевые результаты, полученные с помощью микроинъекции snRNA с системой MS2 5.

Советы и устранение неполадок
Давление инъекций, давление компенсации и время инъекции должны быть определены экспериментально для каждой линии клеток. Мы применили давление инъекций (Pi) 170 hPa и компенсационное давление (Pc) 50 hPa в случае цитоплазмической микроинъекции и Pi'200 hPa и Pc'80 hPa в случае ядерной микроинъекции. Время инъекции в обоих случаях было установлено на 0,2 с. Иногда можно наблюдать небольшое движение материала внутри клетки, что является признаком успешной инъекции. Если клетка лопается, вы должны уменьшить давление инъекций. Вы также должны проверить давление компенсации через канал флуоресценции TRITC. Когда вы видите сильный поток выходит из кончика иглы, а затем уменьшить давление компенсации.

Между инъекциями, всегда проверяйте, успешно ли вводятся клетки. Определите микроинъекционные клетки с помощью инъекционных Dextran-TRITC с помощью флаоресцентного канала TRITC. Если вы не видите каких-либо микроинъекционных клеток, сначала увеличить давление инъекций и время инъекции. Во-вторых, проверьте, не подключена ли игла через флуоресцентный канал (TRITC). Если вы видите Dextran-TRITC слабо потокового от кончика иглы, то игла является функциональным, и проблема, скорее всего, в установлении нижнего предела для инъекции. Установление лимита является очень сложным и важным шагом. Каждая клетка имеет различную форму, и вы будете менять предел очень часто, чтобы обеспечить правильную микроинъекцию.

В идеальном случае, нужно быть в состоянии микро-инъекций 50 клеток, прежде чем кончик иглы подключен с мусором клетки. Проверьте, если флуоресценция выходит из кончика регулярно, и если вы не видите каких-либо Dextran-TRITC потокового из кончика, то игла блокируется. Чтобы очистить его, держите кнопку CLEAN на инжекторе в течение 3 с, что увеличивает давление и должен удалить блок. Если это не поможет, то вы можете попытаться разорвать кончик иглы, попав в нижней части чашки Петри. Однако это очень сложная процедура, которая требует значительного опыта и нет никакой гарантии успеха. Поэтому, для начинающих, обмен иглы рекомендуется.

Перед обменом иглы нажмите кнопку MENU на инжектор. Возьмите иглу немного вверх и нажмите домой на микроманипулятор. Игла будет идти весь путь от среды, но микроманипулятор помнит исходное положение иглы, и вам не нужно, чтобы найти иглу снова. Когда игла заменена, нажмите кнопку HOME и игла пойдет в исходное положение, и вы должны быть в состоянии видеть кончик иглы в микроскоп. После смены иглы, вы должны настроить предел. Затем нажмите кнопку MENU на инжектор снова и иглы готовится для микроинъекции.

Во время визуализации, самая сложная часть заключается в том, чтобы найти микроинъекционные клетки. Чтобы найти их, используйте канал TRITC, где TRITC-конъюгированный Dextran-70kDa гораздо лучше виден, чем слабый сигнал Alexa488 микроинъекционных snRNAs. Обложки с сеткой полезны здесь.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Чешским научным фондом (18-10035S), Национальной программой устойчивого развития I (LO1419), институциональной поддержкой (RVO68378050), Европейским фондом регионального развития (К.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775) и Грантовое агентство Карлов университет (GAUK 134516). Мы также признаем, свет микроскопии Core фонда, IMG CAS, Прага, Чешская Республика (при поддержке грантов (Чешская-Биоизображение - LM2015062).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42, (4), 2708-2724 (2014).
  2. Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14, (6), 671-679 (2017).
  3. Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
  4. Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
  5. Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46, (7), 3774-3790 (2018).
  6. Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12, (2), 573-583 (1993).
  7. Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111, (32), E3277-E3286 (2014).
  8. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20, (7), 380-390 (2010).
  9. Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17, (12), 4972-4981 (2006).
  10. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33, (6), 1902-1912 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics