Analyse de la localisation spliceosomale snRNA dans les cellules humaines d'Hela utilisant la microinjection

Neuroscience

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Summary

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant divers compartiments cellulaires. Ici, nous avons utilisé la microinjection de snRNAs fluorescents afin de surveiller leur transport à l'intérieur de la cellule.

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Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

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Abstract

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant des phases nucléaires et cytoplasmiques et la dernière étape se produit dans un compartiment nucléaire appelé le corps de Cajal. Cependant, les séquences qui dirigent la localisation de l'ARNs dans cette structure sous-nucléaire n'ont pas été connues jusqu'à récemment. Pour déterminer des séquences importantes pour l'accumulation des snRNAs dans les corps de Cajal, nous avons employé la microinjection des snRNAs fluorescents étiquetés suivis de leur localisation à l'intérieur des cellules. Tout d'abord, nous avons préparé des mutants de suppression de snRNA, synthétisé des modèles d'ADN pour la transcription in vitro et snRNAs transcrits en présence de l'UTP couplé avec Alexa488. Les snARN étiquetés ont été mélangés avec 70 kDa-Dextran conjugués avec TRITC, et microinjectés au noyau ou au cytoplasme des cellules humaines de HeLa. Les cellules ont été incubées pendant 1 h et fixes et la coiline de marqueur de corps de Cajal a été visualisée par immunofluorescence indirecte, alors que les snARN et le dextran, qui sert de marqueur de l'injection nucléaire ou cytoplasmique, ont été observés directement utilisant une microscope fluorescence. Cette méthode permet des tests efficaces et rapides de la façon dont diverses séquences influencent la localisation de l'ARN à l'intérieur des cellules. Ici, nous montrons l'importance de la séquence Sm-contraignante pour une localisation efficace des arnaques dans le corps cajal.

Introduction

L'épissage de l'ARN est l'une des étapes cruciales dans l'expression des gènes, qui est catalysée par un grand complexe de ribonucléoprotéines appelé l'épiscédsome. Au total, plus de 150 protéines et 5 petits ARN nucléaires (ARNN) sont intégrés dans l'épisséoce à différents stades de la voie d'épissage. Les snRNAS U1, U2, U4, U5 et U6 participent à l'épissage des principaux introns GU-AG. Ces snRNAs se joignent à l'épiscédsome comme petites particules de ribonucléoprotéines nucléaires préformées (snRNPs) qui contiennent de l'ARNs, sept protéines Sm associées à l'ARSS (ou protéines Like-Sm, qui s'associent à l'ARNT U6) et 1-12 protéines spécifiques pour chaque snRNP.

L'assemblage des snRNPs implique des étapes cytoplasmiques et nucléaires. L'ARS nouvellement transcrit est exporté vers le cytoplasme où il acquiert un anneau assemblé à partir de sept protéines Sm. L'anneau Sm sert par la suite de signal pour la réimportation de l'ARNds vers le noyau. Les snARN défectueux qui ne s'associent pas aux protéines Sm sont conservés dans le cytoplasme1. Les snRNP nouvellement importés apparaissent pour la première fois dans le corps de Cajal où ils rencontrent des protéines spécifiques au snRNP et terminent leur maturation (revue en référence2,3). Nous avons récemment montré que l'inhibition des étapes finales de maturation entraîne la séquestration des snRNPs immatures dans les corps de Cajal4,5. Nous avons proposé un modèle où la maturation finale de snRNP est sous contrôle de qualité qui surveille l'addition des protéines snRNP-spécifiques et la formation des snRNPs actifs. Cependant, les détails moléculaires de la façon dont les cellules font la distinction entre les particules matures et immatures aberrantes correctement assemblées restent insaisissables.

Pour déterminer les séquences d'ARNs qui sont essentielles pour le ciblage et l'accumulation des ARNs dans les corps nucléaires de Cajal, nous avons décidé d'utiliser la microinjection de snRNAs fluorescents. La microinjection était une méthode de choix parce que : 1) il ne faut pas une étiquette de séquence supplémentaire pour distinguer les snRNAs synthétiques forment leurs homologues endogènes qui est particulièrement important pour les ARN courts avec peu d'espace pour l'insertion de séquence supplémentaire d'étiquette ; 2) il permet l'analyse des séquences qui sont importantes pour la biogenèse. Par exemple, la séquence Sm est essentielle pour l'assemblage de l'anneau Sm et la réimportation dans le noyau6. Lorsque les snRNAS sont exprimés dans la cellule, les snRNAs dépourvus de la séquence Sm sont dégradés dans le cytoplasme et n'atteignent pas le noyau et les corps cajal7. Cependant, les snRNAs sans la séquence Sm peuvent être directement microinjectés dans le noyau et donc un rôle potentiel de la séquence Sm dans la localisation du corps Cajal a été mis en compte.

Ici, nous décrivons en détail une méthode de microinjection que nous avons appliquée pour déterminer les séquences snRNA nécessaires pour cibler les ARNs dans le corps cajal5. Nous avons montré que les sites de liaison Sm et SMN sont ensemble nécessaires et suffisants pour localiser non seulement les ARN, mais aussi divers ARN courts non codants dans le corps de Cajal. Sur la base de la microinjection ainsi que d'autres preuves, nous avons proposé que l'anneau Sm assemblé sur le site de liaison Sm est le signal de localisation du corps Cajal.

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Protocol

1. Préparation des snARN pour la microinjection

  1. Préparer un modèle d'ADN contenant la version intégrale ou tronquée/mutée de l'ARNs par PCR à l'aide d'une configuration PCR suivante : 98 oC pour 60 s, 98 oC pour 15 s, 68 oC pour 30 s, 72 oC pour 1 min, 98 oC pour 15 s pour 35x , et 72 oC pendant 5 min.
  2. L'apprêt avant doit contenir une séquence de promoteur pour la transcription in vitro juste en amont du premier nucléotide transcrit. Amplifiez la séquence snRNA de U2 à l'aide de l'amorce avant contenant le promoteur T7 et l'amorce inverse, qui se termine par le dernier nucléotide transcrit (voir tableau des matériaux pour plus de détails).
  3. Synthétiser l'ARS à l'aide d'un kit pour la synthèse à court ARN (voir tableau des matériaux pour plus de détails) contenant la polymérase d'ARN T7. Ajouter 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine cap analogue (m32,2,7G(5')ppp(5')G), 1 mL d'un inhibiteur d'ARN et 500-700 ng du modèle d'ADN au mélange de réaction et d'incubation à 37 oC pendant la nuit.
  4. Ajouter 1 l (2U) de DNase dans la réaction et couver pendant 15 min supplémentaires à 37 oC.
  5. Isoler le snRNA par extraction acide de phénol/chloroforme. Retirez la phase supérieure de l'eau et ajoutez 1/10 du volume initial de 3 M d'acétate de sodium (pH à 5,2), 3 l de glycogène pour une meilleure visualisation des granulés et 2,5 volumes d'éthanol à 100 %. Incuber pendant 1 h à -80 oC, centrifugeuse pendant 10 min à 14 000 x g et 4 oC.
  6. Laver la pastille avec 70 % d'éthanol et dissoudre dans 12 L d'eau exempte de nucléane. Le rendement habituel d'ARN était d'environ 600 ng/mL. Conserver à -80 oC.
  7. Surveiller l'intégrité des snARN transcrits in vitro par électrophores de gel d'agarose.
  8. Avant la microinjection, diluer l'ARN jusqu'à la concentration finale de 200 ng/mL dans de l'eau contenant 10 g/L dextran-TRITC 70 kDa.

2. Cellules

  1. Avant l'utilisation, traiter les rémaquilles avec 1 M HCl pendant 1 h, laver soigneusement dans de l'eau distillée et les conserver dans 100 % d'éthanol. Le traitement acide favorise l'adhérence des cellules pour empêcher l'épluchage cellulaire pendant ou après l'injection. Pour une identification plus facile des cellules injectées, utilisez un bordereau avec une grille.
  2. HeLa de graine ou d'autres cellules adhérentes 1 jour avant la microinjection sur des couvertures de 12 mm (no 1 ou no. 1.5) pour atteindre 50% de confluency au moment de la microinjection.

3. Injection

REMARQUE: Les cellules HeLa ont été microinjectées dans le médium d'aigle modifié du Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glucose contenant du rouge phénol et des antibiotiques). L'injection a été effectuée à l'aide d'un injecteur et d'un micromanipulateur équipé de l'aiguille stérile (voir tableau des matériaux pour plus de détails). L'ensemble du système microscopique/micromanipulateur a été préchauffé à 37 oC pendant au moins 4 h afin d'éviter la fluctuation des différentes parties du microscope et du micro-injecteur.

  1. Mettre le plat Petri (30 mm) contenant 2 ml de milieu de culture avec la couverture au milieu dans le support du microscope. Chargez 3 ll de mélange de snRNA dans l'aiguille à l'aide d'un microchargeur. Installez l'aiguille dans le support du micro-injecteur à 45 degrés par rapport à la surface du plat Petri.
  2. Pour trouver l'aiguille, utilisez un objectif 10x longue distance. Tout d'abord, définir la vitesse COARSE sur l'injecteur et abaisser l'aiguille jusqu'à ce qu'il touche le milieu de culture. À l'aide des jumelles au microscope, trouver la tache lumineuse, qui est l'endroit où l'aiguille touche le milieu de culture.
  3. Changez la vitesse à FINE et abaissez davantage l'aiguille tout en regardant dans le microscope jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille soit observée. Déplacez l'aiguille au milieu du champ visuel et passez à un objectif 40x longue distance.
  4. Après avoir changé l'objectif, sélectionnez la cellule et déplacez l'aiguille au-dessus de cette cellule. Définir les pressions et le temps pour le contact cellulaire (voir Conseils et dépannage en discussion).
  5. Déplacez l'aiguille vers le bas dans la cellule, puis définir la limite inférieure sur le micromanipulateur. Veillez à ne pas déplacer l'aiguille sous la cellule.
  6. Après avoir fixé la limite inférieure, déplacez l'aiguille au-dessus de la cellule et appuyez sur le bouton d'injection sur le joystick de l'injecteur. L'aiguille se déplace automatiquement à l'intérieur de la cellule à l'endroit où la limite est fixée et injecte le mélange d'ARN.
  7. Pour finir, appuyez sur le bouton MENU sur l'injecteur et retirez l'aiguille du support. Débranchez ensuite le tube de l'injecteur avant d'éteindre l'injecteur et le micromanipulateur.

4. Fixation cellulaire et coloration

  1. Après la microinjection, retourner les cellules dans un incubateur de CO2 et incuber à 37 oC pendant 1 h.
  2. Après l'incubation, rincer les cellules trois fois avec la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à température ambiante, fixer pendant 20 min avec 4% de paraformaldéhyde dans 0.1 M PIPES pH 6.9, et laver trois fois avec la température ambiante PBS. Si seulement la localisation de snRNA est analysée, rincez brièvement les cellules dans l'eau et montez dans un milieu de montage avec DAPI.
  3. En cas de localisation supplémentaire des protéines, perméabiliser les cellules avec 0,5% Triton-X100 en PBS pendant 5 min à température ambiante. Après trois rinçaments avec PBS, incuber les cellules avec des anticorps primaires et secondaires et après les lavages finaux en PBS et le rinçament bref dans l'eau, monter dans un milieu de montage avec DAPI.

5. Microscopie

  1. S'il n'est pas photographié immédiatement après le montage, rangez les diapositives à 4 oC jusqu'à l'imagerie.
  2. Acquérir des images à l'aide d'un système microscopique à fluorescence haut de gamme équipé d'un objectif d'immersion (60X ou 100x/1.4NA).
  3. Une fois les cellules microinjectées identifiées, collectez une pile de 20 z-sections avec 200 nm z par échantillon et soumises à une déconvolution mathématique. Des projections maximales ou des piles z individuelles ont ensuite été présentées.
  4. Pour quantifier le signal fluorescent, dessinez Région d'intérêt (ROI) autour d'un corps cajal identifié par l'immunostaining de coilin. Mesurez l'intensité du signal snRNA dans le retour sur investissement défini par la bobine. Déterminer ensuite l'intensité de la fluorescence de l'ARNde dans le retour sur investissement placé au hasard dans le nucléoplasme et calculer le rapport de signal d'ARN dans le corps cajal et le nucléoplasme.

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Representative Results

Pour surveiller la localisation de snRNA et le rôle du site de liaison de Sm dans le ciblage de corps de Cajal, nous avons préparé un modèle d'ADN contenant le promoteur de T7 et l'ARNs de S2 pleine longueur ou le snRNA de U2 manquant les sept nucléotides (AUUUUUG) formant le site de liaison de Sm. les snRNAs ont été transcrits in vitro, isolés et mélangés avec le dextran-70kDa TRITC-coupled. Nous avons microinjecté le mélange contenant l'ARNs transcrit in vitro dans le noyau ou le cytoplasme des cellules de HeLa.

Il a déjà été démontré que le site de liaison Sm est nécessaire pour l'importation nucléaire6. Pour vérifier si le site Sm est également important pour l'accumulation du corps Cajal, nous micro-injecté snRNA dépourvu du site Sm directement dans le noyau (Figure 1A). L'injection dans le cytoplasme a servi de contrôle (Figure 1B). Comme un contrôle positif, nous micro-injecté snRNA pleine longueur (Figure 1C,D). Après 60 min d'incubation dans un incubateur de CO2, des cellules micro-injectées ont été fixées et la coiline de marqueur de corps de Cajal a été visualisée par immunofluorescence indirecte. Le snRNA pleine longueur s'est accumulé dans les corps de Cajal après des injections nucléaires et cytoplasmiques. En revanche, snRNA manquant le site de Sm est resté dans le cytoplasme après microinjection dans ce compartiment, qui est compatible aux résultats précédents6. La microinjection nucléaire de snRNA sans le site Sm a indiqué que la séquence de liaison Sm est importante pour la localisation du corps cajal. U2 snRNA dépourvu du site Sm est resté dans le noyau, mais ne s'est pas accumulé dans les corps cajal (Figure 1A).

Parfois, la microinjection dans un seul compartiment cellulaire a échoué et TRICT-dextran-70kDa a été trouvé dans le noyau et le cytoplasme (Figure 2A). Ces cellules ont été jetées d'une analyse plus approfondie. Malgré le fait que les snRNAs étiquetés fluorescents sont stockés à -80 oC avant l'injection, la dégradation de l'ARN peut se produire. L'ARNss dégradé injecté dans le cytoplasme n'est pas transporté dans le noyau et reste localisé dans le cytoplasme (figure 2B). Un tel snRNA devrait être jeté, et le nouveau snRNA devrait être synthétisé.

Figure 1
Figure 1 : Localisation des ARN microinjectés. Alexa488-étiqueté U2 snRNA soit dépourvu du site Sm (A,B) ou pleine longueur (C,D) ont été microinjectés dans le cytoplasme ou le noyau des cellules HeLa. Les corps de Cajal (flèches) sont marqués par l'immunolabeling de coilin (rouge); les snRNAs sont représentés en vert. Dextran-TRITC-70kDa (jaune) a été utilisé pour surveiller l'injection nucléaire ou cytoplasmique; L'ADN a été taché par DAPI (bleu). Arrowheads marque la localisation cytoplasmique de snRNA. Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Un écueil potentiel de l'approche de microinjection. (A) Microinjection dans un compartiment a échoué et WT U2 snRNA a été microinjecté dans le cytoplasme et le noyau. Notez que Dextran-TRITC-70kDa (jaune) est présent dans les deux compartiments cellulaires. (B) WT U2 snRNA a été micro-injecté dans le cytoplasme des cellules HeLa (vert), mais une quantité significative de snRNA est restée dans le cytoplasme (pointes de flèche), ce qui indique une dégradation partielle de l'ARS injecté et une perte du site de liaison Sm. Les corps de Cajal (flèches) sont marqués par l'immunolabeling de coilin (rouge). L'ADN a été taché par DAPI (bleu). Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous avons employé la microinjection des snRNAs fluorescents pour déterminer des séquences importantes pour la localisation de snRNA dans les corps nucléaires de Cajal. En raison de la préparation rapide et assez simple des ARN étiquetés (préparation du modèle d'ADN par PCR suivi de la transcription in vitro), la méthode offre une analyse efficace de la façon dont les différentes séquences contribuent à la localisation de l'ARN. En relativement peu de temps, nous avons pu analyser dix suppressions ou substitutions différentes de l'ARNde U2 (référence5 et données non affichées). Pour les ARN avec une voie de biogenèse complexe, cette approche permet également d'tester des séquences essentielles à la maturation. Dans le cas des snRNAs, la suppression des séquences de liaison Sm, qui sont nécessaires pour l'assemblage de l'anneau Sm entraîne la séquestration et la dégradation des snRNAs mutés dans le cytoplasme7. D'autres avantages incluent que deux ARN différemment étiquetés peuvent être injectés simultanément et leur localisation directement comparée dans une cellule. Cependant, comme divers fluorochromes peuvent modifier le comportement de l'ARN, chaque fluorochrome doit être testé individuel avant les expériences de double étiquetage. Des ARN de plusieurs centaines de nucléotides de longueur ont été injectés avec succès et leur localisation a été testée dans divers systèmes modèles (revue en référence8). L'étape limitante en cas d'ARN plus long est habituellement la synthèse in vitro de l'ARN pleine longueur. En outre, l'injection d'ARN avec des protéines pré-assemblées peut être appliquée pour tester l'effet des protéines individuelles sur la localisation RNP. Dans nos projets, nous avons injecté snRNA associé aux protéines Sm pour confirmer le rôle de l'anneau Sm dans la localisation du corps Cajal5. Enfin, la microinjection d'ARN étiquetés fluorescents permet une quantification directe sans aucune étape supplémentaire, comme cela a été appliqué précédemment pour lesARNN9.

Il y a également plusieurs inconvénients des méthodes qui devraient être considérées avant de lancer un projet de microinjection. Tout d'abord, malgré une certaine automatisation du processus de microinjection, la méthode nécessite encore des compétences manuelles et de l'expérience, et les chercheurs devraient considérer le temps nécessaire pour la formation. Les parties critiques du protocole sont la préparation d'ARN intacts, la microinjection, puis la recherche de cellules injectées au microscope (voir Conseils et dépannage ci-dessous). Deuxièmement, la microinjection représente un stress important et de nombreuses cellules ne survivent pas plus longtemps. Tandis qu'il y a quelques tentatives réussies de suivre les ARN microinjectés à l'intérieur des cellules par l'imagerie de cellules vivantes10,nous avons observé l'augmentation significative de la mort cellulaire quand nous avons combiné la microinjection avec l'imagerie de cellules vivantes utilisant la microscopie de fluorescence. Troisièmement, la quantité d'ARN injecté dans les cellules humaines est très faible, ce qui empêche l'analyse biochimique des ARN injectés. Cela signifie également qu'il est difficile de surveiller comment l'incorporation de nucléotides fluorescents affecte les fonctions de l'ARN. Par conséquent, divers rapports de l'étiquette-NTP:NTP devraient être incorporés dans l'ARN sauvage-type et sa localisation a été précisée pour obtenir le rapport idéal entre le signal de fluorescence et la fonctionnalité de l'ARN étiqueté. En outre, la nature du fluorochrome pourrait affecter la localisation de l'ARN. Dans nos mains, Alexa488-UTP a beaucoup mieux fonctionné qu'Alexa546-UTP. Nous n'avons pas exploré ces différences plus loin, mais une raison pourrait être une plus grande taille et la forme différente d'Alexa546 par rapport à Alexa488.

Prenant ensemble, la microinjection d'ARN est une méthode puissante pour la localisation de l'ARN, mais doit toujours être combinée avec des approches alternatives. Dans notre cas, nous avons introduit avec succès le site de liaison MS2 dans le snRNA de U2, suivi sa localisation en utilisant MS2-YFP et confirmé quelques résultats clés obtenus par microinjection de snRNA avec le système MS25.

Conseils et dépannage
La pression d'injection, la pression de compensation et le temps d'injection doivent être déterminés expérimentalement pour chaque lignée cellulaire. Nous avons appliqué la pression d'injection (Pi) 170 hPa et la pression de compensation (Pc) 50 hPa dans le cas de la microinjection cytoplasmique et de Pi-200 hPa et de Pc-80 hPa dans le cas de la microinjection nucléaire. Le temps d'injection a été dans les deux cas fixé à 0.2 s. Vous pouvez parfois observer un léger mouvement de matériel à l'intérieur de la cellule, qui est une indication d'une injection réussie. Si la cellule éclate, vous devez diminuer la pression d'injection. Vous devriez également vérifier la pression de compensation par l'intermédiaire du canal de fluorescence de TRITC. Lorsque vous voyez le flux fort sortant de la pointe de l'aiguille, puis diminuer la pression de compensation.

Entre les injections, vérifiez toujours si les cellules sont injectées avec succès. Identifiez les cellules microinjectées par dextran-TRITC injecté e à l'aide du canal de fluorescence TRITC. Si vous ne voyez pas de cellules microinjectées, augmentez d'abord la pression d'injection et le temps d'injection. Deuxièmement, vérifiez si l'aiguille n'est pas branchée par canal de fluorescence (TRITC). Si vous voyez Dextran-TRITC faiblement streaming à partir de la pointe de l'aiguille, puis l'aiguille est fonctionnelle, et le problème est probable dans le réglage de la limite inférieure pour l'injection. Le réglage de la limite est une étape très délicate et importante. Chaque cellule a une forme différente et vous allez changer la limite très souvent pour assurer une microinjection appropriée.

Dans le cas idéal, on devrait être en mesure de micro-injecter 50 cellules avant que la pointe de l'aiguille est branchée avec un débris cellulaire. Vérifiez si la fluorescence sort de la pointe régulièrement, et si vous ne voyez pas de Dextran-TRITC en streaming à partir de la pointe, alors l'aiguille est bloquée. Pour le nettoyer, maintenez le bouton CLEAN sur l'injecteur pendant 3 s, ce qui augmente la pression et devrait enlever le bloc. Si cela n'aide pas, alors vous pouvez essayer de briser le bout de l'aiguille en frappant le fond du plat Petri. Cependant, il s'agit d'une procédure très délicate, qui exige une quantité importante d'expérience et il n'y a aucune garantie de succès. Par conséquent, pour les débutants, l'échange d'aiguilles est conseillé.

Avant d'échanger l'aiguille, appuyez sur le bouton MENU sur l'injecteur. Prenez l'aiguille un peu en haut et appuyez sur HOME sur le micromanipulateur. L'aiguille va aller tout le chemin à partir du milieu, mais le micromanipulateur se souvient de la position d'origine de l'aiguille et vous n'avez pas besoin de trouver l'aiguille à nouveau. Lorsque l'aiguille est remplacée, appuyez sur le bouton HOME et l'aiguille ira à la position d'origine et vous devriez être en mesure de voir le bout de l'aiguille dans le microscope. Après avoir changé l'aiguille, vous devez ajuster la limite. Ensuite, appuyez à nouveau sur le bouton MENU sur l'injecteur et l'aiguille est préparée pour la microinjection.

Pendant l'imagerie, la partie la plus délicate est de trouver les cellules microinjectées. Pour les localiser, utilisez le canal TRITC, où le Dextran-70kDa conjugué triTC est beaucoup mieux visible qu'un faible signal Alexa488 de snARN microinjectés. Les couvertures avec une grille sont utiles ici.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Fondation tchèque pour la science (18-10035S), le Programme national de développement durable I (LO1419), le soutien institutionnel (RVO68378050), le Fonds européen de développement régional (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775) et l'Agence de subventions de Université Charles (GAUK 134516). Nous reconnaissons en outre le Centre de microscopie légère, IMG CAS, Prague, République tchèque (soutenu par des subventions (Czech-Bioimaging - LM2015062).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

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References

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