लिस्टिरिया मोनोसाइटोजेनेस संक्रमण के बाद माउस स्प्लेन में सीटू इंटरफेरॉन गामा उत्पादन की इमेजिंग

Immunology and Infection
 

Summary

यहाँ, हम एक साधारण confocal इमेजिंग विधि का वर्णन करने के लिए murine माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में साइटोकीन इंटरफेरॉन गामा स्रावित कोशिकाओं के situ स्थानीयकरण कल्पना. इस प्रोटोकॉल विभिन्न ऊतकों में अन्य cytokines के दृश्य के लिए बढ़ाया जा सकता है.

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Mazet, J. M., Chiodetti, A. L., Mahale, J. N., Gérard, A. Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection. J. Vis. Exp. (149), e59819, doi:10.3791/59819 (2019).

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Abstract

Cytokines कोशिकाओं द्वारा स्रावित छोटे प्रोटीन होते हैं, सेल सेल संचार है कि प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं मध्यस्थता. cytokines की एक विशेषता उनके pleiotropism है, के रूप में वे द्वारा उत्पादित कर रहे हैं और सेल प्रकार की एक भीड़ को प्रभावित कर सकते हैं. इस तरह, यह न केवल जो कोशिकाओं cytokines का उत्पादन कर रहे हैं समझने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी जो वातावरण में वे ऐसा करते हैं, ताकि अधिक विशिष्ट चिकित्सा को परिभाषित करने के लिए. यहाँ, हम जीवाणु संक्रमण के बाद situ में साइटोकीन उत्पादन कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस तकनीक confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अपने मूल वातावरण में इमेजिंग cytokine उत्पादन कोशिकाओं पर निर्भर करता है. ऐसा करने के लिए, ऊतक वर्गों एक साइटोकिन दाग के साथ एक साथ कई सेल प्रकार के मार्करों के लिए दाग रहे हैं. इस विधि की कुंजी, साइटोकिन स्राव ब्याज के ऊतकों को काटने से पहले सीधे विवो में अवरुद्ध है, जिससे कोशिका की कोशिकाओं के अंदर जमा साइटोकिन का पता लगाने की अनुमति मिलती है। इस विधि के लाभ एकाधिक हैं. सबसे पहले, microenvironment जिसमें cytokines का उत्पादन कर रहे हैं संरक्षित है, जो अंततः cytokine उत्पादन और उन cytokines से प्रभावित कोशिकाओं के लिए आवश्यक संकेतों पर सूचित कर सकता है. इसके अलावा, यह विधि विवो में साइटोकिन उत्पादन के स्थान का संकेत देती है, क्योंकि यह उत्पादक कोशिकाओं के विट्रो में कृत्रिम पर निर्भर नहीं करती है। हालांकि, साइटोकिन प्राप्त करने वाली कोशिकाओं में साइटोकीन डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग का एक साथ विश्लेषण करना संभव नहीं है। इसी प्रकार, साइटोकिन संकेतों को केवल समय-खिड़की के अनुरूप देखा जाता है, जिसके दौरान साइटोकिन स्राव अवरुद्ध किया गया था। जब कि हम इंट्रासेल्यूलर बैक्टीरिया लिस्टिरिया मोनोसाइटोजेनेस द्वारा माउस संक्रमण के बाद तिल्ली में साइटोकिन इंटरफेरॉन (IFN) गामा के दृश्य का वर्णन करते हैं, तो इस विधि को संभवतः किसी भी साइटोकीन के दृश्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है सबसे अंगों.

Introduction

एक रोगजनक के खिलाफ एक कुशल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आर्केस्ट्रा प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि अक्सर जीव के बीच बिखरे हुए हैं की एक किस्म द्वारा प्रदर्शित संकेतों के जटिल एकीकरण की आवश्यकता है. संवाद करने के लिए, इन कोशिकाओं को कई जैविक कार्यों के साथ छोटे घुलनशील प्रोटीन का उत्पादन है कि cytokines नाम इम्यूनोमॉड्यूलेटर के रूप में कार्य. Cytokines नियंत्रण सेल भर्ती, सक्रियण और प्रसार और इसलिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं1के संवर्धन में प्रमुख खिलाड़ी होने के लिए जाना जाता है. प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए विशिष्ट संकेतों को प्रेरित करने के लिए विशिष्ट कोशिकाओं को जोड़ने वाले एक बहुत ही संगठित spatiotemporal पैटर्न में साइटोकिन्स जारी करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, साइटोकिन उत्पादन और सिटोकिन उत्पादन में इसके संकेत का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है, जिसमें साइटोकिन्स का उत्पादन किया जाता है, सूक्ष्म पर्यावरण को ध्यान में रखते हुए।

लिस्टिरिया मोनोसाइटोजीन्स (एल मोनोसाइटोजेन्स) चूहों में इंट्रासेल्यूलर रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाने वाला ग्राम-पॉजीटिव इंट्राकोशिकीय जीवाणु है। एक साइटोकिन, IFN गामा (IFN] तेजी से उत्पादन किया जाता है, 24 एच के भीतर एल monocytogenes संक्रमण के बाद. यह रोगज़नक़ निकासी के लिए आवश्यक है, क्योंकि चूहों ने आईएफएन के लिए दस्तक दी है, एल मोनोसाइटोजीन्स संक्रमण2के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं। आईएफएनजेड प्लेरियोट्रोपिक है और संक्रमण के बाद कई कोशिकाओं द्वारा उत्पादित3. जबकि प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं द्वारा उत्पादित IFN] प्रत्यक्ष विरोधी बैक्टीरियल गतिविधिकेलिए आवश्यक है 4, IFN] अन्य स्रोतों से अन्य कार्य किया है दिखाया गया है. वास्तव में, हमने और अन्य लोगों ने हाल ही में पाया कि सी डी 8+ टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित आईएफएन जेड का एक विशिष्ट कार्य है जो सीधे टी सेल विभेदन5,6,7को विनियमित करने में एक विशिष्ट कार्य करता है। इस प्रकार, यह समझना कि कौन सी कोशिकाएं आईएफएन का उत्पादन करती हैं (और जिसमें सूक्ष्म पर्यावरण) अपने कार्य को विभाजित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

साइटोकिन उत्पादन का अध्ययन करने के लिए सबसे आम तकनीक प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किए गए इंट्रासेल्यूलर साइटोकीन धुंधला पर निर्भर करती है। इस विधि एक ही नमूना के भीतर सेल सतह मार्करों के साथ संयुक्त कई cytokines के एक साथ पता लगाने की अनुमति देता है, cytokine उत्पादन का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी उपकरण प्रदान. तथापि, उपर्युक्त तकनीक का उपयोग करने का अर्थ है किसी भी स्थानिक जानकारी को खोना। इसके अलावा, cytokine का पता लगाने अक्सर साइटोकिन का पता लगाने को सक्षम करने के लिए इन विट्रो फिर से उत्तेजना पर निर्भर करता है. इस प्रकार, साइटोकीन का उत्पादन करने के लिए दिए गए सेल की क्षमता का विश्लेषण किया जाता है, और यह आवश्यक रूप से स्थिति में वास्तविक साइटोकीन स्राव के साथ सहसंबंधित नहीं करता है। अन्य तरीकों रिपोर्टर चूहों जिसके लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति साइटोकीन प्रतिलेखन के साथ संबंधित है और एक एकल कोशिका स्तर8पर दृश्य के लिए अनुमति देता है का उपयोग करें। हालांकि इस विधि situ में cytokine प्रतिलेखन ट्रैक कर सकते हैं, वहाँ cytokine-रिपोर्टर चूहों की एक सीमित संख्या में उपलब्ध हैं. इसके अलावा, प्रतिलेखन, अनुवाद और स्राव कभी कभी अनलिंक किया जा सकता है, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन cytokine वे रिपोर्ट की तुलना में एक अलग आधा जीवन है, इस विधि कभी कभी situ cytokine दृश्य में के लिए पर्याप्त नहीं बना.

यहाँ, हम एक सेल संकल्प पर confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा situ cytokine उत्पादन में कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस तकनीक के ऊतकों के भीतर सेलुलर स्रोत और आसपास के आला के दृश्य सक्षम बनाता है. इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से एल monocytogenes संक्रमित चूहों की तिल्ली में IFN] उत्पादन के दृश्य का वर्णन करता है, एनके कोशिकाओं और प्रतिजन विशिष्ट CD8+ टी कोशिकाओं द्वारा IFN] उत्पादन पर यहाँ ध्यान केंद्रित. हालांकि, यह बढ़ाया जा सकता है और अन्य स्थितियों जहां cytokines ऐसे संक्रमण, सूजन या autoimmune रोगों के रूप में उत्पादित कर रहे हैं के संदर्भ में किसी भी cytokine उत्पादन की विशेषता के लिए अनुकूलित, जब तक लक्षित साइटोकीन कोशिकाओं में बनाए रखा जा सकता है इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन परिवहन अवरोधक द्वारा.

Protocol

चूहों से जुड़े सभी प्रयोग 1986 के यूके वैज्ञानिक प्रक्रिया अधिनियम के साथ समझौते में थे।

1. चूहे में एंटीजेनिक-विशिष्ट CD8+ टी कोशिकाओं का दत्तक स्थानांतरण

  1. आइसोलेट ओवेलबुमिन (ओवीए)-विशिष्ट CD8+ टी कोशिकाओं (OTI) हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त (OTI-GFP) या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (OTI-RFP) टी सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक चूहों के लिम्फ नोड निलंबन से9,10 एक माउस का उपयोग निर्माण निर्देशों के अनुसार सीडी 8+ टी सेल आइसोलेशन किट। एक सिरिंज प्लंजर का उपयोग कर लिम्फ नोड्स मुंहतोड़ द्वारा सेल निलंबन तैयार, जैसा कि पहलेवर्णित 11.
  2. स्थानांतरण OTI-GFP या OTI-RFP कोशिकाओं (3 x 106 कोशिकाओं) C57BL/6 जंगली प्रकार चूहों प्राप्तकर्ताओं में अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा Cahalan द्वारा वर्णित के रूप में, एट अल12. उन चूहों का उपयोग करें जो आम तौर पर 6-12 सप्ताह की उम्र के होते हैं।
    नोट: यह चरण वैकल्पिक है और केवल एंटीजन-विशिष्ट CD8+ T कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए आवश्यक है।

2. लिस्टिरिया मोनोसाइटोजीन्स संक्रमण

  1. विस्तृत एल monocytogenes आनुवंशिक रूप से OVA व्यक्त करने के लिए संशोधित (LM-OVA)13 कोमल आंदोलन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर शोरबा दिल जलसेक में वृद्धि की एक घातीय चरण के लिए जब तक OD600 0.08-0.1 तक पहुँच ता है, जैसा कि पहले संदर्भ में वर्णित 14.
  2. इंजेक्शन 100 $L (अधिकतम मात्रा $ 200 $L) 0.1-0.5 LD50 LM-OVA में पतला फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा एक 29 जी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर, C57BL/6 जंगली प्रकार के चूहों में OTI-GFP या ओटीआई-आरएफपी कोशिकाओं असर जब संकेत दिया.
    नोट: हमारे हाथों में, 0.1 x LD50 LM-OVA 2 x 104 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) से मेल खाती है. एल monocytogenes आनुवंशिक रूप से OVA व्यक्त करने के लिए संशोधित पहले स्थानांतरित OTI CD8+ टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन एल monocytogenes के अन्य उपभेदों इस्तेमाल किया जा सकता है.

3. Brefeldin A (BFA) के साथ उपचार ब्लॉक Cytokine स्राव करने के लिए

  1. एक 29 जी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर माउस बलिदान से पहले पीबीएस intraperitoneally 6 एच के 200 डिग्री एल में BFA के 250 डिग्री ग्राम इंजेक्शन।
    नोट: Lyophilized BFA पहले dimethyl sulfoxoxide (DMSO) में resuspended है 25 मिलीग्राम / BFA तो कमरे के तापमान पर पीबीएस में पतला है (आरटी) इंजेक्शन से पहले क्रिस्टलीकरण से बचने के लिए. साइटोकिन स्राव का निषेध कोशिकाओं में आईएफएन के संचय को प्रेरित करता है। यह साइटोकिन का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है।

4. तिल्ली की कटाई

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 की बढ़ती एकाग्रता का उपयोग कर चूहों Euthanize.
    नोट: चूहों की मानवीय इच्छामृत्यु के लिए स्थानीय संस्था के दिशानिर्देशों का पालन करें।
  2. 70% इथेनॉल के साथ पेट शुद्ध, कैंची के साथ एक चीरा बनाने के लिए माउस के बाईं ओर, जहां तिल्ली स्थित है पर त्वचा के माध्यम से एक 1 -2 सेमी कटौती कर. तिल्ली को बेनकाब करने और इसे चितने के साथ बाहर निकालने के लिए पेरिटोनम में सावधानी से एक चीरा बनाएं। तिल्ली फसल, यह संदंश के साथ निचोड़ या तिल्ली वास्तुकला को बाधित करने से बचने के लिए इसे काटने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है।

5. पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ तिल्ली का निर्धारण

  1. पीबीएस के 3.75 एमएल और 0ण्2 एमएल-लीसिन के 3.75 एमएल को मिलाकर स्थिर समाधान तैयार की जा सके। 21 मिलीग्राम सोडियम एम-पीरियड जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। फिर 4% पीएफए के 2.5 एमएल और 12 एन नाओएच के 20 डिग्री एल जोड़ें।
    नोट: एक ही दिन पर fixative समाधान का उपयोग करें और अतिरिक्त छोड़ दें. इसे संग्रहीत न करें। इस निर्धारण कदम महत्वपूर्ण है अगर नमूना ऐसे GFP के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन होता है. पीएफए का उपयोग न करें जिसमें मेथनॉल के निशान होते हैं, क्योंकि यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन को विकृत करता है।
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और सावधानी के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए.
  2. स्थिर में तिल्ली डूब और 4 एच की एक न्यूनतम के लिए तय, आम तौर पर 16-20 एच कोमल आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर.
  3. स्थिर समाधान को छोड़ दें और कोमल आंदोलन के तहत आरटी में 5 मिनट के लिए पीबीएस के 5 एमएल जोड़ें।
  4. कोमल आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए ताजा पीबीएस इनक्यूबेट के 5 एमएल के साथ पीबीएस बदलें।
  5. 30% सुक्रोज के 5 एमएल के साथ पीबीएस को बदलें, 12-24 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस विधि ऊतक आकारिकी को बनाए रखने में मदद करता है. सुक्रोज समाधान के साथ ऊष्मायन के बाद, अंग को अच्छी तरह से नीचे सिंक करना चाहिए।

6. बर्फ़ीली और अनुभागिंग

  1. एक बड़े गोदाम में सूखी बर्फ रखो और शुद्ध मेथनॉल और सूखी बर्फ के कुछ टुकड़े के लगभग 50 एमएल युक्त अंदर एक छोटे गोदाम जगह है।
  2. लिंट-मुक्त पोंछे पर तिल्ली को धीरे-धीरे सुखाएं।
  3. तल पर इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक की एक बूंद युक्त एक आधार मोल्ड के अंदर तिल्ली प्लेस। किसी भी बुलबुले का उत्पादन नहीं करने के लिए सावधान रहें। प्लीहा पर OCT जोड़ें.
  4. संदंश के साथ, मेथनॉल की सतह पर आधार मोल्ड जमा करें, सुनिश्चित करें कि यह OCT को स्पर्श नहीं करता है। कलाकृतियों को कम करने के लिए जितनी तेजी से ऊतक को फ्रीज करना संभव है।
  5. जब यह जमे हुए है, अनुभागकेसाथ आगे बढ़ें.
    नोट: जमे हुए तिल्ली कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  6. क्रायोमाइक्रोटोम का उपयोग करके ऊतक को खंड करें।
    1. क्रायोस्टैट पर कक्ष का तापमान -21 डिग्री सेल्सियस तक निर्धारित करना चाहिए। वांछित मोटाई के वर्गों में कटौती (आमतौर पर लगभग 10 डिग्री मी). यह प्रोटोकॉल 30 डिग्री मीटर तक मोटाई के साथ काम करता है।
  7. कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों लीजिए (सामग्री की मेजदेखें) और नेत्रहीन निरीक्षण.
    नोट: कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर अनुभाग रखा जा सकता है।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंट दाग

  1. अनुभाग को RT में आने दें.
  2. ऊतक अनुभाग के चारों ओर एक तरल अवरोधक (उदा., पीएपी पेन) के साथ एक वृत्त ड्रा करें। OCT के बाहर ड्रा या यह छड़ी नहीं होगा.
  3. एक बार जब यह सूख गया है, 5 मिनट के लिए ऊतक अनुभाग पर पीबीएस रखकर नमूना rehydrate.
    नोट: अनुभाग पर रखा वॉल्यूम अनुभाग के आकार पर निर्भर करता है। हम आम तौर पर 100-300 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करते हैं। एक बार जब वे rehydrated हैं वर्गों सूखी मत देना.
  4. PBS के साथ कम से कम दो बार कुल्ला सुनिश्चित करने के लिए कि अनुभाग अच्छी तरह से स्लाइड का पालन किया है.
  5. एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को कम करने के लिए अनुभाग में ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें।
    1. का पालन करें के रूप में अवरुद्ध समाधान तैयार: 0.1% Triton X100, 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 2.5 g/mL Fc रिसेप्टर अवरोधक (विरोधी माउस CD16/32) के साथ पीबीएस. फिर धुंधला पैनल के प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों के 2-5% सामान्य सीरम जोड़ें.
      नोट: यदि एंटीबॉडी सीधे संयुग्मी/बायोटिनीलेट हैं, तो प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों के 5% सामान्य सीरम जोड़ें। यदि एक प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक एंटीबॉडी में से एक एक ही प्रजाति से हैं (जैसे, प्राथमिक खरगोश खरगोश और माध्यमिक खरगोश विरोधी रैट में उठाया एंटीबॉडी), सामान्य सीरम प्रजातियों का उपयोग नहीं के रूप में यह पृष्ठभूमि संकेत में वृद्धि होगी.
    2. आकांक्षा द्वारा पीबीएस को धीरे से निकालें और प्रति नमूना अनुभाग ब्लॉकिंग समाधान का 100 $L जोड़ें। आरटी में कम से कम 1 एच के लिए एक कवर गीला कक्ष में इनक्यूबेट।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग.
    1. अवरुद्ध समाधान में इष्टतम एकाग्रता पर प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। सामान्य प्रारंभिक बिंदु एंटीबॉडी एकाग्रता है 5g/mL, लेकिन यह प्रत्येक एंटीबॉडी और ऊतक के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
      नोट: यदि एंटीबॉडी सीधे संयुग्मी हैं, तो इसका उपयोग करने से पहले इसका उपयोग करने से पहले 15 मिनट के लिए 17.135 x g (13.500 आरपीएम) पर एंटीबॉडी मिश्रण को अपकेंद्रणित करें। फ्लोरोफोर्स वेग कर सकते हैं। यह चरण वेग को गोली देगा और इस तरह स्लाइड पर वेगित एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट जमाव को रोक देगा।
    2. अवरुद्ध समाधान प्रत्येक नमूने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के साथ बदलें.
    3. एक कवर गीला कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या रात भर (OVN) के लिए इनक्यूबेट।
  7. धोने का प्रदर्शन करें।
    1. पीबीएस में 2% एफसीएस जोड़कर वॉश बफर तैयार करें।
    2. धोने बफर के साथ 4 बार धोएं: एक त्वरित (बिना ऊष्मायन के), 10 मिनट के लिए एक और दो 5 मिनट के लिए। फिर 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ एक अंतिम धोने प्रदर्शन करते हैं.
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग.
    1. अवरुद्ध समाधान में इष्टतम एकाग्रता पर ब्याज की माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें। मिश्रण centrifuge, के रूप में प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए वर्णित है.
    2. अंतिम धोने समाधान निकालें। खंड के शीर्ष पर माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें और एक कवर गीला कक्ष में आरटी पर 1-4 एच के लिए इनक्यूबेट।
  9. धोने बफर के साथ 4 बार धोएं: एक त्वरित (बिना ऊष्मायन के), 10 मिनट के लिए एक और दो 5 मिनट के लिए। फिर 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ एक अंतिम धोने प्रदर्शन करते हैं.
  10. अंतिम धोने समाधान निकालें। पीबीएस को वाष्पित होने दें लेकिन अनुभाग को अधिक सूखा न करें. नमूना के शीर्ष पर बढ़ते माध्यम की एक बूंद रखें और ध्यान से इसके शीर्ष पर कवर ग्लास रखें। बढ़ते माध्यम पूरे अनुभाग ठीक होना चाहिए. यह RT पर polymerase OVN प्रकाश से संरक्षित करते हैं।
    नोट: बढ़ते माध्यम को लागू करने से पहले स्लाइड के रिवर्स साइड पर अनुभाग के चारों ओर एक वृत्त ड्रा करें। एक बार बढ़ते माध्यम लागू किया जाता है, ऊतक को देखने के लिए मुश्किल हो सकता है.
  11. छवि के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्लाइड स्टोर।

8. इमेजिंग और विश्लेषण

  1. एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ धुंधला की इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक उल्टे वर्णक्रमीय लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें), उद्देश्यों के साथ 10x/NA 0.40 या 60x/NA 1.4 (साइटोकिन उप-कोशिकीय स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए)। सामग्री की तालिका में प्रत्येक फ्लोरोफोर और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन की तरंगदैर्घ्य प्रदर्शित कीजाती है .
  2. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (जैसे, Imaris या फिजी) का उपयोग कर आवश्यक के रूप में विश्लेषण और परिमाणीकरण प्रदर्शन।

Representative Results

लिस्टिरिया monocytogenes संक्रमण के बाद पहले 24 घंटे के भीतर उत्पादित IFN] इस रोगज़नक़ के प्रसार को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम न केवल कल्पना कर सकते हैं जो कोशिकाओं IFN का उत्पादन कर रहे हैं, लेकिन यह भी कि क्या वे एक विशिष्ट microenvironment में स्थित हैं. तिल्ली की वास्तुकला को रेखांकित करने में हमारी मदद करने के लिए, हमने प्लीहा के भीतर विशेष स्थान के लिए जाने जाने वाली कोशिकाओं को लेबल किया। मार्कर F4/80 सभी मैक्रोफेज लेबल और लाल लुगदी पर प्रकाश डाला गया. मार्कर B220 बी कोशिकाओं को लेबल करता है और टी सेल ज़ोन के आसपास के बी सेल रोम को हाइलाइट करता है। मार्कर CD169 सीमांत क्षेत्र मैक्रोफेज को लेबल करता है, जो सफेद लुगदी के आस-पास होता है (चित्र 1)। अधिकांश ओटीआई कोशिकाओं, चाहे वे IFN$ व्यक्त या नहीं, सफेद लुगदी में मौजूद हैं और इस तरह के रूप में, सभी छवियों सफेद लुगदी के उन हैं, जब तक संकेत दिया.

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम cytokine स्राव को बाधित करने के लिए BFA का उपयोग है. वास्तव में, जब चूहों का बीएफए के साथ उपचार नहीं किया गया तो एनके कोशिकाओं द्वारा आईएफएनजेड का पता लगाना बहुत खराब हो गया था (चित्र 2)। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम यह पा सकते हैं कि संक्रमण के बाद कम से कम दो सेल प्रकार IFN $ 24 h का उत्पादन करते हैं-एनके कोशिकाओं और प्रतिजन-विशिष्ट CD8+ T कोशिकाओं (चित्र 3) -इसी प्रकार क्या प्रवाह साइटोमेट्री3द्वारा पहले पाया गया है ।

आईएफएन के उत्पादन कोशिकाओं की स्थिति इमेजिंग में पता चला कि आईएफएन का उत्पादन तिल्ली के पूरे क्षेत्र में नहीं फैलता है, बल्कि विचारशील क्षेत्रों में केंद्रित होता है (चित्र 4)। वास्तव में, हमने पाया कि टी कोशिकाओं तिल्ली भर में सक्रिय थे (टी सेल क्लस्टरिंग द्वारा प्रकाश डाला), और यह जरूरी IFN ] उत्पादन के साथ सहसंबंधित नहीं था. एक संभावित स्पष्टीकरण यह है कि IFN] उत्पादन संक्रमित कोशिकाओं के स्थान तक ही सीमित है15,16, और टी सेल सक्रियण द्वारा प्रतिनिधित्व किया क्लस्टरिंग द्वारा प्रतिनिधित्व-दोनों संक्रमित द्वारा समर्थित किया जा सकता है (IFN] सकारात्मक) और गैर संक्रमित (IFN] नकारात्मक) प्रतिजन-प्रजेंटेवेन्ट कोशिकाओं. अन्य दाग सटीक स्थान इंगित करने के लिए और इस क्षेत्र और प्रतिजन हस्तांतरण करने के लिए अपने रिश्ते के लिए IFN उत्पादन सीमित तंत्र का एक संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि सक्रिय, संकुल, प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाएं तिल्ली के सफेद लुगदी में स्थित होती हैं, लेकिन वे केवल उन क्षेत्रों में आईएफएन का उत्पादन करती हैं जहां एनके कोशिकाएं उनके साथ मौजूद हैं (चित्र 5)। इस प्रकार, एनके कोशिकाओं की उपस्थिति सफेद लुगदी में एक विशिष्ट सूक्ष्म पर्यावरण को रेखांकित करती है, जिसमें संकुल टी कोशिकाएं सफेद लुगदी के दूसरे भाग में संकुल टी कोशिकाओं के विपरीत आईएफएन का उत्पादन करती हैं। यह पता चलता है कि टी सेल सक्रियण इस समय बिंदु पर IFN$ उत्पादन हुक्म चलाने के लिए पर्याप्त नहीं है.

हमारे प्रोटोकॉल द्वारा प्रकाश डाला एक और दिलचस्प विशेषता एनके बनाम CD8+ टी कोशिकाओं5में IFN$ के विभिन्न उप-कोशिकीय स्थानीयकरण है। जैसा कि चित्र 6में दिखाया गया है , जबकि एनके कोशिकाओं में आईएफएनजेड स्थानीयकरण साइटोसोल में फैलाहुआ है, CD8+ T कोशिकाओं को अक्सर एक और टी सेल की ओर आईएफएन जेड की भर्ती करता है।

Figure 1
चित्रा 1: तिल्ली वास्तुकला पर प्रकाश डाला मार्करों. चूहे 2 x 104 CFU LM-OVA और euthanized 24 एच पोस्ट संक्रमण से संक्रमित थे. तिल्ली explanted और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था. (क) एनके कोशिकाओं के लिए धाराएं दागी गई थीं (एंटी-एनसीआर1 के बाद एंटी-गेट आईजीजी-फिटसी; ग्रीन), ओटीआई-आरएफपी सेल (लाल) और मैक्रोफेज (एंटी-एफ 4/80-एपीसी; मैजंटा)। आर.पी. - लाल पल्प; WP - व्हाइट पल्प. स्केल बार ] 200 डिग्री मी (बी) अनुभाग बी कोशिकाओं के लिए दागे गए थे (विरोधी B220-प्रशांत ब्लू; ब्लू), OTI-GFP कोशिकाओं (जीएफपी संकेत लाल रंग में दिखाया गया) और सीमांत क्षेत्र मैक्रोफेज (विरोधी CD169-Alexa647; मैजंटा). आर.पी. - लाल पल्प; बीएफ जेड बी सेल कूप; टी जेड टी सेल ज़ोन। स्केल बार $ 50 डिग्री मी. यह 3 स्वतंत्र प्रयोगों (छ ] 4) की एक प्रतिनिधि छवि है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: BFA उपचार situ में intracellular IFN$ का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. एनजेड उत्पादन स्प्लीप चूहे में विशिष्ट क्षेत्रों के लिए प्रतिबंधित है 2 x 104 CFU LM-OVA से संक्रमित थे और BFA के साथ इलाज किया () या छोड़ दिया अनुपचारित (बी) के बाद 18 ज चूहे euthanized थे 24 एच पोस्ट संक्रमण. तिल्ली explanted और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था. एनके कोशिकाओं के लिए धाराओं को दागदिया गया था (एंटी-एनसीआर1 के बाद एंटी-गोट आईजीजी-एफआईटीसी; हरे, ओटीआई-आरएफपी सेल (लाल) और आईएफएनजेड (एंटी-आईएनजेड-बीवी421; सियान)। स्केल बार ] 5 डिग्री मी. यह 3 स्वतंत्र प्रयोगों (एन जेड 3) से एनके सेल समृद्ध क्षेत्रों की एक प्रतिनिधि छवि है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: तिल्ली में IFN] उत्पादन कोशिकाओं. चूहे 2 x 104 CFU LM-OVA से संक्रमित थे जब संकेत दिया और BFA के साथ इलाज के बाद 18 ज चूहे ethanized 24 एच पोस्ट संक्रमण थे. तिल्ली explanted और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था. एनके कोशिकाओं के लिए धाराओं को दागदिया गया था (एंटी-एनसीआर1 के बाद एंटी-गोट आईजीजी-एफआईटीसी; हरे, ओटीआई-आरएफपी सेल (लाल) और आईएफएनजेड (एंटी-आईएनजेड-बीवी421; सियान)। (ए) एक संयुक्त राष्ट्र संक्रमित भोले माउस से एक तिल्ली के प्रतिनिधि छवि IFN के गैर विशिष्ट दाग की अनुपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए. सफेद रेखाएँ सफेद लुगदी को रेखांकित करती हैं। WP - सफेद लुगदी; आर.पी. - लाल लुगदी. (बी) एलएम-ओवा से संक्रमित माउस की तिल्ली से सफेद लुगदी की प्रतिनिधि छवि, सफेद लुगदी के लिए एनके कोशिकाओं के आक्रमण और एनके कोशिकाओं, ओटीआई कोशिकाओं और गैर लेबल कोशिकाओं द्वारा आईएफएन के उत्पादन को दर्शाती है। छवियाँ 4 स्वतंत्र प्रयोगों से प्रतिनिधि हैं (एन $ 4). स्केल बार्स ] 70 डिग्री मी (ए); और 20 डिग्री मी (बी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: IFN] उत्पादन LM-OVA संक्रमण के बाद तिल्ली में विशिष्ट क्षेत्रों के लिए प्रतिबंधित है। चूहे 2 x 104 CFU LM-OVA से संक्रमित थे और BFA के साथ इलाज के बाद 18 ज. चूहे ethanized 24 एच पोस्ट संक्रमण थे. तिल्ली explanted और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था. सभी वर्गों बी कोशिकाओं के लिए दाग थे (B220-प्रशांत ब्लू अब, ब्लू) और IFN](विरोधी IFN]-बायोटिन streptavidin-पीई; सियान द्वारा पीछा किया. OTI-GFP कोशिकाओं (जीएफपी संकेत लाल रंग में दिखाया गया है) Cyan लाइनों उच्च IFN$ उत्पादन के क्षेत्रों के अनुरूप हैं. वे 4 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि चित्र हैं (एन $ 4). (ए) सीमांत क्षेत्र मैक्रोफेज (विरोधी-सीडी169-एलेक्सा 647, मैजंटा) के लिए धाराएं दागी गई थीं। स्केल बार - 50 डिग्री मी (बी) सभी मैक्रोफेज (एफ 4/80) के लिए धाराओं को दागा गया था। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: सक्रिय OTI कोशिकाओं द्वारा IFN$ उत्पादन एक विशिष्ट microenvironment में होता है. चूहे 2 x 104 CFU LM-OVA से संक्रमित थे और BFA के साथ इलाज के बाद 18 ज. चूहे ethanized 24 एच पोस्ट संक्रमण थे. तिल्ली explanted और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संसाधित किया गया. एनके कोशिकाओं के लिए धाराओं को दागदिया गया था (एंटी-एनसीआर1 के बाद एंटी-गोट आईजीजी-एफआईटीसी; हरे, ओटीआई-आरएफपी सेल (लाल) और आईएफएनजेड (एंटी-आईएनजेड-बीवी421; सियान)। हरे और लाल लाइनों क्रमशः एनके और ओटीआई सेल जोनों को उजागर करते हैं। सफेद तीर टी सेल क्लस्टर IFN$ का उत्पादन नहीं के उदाहरण से संकेत मिलता है. टी सेल क्लस्टर के हरे तीर उदाहरण IFN$ का उत्पादन. स्केल बार ] 100 डिग्री मी. यह चार स्वतंत्र प्रयोगों (छ ] 4) की एक प्रतिनिधि छवि है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: एनके कोशिकाओं और टी कोशिकाओं में आईएफएनजेड का उप-कोशिकीय स्थानीयकरण। चूहे 2 x 104 CFU LM-OVA से संक्रमित थे और BFA के साथ इलाज के बाद 18 ज. चूहे ethanized 24 एच पोस्ट संक्रमण थे. तिल्ली explanted और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था. सभी वर्गों IFN के लिए दाग रहे थे (विरोधी IFN$-BV421; सियान). सफेद रेखाएँ कोशिका के किनारों को रेखांकित करती हैं और सफेद तीर स्राव की दिशात्मकता दर्शाते हैं। यह दो स्वतंत्र प्रयोगों (छ र् 5) की एक प्रतिनिधि छवि है। (ए)- ओटीआई-आरएफपी कोशिकाओं को लाल रंग में दिखाया गया है। स्केल बार - 5 डिग्री मी (बी) एनके कोशिकाओं के लिए धाराओं को दागदिया गया था (एंटी-एनसीआर1 के बाद एंटी-गोट आईजीजी-फिटसी; हरे रंग। स्केल बार ] 2 m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस पांडुलिपि में, हम चूहों में एल monocytogenes संक्रमण के बाद तिल्ली में IFN$ उत्पादन कल्पना करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल सरल है और अन्य ऊतकों और साइटोकिन ट्रिगर्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन निम्नलिखित पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए। कोशिकाओं अक्सर तेजी से cytokines वे उत्पादन स्रावित, और cytokines तेजी से पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा उठाया जाता है. यह इस तरह के रूप में situ में cytokines का पता लगाने के लिए मुश्किल है. तेजी से cytokine उत्पादन फिर से आरंभ करने के लिए एक आम तरीका एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसॉरबेंट परख द्वारा मीडिया में साइटोकीन का पता लगाने के बाद कोशिकाओं को फिर से उत्तेजित करना है। इस संदर्भ में, साइटोकिन उत्पादक कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण के बारे में कोई भी जानकारी खो जाती है। इसके अलावा, cytokine उत्पादन फिर से उत्तेजना के बाद जरूरी प्रतिबिंबित नहीं करता है कि cytokines वास्तव में उत्पादन कर रहे हैं और विवो में स्रावित होता है, बल्कि एक दिया सेल आबादी की क्षमता को इंगित करता है cytokines का उत्पादन. इसलिए, दोनों तरीकों अलग जानकारी प्रदान करेगा और एक पर विचार करना चाहिए जो जानकारी उनके प्रयोग के लिए सबसे मूल्यवान है.

इंट्रासेल्यूलर साइटोकिन्स का पता लगाने के लिए, हमारी विधि कोशिकाओं के अंदर साइटोकिन्स को ट्रैप करने और सिग्नल का पता लगाने में वृद्धि करने के लिए इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन ट्रांसपोर्ट अवरोधक का उपयोग करती है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ये अवरोधक एंडोथेलियल रेटिक्युलम (आरई) से गोलगी उपकरण तक और उनकी रिहाई को बाधित करने वाले स्रावी vesicle से प्रोटीन के सामान्य परिवहन को प्रभावित करते हैं, जो विषाक्तता का कारण बन सकता है। एक परिणाम के रूप में, BFA, या अन्य अवरोध करनेवाला, समय की एक छोटी अवधि के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, आम तौर पर कुछ घंटों से अधिक नहीं. इसलिए, गंभीर साइटोटॉक्सिक प्रभाव के कारण के बिना सेल के अंदर फंस cytokines के स्तर का अनुकूलन करने के लिए अवरोधक खुराक और उपचार के समय के बीच सही संतुलन खोजने के लिए महत्वपूर्ण है। इन चर cytokines और BFA के लिए प्रशासन के मार्ग के बीच अलग कर सकते हैं. हमारे संक्रमण मॉडल में, बीएफए को एक तेजी से प्रणालीगत फैलाव प्रदान करने के लिए इंट्रापेरिटोनली को व्यवस्थित किया गया था, लेकिन इसे अंतःशिरा भी वितरित किया जा सकता है।

सबसे अधिक इस्तेमाल किया intracellular प्रोटीन परिवहन inhibitors BFA हैं, यहाँ इस्तेमाल किया, और monensin (MN). इन अवरोधकों अक्सर indistinctly जमा और cytokine उत्पादन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन वे कार्रवाई के अपने तंत्र में मामूली अंतर है. एम.एन. गोलगी तंत्र के भीतर प्रोटीन के परिवहन को रोकता है इसलिए गोलगी में प्रोटीन जमा17 जबकि बीएफए कोटॉमर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स-I भर्ती को रोकता है, जो एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) को प्रोटीन के प्रतिगामी आंदोलन को रोकता है। और इस प्रकार ईआर18में साइटोकिन्स के संचय को बढ़ावा देने . इस तरह के रूप में, सबसे अच्छा intracellular प्रोटीन परिवहन अवरोध करनेवाला का चयन विभिन्न कारकों पर निर्भर करेगा, जैसे cytokine का पता लगाया जा करने के लिए. उदाहरण के लिए, यह lipopolisaccharide में दिखाया गया है प्रेरित intracellular monocytes के दाग है कि BFA साइटोकिन्स आईएल-1 को मापने के लिए अधिक कुशल है, आईएल -6 और TNF MN19से .

इस प्रोटोकॉल confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा situ में cytokine के दृश्य शामिल है और इसलिए वहाँ केवल मार्करों की एक सीमित संख्या से cytokine उत्पादन कोशिकाओं और उनके microenvironment अध्ययन किया जा सकता है. यह भी विचार करना आवश्यक है कि बीएफए या एमएन जैसे प्रोटीन परिवहन अवरोधक कई प्रोटीन की सामान्य अभिव्यक्ति को परेशान करते हैं और इसलिए कुछ सक्रियण सेल सतह मार्करों की एक साथ अभिव्यक्ति का अध्ययन करते समय उनके उपयोग से संपर्क करना होगा ध्यान. उदाहरण के लिए, BFA लेकिन नहीं MN murine लिम्फोसाइटों20में CD69 की अभिव्यक्ति ब्लॉक. इस सीमा के बावजूद, confocal इमेजिंग cytokines के उप-कोशिकीय स्थानीयकरण, साथ ही सेल के भीतर साइटोकिन स्राव की दिशा में सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न किए गए डेटा से पता चलता है कि एनके कोशिकाओं को एक फैलाना पैटर्न में IFN-y स्रावित करते हैं, जबकि CD8+ T कोशिकाओं को अन्य CD8 + टी कोशिकाओं है कि उनके साथ सीधे बातचीत में हैं की ओर IFN] स्राव प्रत्यक्ष लग तेहैं5.

समाप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल situ में cytokines की एक किस्म कल्पना और इस तरह के संक्रमण या autoimmunity के रूप में कई ट्रिगर के बाद उत्पादन कोशिकाओं और उनके microenvironment की पहचान करने के लिए उपयुक्त है. प्राप्त जानकारी विभिन्न सेल प्रकार के vivo स्थानिक orchestration के महत्व को समझने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और cytokine वे उत्पादन, एक कुशल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम इमेजिंग के साथ तकनीकी सहायता के लिए कैनेडी इंस्टीट्यूट इमेजिंग सुविधा कर्मियों को धन्यवाद देते हैं। यह काम कैनेडी ट्रस्ट (ए.जी. के लिए) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BB/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brefeldin A Cambridge bioscience CAY11861
Paraformaldehyde Agar scientific R1018
L-Lysin dihydrochloride Sigma lifescience L5751
Sodium meta-periodate Thermo Scientific 20504
D(+)-saccharose VWR Chemicals 27480.294
Precision wipes paper Kimtech science Kimberly-Clark Professional 75512
O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy VWR Chemicals 361603E
Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 Biolegend 101302 Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml
Microscope slides - Superfrost Plus VWR Chemicals 631-0108
anti-CD169 - AF647 Biolegend 142407 Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml
Excitation wavelength: 650
Emission wavelength: 65
anti-F4/80 - APC Biolegend 123115 Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml
Excitation wavelength: 650
Emission wavelength: 660
anti-B220 - PB Biolegend 103230 Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/mL
Excitation wavelength: 410
Emission wavelength: 455
anti-IFNg - biotin Biolegend 505804 Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL
anti-IFNg - BV421 Biolegend 505829 Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL
Excitation wavelength: 405
Emission wavelength: 436
anti-Nkp46/NCRI R&D Systems AF2225 Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/mL
anti-goat IgG-FITC Novusbio NPp 1-74814 Antibody clone and Concentration used: 1 mg/mL
Excitation wavelength: 490
Emission wavelength: 525
Streptavidin - PE Biolegend 405203 Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mL
Excitation wavelength: 565
Emission wavelength: 578
Streptavidin - FITC Biolegend 405201 Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mlL
Excitation wavelength: 490
Emission wavelength: 525
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
Cover glasses 22 mm x 40 mm Menzel-Glazer 12352128
Liquid blocker super PAP PEN mini Axxora CAC-DAI-PAP-S-M
Imaris - Microscopy Image Analysis Software Bitplane
Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope Olympus
Cryostat - CM 1900 UV Leica
Base mould disposable Fisher Scientific UK Ltd 11670990
PBS 1x Life Technologies Ltd 20012068
BHI Broth VWR Brand 303415ZA
GFP
Excitation wavelength: 484
Emission wavelength: 507
RFP
Excitation wavelength: 558
Emission wavelength: 583
Insulin syringe, with needle, 29 G VWR International BDAM324824
C57BL/6 wild type mice Charles River

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References

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