Overføring av manipulert tumor-Associated nøytrofile til tumor-bærende mus for å studere deres angiogenic potensial in vivo

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her viser vi terapeutiske potensialet i anti-angiogenic tumor-assosiert nøytrofile etter overføring til tumor bærende mus. Denne protokollen kan brukes til å manipulere nøytrofile aktivitet ex vivo og til senere evaluere sin funksjonalitet i vivo i utvikling av svulster. Det er en passende modell for å studere potensielle nøytrofile-baserte immunterapi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pylaeva, E., Spyra, I., Bordbari, S., Lang, S., Jablonska, J. Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo. J. Vis. Exp. (149), e59807, doi:10.3791/59807 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bidraget av nøytrofile til regulering av tumorigenesis blir økt oppmerksomhet. Disse cellene er heterogene, og avhengig av tumor miljøet kan ha Pro-eller anti-tumor kapasitet. En av de viktige cytokiner regulere nøytrofile funksjoner i en tumor sammenheng er typen jeg interferoner. I nærvær av interferoner, nøytrofile Gain anti-tumor egenskaper, inkludert cytotoksisitet eller stimulering av immunsystemet. Omvendt, fraværet av en interferon signalering resulterer i fremtredende Pro-tumor aktivitet, karakterisert med sterk stimulering av tumor angiogenese. I den seneste tid, vi kunne demonstrere det Pro-angiogenic eiendom av nøytrofile avhenger på aktivisering av nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) signalveien inne disse celler. Hemming av denne veien i tumor-assosiert nøytrofile fører til deres potente anti-angiogenic fenotype. Her viser vi vår nyopprettede modellen tillater in vivo evaluering av tumorigene potensialet i manipulert tumor-assosiert nøytrofile (TANs). Kort tid, Pro-angiogenic tumor-assosiert nøytrofile kan isoleres fra tumor-bærende interferon-mangelfull mus og repolarized inn anti-angiogenic fenotype ved blokkering av NAMPT signalering. Den angiogenic aktiviteten til disse cellene kan senere evalueres ved hjelp av en aorta ring analysen. Anti-angiogenic TANs kan overføres til tumor-bærende ville type mottakere og tumor vekst bør overvåkes i 14 dager. På dag 14 mus er ofret, svulster fjernet og kuttet med sine endometrial blodkar vurdert. Samlet sett gir vår protokoll en ny verktøyet til in vivo evaluere angiogenic kapasitet på primære celler, slik som tumor-assosiert nøytrofile, uten behov for å bruke kunstige nøytrofile cellelinje modeller. Vc

Introduction

Type I interferoner (IFNs) spiller en viktig rolle i stimulering av vert svar til neoplasias, som mangel på type jeg IFN signalering resulterer i betydelig forhøyet tumor vekst1. En av mekanismene som er involvert i denne prosessen er regulering av tumorigene aktivitet av tumor-assosiert nøytrofile, som er kontrollert av koloni-stimulerende faktor 3 reseptor (CSF3R) nedstrøms signalering2. Colony-stimulerende faktor 3 (CSF3), eller granulocytt koloni-stimulerende Factor, ble vist å aktivere signalering som involverer nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT)3,4. NAMPT er en rate-begrensende enzym for nikotinamid adenine dinucleotide syntese, som forbedrer Glykolysen og regulerer DNA reparasjon, genuttrykk, og stress respons fremme kreftceller overlevelse og spredning5. NAMPT er overexpressed i flere krefttyper, inkludert tykk tarms, eggstokkene, bryst, mage, prostata kreft og gliomas6. NAMPT er viktig ikke bare for tumorceller, men også for en rekke andre celletyper som er til stede i svulster, slik som myelogen celler-det driver sin differensiering4, hemmer apoptose og stimulere uttrykk for flere cytokiner eller matrise-nedverdigende enzymer i makrofager7.

Tumor-assosiert nøytrofile representerer viktig modulatorer av tumor vekst. TAN funksjoner er sterkt avhengig av typen jeg IFN tilgjengelighet, da disse cytokiner Prime anti-tumor aktivitet av nøytrofile. Tvert imot, fraværet av IFNs støtter tumorigene aktivering av disse cellene, spesielt deres Pro-angiogenic egenskaper. I samråd med dette, mus mangelfull i IFNs utvikle betydelig større og bedre vascularized svulster, som er sterkt infiltrere med Pro-tumoral/Pro-angiogenic nøytrofile1,2,8, 9,10. Viktigere, slik Pro-angiogenic TANs viser forhøyet aktivitet av NAMPT, antyder sin viktige rolle i Pro-tumor polarisering av nøytrofile.

Nedbryting av nøytrofile ved bruk av Ly6G antistoff eller hemming av deres migrasjon (CXCR2 antistoff) resulterer i nedsatt tumor angiogenese, vekst og metastasering1,8. Likevel, genererte monoklonale antistoffer er immunogenic, og deres administrasjon er forbundet med en rekke livstruende bivirkninger11. Behandling med små molekyler, slik som NAMPT-hemmer FK866, som modulere nøytrofile tumoriogenicity, kan bidra til å unngå slike komplikasjoner. Dessverre, farmakologisk systemisk hemming av NAMPT, ved siden av sin terapeutiske effekt på tumor vekst, fører til alvorlige bivirkninger, inkludert Gastrointestinal toksisitet og trombocytopeni. Derfor er systemisk anvendelse av NAMPT hemmere ikke gjennomførbart12,13,14.

Derfor foreslår vi en protokoll der NAMPT-aktivitet blokkeres direkte i isolerte TANs. Slike anti-tumor nøytrofile blir deretter adoptively overført til en svulst-bærende vert. Denne protokollen vil bidra til å unngå systemiske giftige bivirkninger av forbindelsene, mens dens effekt på målcellene vil bli opprettholdt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrene, inkludert dyre forsøkspersoner, er godkjent av myndighetene: LANUV (Landesamt für natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) og Regierungspräsidium Tübingen i Tyskland. Alle manipulasjoner bør utføres under sterile forhold (under laminær) ved bruk av sterile reagenser og instrumenter (sprøyter, sakser, tang, en gangs skalpeller, Petri-retter).

Merk: den generelle ordningen av protokollen er vist i figur 1.

1. utarbeidelse av B16F10 melanom cellelinje

  1. Forbered mycoplasma-negative celler vokst til en 90% confluent monolag (ca 10 x 106 celler/T75 kolbe) i komplett Iscove ' s modifisert Dulbecco ' s medium (IMDMC: IMDM + 10% fosterets storfe serum (FBS) + 1% penicillin-Streptomycin).
  2. Fjern mediet, og skyll cellene med fosfat bufret saltvann (PBS). Påfør 6 mL av en celle avløsning løsning som inneholder proteolytiske og collagenolytic enzymer (se tabell over materialer), og ruge ved 37 ° c i 2 min.
  3. Knock flasken forsiktig å mobilisere resterende tilhenger celler fra bunnen. Samle celle fjæringen i 15 mL rør og sentrifuge ved 300 x g i 7 min og 20 ° c.
  4. Fjern supernatanten, og resuspend pellet brønnen i 1 mL PBS. Tilsett 14 mL PBS og sentrifuge (300 x g og 20 ° c i 7 min).
  5. Fjern supernatanten og resuspend pellet i 1 mL PBS.
  6. Telle cellene, og resuspend dem til konsentrasjonen av 3 x 106/ml PBS (for trinn 2) eller 6 x 106/ml PBS (for trinn 6) for injeksjon. Hold celler på isen i maksimalt 30 min.

2. allogenic tumor modell i mus

  1. Bruk 10 kvinnelige Ifnar1-/- mus 8-12 uker gamle som er holdt under spesifikke-patogen-Free (SPF) forhold.
    Merk: kvinnelige mus er å foretrekke i en subkutan modell av tumor vekst, siden menn er mer aggressive og dermed utsatt for brudd på tumor området, som påvirker tumor vekst.
  2. Barbere huden av musen på flanken med en elektrisk barbermaskin, og desinfisere huden med vev våt med 70% etanol.
  3. Samle de tilberedte B16F10 melanom cellene med en konsentrasjon på 3 x 106/ml PBS (se trinn 1) i en 1 ml sprøyte og 0,4 x 19 mm nål. Injiser 100 mL suspensjonen subkutant.
    1. Bland cellene godt før hver injeksjon. Bruk nåler ikke mindre enn 0,4 mm i diameter som å ikke forstyrre tumorceller.
  4. Plasser opp til 5 mus i ett bur, og kontroll tumor størrelse (lengde, bredde og dybde) med en sko i 14 dager.
    Merk: i henhold til dyrenes forskrifter, bør tumor størrelsen ikke overstige 15 mm i diameter, mus med større eller nekrotisk/åpne svulster bør bli ofret på forhånd.
  5. På dag 14, ofre musene i CO2 Chamber.
  6. Desinfisere huden med 70% etanol og fjerne svulster med saks og tang i en steril Petri parabolen. Hold svulster i en 50 mL rør i komplett Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-Streptomycin) på isen.

3. TAN isolasjon

  1. Plasser svulster i sterile 6-brønn plater, 5 svulster per brønn. Skjær svulster i 2-3 mm stykker med steril saks.
    1. Digest med 1 mL dispase/kollagenase D/DNase I-løsning (0,2 mg/0,2 mg/100 mg i 1 mL DMEMc) per svulst. Ruge ved 37 ° c, 5% CO2 i en fuktig inkubator, og bland med en 10 ml sprøyte uten en nål hver 15 min 3 ganger.
  2. For å fjerne ufordøyd fibre, filtrerer netting celler gjennom 100 μm inn i 15 mL rør (en brønn per filter per rør). Legg PBS til 15 mL, sentrifugerør ved 460 x g, 4 ° c i 5 min, og fjern supernatanten.
  3. Lyse erytrocytter med en lyseringsbuffer (NH4CL 150 mm, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mm, pH 7,3, 20 ° c) ved å tilsette 1 ml i hvert rør. Bland godt, og kombinere løsningen fra alle rør til én. Stopp reaksjonen etter 2 minutter med 11 mL is-kulde (4 ° c) DMEMc.
  4. Sentrifuger ved 460 x g, 4 ° c i 5 min, og fjern supernatanten. Resuspend pellet med 15 mL kald PBS. Sentrifuger ved 460 x g, 4 ° c i 5 min, og fjern supernatanten.
  5. Resuspend pellet i 1 mL PBS. Tilsett 3 mL FC-blokk antistoffer (CD16/CD32, lager 0,5 mg/mL), og ruge på is i 15 min.
  6. Tilsett antistoffer: 10 mL Ly6G-PE (lager 0,2 mg/mL) og 10 mL CD11b-APC (lager 0,2 mg/mL). Tilsett 20 mL 6-Diamidin-2-phenylindol levedyktighet fargestoff (DAPI, lager 5 mg/mL) og ruge på is i mørket i 30 min.
    Merk: en annen kombinasjon av levedyktighet fargestoffer og fluorescerende konjugater av antistoffer kan brukes.
  7. Legg PBS opp til 15 mL, sentrifuger ved 460 x g, 4 ° c i 5 min, og fjern supernatanten.
  8. Resuspend pellet i DMEMc til konsentrasjonen ca 10 x 106/ml, og holde på isen.
  9. Sorter CD11b+ Ly6GHi Alive (DAPI-negative) nøytrofile med en fluorescens-aktivert celle Sorter (gating strategi se figur 2).
    Merk: Hold røret med celle fjæring og røret med DMEMc for sorterte celler ved 4 ° c. Bruk følgende optimale sorteringsinnstillinger: et 70 mm munnstykke, en terskel sats på maksimalt 22 000 hendelser/sekund og en strømningshastighet på 1-3.
  10. Sjekk renheten av sorterte nøytrofile ved hjelp av en flowcytometer for en anbefalt renhet på > 95%.
  11. Sentrifuger sorterte nøytrofile ved 460 x g, 4 ° c i 5 min, og fjern supernatanten. Resuspend de sorterte cellene i DMEMc til konsentrasjonen av 1 x 106/ml.
    Merk: forventet antall nøytrofile i 1 14-dagers B16F10 svulst (10 mm diameter) er ca 3 x 104 celler.

4. NAMPT hemming i TANs in vitro

  1. Forbered FK866 (NAMPT inhibitor) lager i dimetylsulfoksid (DMSO) ved en endelig konsentrasjon på 100 mM.
  2. Seed sortert nøytrofile (trinn 3,11) i 2 brønner av en 96-brønn U-Bottom plate (1,5 x 105 nøytrofile/Well). Legg FK866 i intervensjonen godt (endelig konsentrasjon av 100 nM), og en lik mengde DMEMc med DMSO inn i kontrollen godt. Ruge for 2 timer ved 37 ° c, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
  3. Sentrifuger ved 460 x g, 4 ° c i 5 min, og fjern supernatanten. Resuspend i 200 mL av PBS i hver brønn. Gjenta to ganger.
  4. Sentrifuger ved 460 x g, 4 ° c i 5 min, og fjern supernatanten. Resuspend i kommersiell endothelial cellevekst medium (supplert med 4 μL/mL endothelial cellevekst supplement, 0,1 ng/mL rekombinant Human epidermal vekstfaktor, 1 ng/mL rekombinant Human Basic Fibroblast vekstfaktor, 90 μg/mL heparin og 1 μg/mL Hydrocortisone) til en endelig konsentrasjon på 0,2 x 106 celler/ml (i 0,75 ml) (for trinn 5) eller i PBS til den endelige konsentrasjonen av 0,6 x 106 celler/mL (i 0,25 ml) (i trinn 6).

5. estimering av angiogenic egenskaper av TANs bruker aorta ringen analysen

  1. Analysere bryst aorta fra en mannlig C57BL/6J (WT) mus. Rengjør og skjær i 0,5 mm bredde ringer. Plasser alle ringene i en brønn av en 24-brønn plate med 1 mL supplert endothelial cellevekst medium. Ruge over natten ved 37 ° c, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
    Merk: bruk av unge (yngre enn 8 uker) mannlige mus for aorta disseksjon er å foretrekke, siden de gir en mer robust angiogenic respons15.
  2. Fyll brønnene på 96-brønn flat bunnplate med 50 μL av solubilized, la gelen være satt i 30 minutter i en 37 ° c, 5% CO2 fuktig inkubator for å tillate matrisen å polymeres. Forbered minst 3 brønner per betingelse.
  3. Embed ringene i solubilized kjelleren membran matrise ved å plassere en aorta ring på toppen av solid matrise laget, 1 ring i midten av hver brønn. Legg til en annen 50 μL av solubilized kjeller membran matrise for å dekke hver ring.
    1. Plasser platen i en 37 ° c, 5% CO2 fuktig inkubator for en annen 30 min for å tillate polymerisering av den andre matrisen laget.
  4. Tilsett 150 ml/vel supplert endothelial cellevekst medium og 2x104Ifnar1-/- TANs (kontroll og FK866-behandlet) (trinn 4,4).
  5. Ruge platen i 14 dager ved 37 ° c, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
  6. Bilde ved hjelp av en standard fase-kontrast mikroskop og anslå endothelial forgrening. Kvantitativ vurdering av fartøyets morphometric og romlige parametre, inkludert forgrenings indeks, kan utføres automatisk ved hjelp av bildebehandlingsprogrammet som er utviklet for vitenskapelige bilder.
    Merk: representative resultater er avbildet i Figur 3.

6. adoptiv overføring av behandlede nøytrofile i allogenic tumor modellen

  1. Forbered B16F10 melanom celler (trinn 1,6) i PBS ved en konsentrasjon på 6 x 106 celler/ml.
  2. Forbered 2 typer nøytrofile: FK866-behandlet nøytrofile og kontroll ubehandlet nøytrofile (trinn 4,4) i PBS ved en konsentrasjon 6 x 105 celler/ml. Bland nøytrofile med B16F10 melanom celler (den endelige nøytrofile til tumorceller ratio 1:10) å ha 2 typer celle blandinger.
  3. Ta 10 kvinnelige WT mus 8-12 uker gammel, 5 i hver gruppe. Barbere huden på flanken med en elektrisk barbermaskin, og desinfisere med 70% etanol.
  4. Injiser 100 μL av celle fjæringen (trinn 6,2) subkutant med en insulinsprøyte og en 0,4 mm diameter nål, til begge grupper av mus. Plasser 1-5 mus fra samme gruppe i ett bur.
  5. På dag 2, utarbeide 2 typer nøytrofile: FK866-behandlet nøytrofile og kontroll ubehandlet nøytrofile (trinn 4,4) i PBS ved en konsentrasjon 6 x 105 celler/ml. Injiser 100 μL av celle oppheng (trinn 6,4) IV i hale venen med en insulinsprøyte og en 0,4 mm diameter nål, til begge grupper av mus. Plasser mus tilbake til buret.

7. tumor vekst måling, histologiske undersøkelse

  1. Overvåk tumor vekst annenhver dag. Vurdere tumor størrelse med markører og beregne tumor volum med formelen V = 4/3 * π * (h * w2)/8 (h = høyde, w = bredde, dybde = bredde).
  2. Offer mus på dag 14 i CO2 Chamber. Fjern svulster og måle tumor vekter.
  3. Fryse svulster i optimal skjæring temperatur sammensatte i flytende nitrogen, og lagre ved-80 ° c.
  4. Tin prøvene til-20 ° c og klargjør 5 mm seksjoner ved hjelp av en cryotome. La cryocuts tørke i 30 minutter ved 20 ° c. Fest seksjonene i-20 ° c kald aceton i 2 minutter og la dem tørke i 30 minutter ved 20 ° c.
  5. Blokk med FC-blokk antistoffer (CD16/CD32, lager 0,5 mg/mL 1:500) i PBS for 1 t ved 20 ° c.
  6. Beis med kanin anti-mus Laminin gamma antistoff (1:1500 i PBS, 200 μL) for 1 t ved 20 ° c. Vask med PBS tre ganger.
  7. Beiset med sekundære geit anti-kanin antistoff (lager 0,5 mg/mL, 1:400 i PBS,), anti-mus αSMA (1:500 i PBS) og 2 μL av DAPI (lager 5 mg/mL, 1:100 i PBS) i et endelig volum på 200 μL av antistoff løsning. Ruge for 1 t ved 20 ° c i mørket. Vask med PBS tre ganger.
  8. Tørre lysbilder i 20 minutter ved 20 ° c i mørket. Monter med vannfritt monterings medium for mikroskopi og dekk med en dekkglass. La det tørke 1 time i 37 ° c.
  9. Utfør microscopical undersøkelse. Kvantifisere endometrial blodkar ved å telle det totale antallet (valgfritt område) av Laminin+ fartøy og antall (areal) av sma+ utviklede fartøy.
    Merk: for å utføre bildeanalyse, ta alle bilder under samme forhold (lys, kontrast, forstørrelse). I dette tilfellet er behandling parametere faste, og bildebehandling blir helt automatisk. Representative resultater er avbildet i Figur 4 og figur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet her, Ifnar1-/- nøytrofile ble isolert fra svulster og behandles med NAMPT inhibitor FK866 for 2 h. ubehandlet Ifnar1-/- nøytrofile ble brukt som en kontroll. Effektiviteten av behandlingen ble evaluert ved hjelp av aorta ringen analysen, som reflekterer de viktigste trinnene involvert i angiogenese (Matrix degradering, migrasjon, spredning, omorganisering). Vi kunne vise at FK866-behandlet nøytrofile har en betydelig redusert kapasitet til å stimulere aorta grenen formasjon, sammenlignet med ubehandlede celler (figur 3a, 3b). FK866-behandlede anti-angiogenic nøytrofile ble injisert subkutant til tumor bærende mus (på dag 0 flanke og dag 2 IV). Vi kunne observere signifikant svekket tumor vekst, sammenlignet med mus injisert med ubehandlet Ifnar1-/- nøytrofile (figur 4a, 4b). Histologiske undersøkelse av utdraget svulster viste betydelig undertrykkelse av angiogenese i svulster isolert fra mus behandlet med FK866-behandlet TANs, i forhold til de injisert med ubehandlet Ifnar1-/- nøytrofile ( Figur 5a , B).

Figure 1
Figur 1. Ordningen av protokollen. Trinn 1. Utarbeidelse av B16F10 melanom cellelinje; 2. allogenic tumor modell i mus; 3. isolering av TANs fra svulster; 4. hemming av NAMPT i TANs in vitro; 5. estimering av angiogenic egenskaper av TANs i aorta ringen analysen; 6. adoptiv overføring av behandlede nøytrofile i allogenic tumor modell; 7. tumor vekst overvåking, histologiske undersøkelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Gating strategi for TANs sortering. CD11b+ Ly6GHei Alive nøytrofile er sortert fra svulster med renhet ≥ 95%. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Undertrykkelse av angiogenic egenskaper av TANs etter behandling med FK866. Angiogenic egenskaper av sorterte Ifnar1-/-TANs behandlet med FK866 eller med medium ble estimert ved hjelp av aorta ring analysen. Branch formasjon ble overvåket i løpet av 14 dager, representative resultater på dag 14 er presentert (A). Behandling med FK866 betydelig redusert antall endothelial grener (B). Data vises som median, interquartile område og min-Max, * p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Retardasjon av tumor vekst etter adoptiv overføring av FK866-behandlet nøytrofile. Påvirkningen av TANs på tumorveksten ble vurdert. TANs ble isolert, behandlet med FK866 og injisert i tumor-bærende mus som beskrevet ovenfor. På dag 14 mus ble ofret, svulster fjernet og analysert. Ifnar1-/- TANs behandlet med FK866 versus kontroller ble sammenlignet. (A) tumor vekst ble målt, (B) tumor massen og (C) størrelse ble estimert. Data vises som median, interquartile område og min-Max, * p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Undertrykt tumor endometrial blodkar etter adoptiv overføring av FK866-behandlet nøytrofile. Svulster ble isolert som beskrevet ovenfor (fig. 4). Fartøy modning ble vurdert ved hjelp av anti-SMA antistoffer (modne fartøy) og anti-gamma laminin (endothelial celler). (A) representative farging av svulster er vist: sma (grønn), laminin (rød). Vektstenger: 50 μm. (B) kvantifisering av tumor endometrial blodkar etter adoptiv overføring av TANs DYRKET med FK866 (grønn) eller middels (rød) data vises som median, interquartile rekkevidde og min-Max, * p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til tross for framgang i kirurgisk og farmakologisk kreft behandling, er vellykket terapi fortsatt en utfordring. Siden immunceller er kjent for å spille en viktig rolle i regulering av tumor vekst, romanen metoder hemme tumorgenisitet hos av slike celler bør etableres. Her viser vi en ny tilnærming for å undertrykke tumor vekst via adoptiv overføring av anti-angiogenic tumor-assosiert nøytrofile. Selektiv målretting av Pro-angiogenic NAMPT signalering i TANs, ved hjelp av FK866 inhibitor, hindrer bivirkninger, som er observert ved systemisk FK866 behandling.

Den mest kritiske delen av protokollen er behovet for å bruke fersk isolert primære nøytrofile. Nøytrofile er Short-levende celler, gjennomgår apoptose eller aktiveres under prosedyren av isolasjon. Murine nøytrofile bør oppbevares i 4 ° c Media under alle trinn av isolasjon, inkludert celle sortering. Isolering av nøytrofile bør utføres så snart som mulig, og eksperimentet bør ikke stanses midlertidig. Bruk av FC-Block kan redusere løs farging av cellene med høy FC-reseptor uttrykk, som NK celler. Vi anbefaler også å minimere antall fluorescerende-bøyd antistoffer for å forenkle gating strategien og for å unngå aktivering av nøytrofile på grunn av antistoff binding.

Den begrensende trinn i protokollen er isolering av levende nøytrofile fra svulster på grunn av en relativt lav mengde av disse cellene i svulster (ikke mer enn 1% av single Alive celler i melanom). Dette kan bare være mulig ved hjelp av flyt flowcytometri sortering. På samme tid, bruk av blod nøytrofile for denne protokollen bør unngås på grunn av bare mindre regulering av NAMPT uttrykk og deres lave funksjonalitet, som er endret på tumor vev ankomst16. Muligens, for å bruke blod nøytrofile, de bør være tidligere aktiveres ved hjelp av tumor-avledet vekstfaktorer.

For å unngå nøytrofile apoptose, er kort behandling med FK866 (2-4 h) foreslått, da det ikke har noen innflytelse på levedyktigheten til TANs, mens langvarig behandling induserer nøytrofile apoptose16. I sum, viser protokollen potensialet i ex vitro manipulert anti-angiogenic nøytrofile å funksjonelt undertrykke tumor vekst i mus melanom tumor modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vårt arbeid ble støttet av tilskudd fra Deutsche Krebshilfe, Grant nummer: 111647, og German Research Council (DFG), Grant nummer: JA 2461/2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml tubes Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62,554,502
50 ml tubes Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 227261
5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 6006180 / 607180 / 760180
6 well flat-bottom cell culture plates Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,920
96 well flat-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
96 well U-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 65018
AMG EVOS fl digital inverted microscope AMG, Bothel, U.S.
anti-mouse CD11b BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553312 clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL
anti-mouse Ly6G BioLegend, California, U.S. 127608 clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL
BD FACS AriaII BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. cell sorter
Caliper Vogel Germany, Kevelaer, Germany
Casy cell counter Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany
Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany 04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifuge Rotina 420 R Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany 4706
Collagenase D Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany 11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) BioLegend, California, U.S. 422801 Stock: 5mg/ml
Dispase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany D4818-2MG
DMEM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 41966-029 DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
DMSO (Dimethylsufoxide) WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany WAK-DMSO-10 CryoSure-DMSO
DNase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany DN25-100MG
DPBS Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 14190-094
Endothelial cell growth medium PromoCell, Heidelberg, Germany c-22010
FBS (Fetal Bovine Serum) Biochrom, Berlin, Germany S0115
Fc-block (Anti-mouse CD16/32) BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553142 clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL
FK 866 hydrochloride Axon Medchem, Groningen, Netherlands Axon 1546 Stock: 100 mM
Goat Anti-Rabbit IgG H&L Abcam, Cambridge, U.K. ab97075 Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. 51026334
IMDM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 12440-053 IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
Isis GT420 shaver B. Braun Asculap, Suhl, Germany 90200714
Matrigel Matrix basement membrane Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands 7205011
Microtome Cryostat Microm HM 505 N Microm International GmbH, Walldorf, Germany
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany F3777 FITC-conjugated, no information about stock concentration
Needles 0.4 mm x 16 mm BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 302200
Neomount Merck, Darmstadt, Germany HX67590916
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. 005-000-121
Penicillin Streptomycin Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 15140-122
Pipetus automatic pipette Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany 9907200
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. P36935
rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain Immundiagnostik, Bensheim, Germany AP1001.1 No information about stock concentration
StemPro Accutase Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. A1105-01
Sterile disposal scalpel (no. 15) MedWare, Naples, U.S. 120920
Syringes 1 ml BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 303172
Syringes 10 ml BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 309110
T75 sterile cell culture flasks Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,911,302
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Torrance, U.S. 4583
Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning Carl Zeiss, Oberkochen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120, (4), 1151-1164 (2010).
  2. Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
  3. Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
  4. Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
  5. Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
  6. Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
  7. Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
  8. Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
  9. Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
  10. Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
  11. Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9, (4), 325-338 (2010).
  12. Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
  13. Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
  14. von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
  15. De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4, (5), (2013).
  16. Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144, (1), 136-149 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics