리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징

Immunology and Infection
 

Summary

여기서, 우리는 뮤린 이차 림프기관에서 사이토카인 인터페론 감마를 분비하는 세포의 내부 국소화를 가시화하는 간단한 공초점 이미징 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 다양한 조직에서 다른 사이토카인의 시각화를 위해 확장될 수 있다.

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Mazet, J. M., Chiodetti, A. L., Mahale, J. N., Gérard, A. Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection. J. Vis. Exp. (149), e59819, doi:10.3791/59819 (2019).

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Abstract

사이토카인은 세포에 의해 분비되는 작은 단백질로, 효과적인 면역 반응에 중요한 세포-세포 통신을 중재합니다. 사이토 카인의 한 가지 특징은 그들의 pleiotropism, 그들은 에 의해 생산 되 고 세포 유형의 다수에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 어떤 세포가 사이토 카인을 생산하고 있는지뿐만 아니라 보다 구체적인 치료법을 정의하기 위해 어떤 환경에서도 이를 이해하는 것이 중요합니다. 여기서, 우리는 세균 감염 에 이어 자리에서 사이토카인 생산을 시각화하는 방법을 설명한다. 이 기술은 공초점 현미경 검사법에 의해 그들의 모국환경에서 화상 진찰 사이토카인 생성 세포에 의존합니다. 이렇게 하기 위하여는, 조직 단면도는 사이토카인 얼룩과 더불어 다중 세포 모형의 마커를 위해 염색됩니다. 이 방법의 핵심은, 사이토카인 분비가 관심 있는 조직을 수확하기 전에 생체 내에서 직접 차단되어 생산 세포 내부에 축적된 사이토카인을 검출할 수 있게 한다. 이 방법의 장점은 여러 가지입니다. 첫째, 사이토카인이 생성되는 미세 환경이 보존되어 궁극적으로 사이토카인 생산에 필요한 신호와 그 사이토카인의 영향을 받는 세포를 알릴 수 있습니다. 또한, 이 방법은 생산 세포의 인공 체외 재자극에 의존하지 않기 때문에 생체 내에서 사이토카인 생산의 위치를 표시한다. 그러나, 사이토카인을 수신하는 세포에서 사이토카인 다운스트림 시그널링을 동시에 분석하는 것은 불가능하다. 유사하게, 관찰된 사이토카인 신호는 사이토카인 분비가 차단된 시간 창에만 해당한다. 우리는 세포 내 박테리아 리스테리아 monocytogenes에 의하여 마우스 감염 다음 비장에 있는 사이토카인 인터페론 (IFN) 감마의 가시화를 기술하는 동안, 이 방법은 잠재적으로 어떤 사이토카인의 가시화에 적응될 수 있었습니다 대부분의 장기.

Introduction

병원체에 대하여 능률적인 면역 반응을 조율하는 것은 유기체 사이에서 수시로 분산되는 다양한 면역 세포에 의해 표시되는 신호의 복잡한 통합을 요구합니다. 통신하기 위하여는, 이 세포는 사이토카인에게 불린 면역 조절제역할을 하는 다중 생물학 기능을 가진 작은 수용성 단백질을 일으킵니다. 사이토카인 제어 세포 모집, 활성화 및 증식 및 이에 따라면역 반응의 촉진에 핵심적인 선수가 되는 것으로 알려져 있다 1. 효과적인 면역 반응은 특정 신호를 유도하기 위하여 특정 세포를 연결하는 아주 조직된 spatiotemporal 패턴에서 풀어 놓일 사이토카인을 요구합니다. 따라서 사이토카인이 생성되는 미세 환경을 고려하여 사이토카인 생산과 시그널링을 연구하는 것이 중요합니다.

리스테리아 단세포 유전자 (L. monocytogenes)는쥐의 세포 내 병원체에 대한 면역 반응을 연구하는 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세포 내 박테리아입니다. 하나의 사이토카인, IFN 감마(IFNγ)는 L. 단핵세포유전자 감염 후 24시간 이내에 빠르게 생성된다. IFNγ를 위해 쓰러진 마우스가 L. monocytogenes 감염에 매우 민감하기 때문에병원체 클리어런스에 필요합니다 2. IFNγ는 흉막성이며 감염3다음에 여러 세포에 의해 생성됩니다. 자연킬러(NK) 세포에 의해 생성된 IFNγ는 직접적인항균 활성4에 필요한 반면, 다른 공급원으로부터IFNγ는 다른 기능을 갖는다는 것을 나타내고 있다. 실제로, 우리 및 다른 사람들은 최근 CD8+ T 세포에 의해 생성된 IFNγ가 T세포 분화 5,6,7을직접 조절하는 데 특정 한 기능을 갖는다는 것을 발견했다. 따라서 IFNγ(및 미세 환경)를 생성하는 세포를 이해하는 것은 그 기능을 해부하는 데 매우 중요합니다.

사이토카인 생산을 연구하는 가장 일반적인 기술은 유세포 측정에 의해 분석된 세포내 사이토카인 염색에 의존합니다. 이 방법을 사용하면 단일 샘플 내에서 세포 표면 마커와 결합된 여러 사이토카인을 동시에 검출할 수 있어 사이토카인 생산을 연구하는 데 매우 유용한 도구를 제공합니다. 그러나 전술한 기술을 사용하면 공간 정보가 손실된다는 의미입니다. 또한, 사이토카인 검출은 종종 사이토카인 검출을 가능하게 하기 위해 시험관내 재자극에 의존한다. 이와 같이, 사이토카인을 생성하는 주어진 세포의 용량이 분석되고, 반드시 그자리에서 실제 사이토카인 분비와 상관관계가 있는 것은 아니다. 다른 방법은 형광 단백질 발현이 사이토카인 전사와 상관관계가 있고 단일 세포 수준 8에서시각화를 허용하는 리포터 마우스를 사용한다. 이 방법은 사이토카인 전사를 그(것)들 에서 추적할 수 있더라도, 유효한 사이토카인 리포터 마우스의 한정된 수의 있습니다. 또한, 전사, 번역 및 분비는 때때로 연결되지 않을 수 있고, 형광 단백질은 그들이 보고하는 사이토카인과는 다른 반감기를 가지며, 이 방법은 때때로 사이토카인 시각화에 적합하지 않다.

여기서, 우리는 단일 세포 해상도에서 공초점 현미경검사법에 의해 사이토카인 생산을 현장에서 시각화하는 방법을 기술한다. 이 기술은 조직 내의 세포 근원 그리고 주변 틈새의 가시화를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 특히 NK 세포 및 항원 특이적 CD8+ T 세포에 의한 IFNγ 생산에 초점을 맞추고, L. monocytogenes 감염 마우스의 비장에서 IFNγ 생산의 시각화를 설명합니다. 그러나, 표적 사이토카인이 세포에서 유지될 수 있는 한, 감염, 염증 또는 자가면역 질환과 같은 사이토카인이 생성되는 다른 상황의 맥락에서 임의의 사이토카인 생산의 특성화에 확장 및 적응될 수 있다. 세포 내 단백질 수송 억제제에 의해.

Protocol

마우스를 관련시키는 모든 실험은 1986의 UK 과학적인 절차 법에 동의했습니다.

1. 마우스에 있는 항원 특정 CD8+ T 세포의 채택적인 전송

  1. 마우스를 사용하여 N세포 수용체 형질전환 마우스의 림프절 현탁액으로부터 녹색 형광 단백질(OTI-GFP) 또는 적색 형광 단백질(OTI-RFP)을 발현하는 OValbumin(OVA)-특이적 CD8+ T 세포(OTI)를 분리 제조 지침에 따라 CD8+ T 셀 절연 키트. 앞서설명한 바와같이 주사기 플런저를 사용하여 림프절을 스매싱하여 세포 현탁액을 준비한다.
  2. 카할란, 외12에의해 기술된 바와 같이 정맥 주사에 의해 C57BL/6 야생형 마우스 수용자로 OTI-GFP 또는 OTI-RFP 세포(3 x 106 세포)를 전달한다. 일반적으로 6-12주된 생쥐를 사용하십시오.
    참고: 이 단계는 선택 사항이며 항원 특이적 CD8+ T 세포를 추적하는 데만 필요합니다.

2. 리스테리아 단세포 유전자 감염

  1. 앞서 참조에 기재된 바와 같이, OD600이 0.08-0.1에 도달할 때까지 37°C에서 국물 심혼 주입에서 기하급수적으로 성장하는 단계로 AL. monocytogenes를 유전적으로 변형한 확장 14.
  2. 29 G 인슐린 주사기를 사용하여 정맥 주사에 의해 인산완충식염수(PBS)에서 희석된 0.1-0-0.5 LD50 LM-OVA의 100 μL(최대 부피 = 200 μL)을 C57BL/6 야생형 마우스 수령인에게 OTI-GFP 또는 OTI-RFP 세포를 주입합니다.
    참고: 우리의 손에, 0.1 x LD50 LM-OVA는 2 x 104 콜로니 형성 단위 (CFU)에 해당합니다. OVA를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 단핵포세포유전자는 이전에 옮겨진 OTI CD8+ T 세포를 활성화하는데 사용되지만, L. 단핵세포유전자의 다른 균주가 사용될 수 있다.

3. 브레펠딘 A (BFA)로 시토 카인 분비를 차단하는 치료

  1. 29 G 인슐린 주사기를 사용하여 마우스 희생 전에 200 μl의 PBS 인복피 6 시간 동안 BFA 250 μg를 주입합니다.
    참고: Lyophilized BFA는 25 mg/mL 농도의 주식을 준비하기 위하여 디메틸 설폭화물 (DMSO)에서 처음으로 재중단됩니다. BFA는 주입 전에 결정화를 피하기 위해 실온 (RT)에서 PBS에서 희석됩니다. 사이토카인 분비의 억제는 세포에서 IFNγ의 축적을 유도한다. 이것은 사이토카인 검출을 위해 중요합니다.

4. 비장 수확

  1. CO2의 상승 농도를 이용하여 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구를 뒤따른다.
    참고: 쥐의 인도적 안락사에 대한 현지 기관 지침을 따르십시오.
  2. 70 % 에탄올로 복부를 정화하고 가위로 절개를하여 비장이있는 마우스의 왼쪽 측면에있는 피부를 통해 1-2cm 잘라냅니다. 조심스럽게 비장을 노출하고 핀셋으로 꺼내 기창에 절개를합니다. 비장을 수확, 집게로 짜내거나 비장 아키텍처를 방해하지 않도록 잘라하지 않도록주의.

5. 파라 포름 알데히드와 비장의 고정 (PFA)

  1. 3.75 mL의 PBS와 0.2 M L-리신의 3.75 mL을 혼합하여 고정 용액을 준비합니다. 나트륨 m-periodate의 21 mg을 추가하고 잘 섞는다. 그런 다음 4% PFA의 2.5 mL및 12 N NaOH의 20 μL을 추가합니다.
    참고: 같은 날에 고정 용액을 사용하고 초과 분을 폐기하십시오. 보관하지 마십시오. 이 고정 단계는 견본이 GFP와 같은 형광성 단백질을 포함하는 경우에 중요합니다. 형광 성 단백질을 변성으로 메탄올의 흔적을 포함하는 PFA를 사용하지 마십시오.
    주의 사항: PFA는 독성이 있으며 주의해서 처리해야 합니다.
  2. 고정제에 비장을 담그고 최소 4시간, 일반적으로 4°C에서 16-20시간 동안 부드러운 교반 하에 고정하십시오.
  3. 고정 용액을 버리고 부드러운 교반하에 RT에서 5 분 동안 PBS 5 mL을 추가하십시오.
  4. PBS를 부드러운 교반 하에서 4°C에서 1시간 동안 신선한 PBS 인큐베이터 5 mL로 교체합니다.
  5. PBS를 30% 자당의 5 mL로 교체하고 12-24 시간 동안 배양하십시오.
    참고: 이 방법은 조직 형태를 유지하는 데 도움이됩니다. 자당 용액으로 배양 한 후 장기는 우물 바닥에 가라 앉어야합니다.

6. 동결 및 단면화

  1. 드라이 아이스를 대형 리셉터클에 넣고 약 50 mL의 순수 메탄올과 몇 조각의 드라이 아이스가 들어있는 작은 리셉터클을 내부에 놓습니다.
  2. 보풀이 없는 물티슈로 비장을 부드럽게 말립니다.
  3. 비장을 최적 절삭 온도(OCT) 화합물을 포함하는 베이스 몰드 내부에 바닥에 놓습니다. 거품이 생기지 않도록 주의하십시오. 비장 위에 OCT를 추가합니다.
  4. 집게로, 메탄올의 표면에 베이스 금형을 증착, OCT를 만지지 않도록. 유물을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 조직을 동결.
  5. 고정되면 단면화를 진행합니다.
    참고: 냉동 비장은 몇 개월 동안 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
  6. 저온 미생물을 사용하여 조직을 단면도하십시오.
    1. 저온 가에 챔버 온도를 -21°C로 설정한다. 원하는 두께의 절단을 잘라냅니다 (일반적으로 약 10 μm). 이 프로토콜은 최대 30 μm의 두께에서 작동합니다.
  7. 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 수집하고 (재료 참조) 시각적으로 검사합니다.
    참고: 단면은 몇 달 동안 -80 °C에서 유지될 수 있다.

7. 면역 형광 염색

  1. 섹션이 RT에 올 수 있도록 허용합니다.
  2. 티슈 섹션 주위에 액체 차단제(예: PAP 펜)로 원을 그립니다. OCT 외부로 그리거나 달라붙지 않습니다.
  3. 일단 건조되면, 5 분 동안 조직 섹션에 PBS를 배치하여 샘플을 재수화.
    참고: 섹션에 놓인 볼륨은 단면의 크기에 따라 다릅니다. 우리는 일반적으로 100-300 μL을 사용합니다. 수분을 보충한 후에는 단면을 건조시키지 마십시오.
  4. PBS로 적어도 두 번 헹구어 섹션이 슬라이드에 잘 부착되도록 하십시오.
  5. 단면에 차단 용액을 추가하여 항체의 비특이적 결합을 감소시입니다.
    1. 다음과 같이 차단 용액을 준비하십시오 : 0.1 % 트리톤 X100, 2 % 태아 송아지 혈청 (FCS), 2.5 μg / mL Fc 수용체 차단제 (안티 마우스 CD16 / 32)가있는 PBS. 그런 다음 염색 패널의 각 이차 항체의 종의 2-5 % 정상 혈청을 추가합니다.
      참고: 항체가 직접 공액 /생체 구성되는 경우 각 1 차 항체의 종의 5 % 정상 혈청을 추가하십시오. 1차 항체 와 이차 항체 중 하나가 동일한 종(예를 들어, 토끼 및 이차 토끼 항-래트에서 제기된 1차 항체)으로부터 인 경우, 배경 신호를 증가시킬 때 정상적인 혈청 종을 사용하지 않는다.
    2. 흡인에 의해 섹션에서 PBS를 부드럽게 제거하고 샘플 섹션당 차단 용액의 100 μL을 추가합니다. RT에서 최소 1 시간 동안 덮인 젖은 챔버에서 배양하십시오.
  6. 1 차 항체로 얼룩.
    1. 차단 용액에서 최적의 농도로 1 차 항체를 희석하십시오. 일반적인 시작점 항체 농도는 5 μg/mL이지만 각 항체 및 조직에 대해 최적화되어야 한다.
      참고: 항체가 직접 공액되는 경우, 17.135 x g (13.500 rpm)에서 항체 혼합을 4°C에서 15분 동안 사용한다. 형광단은 침전할 수 있습니다. 이 단계는 침전물 펠렛을 하고 슬라이드 상에서 침전된 항체의 비특이적 침착을 방지할 것이다.
    2. 차단 용액을 각 샘플에 대한 기본 항체 혼합물로 교체합니다.
    3. 덮여 습식 챔버에서 4 °C에서 RT 또는 하룻밤 (OVN)에서 4 시간 동안 배양하십시오.
  7. 세탁을 실시합니다.
    1. PBS에 2% FCS를 추가하여 세척 버퍼를 준비합니다.
    2. 세척 버퍼로 4 회 씻어 내세요 : 빠른 (배양없이) 1 회, 10 분 동안, 2 회5 분 동안 씻으하십시오. 그런 다음 5 분 동안 PBS로 최종 세척을 수행합니다.
  8. 이차 항체로 염색.
    1. 차단 용액에서 최적의 농도로 관심 있는 이차 항체를 희석합니다. 원심분리기는 1차 항체에 대해 기재된 바와 같이 혼합물이다.
    2. 최종 세척 용액을 제거합니다. 이차 항체 혼합물을 섹션 위에 추가하고 덮여 습한 챔버에서 RT에서 1-4 시간 동안 배양합니다.
  9. 세척 버퍼로 4 회 씻어 내세요 : 빠른 (배양없이) 1 회, 10 분 동안, 2 회5 분 동안 씻으하십시오. 그런 다음 5 분 동안 PBS로 최종 세척을 수행합니다.
  10. 최종 세척 용액을 제거합니다. PBS가 증발할 수 있도록 허용하지만 섹션을 과도하게 건조시키지 마십시오. 시료 위에 장착 매체를 한 방울 떨어뜨리고 커버 글래스를 조심스럽게 위에 놓습니다. 마운팅 매체는 전체 섹션을 복구해야 합니다. RT에서 중합효소 OVN을 빛으로부터 보호합니다.
    참고: 마운팅 매체를 적용하기 전에 슬라이드의 뒷면에 있는 섹션 주위에 원을 그립니다. 마운팅 매체를 적용하면 조직을 보기 어려울 수 있습니다.
  11. 슬라이드를 4°C에서 어두운 위치에 보관하여 이미지가 준비될 때까지 보관합니다.

8. 이미징 및 분석

  1. 공초점 현미경으로 염색의 이미징을 수행합니다.
    참고: 이 프로토콜에서는 역스펙트럼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하였다(재료 참조), 목표 10x/NA 0.40 또는 60x/NA 1.4(사이토카인 하위 세포 국소화 분석). 형광및형광단백질에대해여기및방출의파장이표에표시되어있습니다.
  2. 이미지 처리 소프트웨어(예: Imaris 또는 Fiji)를 사용하여 필요에 따라 분석 및 정량화를 수행합니다.

Representative Results

IFNγ는 리스테리아 단세포유전자 감염 후 처음 24시간 내에 생산되며 이러한 병원체의 확산을 조절하는 데 중요하다. 이 프로토콜을 사용하여 IFNγ를 생산하는 세포뿐만 아니라 특정 미세 환경에 있는지 여부를 시각화할 수 있습니다. 비장의 구조를 묘사하기 위해 비장 내에 특정 위치가 있는 것으로 알려진 셀에 레이블을 지정했습니다. 마커 F4/80은 모든 대식세포에 라벨을 부착하고 빨간색 펄프를 강조표시합니다. 마커 B220은 B 세포를 표시하고 T 세포 영역을 둘러싼 B 세포 여포를 강조합니다. 마커 CD169는 백색 펄프를 둘러싼 한계영역 대식세포에 라벨을 붙인다(그림 1). 대부분의 OTI 세포는 IFNγ를 발현하든 그렇지 않든, 백색 펄프에 존재하며, 따라서 모든 이미지는 지시되지 않는 한 백색 펄프의 세포이다.

이 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 사이토카인 분비를 억제하기 위해 BFA를 사용하는 것입니다. 실제로, NK 세포에 의한 IFNγ의 검출은 마우스가 BFA로 처리되지 않았을 때 크게 손상되었다(도 2). 우리의 프로토콜을 사용하여, 우리는 적어도 2개의 세포 모형이 감염 후에 IFNγ 24 h를 생성한다는 것을 것을을 발견할 수 있었습니다-NK 세포 및 항원 특이적 CD8+ T 세포 (그림 3)-유사하게 유세포 분석에 의해 이전에 발견된 것과유사하게.

IFNγ 생산 세포의 심상 영상에서 IFNγ 생산은 비장 전체에 퍼지지 않고, 신중한 영역으로집중되는 것으로 나타났다(도 4). 실제로, 우리는 T 세포가 비장 전체에 걸쳐 활성화되었다는 것을 발견했습니다 (T 세포 군집화에 의해 강조), 이것은 반드시 IFNγ 생산과 상관 관계가 없습니다. IFNγ 생산이 감염된 세포(IFNγ 양성)와 비감염(IFNγ) 모두에 의해 지원될 수 있는 클러스터링으로 표시되는 감염된세포(15,16및 T 세포 활성화)의 위치로 제한된다는 설명이 있습니다. 음수) 항원 제시 세포. 다른 얼룩은 정확한 위치를 정확히 파악하고 IFNγ 생산을 이 영역으로 제한하는 메커니즘의 표시와 항원 전달과의 관계를 파악하는 데 필요합니다. 흥미롭게도, 우리는 활성화, 클러스터, 항원 특이적 T 세포가 비장의 백색 펄프 전체에 위치하지만 NK 세포가 그들과 공존하는지역에서만 IFNγ를 생성한다는 것을 발견했습니다 (그림 5). 이와 같이, NK 세포의 존재는 백색 펄프의 다른 부분에서 클러스터된 T 세포와 반대로 클러스터된 T 세포가 IFNγ를 생성하는 백색 펄프에 있는 특정 미세 환경을 묘사합니다. 이는 T 세포 활성화가 이 시점에서 IFNγ 생산을 지시하기에 충분하지 않다는 것을 시사한다.

우리의 프로토콜에 의해 강조 된 또 다른 흥미로운 기능은 CD8+ T 세포5대 NK에서 IFNγ의 다른 하위 세포 지역화입니다. 6에 도시된 바와 같이, NK 세포에서 IFNγ 국소화는 사이토솔에서 확산되는 반면, CD8+T 세포는 종종 다른 T 세포를 향해 IFNγ를 모집한다.

Figure 1
그림 1: 비장 아키텍처를 강조하는 마커입니다. 마우스는 2 x 104 CFU LM-OVA에 감염되었고 24시간 후 감염을 안락사시켰다. 비장 은 프로토콜에 기재된 바와 같이 이식 및 처리되었다. (a) 단면도는 NK 세포(항-NCR1 다음에 항염소 IgG-FITC; 녹색), OTI-RFP 세포(적색) 및 대식세포(항-F4/80-APC; 마젠타)에 대해 염색되었다. RP = 레드 펄프; WP = 흰색 펄프. 스케일 바 = 200μm. (B) 절편은 B 세포에 대해 염색되었다(항-B220-Pacific Blue; 청색), OTI-GFP 세포(적색으로 나타낸 GFP 신호) 및 한계 영역 대식세포(항-CD169-Alexa647; 마젠타). RP = 레드 펄프; BF = B 세포 여포; TZ = T 셀 영역. 배율 막대 = 50 μm. 이것은 3개의 독립적인 실험(N=4)의 대표적인 이미지이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: BFA 치료는 그것에서 세포내 IFNγ의 검출을 허용한다. Nγ 생산은 2 x 104 CFU LM-OVA로 감염되었고 BFA(A) 또는좌측 미처리(B)로 처리된 비플 마우스의 특정 부위로 제한되며, 18시간 후 마우스는 24시간 후 감염을 안락사시켰다. 비장 은 프로토콜에 기재된 바와 같이 이식 및 처리되었다. 단면도는 NK 세포(항-NCR1 및 안티-염소 IgG-FITC; 녹색), OTI-RFP 세포(적색) 및 IFNγ(항-IFNγ-BV421; 시안)에 대해 염색되었다. 배율 막대 = 5 μm. 이것은 3개의 독립적인 실험(N=3)으로부터 NK 세포가 풍부한 영역의 대표적인 이미지이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 비장에서 세포를 생산하는 IFNγ. 마우스는 18시간 후에 BFA로 표시하고 처리했을 때 2 x 104 CFU LM-OVA로 감염되었고 마우스는 24시간 후 감염을 안락사시켰다. 비장 은 프로토콜에 기재된 바와 같이 이식 및 처리되었다. 단면도는 NK 세포(항-NCR1 및 안티-염소 IgG-FITC; 녹색), OTI-RFP 세포(적색) 및 IFNγ(항-IFNγ-BV421; 시안)에 대해 염색되었다. (a) IFNγ 비특이적 염색의 부재를 입증하기 위해 감염되지 않은 순진한 마우스로부터비장의 대표적인 이미지. 흰색 선은 흰색 펄프를 묘사합니다. WP = 백색 펄프; RP = 빨간색 펄프. (B) LM-OVA에 감염된 마우스의 비장으로부터백색 펄프의 대표적인 이미지는, NK 세포, OTI 세포 및 비표지세포에 의한 IFNγ의 백색 펄프 및 생산에 대한 NK 세포의 침입을 나타냈다. 이미지는 4개의 독립적인 실험(N=4)에서 대표됩니다. 축척 막대 = 70 μm (A); 및 20 μm (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: IFNγ 생산은 LM-OVA 감염 에 따른 비장의 특정 부위로 제한된다. 마우스는 2 x 104 CFU LM-OVA로 감염시키고 18시간 후에 BFA로 처리하였다. 비장 은 프로토콜에 기재된 바와 같이 이식 및 처리되었다. 모든 단면은 B 세포(B220-Pacific Blue Ab, Blue) 및 IFNγ(항-IFNγ-비오틴 및 스트렙타비딘-PE; 시안)에 대해 염색되었다. OTI-GFP 세포 (GFP 신호는 빨간색으로 표시). 시안 라인은 높은 IFNγ 생산 영역에 해당합니다. 이들은 4 개의 독립적 인 실험 (N = 4)의 대표적인 이미지입니다. (A) 절편은 한계 영역 대식세포(항-CD169-Alexa 647, 마젠타)에 대해 염색되었다. 스케일 바 = 50μm. (B) 절편은 모든 대식세포(F4/80)에 대해 염색되었다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 활성화된 OTI 세포에 의한 IFNγ 생산은 특정 미세 환경에서 발생한다. 마우스는 2 x 104 CFU LM-OVA로 감염시키고 18시간 후에 BFA로 처리하였다. 비장을 이식하고 프로토콜에 기재된 바와 같이 처리시켰다. 단면도는 NK 세포(항-NCR1 및 안티-염소 IgG-FITC; 녹색), OTI-RFP 세포(적색) 및 IFNγ(항-IFNγ-BV421; 시안)에 대해 염색되었다. 녹색과 빨간색 선은 각각 NK 및 OTI 셀 영역을 강조 표시합니다. 흰색 화살표는 IFNγ를 생성하지 않는 T 세포 클러스터의 예를 나타낸다. IFNγ를 생산하는 T 세포 클러스터의 녹색 화살표 예. 배율 막대 = 100 μm. 이것은 4개의 독립적인 실험(N=4)의 대표적인 이미지이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: NK 세포 및 T 세포에서 IFNγ의 하위 세포 국소화. 마우스는 2 x 104 CFU LM-OVA로 감염시키고 18시간 후에 BFA로 처리하였다. 비장 은 프로토콜에 기재된 바와 같이 이식 및 처리되었다. 모든 섹션은 IFNγ(항-IFNγ-BV421; 시안)에 대해 염색하였다. 흰색 선은 셀 가장자리를 묘사하고 흰색 화살표는 분비의 방향성을 보여줍니다. 이것은 두 개의 독립적인 실험(N=5)의 대표적인 이미지이다. (a)-OTI-RFP 세포는 적색으로 나타내고 있다. 스케일 바 = 5μm. (B) 단면은 NK 세포에 대해 염색하였다(안티-NCR1 이어서 안티염소 IgG-FITC; 녹색. 배율 표시줄 = 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 원고에서, 우리는 마우스에서 L. monocytogenes 감염 다음 비장에서 IFNγ 생산을 시각화하는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 간단하고 다른 조직 및 사이토카인 트리거에 적응될 수 있지만 다음과 같은 측면을 고려해야 합니다. 세포는 수시로 급속하게 생성하는 사이토카인을 분비하고, 사이토카인은 급속하게 인접한 세포에 의해 픽업됩니다. 그것은 장소에서 사이토 카인을 검출하는 것이 어렵다. 사이토카인 생산을 빠르게 재개시하는 일반적인 방법은 효소 연계 면역흡착 분석법에 의해 매체에서 사이토카인 검출에 이어 생체 내 세포를 재자극하는 것이다. 이러한 맥락에서, 사이토카인 생성 세포의 공간 국소화에 대한 모든 정보는 손실된다. 또한, 재자극 에 따른 사이토카인 생산은 시토카인이 실제로 생체 내에서 생산및 분비되는지 여부를 반드시 반영하지 않고, 오히려 사이토카인을 생산하는 주어진 세포 집단의 용량을 나타낸다. 따라서 두 방법 모두 서로 다른 정보를 제공하며 실험에 가장 유용한 정보를 고려해야 합니다.

세포내 사이토카인을 검출하기 위해, 우리의 방법은 세포 내부의 사이토카인을 포획하고 신호 검출을 증가시키기 위해 세포내 단백질 수송 억제제를 사용합니다. 그러나, 이 억제제는 내피 망상 (RE)에서 골지 장치및 그들의 방출을 손상시키는 분비 소포에 단백질의 일반적인 수송에 영향을 미친다는 것을 주의하는 것이 중요합니다, 이는 독성을 일으키는 원인이 될 수 있었습니다. 결과적으로, BFA, 또는 다른 억제제는, 단기간 동안, 전형적으로 몇 시간 이상 사용되어야 한다. 따라서, 심각한 세포 독성 효과를 일으키지 않고 세포 내부에 갇혀 있는 사이토카인의 수준을 최적화하기 위해서는 억제제 투여량과 치료 시간 사이의 적절한 균형을 찾는 것이 중요하다. 이러한 변수는 사이토카인과 BFA에 대한 투여 경로 간에 다를 수 있다. 우리의 감염 모델에서, BFA는 급속한 전신 분산을 제공하기 위하여 복강 내로 관리되었습니다, 그러나 또한 정맥으로 전달될 수 있습니다.

가장 일반적으로 사용되는 세포내 단백질 수송 억제제는 BFA, 여기에서 사용되며, 모넨신(MN)입니다. 이 억제제는 수시로 사이토카인 생산을 축적하고 공부하기 위하여 불분명하게 이용됩니다 그러나 행동의 그들의 기계장치에 있는 약간 다름이 있습니다. MN은 골지17에 단백질을 축적하는 골지 장치 내단백질의 수송을 억제하는 한편 BFA는 코아토머 단백질 복합체-I 모집을 방지하여 단백질의 역행이동을 억제하여 벤라세성 망상에 대한 단백질의 역행 이동을 억제한다(ER) ER18에서사이토카인의 축적을 촉진합니다. 이와 같이, 최적의 세포내 단백질 수송 억제제선택은 검출되는 사이토카인과 같은 상이한 인자에 의존할 것이다. 예를 들어, BFA가 MN19보다CYtokines IL-1β, IL-6 및 TNF를 측정하는 것이 더 효율적이라는 단핵구의 리포폴리사카라이드 유도 세포내 염색에 도시되었다.

이 프로토콜은 공초점 현미경 검사법에 의해 그 안에 있는 사이토카인의 시각화를 관련시키고 그러므로 사이토카인-생산 세포 및 그들의 미세 환경을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 보다는 마커의 단지 한정된 수가 있습니다. 또한 BFA 또는 MN과 같은 단백질 수송 억제제가 여러 단백질의 정상적인 발현을 방해하고 따라서 특정 활성화 세포 표면 마커의 동시 발현을 연구 할 때 그 사용이 접근되어야한다는 것을 고려할 필요가 있습니다. 주의깊게. 예를 들어, BFA는 MN이 아닌 뮤린 림프구(20)에서 CD69의 발현을 차단한다. 이러한 제한에도 불구하고, 공초점 이미징은 세포 내 사이토카인 분비의 방향뿐만 아니라 사이토카인의 하위 세포 국소화를 가능하게 한다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 데이터는 NK 세포가 확산 패턴으로 IFN-y를 분비하는 경향이 있는 반면 CD8+ T 세포는 IFNγ 분비를 그들과 직접 상호작용하는 다른 CD8+ T 세포쪽으로 지시하는 것으로 보인다는 것을 시사한다 5.

결론, 이 프로토콜은 그(것)들에서 다양한 사이토카인을 구상하고 감염 또는 자기 면역과 같은 많은 트리거다음 생성 세포 및 그들의 미세 환경을 확인하기 위하여 적당합니다. 얻어진 정보는 능률적인 면역 반응을 위해 필요한 다른 세포 모형 및 그(것)들이 생성하는 사이토카인의 생체 내 공간 오케스트레이션의 중요성을 이해하는 중요한 것입니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

우리는 이미징기술 지원을 위해 케네디 연구소 이미징 시설 직원에게 감사드립니다. 이 작품은 케네디 트러스트 (A.G.) 및 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BB / R015651/1에서 A.G.)의 보조금에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brefeldin A Cambridge bioscience CAY11861
Paraformaldehyde Agar scientific R1018
L-Lysin dihydrochloride Sigma lifescience L5751
Sodium meta-periodate Thermo Scientific 20504
D(+)-saccharose VWR Chemicals 27480.294
Precision wipes paper Kimtech science Kimberly-Clark Professional 75512
O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy VWR Chemicals 361603E
Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 Biolegend 101302 Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml
Microscope slides - Superfrost Plus VWR Chemicals 631-0108
anti-CD169 - AF647 Biolegend 142407 Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml
Excitation wavelength: 650
Emission wavelength: 65
anti-F4/80 - APC Biolegend 123115 Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml
Excitation wavelength: 650
Emission wavelength: 660
anti-B220 - PB Biolegend 103230 Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/mL
Excitation wavelength: 410
Emission wavelength: 455
anti-IFNg - biotin Biolegend 505804 Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL
anti-IFNg - BV421 Biolegend 505829 Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL
Excitation wavelength: 405
Emission wavelength: 436
anti-Nkp46/NCRI R&D Systems AF2225 Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/mL
anti-goat IgG-FITC Novusbio NPp 1-74814 Antibody clone and Concentration used: 1 mg/mL
Excitation wavelength: 490
Emission wavelength: 525
Streptavidin - PE Biolegend 405203 Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mL
Excitation wavelength: 565
Emission wavelength: 578
Streptavidin - FITC Biolegend 405201 Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mlL
Excitation wavelength: 490
Emission wavelength: 525
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
Cover glasses 22 mm x 40 mm Menzel-Glazer 12352128
Liquid blocker super PAP PEN mini Axxora CAC-DAI-PAP-S-M
Imaris - Microscopy Image Analysis Software Bitplane
Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope Olympus
Cryostat - CM 1900 UV Leica
Base mould disposable Fisher Scientific UK Ltd 11670990
PBS 1x Life Technologies Ltd 20012068
BHI Broth VWR Brand 303415ZA
GFP
Excitation wavelength: 484
Emission wavelength: 507
RFP
Excitation wavelength: 558
Emission wavelength: 583
Insulin syringe, with needle, 29 G VWR International BDAM324824
C57BL/6 wild type mice Charles River

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References

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