Analyse av Spliceosomal snRNA lokalisering i Human Hela Cells bruke Microinjection

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Kognitiv av Spliceosomal snRNAs er en kompleks prosess som involverer ulike cellulære rom. Her har vi benyttet microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs for å overvåke deres transport inne i cellen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kognitiv av Spliceosomal snRNAs er en kompleks prosess som involverer både kjernefysiske og cytoplasmatiske faser, og det siste steget skjer i et kjernefysisk rom kalt Cajal kroppen. Men sekvenser som direkte snRNA lokalisering i denne subnuclear strukturen har ikke vært kjent før nylig. For å finne sekvenser som er viktige for akkumulering av snRNAs i Cajal-organer, brukte vi microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs etterfulgt av deres lokalisering i celler. Først forberedte vi snRNA sletting mutanter, syntetisert DNA maler for in vitro transkripsjon og transkribere snRNAs i nærvær av UTP kombinert med Alexa488. Merket snRNAs ble blandet med 70 kDa-Dextran bøyd med TRITC, og microinjected til kjernen eller cytoplasma av menneskelige HeLa celler. Celler ble inkubert for 1 t og fast og Cajal Body markør Marianne ble sett på av indirekte immunofluorescence, mens snRNAs og dextran, som fungerer som en markør for kjernefysisk eller cytoplasmatiske injeksjon, ble observert direkte ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Denne metoden gjør det mulig for effektiv og rask testing av hvordan ulike sekvenser påvirker RNA lokalisering inne i cellene. Her viser vi viktigheten av SM-bindende sekvens for effektiv lokalisering av snRNAs i Cajal kroppen.

Introduction

RNA skjøting er en av de avgjørende trinnene i genuttrykk, som er katalysert av et stort ribonucleoprotein kompleks kalt spliceosome. Totalt er mer enn 150 proteiner og 5 små kjernefysiske RNAs (snRNAs) integrert i spliceosome på ulike stadier av skjøting veien. U1, U2, U4, U5 og U6 snRNAs deltar i skjøting av store GU-AG introns. Disse snRNAs delta i spliceosome som pre-formet små kjernefysiske ribonucleoprotein partikler (snRNPs) som inneholder snRNA, syv SM proteiner forbundet med snRNA (eller like-SM proteiner, som forbinder med U6 snRNA) og 1-12 proteiner spesifikke for hver snRNP.

Montering av snRNPs innebærer cytoplasmatiske og kjernefysiske stadier. Nylig transkribere snRNA eksporteres til cytoplasma der den får en ring montert fra syv SM proteiner. Den SM ringen senere fungerer som et signal for snRNA re-import tilbake til kjernen. Defekt snRNAs som ikke klarer å assosiere med SM proteiner er beholdt i cytoplasma1. Nylig importerte snRNPs først vises i Cajal kroppen der de møter snRNP-spesifikke proteiner og fullføre sin modning (gjennomgått i referanse2,3). Vi har nylig viste at hemming av siste modning trinn resulterer i opptak av umodne snRNPs i Cajal organer4,5. Vi foreslo en modell der den endelige snRNP modning er under kvalitetskontroll som overvåker tillegg av snRNP-spesifikke proteiner og dannelsen av aktive snRNPs. Men molekylære detaljer om hvordan celler skille mellom riktig montert modne og avvikende umodne partikler forblir unnvikende.

For å bestemme snRNA sekvenser som er avgjørende for målretting og akkumulering av snRNAs i kjernefysiske Cajal organer, bestemte vi oss for å ansette microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs. Microinjection var en metode for valg fordi: 1) det krever ikke en ekstra sekvens kode for å skille syntetiske snRNAs danne sine endogene kolleger som er spesielt viktig for korte RNAs med liten plass for innsetting av ekstra kodesekvens; 2) det tillater analyse av sekvenser som er viktige for kognitiv. For eksempel er SM sekvensen viktig for SM ring montering og re-import til kjernen6. Når snRNAs er uttrykt i cellen, snRNAs mangler SM sekvensen er degradert i cytoplasma og ikke nå kjernen og Cajal organer7. Men snRNAs uten SM sekvensen kan direkte microinjected inn i kjernen og dermed en potensiell rolle SM sekvensen i Cajal kroppen lokalisering analyseres.

Her beskriver vi i detalj en microinjection metode som vi brukte for å fastslå snRNA-sekvenser som er nødvendige for å målrette snRNAs inn i Cajal-legemet5. Vi viste at SM og SMN bindende nettsteder er sammen nødvendig og tilstrekkelig til å lokalisere ikke bare snRNAs men ulike korte ikke-koding RNAs inn i Cajal kroppen. Basert på microinjection så vel som andre bevis, foreslo vi at SM ringen montert på SM bindende området er Cajal kroppen lokalisering signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av snRNAs for Microinjection

  1. Forbered en DNA-mal som inneholder full-lengde eller avkortet/mutert versjon av snRNA av PCR ved hjelp av følgende PCR-oppsett: 98 ° c for 60 s, 98 ° c for 15 s, 68 ° c for 30 s, 72 ° c i 1 min, 98 ° c for 15 s for 35x og 72 ° c i 5 min.
  2. Den fremover primer må inneholde en promoter sekvens for in vitro transkripsjon bare oppstrøms av de første transkripsjon nukleotid. Forsterk U2 snRNA sekvens ved å bruke frem primer som inneholder T7 promoter og omvendt primer, som slutter med den siste nukleotid (se tabell over materialer for detaljer).
  3. Syntetisere snRNA ved hjelp av et sett for kort RNA-syntese (se tabell over materialer for detaljer) som inneholder T7 RNA-polymerase. Tilsett 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine cap analog (M32, 2, 7G (5 ') PPP (5 ') g), 1 ml av en RNA inhibitor og 500-700 ng av DNA-malen til reaksjonsblandingen og ruge ved 37 ° c over natten.
  4. Tilsett 1 μL (2U) av DNase i reaksjonen og ruge i ytterligere 15 minutter ved 37 ° c.
  5. Isoler snRNA ved syrlig fenol/kloroform-ekstraksjon. Fjern den øverste vannfasen og tilsett 1/10 av det opprinnelige volumet på 3 M natrium acetate (pH = 5,2), 3 μL av glykogen for bedre pellets visualisering og 2,5 volumer av 100% etanol. Ruge for 1 h ved-80 ° c, sentrifuge for 10 min ved 14 000 x g og 4 ° c.
  6. Vask pellet med 70% etanol og oppløses i 12 μL av nuklease vann. Den vanlige RNA-avkastningen var rundt 600 ng/mL. Store ved-80 ° c.
  7. Overvåk integriteten til in vitro-snRNAs ved agarose gel-electrophoreses.
  8. Før microinjection, fortynne RNA til den endelige konsentrasjonen 200 ng/mL i vann som inneholder 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa.

2. celler

  1. Før bruk, behandle coverslips med 1 M HCl for 1 time, vask grundig i destillert vann og oppbevar i 100% etanol. Syrlig behandling fremmer celler vedheft for å hindre celle peeling under eller etter injeksjon. For enklere identifisering av injisert celler, kan du bruke en dekkglass med et rutenett.
  2. Seed HeLa eller andre tilhenger celler 1 dag før microinjection på 12 mm coverslips (nr. 1 eller no. 1,5) for å nå 50% confluency på tidspunktet for microinjection.

3. injeksjon

Merk: Jakten celler ble microinjected i Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (D-MEM, 4,5 g/L D-glukose som inneholder fenol rød og antibiotika). Injeksjon ble utført ved hjelp av en injeksjons og en micromanipulator utstyrt med den sterile nålen (se tabell over materialer for detaljer). Hele det mikroskopiske/micromanipulator systemet ble forvarmet til 37 ° c i minst 4 timer for å forhindre svingninger i de enkelte delene av mikroskopet og microinjector.

  1. Sett Petri parabolen (30 mm) inneholder 2 mL av kultur Media med dekkglass i midten inn i holderen av mikroskopet. Legg 3 μL av snRNA-blanding inn i nålen ved hjelp av en microloader. Monter nålen i holderen til microinjector i 45 ° med hensyn til overflaten av Petri parabolen.
  2. For å finne nålen, bruk en 10x langdistanse objektiv. Først setter du hastigheten grov på injeksjons og senke nålen til den berører kultur medium. Ved å bruke kikkerten for mikroskop finner du den lyse flekken, som er stedet hvor nålen berører kultur mediet.
  3. Endre hastigheten til fin og ytterligere senke nålen mens du ser inn i mikroskopet til tuppen av nålen er observert. Beveg nålen midt på synsfeltet og Bytt til en 40x langdistanse objektiv.
  4. Når du har endret målsettingen, merker du cellen og flytter nålen over denne cellen. Angi trykk og tid for celle kontakten (se tips og feilsøking i diskusjonen).
  5. Flytt nålen ned i cellen og sett deretter nedre grense på micromanipulator. Vær forsiktig så du ikke flytter nålen under cellen.
  6. Etter at du har angitt nedre grense, flytter du nålen over cellen og trykker på injeksjonsknappen på styrespaken til injeksjonsstedet. Nålen beveger seg automatisk inne i cellen til stedet der grensen er satt og injiserer RNA-blandingen.
  7. For å avslutte, trykk på knappe menyen på injeksjons ren og fjern nålen fra holderen. Koble deretter slangen fra injeksjons enheten før du slår av injeksjons-og micromanipulator.

4. celle fiksering og farging

  1. Etter microinjection, returner cellene til en CO2 inkubator og ruge ved 37 ° c for 1 t.
  2. Etter inkubasjons, skyll cellene tre ganger med fosfat bufret saltvannsoppløsning (PBS) ved romtemperatur, fastsette for 20 min med 4% paraformaldehyde i 0,1 M rør pH 6,9, og vask tre ganger med romtemperatur PBS. Hvis bare snRNA lokalisering er analysert, en kort skylle cellene i vann og montere i et monterings medium med DAPI.
  3. I tilfelle av ytterligere protein lokalisering, permeabilize cellene med 0,5% Triton-X100 i PBS i 5 min ved romtemperatur. Etter tre skyllinger med PBS, ruge cellene med primære og sekundære antistoffer og etter siste vasker i PBS og kort skyll i vann, montere i et monterings medium med DAPI.

5. mikroskopi

  1. Hvis den ikke blir avbildet umiddelbart etter montering, skal du oppbevare lysbildene ved 4 ° c til bildebehandling.
  2. Tilegne seg bilder ved hjelp av et high-end fluorescens mikroskopisk system utstyrt med en nedsenking objektiv (60X eller 100/1.4 NA).
  3. Når microinjected celler er identifisert, samle en stabel med 20 z-seksjoner med 200 NM z trinn per prøve og gjenstand for matematiske deconvolution. Maksimalt anslag eller individuelle z stabler ble deretter presentert.
  4. For å kvantifisere fluorescerende signaler, tegner du region av interesse (ROI) rundt en Cajal kropp identifisert av Marianne immunostaining. Mål intensiteten i snRNA-signalet i den Marianne AVKASTNINGEN. Neste bestemme intensiteten av snRNA fluorescens i AVKASTNINGEN tilfeldig plassert i nucleoplasm og beregne forholdet mellom RNA signal i Cajal kropp og nucleoplasm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å overvåke snRNA lokalisering og rollen til SM bindende nettsted i Cajal kroppen målretting, forberedte vi en DNA mal som inneholder T7 promoter og enten full-lengde U2 snRNA eller U2 snRNA mangler de syv nukleotider (AUUUUUG) danner SM bindende området. snRNAs var in vitro skrives, isolert og blandet med TRITC-kombinert dextran-70kDa. Vi microinjected blandingen som inneholder in vitro skrives snRNA inn i kjernen eller cytoplasma av HeLa celler.

Det har tidligere blitt vist at SM bindende området er nødvendig for kjernefysisk import6. For å teste om SM nettstedet er også viktig for Cajal kroppen akkumulering, microinjected vi snRNA mangler SM området direkte inn i kjernen (figur 1a). Injeksjon i cytoplasma fungert som en kontroll (figur 1B). Som en positiv kontroll, microinjected vi full lengde snRNA (figur 1C,D). Etter 60 min av inkubasjons i en CO2 inkubator, microinjected celler ble fikset og Cajal Body markør Marianne ble visualisere av indirekte immunofluorescence. The full-length snRNA akkumulert i Cajal organer etter både kjernefysiske og cytoplasmatiske injeksjoner. I kontrast, snRNA mangler SM området forble i cytoplasma etter microinjection inn i dette rommet, som er forenlig med tidligere funn6. Den kjernefysiske microinjection av snRNA uten SM området avslørte at SM bindende sekvensen er viktig for Cajal kroppen lokalisering. U2 snRNA mangler SM området forble i kjernen, men ikke akkumuleres i Cajal organer (figur 1a).

Noen ganger, microinjection i bare en cellulær kupé mislyktes og TRICT-dextran-70kDa ble funnet i både kjernen og cytoplasma (figur 2a). Disse cellene ble forkastet fra videre analyse. Til tross for at fluorescensmerkete merket snRNAs er lagret ved-80 ° c før injeksjonen, kan RNA-degradering forekomme. Degradert snRNA injisert i cytoplasma ikke transporteres inn i kjernen og forblir lokalisert i cytoplasma (figur 2b). Slike snRNA skal kastes, og nye snRNA bør være syntetisert.

Figure 1
Figur 1: lokalisering av Microinjected snRNAs. Alexa488-merket U2 snRNA enten mangler SM nettstedet (A,B) eller full lengde (C,D) ble microinjected inn i cytoplasma eller kjernen av HeLa celler. Cajal kropper (piler) er merket med Marianne immunolabeling (rød); snRNAs er avbildet i grønt. Dextran-TRITC-70kDa (gul) ble brukt til å overvåke kjernefysisk eller cytoplasmatiske injeksjon; DNA ble farget av DAPI (blå). Pilspisser merker cytoplasmatiske lokalisering av snRNA. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: en potensiell fallgruve av microinjection tilnærming. (A) Microinjection i ett rom mislyktes og WT U2 snRNA ble microinjected inn i både cytoplasma og kjernen. Merk at Dextran-TRITC-70kDa (gul) er til stede i begge cellulære rom. (B) WT U2 snRNA ble microinjected inn i cytoplasma av HeLa celler (grønn), men betydelig mengde snRNA forble i cytoplasma (pilspisser), som indikerer delvis nedbrytning av injisert snRNA og et tap av SM bindende området. Cajal kropper (piler) er merket med Marianne immunolabeling (rød). DNA ble farget av DAPI (blå). Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi benyttet microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs å bestemme sekvenser viktig for snRNA lokalisering i kjernefysiske Cajal organer. På grunn av rask og ganske enkel utarbeidelse av merket RNAs (utarbeidelse av DNA mal av PCR etterfulgt av in vitro transkripsjon) metoden gir effektiv analyse av hvordan ulike sekvenser bidra til RNA lokalisering. På relativt kort tid var vi i stand til å analysere ti forskjellige slettinger eller erstatninger av U2-snRNA (referanse5 og data ikke vist). For RNAs med en kompleks kognitiv vei, tillater denne tilnærmingen også testing sekvenser som er avgjørende for modning. I tilfelle av snRNAs, sletting av SM bindende sekvenser, som er nødvendig for SM ring Assembly resulterer i opptak og nedbrytning av mutert snRNAs i cytoplasma7. Andre fordelaktige inkluderer at to forskjellige merket RNAs kan injiseres samtidig og deres lokalisering direkte sammenlignet i en celle. Ettersom ulike fluorokromer kan endre RNA-atferden, må imidlertid hver fluorokromkonjugert testes individuelt før dobbel merking av eksperimenter. RNAs av flere hundre nukleotider i lengde har blitt injisert og deres lokalisering analyseres i ulike modellsystemer (gjennomgått i referanse8). Den begrensende trinn i tilfelle lengre RNAs er vanligvis in vitro syntese av full lengde RNA. Også, injeksjon av RNAs med pre-monterte proteiner kan brukes til å teste effekten av enkelte proteiner på RNP lokalisering. I våre prosjekter, injisert vi snRNA assosiert med SM proteiner for å bekrefte rollen til SM ringen i Cajal kroppen lokalisering5. Til slutt, microinjection av fluorescensmerkete benevnt RNAs innrømmer direkte kvantifisering uten alle i tillegg skritt, idet er blitt tidligere anvendt for snRNAs9.

Det er også flere ulemper ved metodene som bør vurderes før lansere en microinjection prosjekt. Først, til tross for noen automatiseringen av microinjection prosessen, krever metoden fortsatt manuell kompetanse og erfaring, og forskerne bør vurdere tiden som er nødvendig for trening. De kritiske delene av protokollen er utarbeidelse av intakt RNAs, microinjection og deretter finne injisert celler i mikroskopet (se tips og feilsøking nedenfor). For det andre representerer microinjection en betydelig belastning og mange celler ikke overlever for en lengre periode. Mens det er noen vellykkede forsøk på å følge microinjected RNAs inne i cellene ved Live-celle Imaging10, observerte vi signifikant økning av celle død da vi kombinerte microinjection med live-celle Imaging bruker fluorescens mikroskopi. For det tredje er mengden av injisert RNA i humane celler svært lav, noe som hindrer biokjemiske analyse av injisert RNAs. Dette betyr også at det er vanskelig å overvåke hvordan inkorporering av fluorescensmerkete merket nukleotider påvirker RNA-funksjoner. Derfor bør ulike forhold med merket-NTP: NTP innlemmes i vill-type RNA og dens lokaliserings analyseres for å få det ideelle forholdet mellom det fluorescens signalet og funksjonaliteten til merket RNA. I tillegg kan fluorokromkonjugert natur påvirke RNA lokalisering. I våre hender, Alexa488-UTP jobbet mye bedre enn Alexa546-UTP. Vi har ikke utforsket disse forskjellene videre, men en grunn kan være en større størrelse og annen form av Alexa546 i forhold til Alexa488.

RNA-microinjection er en kraftig metode for RNA-lokalisering, men bør alltid kombineres med alternative tilnærmingsmåter. I vårt tilfelle har vi lykkes innført MS2-bindende nettsted i U2 snRNA, overvåket sin lokalisering ved hjelp av MS2-YFP og bekreftet noen viktige resultater oppnådd ved snRNA microinjection med MS2 system5.

Tips og feilsøking
Injeksjons trykk, kompensasjons trykk og injeksjons tid må bestemmes eksperimentelt for hver cellelinje. Vi brukte injeksjon trykk (pi) 170 hPa og kompensasjon trykk (PC) 50 hPa i tilfelle av cytoplasmatiske microinjection og pi = 200 hPa og PC = 80 hPa i tilfelle av kjernefysisk microinjection. Injeksjons tiden var i begge tilfeller satt til 0,2 s. Du kan noen ganger observere en liten bevegelse av materiale inne i cellen, som er en indikasjon på en vellykket injeksjon. Hvis cellen sprekker, må du redusere injeksjons trykket. Du bør også sjekke kompensasjons trykket via TRITC fluorescens kanal. Når du ser den sterke strømmen som kommer ut fra tuppen av nålen, Senk deretter kompensasjons trykket.

Mellom injeksjoner, sjekk alltid om cellene er injisert. Identifiser de microinjected cellene via injisert Dextran-TRITC ved hjelp av TRITC fluorescens-kanalen. Hvis du ikke ser noen microinjected celler, må du først øke injeksjons trykket og injeksjons tiden. For det andre, sjekk om nålen ikke er plugget via fluorescens kanal (TRITC). Hvis du ser Dextran-TRITC svakt streaming fra spissen av nålen, så nålen er funksjonell, og problemet er sannsynlig i innstillingen av den nedre grensen for injeksjon. Innstillingen av grensen er en veldig vanskelig og viktig skritt. Hver celle har ulik form og du vil endre grensen veldig ofte for å sikre riktig microinjection.

I det ideelle tilfellet, bør man være i stand til å microinject ~ 50 celler før spissen av nålen er plugget med en celle rusk. Sjekk om fluorescens kommer ut av spissen regelmessig, og hvis du ikke ser noen Dextran-TRITC streaming fra spissen, så nålen er blokkert. For å rengjøre den, Hold Clean -knappen på injeksjons ren i 3 s, noe som øker trykket og bør fjerne blokken. Hvis det ikke hjelper, så du kan prøve å bryte tuppen av nålen ved å treffe bunnen av Petri parabolen. Men dette er en veldig vanskelig prosedyre, som krever en betydelig mengde erfaring og det er ingen garanti for suksess. Derfor, for nybegynnere, er nålen utveksling tilrådelig.

Før du bytter nålen, trykk meny knappen på injeksjons sprøyten. Ta nålen litt opp og trykk Home on the micromanipulator. Nålen vil gå helt opp fra mediet, men micromanipulator husker den opprinnelige plasseringen av nålen og du trenger ikke å finne nålen igjen. Når nålen er byttet ut, trykk på hjem -knappen og nålen vil gå til den opprinnelige posisjonen, og du skal kunne se tuppen av nålen i mikroskopet. Etter å ha endret nålen, må du justere grensen. Trykk deretter meny knappen på injeksjonsstedet igjen og nålen er klargjort for microinjection.

Under bildebehandling er den vanskeligste delen å finne de microinjected cellene. For å lokalisere dem, bruk TRITC kanal, der TRITC-bøyd Dextran-70kDa er mye bedre synlig enn et svakt Alexa488 signal av microinjected snRNAs. Coverslips med et rutenett er nyttig her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av den tsjekkiske Science Foundation (18-10035S), det nasjonale bærekraft programmet I (LO1419), institusjonell støtte (RVO68378050), det europeiske Regional Development Fund (CZ. 02.1.01/0,0/0,0/16_013/0001775) og Grant Agency of Charles University (GAUK 134516). Vi erkjenner videre Light mikroskopi Core Facility, IMG CAS, Praha, Tsjekkia (støttet av tilskudd (tsjekkisk-Bioimaging-LM2015062).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42, (4), 2708-2724 (2014).
  2. Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14, (6), 671-679 (2017).
  3. Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
  4. Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
  5. Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46, (7), 3774-3790 (2018).
  6. Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12, (2), 573-583 (1993).
  7. Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111, (32), E3277-E3286 (2014).
  8. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20, (7), 380-390 (2010).
  9. Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17, (12), 4972-4981 (2006).
  10. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33, (6), 1902-1912 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics