Sıcaklık kontrol fonksiyonlu dikey gözlem için mikroskop aşamasının imalatı

Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada sunulan bir örnek konteyner dikey mikroskop üzerine monte edilmesini sağlayan bir sıcaklık kontrollü mikroskop aşaması kullanarak bir protokoldür.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matsukawa, Y., Ide, Y., Umemura, K. Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function. J. Vis. Exp. (149), e59799, doi:10.3791/59799 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Numuneler genellikle mikroskobik gözlem için yatay bir mikroskop aşamasına yerleştirilir. Ancak, bir örnek ya da çalışma ayakta davranışında yerçekimi etkisini gözlemlemek için, dikey mikroskop sahne yapmak için gereklidir. Bunu başarmak için, 90 ° tarafından eğilmiş bir yan ters mikroskop geliştirdi. Bu mikroskop ile numuneleri gözlemlemek için, Petri yemekleri veya cam slaytlar gibi numune konteynerleri dikey olarak sahneye sabitlenmelidir. Bir dikey mikroskop aşamasında yerinde örnek konteynerleri güvenli bir cihaz geliştirilmiştir ve burada açıklanmıştır. Bu cihazın aşamasına bağlanma, dikey düzlemde örnek dinamiklerin gözlemlenmesi sağlar. Bir silikon kauçuk ısıtıcı kullanarak sıcaklık düzenleyen yeteneği de sıcaklık bağımlı örnek davranışları gözlem izin verir. Ayrıca, sıcaklık verileri bir internet sunucusuna aktarılır. Sıcaklık ayarları ve günlük izleme, bir PC veya akıllı telefondan uzaktan kontrol edilebilir.

Introduction

Optik microskopi lensler ve görünür ışık ile bir örnek büyütme yoluyla gözlemlenebilir detayları artırmak için kullanılan bir tekniktir. Optik mikroskobik olarak, ışık bir numune üzerine yönlendirilir, sonra iletilen, yansıtılan, veya floresan ışık gözlem için lensler Büyüteç tarafından yakalanan. Farklı kullanımlar ve gözlem yöntemlerini karşılayacak tasarıma farklı olan çeşitli mikroskop türleri mevcuttur. Farklı tasarımlar yukarıdan gözlem için aşağıdan bir numune aydınlatmak için yapılandırılmış bir dik mikroskop, ve aşağıdan gözlem için yukarıdakinden örnek aydınlatır ters bir mikroskop içerir. Dik mikroskoplar en yaygın ve yaygın olarak kullanılan tasarımtır. Ters mikroskoplar genellikle bir merceğin alt kısmına yapışmış olan kültürlü hücreler gibi, yukarıdakinden uzakta bir lensin kapanmasına izin veremiyor örnekleri gözlemlemek için kullanılır. Birçok araştırma grubu, ters mikroskoplar1,2,3,4,5,6,7kullanarak çok çeşitli alanlarda gözlemler bildirdi. Ters mikroskopların özelliklerinden yararlanan birçok ek cihaz da geliştirilmiştir8,9,10,11,12,13 .

Şu anda, tüm konvansiyonel mikroskop tasarımları, mikroskop sahne yatay ve bu nedenle dikey düzlemde hareket üreten numunelerin gözlem için uygun değildir, (nedeniyle yerçekimi, buoyancy, hareket, vb.). Bu gözlemleri mümkün kılmak için mikroskop aşaması ve ışık yolu dikey olarak döndürülmelidir. Dikey aşama, cam slaytları veya Petri yemekleri gibi örnek konteynerleri sahneye dikey olarak takmak için gereklidir. Bu adrese, 90 ° tarafından eğilmiş bir yan ters mikroskop zaten geliştirildi. Ancak, teyp veya diğer yapıştırıcılar ile örnekleri ekleme gerekli uzun vadeli hareketsizlik vermez. Burada açıklanan gerekli istikrar elde edebilirsiniz bir cihazdır. Bu cihaz, dikey düzlemde örnek hareketin zaman içinde gözlem izin verir. Silikon kauçuk ısıtıcı montajı aynı zamanda örnek davranıştaki sıcaklık varyasyonunun etkisini gözlemlemek için de mümkün hale gelmiştir. Sıcaklık verileri Wi-Fi ile bir internet sunucusuna aktarılır ve sıcaklık ayarları ve günlük izleme, bir PC veya akıllı telefondan uzaktan kontrol edilebilir. Bizim bilgimize göre, 90 ° tarafından eğilmiş bir yan eğimli mikroskop bağlı sahne henüz önceki çalışmalarda rapor edilmedi.

Mikroskop sahne üç alüminyum plaka oluşur. Orta alüminyum plaka, sahneye takılan alt alüminyum plakaya monte edilmiştir. Sıcaklık sensörünü içeren silikon kauçuk orta ve üst alüminyum plakalar arasında takılır. Kauçuk Bantlar numuneyi yapıştırabilir. Pençeleri, kauçuk bantların güvenliğini sağlamak için üst alüminyum plakanın sol ve sağ dört noktaya eklenir. Sıcaklık regülatörünün kontrol devresi, silikon kauçuktan gömülü sıcaklık sensöründen bir sinyal alır ve darbe genişliği modülasyonu (PWM) yöntemiyle elektrik gücünü modüle eder. Sıcaklık 1 °C artışlarla kademeli olarak 50 °C ' ye yükseltilebilir. Bu cihaz, dikey örnek hareketleri sıcaklığa bağlı olabilir uygulamalar için yararlıdır.

Bu raporda diatomların yüzen fenomen üzerinde sıcaklık etkileri örnekleri sağlar. Diatom gözlem çalışmaları örnekleri, hücre kümeleri sedimentasyon hızı ölçümleri, hareket analizleri, Ultrafine yapı çalışmaları, vb bildirilmiştir14,15,16,17 , 18 , 19 , 20 tane , 21 , 22 , 23. fotosentetik organizmalar ile suda yüzen diatomların spesifik yerçekimi su daha biraz daha yüksektir, bu yüzden lavabo eğilimindedir; Ancak, hatta hafif konveksiyon meydana ise yükselecektir. Bu fenomeni incelemek için, bir cam slayt mikroskop aşamasına dikey olarak yapıştırılmıştır ve artan sıcaklığın diatom dikey hareketine etkileri gözlenmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tasarım

  1. Alüminyum plakalar imalatı
    1. 150 mm x 200 mm x 2 mm ebatlarında alüminyum plakanın merkezinde 101 mm 'lik bir delik kesebilir ve lazer işleme makinesi ile ön planda plaka olarak kullanılacaktır. Makine pençeleri sekiz noktadan uzunluğa iki lastik bandı yapıştırın veya Bu plakanın genişliği boyunca iki (bkz. ek Şekil 1a ve ek Şekil 2a).
    2. Bir lazer işleme makinesi ile orta üst plaka olarak kullanılmak üzere başka bir 150 mm x 200 mm x 5 mm alüminyum plaka merkezinde bir 130 mm delik kes. Lastik bantları uzunluğu boyunca iki noktaya takmak için sekiz çentikler veya Bu plakanın genişliğinin iki tarafında (bkz. ek Şekil 1B ve ek şekil 2B).
    3. 150 mm x 200 mm x 4 mm alüminyum plakanın merkezinde 130 mm 'lik bir deliği kesme, lazer işleme makinesi ile orta alt plaka olarak kullanılmak üzere (bkz. ek şekil 1C ve ek şekil 2C).
    4. 150 mm x 200 mm x 1,5 mm alüminyum plakanın ortasında 30 mm 'lik bir deliği temel plaka olarak kullanılacak şekilde keser (bkz. ek şekil 1D ve ek şekil 2D).
  2. İki alüminyum Kaide imalatı
    1. Alüminyum plakanın (100 mm çapı, 3 mm kalınlığında) merkezinde 30 mm 'lik bir deliği keser ve bir taraftan 42 mm genişliğinde x 30 mm derinlikte bir çentik yapın (bkz. ek Şekil 3A).
    2. Alüminyum plakalı (100 mm çap, 4 mm kalınlığında) plakanın ortasına 30 mm 'lik bir delik kesebilir ve merkezden 25 mm 'lik üç 3 mm 'lik delik, birbirinden 120 ° aralıklı (bkz. ek şekil 3B).
  3. Üç preslenmiş mantar diski imalatı
    1. Bir su jeti kesme makinesi ile preslenmiş mantar diski (100 mm çapı, 2 mm kalınlığı) merkezinde 20 mm delik kes. X 30 mm derinlikte bir kesim 42 mm, sonra bir kesim 4 mm genişliğinde x 5 mm derinlikte olun (bkz. ek Şekil 4A).
    2. 100 mm çapı, 1 mm kalınlığında su jeti kesme makinesi ile preslenmiş mantar diskinin merkezinde 20 mm 'lik bir delik kesiniz. X 30 mm derinlikte bir kesim 42 mm, 4 mm genişliğinde x 40 mm derinlikte bir kesim yapın (bkz. ek Şekil 4b).
    3. 42 mm genişliğine ve 30 mm derinliğine sahip 100 mm çap diskten preslenmiş mantar plakasını keser. 1 mm kalınlığında iki yaprak ve 2 mm kalınlığında bir levha gereklidir (bkz. ek şekil 4c).
  4. Silikon kauçuk ısıtıcı imalatı
    1. Dahili Nichrome tel ile 2,5 mm kalınlığında silikon kauçuk 100 mm çap disk kullanarak bir ısıtıcı imal ve diskin merkezinde 20 mm delik kesti ( ek Şekil 5bakın).
  5. 1.1 – 1.4 adımlarında açıklanan parçaları, ek Şekil 6 ' da gösterildiği gibi istifleyerek birleştirin.
  6. Mikroskop sahne oluşturmak için, ek Şekil 6, mikroskop sahne çapraz bölümüne bakın. Düzelt Equation 1 Equation 2 , sonra Equation 3 ve Equation 4 vidalarla. Fix Equation 4 ve Equation 5 vida ile. Düzeltmek Equation 2 ve Equation 3 , Equation 6 Equation 5 Equation 7 Equation 7 Equation 8 ve, ve, ve Equation 5 ve ve yapışkan Equation 9 ile. Equation 6

2. donanım tasarımı anahatlar

  1. Tamamlayıcı Şekil 7' de gösterildiği gibi bir "güç kaynağı ve programlama devresi" hazırlayın. AC adaptörüne bağlı J4 terminalinden ısıtıcı denetleyiciye 12 V DC sağlayın. CPU besleme voltajı 3,3 V DC olduğundan, devre güç kaynağı için bir regülatör kullanarak 12 V DC 'den 3,3 V DC 'ye kadar voltajı azaltın.
    Not: USB 1, 5 V DC ve geliştirme PC seri sinyali için bir terminaldir. 5 V DC gerekli olmasa da, CPU 'YU programlamak için güç kaynağı olarak kullanılır. Bu da regülatör tarafından 3,3 V DC dönüştürülür. J1 programlama sırasında bir kontrol sinyali terminalidir. Bu devre, ek Şekil 8' de gösterilen denetleyici durumda barındırılıyor.
  2. Tamamlayıcı Şekil 7' de gösterildiği gibi bir "Isıtıcı kontrol devresi" hazırlayın. Q5 (P kanallı MOS FET) ile 12 V DC 'ye geçin ve ısıtıcıya sağlayın. Q5, ısıtıcı için sağlanan güç miktarını ayarlamak için PWM ile 12 V DC 'yi denetleyen bir anahtarlama elemanıdır.
    Not: devre, ısıtıcıya voltaj temin edildiğini görsel olarak teyit etmek için bir LED içerir. Bu sürücü sinyali (HEATER_C) IŞLEMCININ PWM sinyalidir. Koruma devresi tarafından aşırı ısınma sinyali algılandığında, BREAKER sinyali LOW 'a geçer ve MOS-FET ' i k i operasyon durur. Bu devre, ek Şekil 8' de gösterilen denetleyici durumda barındırılıyor.
  3. Tamamlayıcı Şekil 7' de gösterildiği gibi "ısıtıcı ünitesi için bağlayıcı devresi" hazırlayın. Isıtıcı bölümü ile bağlantı için bir USB konektörü takın.
    Not: Bu devre, ek Şekil 8' de gösterilen denetleyici durumda barındırılıyor.
  4. Tamamlayıcı Şekil 7 ' de gösterildiği gibi "sıcaklık sensörü için bağlayıcı devresi" hazırlayın. Sıcaklık sensörünü bağlamak için konnektörü (Euroblock alıcı 2P) takın.
    Not: Bu devre, ek Şekil 8' de gösterilen denetleyici durumda barındırılıyor.
  5. Ek Şekil 7' de gösterildiği gibi bir "a/D dönüştürücü" IÇIN, ads 1015 ' i bir ad dönüştürme aygıtı olarak kullanın.
    Not: AD dönüştürme cihazı, sıcaklık sensörü ve aşırı ısınma algılama sensörünün değerlerini, voltajdan dijital değerlere dönüştürür. Bu, 12 bitlik Multiplexer AD dönüştürme cihazdır ve ı2C arabirimiyle CPU 'ya bağlanır. Bu devre, ek Şekil 8' de gösterilen denetleyici durumda barındırılıyor.
  6. Aşırı ısı algılama sensörü (OHS) sinyalini OP amp 'ın ters girme girişine bağlayarak, ek Şekil 7 ' de gösterildiği gibi bir "koruma devresi" yapın. Bu sinyali, ters çevrilme olmayan girişe bağlı düzeltici direnç gerilimi ile karşılaştırın.
    1. Voltaj düzeltici direnç voltajından daha düşük olduğunda, OP amplifikatörünün çıktısı yüksek gider, bağlı NPN Transistör Q2 açık ve BREAKER sinyali düşük gider emin olun.
    2. Aynı zamanda, S4 açık ve bağlı aşırı ısı göstergesi LED D6 yanar emin olun.
      Not: Bu devre, ek Şekil 8' de gösterilen denetleyici durumda barındırılıyor.
  7. Ek Şekil 7' de gösterildiği gibi bir "ekran bölümü" IÇIN, OLED için 192 x 64 nokta kullanın. I2C arabirimi üzerinden CPU ile bağlanın.
    1. OLED GND ile CPU sinyali IO0 OLED GND bağlı bir NPN Transistör kullanarak OLED ayırmak tarafından sıfırlayın.
      Not: Bu OLED çeşitli bilgi türlerini görüntüler. Bu devre, ek Şekil 8' de gösterilen denetleyici durumda barındırılıyor.
  8. Ek Şekil 7' de "Push SWITCH ile LED & döner enkoder" için, bir itme anahtarı olarak işlev görür ve iki LED içeren bir döner kodlayıcı monte edin.
    1. Güç LED 'i olarak kullanılmak üzere bir LED 'i VCC 'ye bağlayın. Diğer IŞLEMCI ısıtıcı işlemi sırasında bir gösterge olarak kullanılmak üzere bağlı.
    2. CPU 'ya bağlı ısıtıcı Başlat/Durdur için bir itme anahtarı teması kullanın. Döner kodlayıcı A ve B çıkışlarını CPU kesmesi içindeki g/ç girişine bağlayın.
      Not: Bu devre, ek Şekil 8' de gösterilen denetleyici durumda barındırılıyor.
  9. Ek Şekil 7CPU IÇIN, wroom CPU kullanın-02d.
    1. Ekranın arabirimi I2C standardıdır, çünkü IO12, IO13 "ekran ünitesine" çıktı. IO0 "ekran ünitesine" bağlayın ve OLED sıfırlamak.
    2. IO15 "Isıtıcı kontrol ünitesi" Bağlan ve PWM çıkışı ile ısıtıcı için sağlanan güç kontrol.
    3. IO2 "Push Switch ile döner kodlayıcı LED &" bağlayın ve START LED 'i yanar. IO4 ve IO14 bağlayın "Push Switch ile döner kodlayıcı LED &" ve ayarlamak sıcaklık belirlemek için döner Encoder gelen sinyalleri (REA ve REB) almak. IO5 "Push Switch ile döner kodlayıcı LED &" bağlayın ve ısıtıcı başlatmak/durdurmak.

3. yazılım tasarım anahat

  1. Kullanım Arduino CORE WROOM için-02D CPU için bu sistem için denetleyici olarak.
    Not: giriş cihazları olarak, başlangıç/durdurma anahtarı, döner kodlayıcı, sıcaklık sensörü (termistör) kullanılır. Çıkış cihazları olarak, bir LED, karakter ekranı (OLED) ve ısıtıcı kullanılır. İletişim cihazı Wi-Fi kullanır.
  2. İşlemin anahattı
    1. Ek Şekil 7' de itme anahtarı ile LED & döner kodlayıcı olarak gösterildiği gibi döner kodlayıcı çalışmasını algılamak, set sıcaklığı olarak saklamak ve OLED üzerinde görüntüler. REA ve REB faz terminallerinin bir kesme giriş terminali olarak bağlı olduğu CPU 'nun giriş terminalini ayarlayın ve döner Encoder 'ın rotasyonunu (ileri ve geri) keserek işlemi yapın. İleri döndürme için + 1 ve ters döndürme için-1 olarak ayarlayın. Küresel değişkene ayarlanan sıcaklığı yazın ve ısıtıcı sıcaklık kontrolü için kullanın. Aynı zamanda, OLED set sıcaklık ekranı güncelleyin.
    2. Başlatma/durdurma anahtarı (SW-S) ile CPU GÇ 5 ' in CPU 'da gösterildiği gibi başlangıç ve durdurma ayarını tanımlayın. Başlangıç/durdurma anahtarının durumu, her 50 MS 'de bir Zamanlayıcı kesme işlemidir.
      Not: anahtar bir anlık anahtar olduğundan, itilir ve serbest bırakıldığında başlatma/durdurma durumunu tersine çevirir. Bu durum, genel değişkende depolanır.
    3. Sıcaklık sensörü için bir termistör kullanın. Numune sensöründen ölçülen değerleri okuyun ( ek Şekil 7' de "ısıtıcı bağlantısı için bağlayıcı devresi" konusuna bakın) A/d dönüştürücüsünün ardından CPU 'Ya ( ek Şekil 7' de "a/d dönüştürücü" konusuna bakın). Takviyesi Şekil 7"CPU" IO15 portu açarak ısıtıcı için akım kaynağı.
      Not: iki tip sıcaklık sensörü vardır. Bir numunenin sıcaklığını ölçmek ve ayarlanan sıcaklıkta Isıtıcı kontrol ve diğer bir ısıtıcı bağlı ve ısı önleme için kullanılan kullanılır. Bir direnç yoluyla 3,3 V 'ye termistör bağlayın ve voltaj değişikliği olarak direnç değişikini kaydedin. Hareketli ortalama yönteme göre bir gürültüyü kaldırın.
    4. Sıcaklık önleme sıcaklık sensörü için bir termistör kullanın. Aşırı ısı tespiti, ek Şekil 7' de bir termistör (R2) ("ısıtıcı bağlantısı için bağlayıcı devresi") kullanılarak gerçekleştirilir ve set değeri aşıldığında, ısıtıcı akımı kapatılır ( ek Şekil 7' de "devresi koruyun").
      Not: Bu sensör CPU üzerinden değil, bir devre içine dahil edilmiştir. Bu sensör, CPU 'dan bağımsızdır ve direnç düzeltici tarafından belirlenen direnç değerine göre bir diferansiyel amplifikatör ile analog bir şekilde karşılaştırılır. Bu sıcaklık ayarlanan değeri aştı algıladığında, bu ısıtıcı için akım kontrol ve zorla geçerli kaynağı durdurur FET anahtarı, müdahale. Amacı, CPU düzgün çalışmaz bir durumda bile belirli bir seviyede aşan ısıtıcı sıcaklığını önlemek için.
    5. Cihaz operasyonda olduğunda ( ek Şekil 7' nın "CPU" nda) CPU tarafından ek Şekil 7 ' nin "push Switch ile LED & döner kodlayıcı" LED 'i açın.
    6. CPU ( ek Şekil 7' de "CPU") tarafından ek Şekil 7 ' nin "ekran bölümünde" OLED için ayarlanan sıcaklık ve ölçülen değeri görüntüleyin.
    7. Kontrol etmek için CPU PWM ile ek Şekil 7 "Isıtıcı kontrol devresi" içinde fet anahtarı sürücü ısıtıcı.
    8. Sıcaklık sensörü tarafından elde edilen ölçülen sıcaklıklara dayalı olarak ısıtıcı ile PID 'yi kontrol etme. PID işleme için Arduino 'nun pid_v1. h kütüphanesini kullanın.
      Not: CPU süreyi kalibre eder, sunucu ile iletişim kurar, veri aktarır ve sunucudan yönergeler alır. Sensör sıcaklığı ayarlanan sıcaklığı aştığında, ısıtıcı için geçerli 0 olarak ayarlanır ve overshoot bastırılır.
    9. CPU 'nun yerleşik Wi-Fi bağlantı fonksiyonunu kullanın ve Internete bağlanın. İletme sıcaklık, ısıtıcı sıcaklığı, vb. Wi-Fi tarafından belirlenmiş sunucuya ayarlayın.

4. sistem konfigürasyonu

  1. Sistemi Tamamlayıcı Şekil 9' a göre oluşturun.
  2. Kontrol cihazı ile bir Wi-Fi donatın.
  3. Sıcaklık ölçümü için sensör olarak bir termistör kullanın. Termistör kabloyu kontrol ünitisindeki "sensör" terminaline bağlayın. Termistör tarafından ölçülen sıcaklık sinyalini alın.
  4. Kauçuk ısıtıcı ve özel bir kablo ile denetleyici durumda "ısıtıcı" içeren bir mikroskop sahne bağlayın. Geçerli kauçuk Isıtıcı kontrol.
  5. Kumanda üzerindeki düğme ile ayarlanan sıcaklığı değiştirin.
    Not: sıcaklık günlüğü izleme, sıcaklık ayarı bir PC veya akıllı telefondan uzaktan çalıştırılabilir.
  6. Ölçüm sıcaklığını, ayarlanan sıcaklığı ve zaman bilgisini denetleyicisinden internet üzerinden sunucuya aktarabilir. Veri ölçüm döngüsü süresi 5 s ve sunucuya veri aktarımı için çevrim süresi 1 dakikadır.
  7. Sunucu denetleyici tarafındaki düzenli aralıklarla erişim ve analiz ve grafik için sunucu denetleyici CPU saklanan ölçüm verilerini aktarmak.
  8. Sunucunun nasıl çalıştırılacağı konusunda ek malzemeye bakın.

5. yan ters mikroskopla tasarım

  1. Temel bir montaj oluşturmak için vidalar ile dikey olarak 15 mm kalınlığında iki alüminyum plaka düzeltin.
  2. Taban montajının yatay kısmına bir jig (bir yer) takın.
  3. Mikroskop sahne parçasını dikey olarak yerleştirin, temel standın dikey kısmına Jigs (iki yer) takın ve mikroskop alt kısmını baz standı ile düzeltin.
  4. Vida ile mikroskop sahne düzeltin.

6. operasyon yöntemi

Not: burada, kullanılan örnek Bold değiştirilmiş bazal tatlı su besin solüsyonu sıvı kültür orta, sodyum metasilicate, vitaminler ve steril su bir karışımıdır. 800 bu örnekteki μL 10 mL taze su ortamında seyreltilir.

  1. Gözlem yöntemi
    1. Hazırlanan numunenin 1.000 μL değerini kendi kendine yapılmış cam odasına enjekte edilir.
      Not: Self-yapılmış cam odası paralel iki slayt gözlük düzenler ve bir yapıştırıcı ile giderir. Normal bir petri çanak büyük bir kalınlık ve hücreler odasında derinlik yönünde kaçmak, zor bir mikroskop ile gözlemlemek için yapım. Bunu önlemek için, küçük bir derinlik yönü olan oda yapılır, bu da hücrelerin odanın derinliği yönünde kaçmasını önlemek için mümkün kılar. Düşük sıcaklık tedavi edilebilir epoksi reçine yapıştırıcı, örnek odasından bırakarak önlemek için cam etrafında bağ için kullanılır.
    2. Mikroskop için ayrı olarak hazırlanmış bir video kamera takın. Mikroskop özel objektif adaptörü kullanarak bir video kamera bağlayın ve örnek ateş.
    3. 10X mercek ve 200x objektif ile mikroskop kullanın.
    4. 4 mm vida ile dört yerde bir mikroskop için dikey mikroskop sahne takın.
      Not: bkz. ek Şekil 1a ve ek Şekil 2a alüminyum plakalar tasarım çizimleri için. Bu deneyde tersine çevrilmiş bir mikroskop kullanıldı. Bu 90 ° tarafından eğilmiş ve fabrikasyon mikroskop sahne vida ile yapıştırılmıştır. Bkz. Şekil 1.
    5. Dört pençeleri uzunlamasına yapılan kullanarak iki kauçuk bantları ile örnek güvenli. Bir numuneyi zemin yüzeyine dik bir mikroskop aşamasına yerleştirin.
    6. Ek Şekil 8' de gösterilen kontrolör ile sıcaklığı 40 °c ' ye ayarlayın. Sıcaklık ayarlamak için denetleyici düğmesini açın. Ekranda ayarlanan sıcaklığı kontrol edin. Sıcaklık kontrolünü başlatmak için düğmeye basın ve mavi LED yanar. LED 'i kapatmak ve sıcaklık kontrolünü durdurmak için düğmeye tekrar basın.
      Not: ölçülen sıcaklık gerçek zamanlı olarak görüntülenir ve ısıtıcı set sıcaklığına ulaşmak için kontrol edilir. Sıcaklık kontrolü başladığında, mavi LED yanar ve ısıtıcı çalışırken böylece kalır. Isıtıcı aşırı ısınır, kırmızı LED ışıkları ve ısıtıcı otomatik olarak durur.
    7. Sunucu işlemi için ek bilgilerde "sunucu kullanım kılavuzu" konusuna bakın.
      Not: veri depolama için bir sunucu gereklidir. Sunucunun veritabanı My-SQL kullanır.

7. kauçuk ısıtıcı yüzey sıcaklığı dağılımı ölçümü

  1. Sıcaklık tekdüzelik kontrol etmek için termografi ile kauçuk ısıtıcı yüzey sıcaklığı dağılımı ölçmek.
  2. Kauçuk ısıtıcıyı stand ile birleştiren mikroskop aşamasını takın.
  3. Kauçuk ısıtıcı yüzeyinin ayar sıcaklığını 35 °C, 45 °C, 55 °C ve 65 °C ' ye değiştirin ve öndeki termografiye göre ölçer ( ek Şekil 10' a bakın).

8. sıcaklık tepkisi testi

  1. Örnek ayar sıcaklığını 30 °C ' ye ayarlayarak sıcaklık kontrolünü başlatın. Ölçüm değeri 30 °C ' ye ulaşıncaya kadar bekleyin ve stabilize eder. Önceden belirlenmiş sıcaklığı 5 °C ile 30 °c ' den 50 °C ' ye kadar artırın ve ölçülen değerin ilgili önceden belirlenmiş sıcaklığı takiben stabilize edilmesini bekleyin.
  2. Ön ayarlı sıcaklığı 5 °C ' den 30 °C ' ye 50 °c ' ye kadar azaltın ve ölçülen değerin izleme yeteneğini algılayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 2 , kauçuk ısıtıcının sıcaklık dağılımını gösterir. Kauçuk ısıtıcı yüzey sıcaklığı her sıcaklıkta üniforma oldu. Şekil 3 sıcaklık değişikliklerini ayarlamak için ölçülen sıcaklığın yanıt hızını gösterir. Turuncu çizgi ayarlanan sıcaklık ve mavi çizgi gösterir örnek sıcaklık değişikliği gösterir. Ayar değişikine ölçülen değerin overshoot küçük ve izleme hızlıdır.

Bu cihazın kullanımı belirli bir örnek sağlamak için diatom hücreleri gözlendi. Diatom hücrelerinin hareketli yörünge Analizi diatom hücrelerinin motilitesi değerlendirmek için yararlı bir yaklaşımdır. Ancak normal olarak ters çevrilmiş bir mikroskop, numuneyi yatay olarak gözlemlese de, yerçekimi veya yüzen hareketin dikey yönde etkisini gözlemlemek için uygun değildir.

Bu deneyde, sıcaklık kontrolcüsü olan mikroskop aşaması, 90 ° döndürülmüş ters çevrilmiş bir mikroskop ile bağlanmış. Diatomların sıcaklığa bağlı dikey hareketi başarıyla kaydedildi. Bu yöntemle, diatomların dikey hareket Locus Şekil 4' te gösterildiği gibi algılandı. 100 diatomlar ile gözlem sonucunda ortalama hız 7,01 μm/s, oda sıcaklığında ve 40 °C ' de 470,1 μm/s 'dir. Termal konveksiyon diatom hücrelerinin dikey yüzen fenomen üzerinde etkileri doğrudan gözlem tarafından görselleştirildi.

Figure 1
Şekil 1: mikroskop aşamasına sabitlenmiş cihazın fotoğrafı. Aygıtın mikroskop aşamasında sabit görünümü. Cihaz, dört vida ile mikroskop aşamasına sabitlenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: kauçuk ısıtıcının sıcaklık dağılımı. Termografi ile ölçülen kauçuk ısıtıcı dağılımı. Isıtıcı sıcaklığı, ortam sıcaklığından 35 °C, 45 °C, 55 °C ve 65 °C ' ye kadar kademeli olarak değiştirildi. Sıcaklık her sıcaklıkta ısıtıcının üzerinden eşit şekilde dağıtılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: sıcaklık sinyalinin yanıt verme hızı. Bu yanıt, ayarlanan sıcaklık 30 °C ' den 50 °C ' ye yükseltildiğinde ve 50 °C ' den 30 °C ' ye düşürüldüğünü gösterir. Set sıcaklığı 5 °C artışlarla değiştirildi. İstikrarlı durumda ölçülen sıcaklık, set değerinin ± 1,5 °C ' dir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: diatom hareketinin Locus. Sıcaklık değişikliklerinden dolayı diatom hareketinin dikey yörüngeleri çizildi. Mavi çizgiler, 27,06 s için 25 °C ' de ve 0,2 s için 40 °C ' de diatom hücrelerinin yörüngeleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 1
Ek Şekil 1: alüminyum plakalar (boyutları ile) tasarım çizimi. (A) plaka 2 mm kalınlığında x 150 mm genişliğinde x 200 mm uzunluğundadır ve lastik ısıtıcının yerleştirilmesine izin vermek için, merkezli bir 101 mm çapında deliktir. Her plaka kenarı iki işlenmiş pençeleri vardır hangi kauçuk bantları sahne üzerine örnekleri güvenli bağlı olabilir. Bu dikey aşaması 4 mm vidası olan bir mikroskop ile bağlamak için 4,2 mm vida delikleri, merkezi deliği simetrik olarak çevreleyen dört yerde delinir. (B) plaka 5 mm kalınlığında x 150 mm genişliğinde x 200 mm uzunluğunda, merkezli bir 130 mm çapında delik. Makine çentik konumları sahne boyunca numune-güvence kauçuk bantları eki izin ön plaka üzerinde pençe konumları maç. Sahne alanının mikroskopla açılması için, ön planda bulunan konumlara eşleşen konumlarda dört 4,2 mm 'lik vida deliği delinir. (C) plaka 4 mm kalınlığında x 150 mm genişliğinde x 200 mm uzunluğunda, merkezli bir 130 mm çapında delik. 30 mm 'lik bir Aralık, plakanın sağ 200 mm yüzünde, merkezi deliğin derinliğine kadar kesilir. Bu kesme amacı, ısıtıcı konnektörünün sağ taraftaki ataşmanı sağlamaktır. Ön planda olduğu gibi aynı pozisyonlarda, dört 4,2 mm vida deliği bir mikroskop için sahne eki için delinmiş. (D) plaka, 1,5 mm kalınlığında x 150 mm genişliğinde x 200 mm uzunluğunda, ortalanmış 30 mm çapında bir deliktir. Ön planda olduğu gibi aynı pozisyonlarda, dört 4,2 mm vida deliği bir mikroskop için sahne eki için delinmiş. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Ek Şekil 2: alüminyum plakalar (boyutları olmadan) tasarım çizimi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Ek şekil 3: Alüminyum yaylar tasarım çizimi. (A) üst tarafta yüklü olması: çapı 100 mm, kalınlığı 3 mm. Merkezde 30 mm 'lik çap deliği delinir ve 42 mm genişliğinde x 30 mm derinlikte bir kesim bir tarafta yapılır. (B) alt tarafta yüklü olması: çapı 100 mm, kalınlık 4 mm. Merkezde 30 mm 'lik çap deliği delinir ve merkezden 25 mm mesafeden birbirine 3 mm 'lik üç delik 120 konulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Ek Şekil 4: baskılı mantar diskleri tasarım çizimi. (A) silikon kauçuk ısıtıcı ve üst alüminyum Kaide arasında üst tarafında yüklü olması: çapı 100 mm, Kalınlık 2 mm. Ortadaki 20 mm çapında bir delik delinir ve iki kesim (42 mm genişliğinde x 30 mm derinlikte, 4 mm genişliğinde x 40 mm), diskin yanlarında birbirine doğru açılarda yapılır. (B) silikon kauçuk ısıtıcı ve alt alüminyum Kaide arasında alt tarafında yüklü olması: çapı 100 mm, kalınlık 1 mm. Merkezde 20 mm 'lik çap deliği delinir. (C) bu destek 42 mm genişliğinde × 30 mm derinliğindedir ve 100 mm çapında bir diskin çevresinden kesilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Ek Şekil 5: silikon kauçuk ısıtıcı özellikleri. Çap 100 mm ve kalınlık 2,5 mm 'dir. Merkezde 20 mm 'lik çap deliği delinir. Güç kaynağı 12 V, 18 W yük kapasitesine sahiptir. Isıtıcı, elektrot bağlı bir kurşun tel ile Nichrome tel oluşur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Ek Şekil 6: mikroskop aşamasının çapraz bölümü. Bu, mikroskop aşamasının kesit görünümü. Alüminyum Kaide arka alüminyum plakaya takılır ve kauçuk ısıtıcı en dıştaki yüzeye monte edilir. Preslenmiş mantar kauçuk ısıtıcı ve alüminyum Kaide arasında yalıtım için monte edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 7
Ek Şekil 7: devre diyagramının detayları. Bu, kumandanın içinde yerleşik olan devresi gösterir. Devre şeması, bireysel işlevlere göre dokuz parçaya ayrılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 8
Ek Şekil 8: tasarım plastik denetleyici durumda çizim. Boyutlar 143,9 mm uzunluğunda x 85,3 mm Derinlik x 25 mm genişliğindedir. Sıcaklık ayar düğmesi, çalışma/aşırı ısınma lambası ve gösterge plastik kontrol ünitesindeki durumda bulunur. Set düğmesini çevirerek göstergesi izlerken sıcaklık ayarlanabilir. Bu düğmeyi itmek sıcaklık kumandasını başlatır. Ölçülen sıcaklık gerçek zamanlı olarak görüntülenir ve ısıtıcı, ayarlanan sıcaklığa ulaşır ve tutar, böylece kontrol edilir. Sıcaklık kumandası açıkken, mavi LED yanar ve ısıtıcı çalışırken aydınlatmalı olarak kalır. Isıtıcı aşırı ısınır, kırmızı LED geliyor ve ısıtıcı otomatik olarak durur. Sıcaklık denetleyici düğmesini tekrar basmak onu durduracaktır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 9
Ek Şekil 9: sistem yapılandırması. Entegre denetleyici ile mikroskop sahne özel bir kablo ile kauçuk ısıtıcı bağlanır. Ölçülen örnek sıcaklık sinyalleri alınır ve lastik ısıtıcı için akım kontrol cihazı tarafından iletilir. Denetleyiciden ölçülen sinyaller, Internet yönlendiricisi üzerinden sunucuya kablosuz olarak gönderilir. Sunucu, ölçüm verilerini analiz ve grafikleme için derler. Sıcaklık günlüğü izleme ve sıcaklık ayarları bir PC veya akıllı telefon üzerinden uzaktan kontrol edilebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 10
Ek Şekil 10: termografi Ile sıcaklık dağılımı ölçümü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Diatom hücrelerinin hareketli yörünge Analizi diatom motilitesi değerlendirmek için yararlı bir yaklaşımdır. Ancak normal olarak ters çevrilmiş bir mikroskop, numuneleri yatay olarak gözlemlerken, yerçekimi veya yüzen hareketin dikey yönde etkisini gözlemler için uygun değildir. Burada geliştirilen ve açıklanan sıcaklık kontrolü ile dikey bir mikroskop sahne ve 90 ° tarafından döndürülmüş bir ters mikroskop, bağlı. Sıcaklık kontrolü ile bu mikroskop sahne diatom hücrelerinin sıcaklık bağımlı dikey hareket gözlem sağlar.

Protokol içinde kritik bir adım denetleyici devre tasarımıdır. Güvenlik sağlamak için bir kesici devre uygulandı. Sensör örnekten kesildiğinde veya mikrodenetleyici düzgün çalışmadığında, ısıtıcı için akım mikrodenetleyicisinden farklı bir devre ile kesilir.

Kontrol sistemi, ısıtıcı akımı kontrol etmek için PID sistemi kabul beri PID optimum parametre bulmak için bir teknik gereklidir. Mevcut yöntemle karşılaştırıldığında, uzaktan çalışma ve izleme Wi-Fi işlevi, bir sunucu üzerinde veri toplama ve sıcaklık ayarı fonksiyonu ile mümkündür. Mikroskop bağlı sahne bölümünün yapısı karmaşık olduğu için, bu yapının basitleştirme gelecekteki bir çalışma garanti eder.

Bu ekipman sıcaklığı yükseltmek için bir ısıtıcı kullanır, ancak soğutma güç değildir; Bu nedenle, ayarlanan sıcaklık oda sıcaklığında olamaz. Oda sıcaklığından daha düşük sıcaklıklarda soğutma örnekleri, gelecekteki çalışmalar için dikkate alınarak karmaşık bir soğutma cihazı gerektirecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken çatışmalar yok.

Acknowledgments

Yazarların hiçbir onayı yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC adapter 12V2A Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. AD-D120P200 Tokyo, Japan
ADS1015 Substrate Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. adafruit PRODUCT ID: 1083 Tokyo, Japan
Alminium Plate (Back Side Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 1.5mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Forefront Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 2mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Lower Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 4mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Upper Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 5mm Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Lower Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Upper Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution Sigma-Aldrich Co. LLC B5282-500ML St. Louis, USA
Controller Case Marutsu Elec Co., Ltd. pff-13-3-9 Tokyo, Japan
CPU Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. ESP-WROOM-02D Tokyo, Japan
Inverted microscope Olympus Corporation CKX 53 Tokyo, Japan
Low temperature hardening epoxy resin adhesive ThreeBond Co., Ltd. TB2086M Tokyo, Japan
Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. 3296W-1-501LF Tokyo, Japan
OLED module Akihabara Inc. M096P4W Tokyo, Japan
Pressed Cork (For supporting electrode ) Tera Co., Ltd. W 42mm×L 30? Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Lower Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 0.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Upper Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Rotary encoder with switch with 2 color LED Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. P-05772 Tokyo, Japan
Silicone rubber heater Three High Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Kanagawa, Japan
Substrate Seeed Technology Co., Ltd. mh5.0 Shenzhen, China
Temperature sensor Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. NXFT15XH103FA2B050 Tokyo, Japan
Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V Marutsu Elec Co., Ltd. BR301 Tokyo, Japan
Universal Flexible Arm Banggood Technology Co., Ltd. YP-003-2 Hong Kong, China
USB cable USB-A - MicroUSB Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. USB CABLE A-MICROB Tokyo, Japan
Video Canera Sony Corporation HDR-CX590 Tokyo, Japan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
  2. McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
  3. Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
  4. Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
  5. Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. 114-120 (2016).
  6. Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
  7. Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM - selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
  8. Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. 349-357 (1991).
  9. Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
  10. Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
  11. Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
  12. Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
  13. Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
  14. Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
  15. Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
  16. Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
  17. Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields - A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
  18. Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
  19. Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
  20. Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
  21. Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates - potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
  22. Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
  23. Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion - An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics