विवो में अपने एंजियोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए ट्यूमर-असरिंग चूहे में हेरफेर ट्यूमर-संबद्ध न्यूट्रोफिल का स्थानांतरण

Cancer Research

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Summary

यहां, हम ट्यूमर असर चूहों में उनके हस्तांतरण के बाद विरोधी एंजियोजेनिक ट्यूमर संबद्ध न्यूट्रोफिल की चिकित्सीय क्षमता दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग न्यूट्रोफिल गतिविधि पूर्व विवो में हेरफेर करने और बाद में ट्यूमर के विकास में विवो में उनकी कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है. यह संभावित न्यूट्रोफिल-आधारित इम्यूनोथेरपी का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल है।

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Pylaeva, E., Spyra, I., Bordbari, S., Lang, S., Jablonska, J. Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo. J. Vis. Exp. (149), e59807, doi:10.3791/59807 (2019).

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Abstract

ट्यूमरजनन के विनियमन में न्यूट्रोफिल का योगदान बढ़ रहा है। इन कोशिकाओं विषम हैं, और ट्यूमर वातावरण के आधार पर समर्थक या विरोधी ट्यूमर क्षमता के अधिकारी कर सकते हैं. एक ट्यूमर संदर्भ में न्यूट्रोफिल कार्यों को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण साइटोकिन्स में से एक प्रकार मैं interferons हैं. इंटरफेरॉन की उपस्थिति में, न्यूट्रोफिल एंटी-ट्यूमर गुण प्राप्त करते हैं, जिसमें साइटोटॉक्सिसिटी या प्रतिरक्षा प्रणाली की उत्तेजना शामिल है। इसके विपरीत, प्रमुख समर्थक ट्यूमर गतिविधि में एक इंटरफेरॉन संकेतन परिणाम ों की अनुपस्थिति, ट्यूमर एंजियोजेनेसिस की मजबूत उत्तेजना के साथ विशेषता। हाल ही में, हम यह प्रदर्शित कर सकते हैं कि न्यूट्रोफिल के प्रो-एंजिोजेनिक गुण इन कोशिकाओं में निकोटिनमाइड फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफरेज़ (एनएपीटी) संकेतन मार्ग के सक्रियण पर निर्भर करते हैं। ट्यूमर संबद्ध न्यूट्रोफिल में इस मार्ग का निषेध उनके शक्तिशाली विरोधी एंजियोजेनिक फीनोटाइप की ओर जाता है। यहाँ, हम हेरफेर ट्यूमर संबद्ध न्यूट्रोफिल (TANs) के tumorigenic क्षमता के vivo मूल्यांकन में अनुमति हमारे नव स्थापित मॉडल का प्रदर्शन. शीघ्र ही, प्रो-एंजियोजेनिक ट्यूमर-संबद्ध न्यूट्रोफिल ट्यूमर असर interferon कमी चूहों से अलग किया जा सकता है और NAMPT संकेतन के अवरुद्ध द्वारा विरोधी एंजियोजेनिक phenotype में repolarized. इन कोशिकाओं की एंजियोजेनिक गतिविधि बाद में एक महाधमनी अंगूठी परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. एंटी-एंजियोजेनिक टैन्स को ट्यूमर असर वाले जंगली प्रकार प्राप्तकर्ताओं में स्थानांतरित किया जा सकता है और ट्यूमर के विकास की निगरानी 14 दिनों के लिए की जानी चाहिए। दिन में 14 चूहों बलिदान कर रहे हैं, ट्यूमर हटा दिया और उनके संवहनी मूल्यांकन के साथ कटौती. कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल में विवो के लिए एक उपन्यास उपकरण प्रदान करता है प्राथमिक कोशिकाओं की angiogenic क्षमता का मूल्यांकन, जैसे ट्यूमर संबद्ध न्यूट्रोफिल के रूप में, कृत्रिम न्यूट्रोफिल सेल लाइन मॉडल का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना. कुलपति

Introduction

प्रकार मैं इंटरफेरॉन्स (IFNs) neoplasias के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं की उत्तेजना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, प्रकार की कमी के रूप में मैं IFN संकेतन काफी ऊंचा ट्यूमर विकास1में परिणाम . इस प्रक्रिया में शामिल तंत्रों में से एक ट्यूमर-संबद्ध न्यूट्रोफिल की ट्यूमरीनिक गतिविधि का विनियमन है, जिसे कॉलोनी-उत्तेजक कारक 3 रिसेप्टर (सीएसएफ3आर) डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग2द्वारा नियंत्रित किया जाता है। कालोनी-उत्तेजक कारक 3 (सीएसएफ3), या ग्रेनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारक, निकोटिनमाइड फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफरेज(एनएएमपीटी) 3,4. NAMPT Nicotinamide adenine dinucleotide संश्लेषण के लिए एक दर सीमा एंजाइम है, जो ग्लाइकोलिओसिस को बढ़ाता है और डीएनए की मरम्मत को नियंत्रित करता है, जीन अभिव्यक्ति, और तनाव प्रतिक्रिया कैंसर कोशिकाओं के अस्तित्व और प्रसार को बढ़ावा देने5. NAMPT कोलोरेक्टल, डिम्बग्रंथि, स्तन, गैस्ट्रिक, प्रोस्टेट कैंसर और ग्लिओमास6सहित कई कैंसर प्रकार, में overexpressed है। NAMPT ट्यूमर कोशिकाओं के लिए न केवल आवश्यक है, लेकिन यह भी अन्य सेल प्रकार है कि ट्यूमर में मौजूद हैं की एक विस्तृत विविधता के लिए, माइलॉयड कोशिकाओं के रूप में - यह उनके भेदभावड्राइव 4, apoptosis रोकता है और कई cytokines की अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित या मैक्रोफेज में मैट्रिक्स-डिग्रेडिंग एंजाइम7|

ट्यूमर-संबद्ध न्यूट्रोफिल ट्यूमर विकास के महत्वपूर्ण न्यूनाधिक का प्रतिनिधित्व करते हैं। TAN फ़ंक्शन दृढ़ता से प्रकार I IFN उपलब्धता पर निर्भर हैं, क्योंकि ये साइटोकिन्स न्यूट्रोफिल की प्रमुख एंटी-ट्यूमर गतिविधि है। इसके विपरीत, IFNs की अनुपस्थिति इन कोशिकाओं के ट्यूमरीजेनिक सक्रियण का समर्थन करता है, विशेष रूप से उनके समर्थक एंजियोजेनिक गुण. इस के साथ समझौते में, IFNs में कमी चूहों काफी बड़ा और बेहतर संवहनी ट्यूमर का विकास, जो दृढ़ता से समर्थक के साथ घुसपैठ कर रहे हैं/ 9,10. महत्वपूर्ण बात यह है कि इस तरह के समर्थक-एंजियोजेनिक TANs NAMPT की ऊंचा गतिविधि दिखाते हैं, न्यूट्रोफिल के समर्थक ट्यूमर ध्रुवीकरण में अपनी आवश्यक भूमिका का सुझाव देते हैं।

Ly6G एंटीबॉडी का उपयोग कर न्यूट्रोफिल की कमी या उनके प्रवास के निषेध (CXCR2 एंटीबॉडी) में कमी ट्यूमर एंजियोजेनेसिस, विकास, और मेटास्टेसिस1,8में परिणाम. फिर भी, उत्पन्न मोनोक्लोनल एंटीबॉडी इम्यूनोजेनिक हैं, और उनका प्रशासन जीवन-धमकी देने वाले दुष्प्रभावों की एक श्रृंखला के साथ जुड़ा हुआ है11। छोटे अणुओं के साथ उपचार, जैसे NAMPT अवरोधक FK866, कि न्यूट्रोफिल tumorogenicity modulate, ऐसी जटिलताओं से बचने में मदद कर सकता है. दुर्भाग्य से, NAMPT के औषधीय प्रणालीगत निषेध, ट्यूमर के विकास पर अपने चिकित्सीय प्रभाव के बगल में, जठरांत्र विषाक्तता और थ्रोम्बोसाइटोपेनिया सहित गंभीर साइड इफेक्ट की ओर जाता है. इसलिए, एनएएमपीटी अवरोधकों का प्रणालीगत अनुप्रयोग संभव नहीं है12,13,14.

इस कारण से, हम यहाँ एक प्रोटोकॉल जहां NAMPT गतिविधि सीधे अलग TANs में अवरुद्ध है सुझाव देते हैं. इस तरह के विरोधी ट्यूमर न्यूट्रोफिल तो adoptively एक ट्यूमर असर मेजबान में स्थानांतरित कर रहे हैं। यह प्रोटोकॉल यौगिकों के प्रणालीगत विषाक्त दुष्प्रभावों से बचने में मदद करेगा, जबकि लक्ष्य कोशिकाओं पर इसके प्रभाव को बनाए रखा जाएगा।

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Protocol

पशु विषयों सहित सभी प्रक्रियाओं को नियामक प्राधिकरणों द्वारा अनुमोदित किया गया है: LANUV (Landesamt f$r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) और Regierungspr]sidium T$bingen, जर्मनी. सभी जोड़तोड़ बाँझ शर्तों में किया जाना चाहिए (लेमिनर प्रवाह हुड के तहत) बाँझ अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग कर (सिरिंज, कैंची, संदंश, डिस्पोजेबल स्कैल्पल्स, पेट्री व्यंजन).

नोट: प्रोटोकॉल की समग्र योजना चित्र 1में दिखाया गया है।

1. B16F10 मेलेनोमा सेल लाइन की तैयारी

  1. एक 90% confluent monolayer (लगभग 10 x 106 कोशिकाओं /T75 फ्लास्क) को तैयार करें Iscove के संशोधित Dulbecco के मध्यम (IMDMc: IMDM + 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (FBS) + 1% पेनिसिलिन-स्ट्टोमाइसिन).
  2. माध्यम निकालें, और फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं कुल्ला. प्रोटीओलिटिक और कोलेजोलिटिक एंजाइमों वाले सेल टुकड़ी समाधान के 6 एमएल लागू करें (सामग्री की तालिकादेखें), और 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. नीचे से शेष अनुशील कोशिकाओं को जुटाने के लिए फ्लास्क को धीरे से दस्तक करें। सेल निलंबन 15 एमएल ट्यूबों में ले लीजिए और 300 x ग्राम पर 7 मिनट और 20 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र।
  4. supernatant निकालें, और पीबीएस के 1 एमएल में अच्छी तरह से गोली resuspend. पीबीएस और अपकेंद्रित्र (300 x ग्राम और 7 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस) के 14 एमएल जोड़ें।
  5. सुपरनेंट निकालें और पीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से करें।
  6. कोशिकाओं की गणना करें, और उन्हें की एकाग्रता के लिए पुन: निलंबित 3 x 106/mL PBS (चरण के लिए 2) या 6 x 106/mL PBS (चरण 6 के लिए) इंजेक्शन के लिए. 30 मिनट की एक अधिकतम के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें.

2. चूहों में एलोजेनिक ट्यूमर मॉडल

  1. का प्रयोग करें 10 महिला Ifnar1-/- चूहों 8-12 सप्ताह पुराने कि विशिष्ट रोगजनक मुक्त (SPF) शर्तों के तहत रखा जाता है.
    नोट: मादा चूहों ट्यूमर के विकास के एक subcutaneous मॉडल में बेहतर कर रहे हैं, के बाद से पुरुषों और अधिक आक्रामक हैं और इस तरह ट्यूमर साइट है, जो ट्यूमर के विकास को प्रभावित करता है के उल्लंघन के लिए प्रवण.
  2. एक बिजली शेवर के साथ पार्श्व पर माउस की त्वचा दाढ़ी, और 70% इथेनॉल के साथ गीला ऊतक के साथ त्वचा कीटाणुरहित.
  3. तैयार B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को ले लीजिए 3 x 106/mL PBS की एकाग्रता पर (चरण 1 देखें) एक 1 एमएल सिरिंज और 0.4 x 19 मिमी सुई में. निलंबन के 100 एमएल को subcutaneously इंजेक्शन.
    1. हर इंजेक्शन से पहले कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिलाएं। ट्यूमर कोशिकाओं को परेशान नहीं करने के रूप में व्यास में कम से कम 0.4 मिमी से कम सुइयों का प्रयोग करें।
  4. एक पिंजरे में 5 चूहों को रखें, और 14 दिनों के लिए एक कैलिपर के साथ ट्यूमर आकार (लंबाई, चौड़ाई और गहराई) को नियंत्रित करें।
    नोट: पशु नियमों के अनुसार, ट्यूमर का आकार व्यास में 15 मिमी से अधिक नहीं होना चाहिए, बड़े या नेक्रोटिक / खुले ट्यूमर के साथ चूहों को पहले से बलिदान किया जाना चाहिए।
  5. 14 दिन में, सीओ2 कक्ष में चूहों बलिदान.
  6. 70% इथेनॉल के साथ त्वचा को संक्रमित और कैंची और एक बाँझ पेट्री डिश में forceps के साथ ट्यूमर को दूर. बर्फ पर पूरा Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) में एक 50 एमएल ट्यूब में ट्यूमर रखें।

3. टैन अलगाव

  1. बाँझ 6 अच्छी तरह से प्लेटों में ट्यूमर प्लेस, 5 अच्छी तरह से प्रति ट्यूमर. बाँझ कैंची के साथ 2-3 मिमी टुकड़े में ट्यूमर कट.
    1. ट्यूमर के अनुसार 1 एमएल dispase/collagenase D/DNase I समाधान (0.2 mg/0.2 mg/100 mg in 1 एमएल DMEMc) के साथ डाइजेस्ट। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 5% सीओ2, और सुई के बिना एक 10 एमएल सिरिंज के साथ हर 15 मिनट 3 बार मिश्रण करें।
  2. अपाच्य फाइबर को दूर करने के लिए, 15 एमएल ट्यूबों में 100 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से जाल कोशिकाओं (एक अच्छी तरह से प्रति ट्यूब फिल्टर)। 15 एमएल, 460 x gपर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में पीबीएस जोड़ें, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, और supernatant हटा दें।
  3. एक lysis बफर के साथ Lyse एरिथ्रोसाइट्स (एनएच4सीएल 150 मीटर, KHCO3 10 मीटर, EDTA 0.1 मीटर, पीएच 7.3, 20 डिग्री सेल्सियस) प्रत्येक ट्यूब में 1 एमएल जोड़कर। अच्छी तरह से मिलाएं, और एक में सभी ट्यूबों से समाधान गठबंधन. बर्फ ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) DMEMc के 11 एमएल के साथ 2 मिनट के बाद प्रतिक्रिया बंद करो.
  4. 460 x gपर सेंट्रीफ्यूज , 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, और supernatant हटा दें। ठंड पीबीएस के 15 एमएल के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। 460 x gपर सेंट्रीफ्यूज , 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, और supernatant हटा दें।
  5. पीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। एफसी-ब्लॉक एंटीबॉडी (CD16/CD32, स्टॉक 0.5 मिलीग्राम/एमएल) के 3 एमएल जोड़ें, और 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  6. एंटीबॉडी जोड़ें: Ly6G-पीई के 10 एमएल (स्टॉक 0.2 mg/mL) और CD11b-APC के 10 एमएल (स्टॉक 0.2 mg/ 6-डायमिडिन-2-फेनिलिनडोल व्यवहार्यता डाई (डीएपीआई, स्टॉक 5 मिलीग्राम/एमएल) के 20 एमएल जोड़ें और 30 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: एंटीबॉडी की व्यवहार्यता रंगों और फ्लोरोसेंट संयुग्मी का एक और संयोजन इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. पीबीएस को 15 एमएल तक जोड़ें, 460 x gपर अपकेंद्रित्र, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, और सुपरनेंट को हटा दें।
  8. लगभग एकाग्रता के लिए DMEMc में गोली resuspend लगभग 10 x 106/mL, और बर्फ पर रहते हैं.
  9. सॉर्ट CD11b+ Ly6Gहाय जीवित (DAPI-नकारात्मक) एक फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल सॉर्टर के साथ न्यूट्रोफिल (गटिंग रणनीति चित्र 2देखें)।
    नोट: सेल निलंबन और 4 डिग्री सेल्सियस पर हल की कोशिकाओं के लिए DMEMc के साथ ट्यूब के साथ ट्यूब रखें। निम्न इष्टतम सॉर्टिंग सेटिंग्स का उपयोग करें: एक 70 मिमी नोजल, अधिकतम 22,000 ईवेंट/सेकंड की थ्रेशोल्ड दर और 1-3 की प्रवाह दर.
  10. की एक सिफारिश की शुद्धता के लिए एक cytometer का उपयोग कर हल न्यूट्रोफिल की शुद्धता की जाँच करें।
  11. सेंट्रीफ्यूज ने 460 x gपर न्यूट्रोफिल ों को हल किया, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, और सुपरनेट को हटा दें। 1 x 106/mL की सांद्रता के लिए DMEMc में सॉर्ट किए गए कक्षों को पुन: निलंबित करें।
    नोट: एक 14 दिन B16F10 ट्यूमर (10 मिमी व्यास) में न्यूट्रोफिल की उम्मीद संख्या लगभग 3 x 104 कोशिकाओं है.

4. इन विट्रो में TANs में NAMPT निषेध

  1. 100 एमएम की अंतिम सांद्रता में डाइमेथिलसल्फक्साइड (डीएमएसओ) में FK866 (NAMPT अवरोधक) स्टॉक तैयार करें।
  2. बीज हल न्यूट्रोफिल (चरण 3.11) एक 96-वेल यू-नीचे प्लेट के 2 कुओं में (1.5 x 105 न्यूट्रोफिल / अच्छी तरह से हस्तक्षेप में FK866 जोड़ें (100 एनएम के अंतिम एकाग्रता), और नियंत्रण में DMSO के साथ DMEMc की एक समान राशि अच्छी तरह से. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट, एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2।
  3. 460 x gपर सेंट्रीफ्यूज , 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, और supernatant हटा दें। प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 200 एमएल में पुन: निलंबित करें। 2 बार दोहराएँ.
  4. 460 x gपर सेंट्रीफ्यूज , 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, और supernatant हटा दें। वाणिज्यिक endothelial सेल विकास माध्यम में पुन: निलंबित (के साथ पूरक 4 $L/एमएल endothelial सेल विकास के पूरक, 0.1 ng/mL पुनः संयोजक मानव epidermal विकास कारक, 1 ng/mL पुनः संयोजक मानव बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक, 90 g/ hydrocortisone) 0.2 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए (में 0.75 एमएल) (चरण 5 के लिए) या PBS में 0.6 x 106 कोशिकाओं /

5. महाधमनी वलय परख का उपयोग करके TANs के एंजियोजेनिक गुणों का अनुमान

  1. एक पुरुष C57BL/6J (WT) माउस से वक्ष आरोटा दूर करें। साफ और 0.5 मिमी चौड़ाई के छल्ले में कटौती। पूरक endothelial सेल विकास माध्यम के 1 एमएल के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में सभी छल्ले रखें. एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: युवा का उपयोग (8 सप्ताह से कम उम्र) aorta विच्छेदन के लिए पुरुष चूहों बेहतर है, क्योंकि वे एक और अधिक मजबूत angiogenic प्रतिक्रिया दे15.
  2. सोलुबिलाइज़्ड बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स के 50 डिग्री एल के साथ 96-वेल फ्लैट-बॉटल प्लेट के कुओं को भरें, जेल को 37 डिग्री सेल्सियस में 30 मिनट के लिए सेट करें, 5% सीओ2 आर्द्र इनक्यूबेटर मैट्रिक्स को पॉलिमरी करने की अनुमति दें। प्रति हालत कम से कम 3 कुओं तैयार करें.
  3. ठोस मैट्रिक्स परत के शीर्ष पर एक महाधमनी अंगूठी रखकर solubilized तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में छल्ले एम्बेड, प्रत्येक अच्छी तरह से केंद्र में 1 अंगूठी. प्रत्येक अंगूठी को कवर करने के लिए solubilized तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का एक और 50 डिग्री एल जोड़ें।
    1. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2 आर्द्र इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए रखें ताकि दूसरी मैट्रिक्स परत के बहुलकीकरण की अनुमति दी जा सके।
  4. पूरक endothelial सेल विकास माध्यम और 2x104Ifnar1 के 150 एमएल/वेल जोड़ें-/
  5. एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 14 दिनों के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  6. एक मानक चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि और endothelial शाखाओं का अनुमान है। शाखा सूचकांक सहित पोत morphometric और स्थानिक मापदंडों के मात्रात्मक मूल्यांकन स्वचालित रूप से वैज्ञानिक छवियों के लिए डिजाइन छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग किया जा सकता है.
    नोट: प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3में चित्रित कर रहे हैं.

6. एलोजेनिक ट्यूमर मॉडल में उपचारित न्यूट्रोफिल का दत्तक स्थानांतरण

  1. B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को तैयार करें (चरण 1.6) पीबीएस में 6 x 106 कोशिकाओं/
  2. 2 प्रकार के न्यूट्रोफिल तैयार करें: FK866-treated न्यूट्रोफिल और नियंत्रण अनुपचारित न्यूट्रोफिल (चरण 4.4) पीबीएस में एक सांद्रता 6 x 105 कोशिकाओं/ मिश्रण न्यूट्रोफिल B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ (अंतिम न्यूट्रोफिल ट्यूमर कोशिकाओं अनुपात 1:10) सेल मिश्रण के 2 प्रकार के लिए है।
  3. ले लो 10 महिला WT चूहों 8-12 सप्ताह पुराने, प्रत्येक समूह में 5. एक बिजली शेवर के साथ पार्श्व पर त्वचा दाढ़ी, और 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित.
  4. चूहों के दोनों समूहों के लिए, एक इंसुलिन सिरिंज और एक 0.4 मिमी व्यास सुई के साथ कोशिका निलंबन (चरण 6.2) के 100 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन। एक पिंजरे में एक ही समूह से 1-5 चूहों प्लेस.
  5. दिन 2 में, 2 प्रकार के न्यूट्रोफिल तैयार करें: FK866-उपचारित न्यूट्रोफिल और नियंत्रण अनुपचारित न्यूट्रोफिल (चरण 4.4) पीबीएस में एक सांद्रता 6 x 105 कोशिकाओं/ चूहों के दोनों समूहों के लिए एक इंसुलिन सिरिंज और एक 0.4 मिमी व्यास सुई के साथ पूंछ नस में सेल निलंबन (चरण 6.4) i.v. के 100 $L इंजेक्शन। चूहों को पिंजरे में वापस रखें।

7. ट्यूमर विकास माप, हिस्टोलॉजिकल परीक्षा

  1. ट्यूमर के विकास की निगरानी हर दूसरे दिन. कैलिपर्स के साथ ट्यूमर आकार का मूल्यांकन करें और सूत्र V [4]3 * के साथ ट्यूमर की मात्रा की गणना *h *w2)/8 (h]height, w]width, गहराई] चौड़ाई)।
  2. सीओ2 कक्ष में दिन 14 में बलिदान चूहों. ट्यूमर निकालें और ट्यूमर वजन को मापने।
  3. तरल नाइट्रोजन में इष्टतम काटने तापमान यौगिक में ट्यूमर फ्रीज, और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  4. -20 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूने thaw और एक cryotome का उपयोग कर 5 मिमी वर्गों तैयार करते हैं। क्रायोकट्स को 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सूखने दें। 2 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस ठंड एसीटोन में वर्गों को ठीक करें और उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सूखी।
  5. 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए पीबीएस में एफसी-ब्लॉक एंटीबॉडी (CD16/CD32, स्टॉक 0.5 mg/mL 1:500) के साथ ब्लॉक।
  6. खरगोश विरोधी माउस Laminin गामा एंटीबॉडी के साथ दाग (1:1500 पीबीएस में, 200 $L) 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए. तीन बार पीबीएस से धो लें।
  7. माध्यमिक बकरी विरोधी रैबिट एंटीबॉडी के साथ दाग (स्टॉक 0.5 mg/mL, 1:400 PBS में,), विरोधी माउस [SMA (1:500 PBS में) और DAPI के 2 $L (स्टॉक 5 mg/mL, 1:100 PBS में) एंटीबॉडी समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस की अंतिम मात्रा में. अंधेरे में 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट। तीन बार पीबीएस से धो लें।
  8. अंधेरे में 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सूखी स्लाइड। माइक्रोस्कोपी के लिए एनहाइड्रोस बढ़ते माध्यम के साथ माउंट और एक कवरस्लिप के साथ कवर करें। इसे 37 डिग्री सेल्सियस में 1 ज सूखने दें।
  9. सूक्ष्म सूक्ष्म परीक्षा निष्पादित करें। Laminin + जहाजों की कुल संख्या (वैकल्पिक क्षेत्र) और SMAकी संख्या (क्षेत्र)+ विकसित जहाजों की गणना करके संवहनी की गणना करके परिमाणित करें।
    नोट: छवि विश्लेषण करने के लिए, एक ही परिस्थितियों (प्रकाश, इसके विपरीत, आवर्धन) के तहत सभी छवियों ले। इस स्थिति में, संसाधन पैरामीटर ठीक किए गए हैं, और छवि संसाधन पूरी तरह से स्वचालित हो जाता है। प्रतिनिधि परिणामों को चित्र 4 और चित्र 5 में दर्शाया गया है।

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Representative Results

यहाँ वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, Ifnar1-/- न्यूट्रोफिल ट्यूमर से अलग किया गया और NAMPT अवरोधक FK866 के साथ इलाज के लिए 2 ज. Untreated Ifnar1// - न्यूट्रोफिल एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. उपचार की प्रभावशीलता का मूल्यांकन महाधमनी वलय परख का उपयोग करके किया गया था, जो एंजियोजेनेसिस (मैट्रिक्स अवक्रमण, प्रवास, प्रसार, पुनर्गठन) में शामिल प्रमुख चरणों को दर्शाता है। हम यह प्रदर्शित कर सकते हैं कि FK866-उपचारित न्यूट्रोफिलों में महाधमनी शाखा निर्माण को प्रोत्साहित करने की क्षमता में काफी कमी होती है, जबकि अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में (चित्र3क, 3ख)। FK866-उपचारित एंटी-एंजियोजेनिक न्यूट्रोफिल्स को ट्यूमर असर करने वाले चूहों में नीचे की ओर इंजेक्ट किया गया था (दिन 0 पार्श्व और दिन 2 i.v.) में। हम काफी बिगड़ा ट्यूमर विकास का निरीक्षण कर सकते हैं, के रूप में चूहों अनुपचारित Ifnar1 के साथ इंजेक्शन की तुलना में -/- न्यूट्रोफिल्स (चित्र 4A, 4B) . निकाले गए ट्यूमर की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा FK866-treated TANs के साथ इलाज चूहों से अलग ट्यूमर में एंजियोजेनेसिस के महत्वपूर्ण दमन साबित कर दिया, के रूप में अनुपचारित Ifnar1के साथ इंजेक्शन उन लोगों की तुलना में - / चित्र 5A , बी).।

Figure 1
चित्र 1. प्रोटोकॉल की योजना| चरण 1. B16F10 मेलेनोमा सेल लाइन की तैयारी; 2. चूहों में एलोजेनिक ट्यूमर मॉडल; 3. ट्यूमर से TANs के अलगाव; 4. इन विट्रो में TANs में NAMPT का निषेध; 5. महाधमनी वलय परख में TANs के एंजियोजेनिक गुणों का अनुमान; 6. एलोजेनिक ट्यूमर मॉडल में उपचारित न्यूट्रोफिल का दत्तक स्थानांतरण; 7. ट्यूमर विकास की निगरानी, हिस्टोलॉजिकल परीक्षा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. TANs छँटाई के लिए गैटिंग रणनीति| CD11b+ Ly6Gहाय जीवित न्यूट्रोफिल शुद्धता के साथ ट्यूमर से हल कर रहे हैं $95%. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. FK866 उपचार के बाद TANs के angiogenic गुणों का दमन| सॉर्ट किए गए Ifnar1 के एंजियोजेनिक गुण -/-TANF FK866 के साथ या माध्यम के साथ इलाज किया गया aorta अंगूठी परख का उपयोग कर अनुमान लगाया गया. शाखा गठन 14 दिनों के दौरान निगरानी की गई थी, दिन में प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं () . FK866 के साथ उपचार काफी endothelial शाखाओं की संख्या में कमी आई (बी) डेटा को मध्य, अंतराक्वाटाइल श्रेणी और न्यूनतम-अधिकतम, *p और lt;0.05 के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. FK866 इलाज न्यूट्रोफिल के दत्तक हस्तांतरण के बाद ट्यूमर के विकास की कमी। ट्यूमर के विकास पर TANs के प्रभाव का आकलन किया गया था. TANs अलग थे, FK866 के साथ इलाज किया और ऊपर वर्णित के रूप में ट्यूमर असर चूहों में इंजेक्शन. दिन में 14 चूहों बलिदान कर रहे थे, ट्यूमर हटा दिया और विश्लेषण किया. इफनार1-/ नियंत्रण बनाम FK866 के साथ इलाज किया TANs तुलना की गई. () ट्यूमर के विकास को मापा गया था , (बी) ट्यूमर द्रव्यमान और (ब्) आकार का अनुमान लगाया गया था। डेटा को मध्य, अंतराक्वाटाइल श्रेणी और न्यूनतम-अधिकतम, *p और lt;0.05 के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. FK866 इलाज न्यूट्रोफिल के दत्तक हस्तांतरण के बाद दबा ट्यूमर संवहनी. ट्यूमर को अलग-अलग किया गया जैसा कि ऊपर वर्णित किया गया था (चित्र 4)। पोत परिपक्वता का मूल्यांकन एंटी-SMA एंटीबॉडी (परिपक्व जहाजों) और एंटी-गामा लेमिन (एंडोथेलियल कोशिकाओं) का उपयोग करके किया गया था। (ए) ट्यूमर के प्रतिनिधि धुंधला दिखाया जाता है: SMA (हरा), laminin (लाल). स्केल बार: 50 डिग्री मी. (बी) FK866 (हरा) या मध्यम (लाल) डेटा के साथ खेती की TANs के दत्तक हस्तांतरण के बाद ट्यूमर संवहनी का परिमाणमध्य, अंतरक्वाटाइल रेंज और न्यूनतम अधिकतम, *p और lt;0.05 के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

शल्य चिकित्सा और औषधीय कैंसर के उपचार में प्रगति के बावजूद, सफल चिकित्सा एक चुनौती बनी हुई है. चूंकि प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ट्यूमर के विकास के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है, इस तरह की कोशिकाओं के ट्यूमरीकरण को बाधित करने वाले उपन्यास तरीकों को स्थापित किया जाना चाहिए। यहाँ हम एंटी-एंजियोजेनिक ट्यूमर-संबद्ध न्यूट्रोफिल के दत्तक हस्तांतरण के माध्यम से ट्यूमर के विकास को दबाने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदर्शित करते हैं। FK866 अवरोध करनेवाला का उपयोग कर, TANs में समर्थक-एंजियोजेनिक NAMPT संकेतन के चयनात्मक लक्ष्यीकरण, साइड इफेक्ट को रोकता है, जो प्रणालीगत FK866 उपचार पर मनाया जाता है.

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा ताजा अलग प्राथमिक न्यूट्रोफिल का उपयोग करने की आवश्यकता है। न्यूट्रोफिल कम रहने वाली कोशिकाएं हैं, जो अलगाव की प्रक्रिया के दौरान एपोटोसिस से गुजर रही हैं या सक्रिय होती हैं। यूरीन न्यूट्रोफिल को अलगाव के सभी चरणों के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस मीडिया में रखा जाना चाहिए, जिसमें कोशिका छँटाई भी शामिल है। न्यूट्रोफिल के अलगाव के रूप में जल्द से जल्द प्रदर्शन किया जाना चाहिए और प्रयोग रोका नहीं जाना चाहिए. एफसी-ब्लॉक का उपयोग उच्च एफसी-रिसेप्टर अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं के विशिष्ट धुंधला को कम करने की अनुमति देता है, जैसे एनके कोशिकाओं। हम गैटिंग रणनीति को सरल बनाने और एंटीबॉडी बाइंडिंग के कारण न्यूट्रोफिल के सक्रियण से बचने के लिए फ्लोरोसेंट-कंजुटेड एंटीबॉडी की संख्या को कम करने की भी सलाह देते हैं।

प्रोटोकॉल के सीमित कदम ट्यूमर में इन कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत कम राशि के कारण ट्यूमर से जीवित न्यूट्रोफिल के अलगाव है (नहीं से अधिक 1% मेलेनोमा में एकल जीवित कोशिकाओं का). यह केवल प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित सॉर्टिंग का उपयोग करके संभव हो सकता है। साथ ही, इस प्रोटोकॉल के लिए रक्त न्यूट्रोफिल के उपयोग से बचा जाना चाहिए क्योंकि NAMPT अभिव्यक्ति के केवल मामूली विनियमन और उनकी कम कार्यक्षमता, जो ट्यूमर ऊतक आगमन16पर बदल जाता है। संभवतः, रक्त न्यूट्रोफिल का उपयोग करने के लिए, वे पहले ट्यूमर व्युत्पन्न विकास कारकों का उपयोग कर सक्रिय किया जाना चाहिए.

न्यूट्रोफिल एपोप्टोसिस से बचने के लिए, FK866 (2-4 h) के साथ कम उपचार का सुझाव दिया जाता है, क्योंकि इसका TANs की व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, जबकि लंबे समय तक उपचार न्यूट्रोफिल एपोप्टोसिस16को प्रेरित करता है। संक्षेप में, प्रोटोकॉल कार्यात्मक माउस मेलेनोमा ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर के विकास को दबाने के लिए विरोधी एंजियोजेनिक न्यूट्रोफिल हेरफेर पूर्व विट्रो की क्षमता को दर्शाता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हमारे काम ड्यूश Krebshilfe, अनुदान संख्या से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: 111647, और जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG), अनुदान संख्या: JA 2461 2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml tubes Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62,554,502
50 ml tubes Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 227261
5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 6006180 / 607180 / 760180
6 well flat-bottom cell culture plates Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,920
96 well flat-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
96 well U-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 65018
AMG EVOS fl digital inverted microscope AMG, Bothel, U.S.
anti-mouse CD11b BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553312 clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL
anti-mouse Ly6G BioLegend, California, U.S. 127608 clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL
BD FACS AriaII BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. cell sorter
Caliper Vogel Germany, Kevelaer, Germany
Casy cell counter Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany
Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany 04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifuge Rotina 420 R Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany 4706
Collagenase D Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany 11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) BioLegend, California, U.S. 422801 Stock: 5mg/ml
Dispase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany D4818-2MG
DMEM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 41966-029 DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
DMSO (Dimethylsufoxide) WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany WAK-DMSO-10 CryoSure-DMSO
DNase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany DN25-100MG
DPBS Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 14190-094
Endothelial cell growth medium PromoCell, Heidelberg, Germany c-22010
FBS (Fetal Bovine Serum) Biochrom, Berlin, Germany S0115
Fc-block (Anti-mouse CD16/32) BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553142 clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL
FK 866 hydrochloride Axon Medchem, Groningen, Netherlands Axon 1546 Stock: 100 mM
Goat Anti-Rabbit IgG H&L Abcam, Cambridge, U.K. ab97075 Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. 51026334
IMDM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 12440-053 IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
Isis GT420 shaver B. Braun Asculap, Suhl, Germany 90200714
Matrigel Matrix basement membrane Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands 7205011
Microtome Cryostat Microm HM 505 N Microm International GmbH, Walldorf, Germany
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany F3777 FITC-conjugated, no information about stock concentration
Needles 0.4 mm x 16 mm BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 302200
Neomount Merck, Darmstadt, Germany HX67590916
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. 005-000-121
Penicillin Streptomycin Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 15140-122
Pipetus automatic pipette Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany 9907200
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. P36935
rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain Immundiagnostik, Bensheim, Germany AP1001.1 No information about stock concentration
StemPro Accutase Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. A1105-01
Sterile disposal scalpel (no. 15) MedWare, Naples, U.S. 120920
Syringes 1 ml BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 303172
Syringes 10 ml BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 309110
T75 sterile cell culture flasks Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,911,302
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Torrance, U.S. 4583
Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning Carl Zeiss, Oberkochen, Germany

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References

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