온도 제어 기능을 갖춘 수직 관찰을 위한 현미경 단계 제작

Engineering

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Summary

여기에 제시된 샘플 용기를 수직 현미경에 장착할 수 있는 온도 제어 현미경 단계를 사용하는 프로토콜이 제시된다.

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Matsukawa, Y., Ide, Y., Umemura, K. Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function. J. Vis. Exp. (149), e59799, doi:10.3791/59799 (2019).

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Abstract

견본은 일반적으로 현미경 관찰을 위한 수평 현미경 단계에 두어. 그러나, 샘플에 중력의 영향을 관찰하거나 해상 행동을 연구하기 위해, 현미경 단계 수직으로 만들 필요가있다. 이를 위해 90°로 기울어진 옆으로 뒤집힌 현미경이 고안되었습니다. 이 현미경으로 샘플을 관찰하려면 페트리 접시 또는 유리 슬라이드와 같은 샘플 용기를 수직으로 스테이지에 고정해야 합니다. 수직 현미경 단계에서 샘플 용기를 고정할 수 있는 장치가 개발되어 여기에 설명되어 있습니다. 이 장치를 스테이지에 부착하면 수직 평면에서 샘플 역학을 관찰할 수 있습니다. 실리콘 고무 히터를 사용하여 온도를 조절하는 기능은 온도 에 의존하는 샘플 거동을 관찰할 수 있게 합니다. 또한 온도 데이터는 인터넷 서버로 전송됩니다. 온도 설정 및 로그 모니터링은 PC 또는 스마트폰에서 원격으로 제어할 수 있습니다.

Introduction

광학 현미경 검사법은 렌즈와 가시광선을 가진 견본의 확대를 통해 관찰 가능한 세부사항을 증가하기 위하여 이용된 기술입니다. 광학 현미경 검사법에서 빛은 시료로 전달된 다음, 관찰을 위해 돋보기를 통해 투과, 반사 또는 형광광을 포착합니다. 현미경의 각종 모형은 다른 용도 및 관측 방법을 수용하기 위하여 디자인에 있는 다른 유효합니다. 다른 디자인은 위에서 관찰을 위해 아래에서 견본을 점등하기 위하여 구조물로 구조되는 직립 현미경을 포함하고, 아래에서 관찰을 위해 위에서 견본을 점등하는 반전한 현미경을 포함합니다. 직립 현미경은 가장 일반적이고 널리 사용되는 디자인입니다. 거꾸로 된 현미경은 종종 용기의 바닥에 부착 배양 세포와 같은 위에서 가까운 거리에서 렌즈를 허용 할 수없는 샘플을 관찰하는 데 사용됩니다. 많은 연구 그룹은 반전 현미경1,2,3,4,5,6,7을사용하여 다양한 분야에서 관찰을보고했다. 반전 된 현미경 8, 9,10,11,12,13의 특징을 활용하는 많은 추가 장치가 개발되었습니다. .

현재 모든 종래의 현미경 설계에서 현미경 단계는 수평이므로 중력, 부력, 운동 등으로 인해 수직 평면에서 움직임을 생성하는 샘플의 관찰에 적합하지 않습니다. 이러한 관찰을 가능하게 하려면 현미경 단계와 광 경로를 수직으로 회전시켜야 합니다. 수직 단계는 유리 슬라이드 또는 페트리 접시와 같은 샘플 용기를 무대에 수직으로 장착하는 데 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 90 °로 기울어진 옆으로 반전 된 현미경이 이미 고안되었습니다. 그러나 테이프 또는 기타 접착제로 샘플을 부착해도 장기적인 부동이 발생하지 않습니다. 여기서 설명된 것은 필요한 안정성을 달성할 수 있는 장치이다. 이 장치는 수직 평면에서 샘플 이동 시간에 따라 관찰할 수 있습니다. 실리콘 고무 히터를 장착하면 시료 거동에 대한 온도 변화의 영향을 관찰할 수 있습니다. 온도 데이터는 Wi-Fi를 통해 인터넷 서버로 전송되며 PC 또는 스마트폰에서 원격으로 온도 설정 및 로그 모니터링을 제어할 수 있습니다. 우리의 지식에, 90°에 의해 기울어진 옆으로 기울어진 현미경에 붙어 있던 단계는 아직 이전 연구 결과에서 보고되지 않았습니다.

현미경 단계는 3개의 알루미늄 판으로 이루어진다. 중간 알루미늄 플레이트는 무대에 부착된 하부 알루미늄 플레이트에 장착됩니다. 온도 센서를 포함하는 실리콘 고무는 중간 및 상부 알루미늄 플레이트 사이에 부착됩니다. 고무 밴드는 샘플을 부착하는 데 사용됩니다. 발톱은 고무 밴드를 고정하기 위해 상부 알루미늄 판의 왼쪽과 오른쪽 4 개 점에 부착됩니다. 온도 조절기의 제어 회로는 실리콘 고무에 내장된 온도 센서로부터 신호를 수신하고 펄스 폭 변조(PWM) 방법에 의해 전력을 조절한다. 온도는 1°C 단위로 50°C로 점진적으로 증가될 수 있다. 이 장치는 수직 샘플 모션이 온도에 따라 달라질 수 있는 응용 제품에 유용합니다.

이 보고서는 규조류의 부동 현상에 대한 온도 영향의 예를 제공합니다. 규조류 관측 연구의 예로, 세포 군집의 침전 속도 측정, 운동 분석, 초미세 구조 연구 등14,15,16,17등이 보고되었다. , 18세 , 19세 , 20개 , 21세 , 22세 , 23. 광합성 유기체와 함께 물에 떠있는 규조류의 비중은 물보다 약간 높기 때문에 가라 앉는 경향이 있습니다. 그러나 약간의 대류가 발생하면 상승합니다. 이 현상을 연구하기 위해 유리 슬라이드가 현미경 단계에 수직으로 부착되고 규조류 수직 운동에 대한 온도 상승의 효과가 관찰됩니다.

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Protocol

1. 디자인

  1. 알루미늄 플레이트 의 제조
    1. 150mm x 200mm x 2mm 의 알루미늄 플레이트 중앙에 101mm 구멍을 절단하여 레이저 가공 기계로 최전선 플레이트로 사용하십시오. 길이에 걸쳐 두 개의 고무 밴드를 부착하기 위해 8 개의 지점에서 기계 발톱, 또는이 접시의 폭에 걸쳐 두 (보충 그림 1A보충 그림 2A 참조).
    2. 레이저 가공 기계와 중간 상부 플레이트로 사용되는 다른 150mm x 200mm x 5mm 알루미늄 판의 중앙에 130mm 구멍을 잘라. 길이에 걸쳐 두 지점에서 고무 밴드를 부착하기위한 8 개의 노치, 또는이 판의 폭에 걸쳐 두 개의 기계 (보충 그림 1B보충 그림 2B 참조).
    3. 레이저 가공 기계가 있는 중간 하부 플레이트로 사용되는 150 mm x 200 mm x 4mm 알루미늄 판의 중앙에 130mm 구멍을 절단합니다(보조 도 1C보조 그림 2C 참조).
    4. 베이스 플레이트로 사용할 150mm x 200mm x 1.5mm 알루미늄 플레이트의 중앙에 30mm 구멍을 잘라냅니다(보조 도 1D보조 그림 2D참조).
  2. 두 개의 알루미늄 받침대 의 제조
    1. 알루미늄 판의 중앙에 30mm 구멍을 자르고 (직경 100mm, 두께 3mm) 치수 42mm x 깊이 30mm의 한 쪽에서 노치를 만듭니다 (추가 그림 3A참조).
    2. 알루미늄 플레이트(직경 100mm, 두께 4mm)로 플레이트 중앙에 30mm 구멍을 자르고 중심에서 25mm 떨어진 3mm 구멍 3개, 간격이 120°로 서로(보조 그림 3B참조).
  3. 세 개의 프레스 코르크 디스크 제작
    1. 워터 제트 커팅 머신으로 프레스 코르크 디스크(직경 100mm, 두께 2mm)의 중앙에 20mm 구멍을 자른다. 한 컷을 x 30mm 깊이에서 42mm, 너비 4mm x 깊이 5mm로 한 컷합니다(추가 그림 4A참조).
    2. 물 분사 절단 기와 치수 100mm 직경, 1mm 두께의 압축 코르크 디스크의 중심에 20mm 구멍을 잘라. 42mm x 30mm 깊이, 4mm 너비 4mm x 깊이 40mm 컷을 만듭니다(추가 그림 4B참조).
    3. 폭 42mm, 깊이 30mm의 직경 100mm 디스크에서 압착 된 코르크 플레이트를 잘라냅니다. 두께 1mm의 두 장과 2mm 두께의 1장이 필요합니다(추가 그림 4C참조).
  4. 실리콘 고무 히터의 제조
    1. 니크롬 와이어가 내장된 2.5mm 두께의 실리콘 고무의 100mm 직경 디스크를 사용하여 히터를 제작하고 디스크 중앙에 20mm 구멍을 자른다(보조 그림 5참조).
  5. 1.1-1.4 단계에 설명된 부품을 추가 그림 6에 표시된 대로 적층하여 조립합니다.
  6. 현미경 단계를 구성하려면 현미경 단계의 보충 도 6, 단면을 참조하십시오. 수정 Equation 1 Equation 2 하고, Equation 3 Equation 4 그런 다음 나사로 고정하십시오. 고정 Equation 4 Equation 5 및 나사. 및 Equation 2 Equation 3 접착제를 Equation 5 Equation 6 고치고 Equation 7 Equation 8 , Equation 6 Equation 5Equation 9 Equation 7 , 및 접착제를 고치.

2. 하드웨어 디자인 개요

  1. 추가 그림7과 같이 "전원 공급 장치 및 프로그래밍 회로"를 준비합니다. AC 어댑터에 연결된 J4 터미널의 히터 컨트롤러에 12V DC를 공급합니다. CPU 공급 전압이 3.3V DC이기 때문에 레귤레이터를 사용하는 회로 전원 공급 장치에 대해 전압을 12V DC에서 3.3V DC로 줄입니다.
    참고: USB 1은 5V DC 및 개발 PC의 직렬 신호를 위한 단자입니다. 5V DC가 필수는 아니지만 CPU를 프로그래밍하는 전원으로 사용됩니다. 이것은 또한 레귤레이터에 의해 3.3 V DC로 변환됩니다. J1은 프로그래밍 시 제어 신호 단자입니다. 이 회로는 보조 그림8에 표시된 컨트롤러 케이스에 보관됩니다.
  2. 보조 그림7에 표시된 대로 "히터 제어 회로"를 준비합니다. Q5(P 채널 MOS FET)를 사용하여 12V DC로 전환하여 히터에 공급합니다. Q5는 히터에 공급되는 전력량을 조정하기 위해 PWM을 사용하여 12V DC를 제어하는 스위칭 요소입니다.
    참고: 회로에는 히터에 전압이 공급되고 있는지 시각적으로 확인하는 LED가 포함되어 있습니다. 이 드라이브 신호(히터_C)는 CPU의 PWM 신호입니다. 보호 회로에서 과열 신호가 감지되면 BREAKER 신호가 LOW로 전환되고 MOS-FET작동이 중지됩니다. 이 회로는 보조 그림8에 표시된 컨트롤러 케이스에 보관됩니다.
  3. 추가 그림7과 같이 "히터 유닛용 커넥터 회로"를 준비합니다. 히터 섹션과 연결하기 위해 USB 커넥터를 설치합니다.
    참고: 이 회로는 보조 그림8에 표시된 컨트롤러 케이스에 보관되어 있습니다.
  4. 추가 그림 7과 같이 "온도 센서용 커넥터 회로"를 준비합니다. 온도 센서를 연결하기 위해 커넥터(유로블록 리셉터클 2P)를 장착합니다.
    참고: 이 회로는 보조 그림8에 표시된 컨트롤러 케이스에 보관되어 있습니다.
  5. 추가 그림7에 표시된 "A/D 변환기"의 경우 ADS 1015를 AD 변환 장치로 사용합니다.
    참고: AD 변환 장치는 온도 센서의 값을 변환하고 감지 센서를 전압에서 디지털 값으로 과열합니다. 이것은 12 비트 멀티 플렉서 AD 변환 장치이며 I2C 인터페이스로 CPU에 연결됩니다. 이 회로는 보조 그림8에 표시된 컨트롤러 케이스에 보관됩니다.
  6. OP 암페어의 반전 입력에 과열 감지 센서(OHS) 신호를 연결하여 보조 도 7에 표시된 대로 "보호 회로"를 만듭니다. 이 신호를 비반전 입력에 연결된 트리머 저항기의 전압과 비교합니다.
    1. 전압이 트리머 저항기의 전압보다 낮아지면 OP 증폭기의 출력이 높아지고 연결된 NPN 트랜지스터 Q2가 켜지고 BREAKER 신호가 낮아지도록 합니다.
    2. 동시에 Q4가 켜지고 연결된 과열 표시기 LED D6가 켜지도록 하십시오.
      참고: 이 회로는 보조 그림8에 표시된 컨트롤러 케이스에 보관되어 있습니다.
  7. 추가 그림7에 표시된 "디스플레이 섹션"의 경우 OLED에 192 x 64 도트를 사용합니다. I2C 인터페이스를 통해 CPU에 연결합니다.
    1. OLED의 GND에 연결된 NPN 트랜지스터 Q1을 사용하여 CPU 신호 IO0에 의해 OLED의 GND를 분리하여 OLED를 재설정합니다.
      참고 :이 OLED는 다양한 유형의 정보를 표시합니다. 이 회로는 보조 그림8에 표시된 컨트롤러 케이스에 보관됩니다.
  8. 보조 그림7의 "푸시 스위치가 있는 LED 및 회전 식 인코더"의 경우 푸시 스위치로 작동하고 두 개의 LED를 통합하는 솔더로 로터리 인코더를 장착합니다.
    1. 전원 LED로 사용하기 위해 하나의 LED를 VCC에 연결합니다. 다른 하나는 히터 작동 중에 표시기로 사용하기 위해 CPU에 연결되어 있습니다.
    2. CPU에 연결된 히터 START/STOP에 푸시 스위치 접점을 사용합니다. 로터리 인코더의 A 및 B 출력을 CPU 인터럽트의 IO 입력 세트에 연결합니다.
      참고: 이 회로는 보조 그림8에 표시된 컨트롤러 케이스에 보관되어 있습니다.
  9. 추가 그림7의 CPU의 경우 WROOM - 02D의 CPU를 사용합니다.
    1. 디스플레이의 인터페이스가 I2C 표준이기 때문에 IO12, IO13에서 "디스플레이 장치"로 출력합니다. IO0을 "디스플레이 장치"에 연결하고 OLED를 재설정합니다.
    2. IO15를 "히터 제어 장치"에 연결하고 PWM 출력으로 히터에 공급되는 전력을 제어합니다.
    3. IO2를 "푸시 스위치가 있는 LED 및 회전 식 인코더"에 연결하고 START LED를 밝습니다. IO4및 IO14를 "푸시 스위치가 있는 LED 및 회전 식 인코더"에 연결하고 로터리 인코더에서 신호(REA 및 REB)를 수신하여 설정된 온도를 결정합니다. IO5를 "푸시 스위치가 있는 LED 및 회전 식 인코더"에 연결하고 히터를 시작/중지합니다.

3. 소프트웨어 설계 개요

  1. WROOM에 아두 이노 코어를 사용 - 02D이 시스템의 컨트롤러로 CPU에 대한.
    참고 : 입력 장치로, 시작 / 정지 스위치, 회전 인코더, 온도 센서 (thermistor)가 사용됩니다. 출력 장치로는 LED, 문자 디스플레이(OLED) 및 히터가 사용됩니다. 통신 장치는 Wi-Fi를 사용합니다.
  2. 작업의 개요
    1. 추가 도7의 푸시 스위치로 LED 및 로터리 인코더에 표시된 대로 로터리 인코더의 작동을 감지하고 설정된 온도로 저장한 다음 OLED에 표시합니다. 위상 단말이 인터럽트 입력 단자로 연결되는 CPU의 입력 단자를 설정하고 인터럽트에 의해 로터리 인코더의 회전(전진 및 후진)을 처리한다. 전진 회전의 경우 +1, 역회전은 -1로 설정합니다. 설정 온도를 전역 변수에 적고 히터 온도 제어에 사용합니다. 동시에 OLED의 설정 온도 표시를 업데이트합니다.
    2. 추가 그림7의 CPU에 표시된 대로 시작/중지 스위치(SW-S)를 통해 CPU IO 5로 시작 및 중지를 식별합니다. 시작/중지 스위치의 상태는 50ms마다 타이머 인터럽트 프로세스입니다.
      참고: 스위치는 순간적인 스위치이므로 푸시및 릴리즈할 때 시작/중지 상태를 반전시입니다. 이 상태는 전역 변수에 저장됩니다.
    3. 온도 센서에 서미스터를 사용하십시오. 샘플 센서에서 측정된 값을 읽으십시오(추가 그림7의 "히터 연결용 커넥터 회로"참조)를 A/D 변환기 후 CPU로 읽으십시오(보조 그림7의 "A/D 변환기"참조). 추가 그림7의 "CPU"에서 IO15 포트를 켜서 히터에 전류를 공급합니다.
      참고: 온도 센서에는 두 가지 유형이 있습니다. 하나는 샘플의 온도를 측정하고 설정 온도에서 히터를 제어하는 데 사용되며, 다른 하나는 히터에 부착되어 열 방지에 사용됩니다. 저항기를 통해 서미스터를 3.3V에 연결하고 전압 변화로 저항 의 변화를 기록합니다. 이동 평균 방법으로 노이즈를 제거합니다.
    4. 온도 방지 온도 센서에 서미스터를 사용하십시오. 과열 검출은 보조 도7에서 서미스터(R2)("히터 연결을 위한 커넥터 회로")를 사용하여 수행되며, 설정값을 초과하면 히터 전류가 차단됩니다(보충 도 7에서"보호 회로").
      참고: 이 센서는 CPU가 아닌 회로에 통합됩니다. 이 센서는 CPU와 독립적이며 아날로그 방식으로 디시펄 앰프에 의해 저항 트리머에 의해 설정된 저항 값과 비교됩니다. 온도가 설정된 값을 초과했다는 것을 감지하면 히터의 전류를 제어하고 전류 공급을 강제로 중지하는 FET 스위치에 개입합니다. CPU가 제대로 작동하지 않는 상황에서도 히터의 온도가 일정 수준을 초과하지 않도록 하는 것이 목적입니다.
    5. 장비가 작동 중일 때 CPU(보조 그림7의 "CPU"에서)에 의해 보조 그림 7의 "푸시 스위치가 있는 LED 및 회전 식 인코더"에서 LED를 켭니다.
    6. CPU에 의한 보충 도면 7의 "디스플레이 섹션"에서 설정된 온도 및 측정값을 OLED에 표시합니다("추가 도면7의 CPU").
    7. CPU에서 PWM으로 보조 그림 7의 "히터 제어 회로"에서 FET 스위치를 구동하여 히터를 제어합니다.
    8. 온도 센서가 획득한 측정 온도를 기준으로 PID로 히터를 제어합니다. PID 처리를 위해 Arduino의 pid_v1.h 라이브러리를 사용합니다.
      참고: CPU는 시간을 보정하고, 서버와 통신하고, 데이터를 전송하고, 서버로부터 지침을 수신합니다. 센서 온도가 설정된 온도를 초과하면 히터의 전류가 0으로 설정되고 오버슈트가 억제됩니다.
    9. CPU의 내장 된 Wi-Fi 연결 기능을 사용하고 인터넷에 연결합니다. Wi-Fi를 통해 지정된 서버로 온도, 히터 온도 등을 설정하여 전송합니다.

4. 시스템 구성

  1. 보조 그림9에 따라 시스템을 구축합니다.
  2. 컨트롤러와 Wi-Fi를 장착합니다.
  3. 온도 측정을 위한 센서로 서미스터를 사용하십시오. 서미스터 와이어를 컨트롤러 케이스의 "SENSOR" 단자에 연결합니다. 서미스터에 의해 측정된 온도 신호를 수신합니다.
  4. 고무 히터와 컨트롤러 케이스의 "히터"를 통합한 현미경 스테이지를 전용 케이블로 연결합니다. 고무 히터의 전류를 제어합니다.
  5. 컨트롤러의 노브로 설정 온도를 변경합니다.
    참고 : 온도 로그 모니터링, 온도 설정은 PC 또는 스마트 폰에서 원격으로 작동 할 수 있습니다.
  6. 측정된 온도, 설정 온도 및 시간 정보를 컨트롤러에서 서버로 인터넷을 통해 전송합니다. 데이터 측정 주기 시간은 서버로 데이터를 전송하는 5초 및 사이클 시간이 1분입니다.
  7. 컨트롤러 측에서 정기적으로 서버에 액세스하고 컨트롤러의 CPU에 저장된 측정 데이터를 분석 및 그래프를 위해 서버로 전송합니다.
  8. 서버 작동 방법에 대한 보충 자료를 참조하십시오.

5. 옆으로 반전 된 현미경의 디자인

  1. 두께 15mm의 알루미늄 플레이트 두 개를 나사로 수직으로 고정하여 기본 마운트를 만듭니다.
  2. 베이스 마운트의 수평 부분에 지그(한 곳)를 부착합니다.
  3. 현미경 단계 부분을 수직으로 놓고 베이스 스탠드의 수직 부분에 지그 (2 개소)를 부착하고 현미경의 바닥을 베이스 스탠드에 고정시다.
  4. 나사로 현미경 단계를 수정합니다.

6. 작동 방법

참고 : 여기에 사용되는 샘플은 대담한 변형 기저 담수 영양소 솔루션 액체 배양 배지, 나트륨 메타실리케이트, 비타민 및 멸균 수의 혼합물입니다. 이 샘플의 800 μL은 담수 배지의 10 mL에서 희석된다.

  1. 관찰 방법
    1. 제조된 샘플의 1,000 μL을 자체 제작 유리 챔버에 주입합니다.
      참고 : 자체 제작 유리 챔버는 두 개의 슬라이드 안경을 병렬로 배열하고 접착제로 고정합니다. 일반적인 페트리 접시는 두께가 크고 세포가 챔버의 깊이 방향으로 빠져나오므로 현미경으로 관찰하기가 어렵습니다. 이를 방지하기 위해 작은 깊이 방향을 가진 챔버가 만들어지므로 셀이 챔버의 깊이 방향으로 빠져 나가는 것을 방지 할 수 있습니다. 저온 경화 성 에폭시 수지 접착제는 챔버에서 샘플이 떨어지는 것을 방지하기 위해 유리 주위에 결합하는 데 사용됩니다.
    2. 별도로 준비된 비디오 카메라를 현미경에 부착합니다. 현미경의 전용 렌즈 어댑터를 사용하여 비디오 카메라를 연결하고 샘플을 촬영합니다.
    3. 10배 접안 렌즈와 200배 의 대물렌즈를 가진 현미경을 사용하십시오.
    4. 4mm 나사로 4개의 위치에서 수직 현미경 스테이지를 현미경에 부착합니다.
      참고: 알루미늄 플레이트의 설계 도면은 추가 그림 1A 보조 그림 2A를 참조하십시오. 본 실험에서, 거꾸로 된 현미경을 사용하였다. 이것은 90°로 기울었고, 제작된 현미경 스테이지는 나사로 부착되었습니다. 그림 1을참조하십시오.
    5. 세로로 만든 네 개의 발톱을 사용하여 두 개의 고무 밴드로 샘플을 고정하십시오. 시료를 지면에 수직인 현미경 단계에 놓습니다.
    6. 보조 도8에 표시된 컨트롤러를 사용하여 온도를 40°C로 설정합니다. 컨트롤러 노브를 돌려 온도를 설정합니다. 디스플레이의 설정 온도를 확인합니다. 노브를 눌러 온도 조절을 시작하면 파란색 LED가 켜집니다. 노브를 다시 눌러 LED를 끄고 온도 제어를 중지합니다.
      참고: 측정된 온도가 실시간으로 표시되고 히터가 설정된 온도에 도달하도록 제어됩니다. 온도 제어가 시작되면 히터가 작동되는 동안 파란색 LED가 켜지고 유지됩니다. 히터가 과열되면 빨간색 LED표시등이 켜지고 히터가 자동으로 멈춥니다.
    7. 서버 작업에 대한 추가 정보는 "서버 운영 설명서"를 참조하십시오.
      참고: 데이터 저장을 위한 서버가 필요합니다. 서버의 데이터베이스는 My-SQL을 사용합니다.

7. 고무 히터의 표면 온도 분포 측정

  1. 온도 균일성을 확인하기 위해 열화상에 의한 고무 히터 표면 온도의 분포를 측정합니다.
  2. 스탠드에 고무 히터를 내장한 현미경 스테이지를 부착합니다.
  3. 고무 히터 표면의 설정 온도를 35°C, 45°C, 55°C 및 65°C로 변경하고, 정면으로부터 의한 서모그래피에 의해 측정한다(보충도 10참조).

8. 온도 반응 테스트

  1. 시료 세트 온도를 30°C로 설정하여 온도 제어를 시작합니다. 측정 값이 30°C에 도달하고 안정화될 때까지 기다립니다. 미리 설정된 온도를 30°C에서 50°C로 단계적으로 높이고 측정값이 각각의 미리 설정된 온도에 따라 안정화될 때까지 기다립니다.
  2. 미리 설정된 온도를 50°C에서 30°C로 5°C로 단계적으로 줄이고 측정값의 추적 능력을 검출합니다.

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Representative Results

2는 고무 히터의 온도 분포를 나타낸다. 고무 히터의 표면 온도는 각 온도에서 균일했다. 그림 3은 온도 변화를 설정하기 위해 측정된 온도의 응답성을 보여줍니다. 주황색 선은 설정된 온도를 나타내고 파란색 선은 샘플 온도의 변화를 보여줍니다. 설정 변경에 대한 측정값의 오버슈트가 작고 추적이 빠를 수 있습니다.

규조류 세포는 이 장치의 사용에 대한 구체적인 예를 제공하는 것으로 관찰되었다. 움직이는 규조류 세포의 궤적 분석은 규조류 세포의 운동성을 평가하는 데 유용한 접근법입니다. 그러나, 정상적인 반전된 현미경이 시료를 수평으로 관찰하지만, 중력의 영향이나 수직 방향으로의 부동 움직임의 관찰에는 적합하지 않다.

이 실험에서 온도 제어기가 있는 현미경 스테이지를 90°로 회전시킨 반전된 현미경에 부착하였다. 규조류의 온도 에 의존하는 수직 운동이 성공적으로 기록되었습니다. 이 방법을 사용하면 그림4와 같이 규조류의 수직 운동 궤적이 검출되었습니다. 100명의 규조류를 관찰한 결과, 평균 속도는 실온에서 7.01 μm/s, 40°C에서는 470.1 μm/s였습니다. 분조류 세포의 수직 부동 현상에 대한 열 대류의 효과는 직접 관찰을 통해 시각화되었습니다.

Figure 1
도 1: 현미경 단계에 고정된 장치의 사진. 현미경 단계에 고정 된 장치의 외관. 이 장치는 4 개의 나사로 현미경 단계에 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : 고무 히터의 온도 분포. 열화상에 의해 측정된 고무 히터의 분포. 히터 온도를 주변 온도에서 35°C, 45°C, 55°C 및 65°C로 단계적으로 변화시켰습니다. 온도는 각 온도에서 히터에 균일하게 분포되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 온도 신호의 응답성. 이는 설정된 온도가 30°C에서 50°C로 상승되고 50°C에서 30°C로 낮아질 때의 반응을 나타낸다. 설정 온도는 5°C 단위로 변경되었다. 안정한 상태에서, 측정된 온도는 설정된 값의 ± 1.5°C 이내이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 규조류 운동의 궤적. 온도 변화로 인한 규조류 운동의 수직 궤적이 플롯되었습니다. 파란색 선은 27.06s의 경우 25 °C에서 규조류 세포의 궤적을 표시하고 0.2 s의 경우 40 °C에서 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 1
추가 그림 1: 알루미늄 플레이트의 설계 도면(치수). (A) 플레이트는 두께 2mm x 너비 150mm x 길이 200mm이며, 고무 히터를 삽입할 수 있도록 직경 101mm의 구멍을 중심으로 합니다. 각 플레이트 가장자리에는 고무 밴드가 무대에 고정 된 샘플을 부착 할 수있는 두 개의 가공 된 발톱이 있습니다. 이 수직 스테이지를 4mm 나사로 현미경에 부착하려면 4.2mm 나사 구멍을 중앙 구멍을 둘러싼 4개 위치에서 드릴링합니다. (B) 플레이트는 두께 5mm x 너비 150mm x 길이 200mm이며, 직경 130mm의 구멍이 있습니다. 무대 전체에 샘플 고정 고무 밴드의 부착을 허용하기 위해 최전선 플레이트의 발톱 위치를 일치시키기 위한 기계 노치 위치. 현미경에 스테이지를 부착하기 위해 4.2mm 나사 구멍 4개가 최전방 플레이트에 있는 것과 일치하는 위치에 드릴링됩니다. (C) 플레이트는 두께 4mm x 너비 150mm x 길이 200mm이며, 직경 130mm의 구멍이 있습니다. 플레이트의 오른쪽 200mm 면의 중심에서 중앙 구멍의 깊이까지 30mm 스팬이 절단됩니다. 컷 아웃의 목적은 오른쪽에 히터 커넥터의 부착을 허용하는 것입니다. 최전선 플레이트와 동일한 위치에서 4.2mm 나사 구멍을 뚫어 현미경으로 스테이지를 부착합니다. (D) 플레이트는 두께 1.5mm x 너비 150mm x 길이 200mm이며, 직경 30mm의 구멍이 있습니다. 최전선 플레이트와 동일한 위치에서 4.2mm 나사 구멍을 뚫어 현미경으로 스테이지를 부착합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
보조 그림 2: 알루미늄 플레이트의 설계 도면(치수 제외). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
보조 그림 3: 알루미늄 받침대의 디자인 도면. (A) 상부에 설치 : 직경은 100mm, 두께는 3mm입니다. 직경 30mm의 구멍을 중앙에 뚫고 한쪽면에 폭 42mm x 깊이 30mm의 컷아웃이 이루어집니다. (B) 하측에 설치 : 직경은 100mm, 두께는 4mm입니다. 30mm 직경의 구멍이 중앙에 뚫리고, 3개의 3mm 구멍이 중심에서 25mm 의 거리에서 서로 120°에 배치되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
보조 그림 4: 가압 코르크 디스크의 디자인 도면. (A) 실리콘 고무 히터와 상부 알루미늄 받침대 사이의 상부에 설치 : 직경은 100mm, 두께는 2mm입니다. 20mm 직경의 구멍을 중앙에 뚫고 두 개의 컷(폭 42mm x 깊이 30mm, 너비 4mm x 40mm)을 디스크 측면에 서로 직각으로 만듭니다. (B) 실리콘 고무 히터와 하부 알루미늄 받침대 사이의 하측에 설치하려면 직경이 100mm, 두께는 1mm입니다. 직경 20mm의 구멍이 중앙에 뚫려 있습니다. (C)이 지원은 폭 42mm × 30mm 깊이, 직경 100mm 디스크의 둘레에서 절단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
추가 그림 5 : 실리콘 고무 히터의 사양. 직경은 100mm, 두께는 2.5mm입니다. 직경 20mm의 구멍이 중앙에 뚫려 있습니다. 전원 공급 장치는 12V이며 18W 부하 용량입니다. 히터는 전극에 연결된 리드 와이어와 니크롬 와이어로 구성되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
보조 도 6: 현미경 단계의 단면. 이것은 현미경 단계의 단면도입니다. 알루미늄 받침대는 후면 알루미늄 플레이트에 부착되고 고무 히터는 가장 바깥쪽 표면에 설치됩니다. 압착 코르크는 고무 히터와 알루미늄 받침대 사이의 절연을 위해 설치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
추가 그림 7: 회로도의 세부 정보입니다. 이는 컨트롤러에 내장된 회로를 나타냅니다. 회로도는 개별 기능에 따라 9부분으로 나뉩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
보조 그림 8: 플라스틱 컨트롤러 케이스의 디자인 도면. 치수는 길이 143.9mm x 깊이 85.3mm x 너비 25mm입니다. 온도 설정 노브, 작동/과열 램프 및 표시등은 플라스틱 컨트롤러 케이스에 있습니다. 온도는 세트 노브를 돌려 표시기를 보면서 설정할 수 있습니다. 이 노브를 누르면 온도 컨트롤러가 시작됩니다. 측정된 온도가 실시간으로 표시되고 히터가 제어되어 설정된 온도에 도달하고 유지됩니다. 온도 컨트롤러가 켜지면 히터가 작동되는 동안 파란색 LED가 켜지고 불이 켜집니다. 히터가 과열되면 빨간색 LED가 켜지고 히터가 자동으로 중지됩니다. 온도 컨트롤러 노브를 다시 누르면 중지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
추가 그림 9: 시스템 구성. 통합 컨트롤러가 있는 현미경 스테이지는 전용 케이블이 있는 고무 히터에 연결됩니다. 측정된 샘플 온도 신호가 수신되고 고무 히터에 전류가 컨트롤러에 의해 전달됩니다. 컨트롤러에서 측정된 신호는 인터넷 라우터를 통해 서버로 무선으로 전송됩니다. 서버는 분석 및 그래프를 위해 측정 데이터를 컴파일합니다. 온도 로그 모니터링 및 온도 설정은 PC 또는 스마트폰을 통해 원격으로 제어할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 10
보충 그림 10: 열화상에 의한 온도 분포 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

움직이는 규조류 세포의 궤적 분석은 규조류 운동성을 평가하는 데 유용한 접근법입니다. 그러나, 일반적인 반전된 현미경은 견본을 수평으로 관찰하는 동안, 수직 방향으로 중력 또는 부동 운동의 영향의 관측에 적합하지 않습니다. 여기에서 개발되고 기술된 것은 온도 제어를 가진 수직 현미경 단계이고 90°에 의해 회전된 반전된 현미경에 붙어 있습니다. 온도 조절이 있는 이 현미경 단계는 규조류 세포의 온도 의존적 수직 운동을 관찰할 수 있게 합니다.

프로토콜 내에서 중요한 단계는 컨트롤러 회로 설계입니다. 안전을 보장하기 위해 차단기 회로가 구현되었습니다. 센서가 샘플에서 분리되거나 마이크로 컨트롤러가 제대로 작동하지 않으면 히터에 대한 전류가 마이크로 컨트롤러와 다른 회로에 의해 차단됩니다.

제어 계통이 히터의 전류를 제어하기 위해 PID 시스템을 채택했기 때문에 PID의 최적의 파라미터를 찾는 기술이 필요합니다. 기존 방식과 비교하여 Wi-Fi 기능, 서버의 데이터 수집 및 온도 설정 기능으로 원격 작동 및 모니터링이 가능합니다. 현미경에 부착 된 단계 부분의 구조가 복잡하기 때문에이 구조의 단순화는 미래의 연구를 보증합니다.

이 장비는 히터를 사용하여 온도를 올리지만 냉각은 전원이 공급되지 않습니다. 따라서 설정된 온도는 실온 이하일 수 없습니다. 시료를 실온보다 낮은 온도로 냉각하려면 복잡한 냉각 장치가 필요하며, 이는 향후 작업을 위해 고려 중입니다.

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Disclosures

저자는 공개할 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 아무런 인정이 없습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC adapter 12V2A Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. AD-D120P200 Tokyo, Japan
ADS1015 Substrate Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. adafruit PRODUCT ID: 1083 Tokyo, Japan
Alminium Plate (Back Side Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 1.5mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Forefront Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 2mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Lower Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 4mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Upper Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 5mm Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Lower Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Upper Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution Sigma-Aldrich Co. LLC B5282-500ML St. Louis, USA
Controller Case Marutsu Elec Co., Ltd. pff-13-3-9 Tokyo, Japan
CPU Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. ESP-WROOM-02D Tokyo, Japan
Inverted microscope Olympus Corporation CKX 53 Tokyo, Japan
Low temperature hardening epoxy resin adhesive ThreeBond Co., Ltd. TB2086M Tokyo, Japan
Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. 3296W-1-501LF Tokyo, Japan
OLED module Akihabara Inc. M096P4W Tokyo, Japan
Pressed Cork (For supporting electrode ) Tera Co., Ltd. W 42mm×L 30? Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Lower Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 0.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Upper Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Rotary encoder with switch with 2 color LED Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. P-05772 Tokyo, Japan
Silicone rubber heater Three High Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Kanagawa, Japan
Substrate Seeed Technology Co., Ltd. mh5.0 Shenzhen, China
Temperature sensor Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. NXFT15XH103FA2B050 Tokyo, Japan
Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V Marutsu Elec Co., Ltd. BR301 Tokyo, Japan
Universal Flexible Arm Banggood Technology Co., Ltd. YP-003-2 Hong Kong, China
USB cable USB-A - MicroUSB Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. USB CABLE A-MICROB Tokyo, Japan
Video Canera Sony Corporation HDR-CX590 Tokyo, Japan

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