Imaging av in situ interferon gamma Production i Mouse milt etter Listeria monocytogenes infeksjon

Immunology and Infection
 

Summary

Her beskriver vi en enkel konfokalmikroskopi imaging metode for å visualisere in situ lokalisering av celler sekresjon cytokin interferon gamma i murine sekundære lymfoide organer. Denne protokollen kan utvides for visualisering av andre cytokiner i ulike vev.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mazet, J. M., Chiodetti, A. L., Mahale, J. N., Gérard, A. Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection. J. Vis. Exp. (149), e59819, doi:10.3791/59819 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cytokiner er små proteiner utskilles av celler, formidling celle-celle kommunikasjon som er avgjørende for effektive immunresponser. En karakteristikk av cytokiner er deres pleiotropism, som de er produsert av og kan påvirke en rekke celletyper. Som sådan er det viktig å forstå ikke bare hvilke celler som produserer cytokiner, men også i hvilket miljø de gjør det, for å definere mer spesifikke legemiddel legemidler. Her beskriver vi en metode for å visualisere cytokin produksjon in situ etter bakteriell infeksjon. Denne teknikken er avhengig av Imaging cytokin-produserende celler i sitt eget miljø ved konfokalmikroskopi mikroskopi. For å gjøre dette, er vevs deler beiset for markører av flere celletyper sammen med en cytokin beis. Nøkkelen til denne metoden, cytokin sekresjon er blokkert direkte i vivo før høsting vevet av interesse, slik at for påvisning av cytokin som akkumulert inne i produserende celler. Fordelene med denne metoden er flere. Først mikromiljøet der cytokiner produseres er bevart, som til slutt kunne informere om signalene som kreves for cytokin produksjon og cellene påvirkes av disse cytokiner. I tillegg gir denne metoden en indikasjon på plasseringen av cytokin produksjon i Vivo, da det ikke er avhengig av kunstig in vitro re-stimulering av produserende celler. Det er imidlertid ikke mulig å analysere cytokin nedstrøms signalering samtidig i celler som mottar cytokin. Tilsvarende cytokin signalene observert tilsvarer bare tid-vinduet der cytokin sekresjon ble blokkert. Mens vi beskriver visualisering av cytokin interferon (IFN) gamma i milten følgende mus infeksjon av intracellulære bakterier Listeria monocytogenes, denne metoden kan potensielt være tilpasset visualisering av eventuelle cytokin i de fleste organer.

Introduction

Orkestrering en effektiv immunrespons mot en patogen krever kompleks integrasjon av signaler som vises av en rekke immunceller som ofte spres blant organismen. For å kommunisere, disse cellene produsere små løselige proteiner med flere biologiske funksjoner som fungerer som immunomodulators navngitt cytokiner. Cytokiner kontroll celle rekruttering, aktivisering og spredning og dermed er kjent for å være sentrale aktører i markedsføringen av immunresponser1. Effektiv immunresponser forlange cytokiner å bli befridd inne en meget organisert spatiotemporal mønster forbinde spesifikk celler å indusere spesifikk signaler. Derfor er det avgjørende å studere cytokin produksjon og dens signalering in situ, tar hensyn til mikromiljøet der cytokiner produseres.

Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) er en gram-positiv intracellulære bakterie som brukes som en førsteklasses modell for å studere immunresponser mot intracellulære patogener hos mus. En cytokin, IFN gamma (IFNγ) produseres raskt, innen 24 h etter L. monocytogenes infeksjon. Det er nødvendig for patogen klaring, som mus slått ut for IFNγ er svært mottakelige for L. monocytogenes infeksjon2. IFNγ er pleiotropic og produsert av flere celler etter infeksjon3. Mens IFNγ produsert av naturlig Killer (NK) celler er nødvendig for direkte anti-bakteriell aktivitet4, IFNγ fra andre kilder har vist å ha andre funksjoner. Faktisk har vi og andre nylig funnet ut at IFNγ produsert av CD8 + T celler har en bestemt funksjon i direkte regulering T celle differensiering5,6,7. Som sådan, forståelse hvilke celler tilvirke IFNγ (og i hvilket mikromiljøet) er avgjørende å analysere dens funksjonen.

Den vanligste teknikken for å studere cytokin produksjon er avhengig av intracellulære cytokin farging analysert av flyt flowcytometri. Denne metoden gjør at samtidig påvisning av flere cytokiner kombinert med celle overflate markører i en enkelt prøve, og gir et svært nyttig verktøy for å studere cytokin produksjon. Men ved hjelp av nevnte teknikk innebærer å miste noen romlige informasjon. I tillegg er cytokin deteksjon ofte avhengig av in vitro re-stimulering for å muliggjøre cytokin deteksjon. Som sådan analyseres kapasiteten til en gitt celle for å produsere en cytokin, og den samsvarer ikke nødvendigvis med selve cytokin sekresjon i situ. Andre metoder bruker reporter mus som fluorescerende protein uttrykk samsvarer med cytokin transkripsjon og gir mulighet for visualisering på en enkelt cellenivå8. Selv om denne metoden kan spore cytokin transkripsjon in situ, det er et begrenset antall cytokin-reporter mus tilgjengelig. I tillegg kan transkripsjon, oversettelse og sekresjon noen ganger være opphevet, og fluorescerende proteiner har en annen halveringstid enn cytokin de rapporterer, noe som gjør denne metoden noen ganger ikke tilstrekkelig for in situ cytokin visualisering.

Her beskriver vi en metode for å visualisere in situ cytokin produksjon av konfokalmikroskopi mikroskopi på én celle oppløsning. Denne teknikken gjør det mulig visualisering av mobilnettet kilde og omkringliggende nisje i vevet. Denne protokollen beskriver spesifikt visualisering av IFNγ produksjon i milten av L. monocytogenes infiserte mus, med fokus her på IFNγ produksjon av NK celler og ANTIGEN spesifikke CD8+ T celler. Imidlertid kan det utvides og tilpasses til karakterisering av enhver cytokin produksjon i sammenheng med andre situasjoner der cytokiner produseres som infeksjon, betennelse eller autoimmune sykdommer, så lenge målrettede cytokin kan beholdes i celler av intracellulære protein transport inhibitor.

Protocol

Alle eksperimenter som involverer mus var enige med UK Scientific prosedyrer Act of 1986.

1. adoptiv overføring av antigen-spesifikke CD8+ T celler i mus

  1. Isolere ovalbumin (OVA)-spesifikke CD8+ T celler (OTI) uttrykker grønt fluorescerende protein (OTI-GFP) eller rødt fluorescerende protein (OTI-RFP) fra lymfe node suspensjon av T-celle reseptor transgene mus9,10 ved hjelp av en mus CD8+ T Cell Isolation kit som per produksjon instruksjoner. Forbered cellen suspensjon ved å knuse lymfeknuter ved hjelp av en sprøyte stempel, som tidligere beskrevet11.
  2. Forflytning OTI-GFP eller OTI-RFP celler (3 x 106 celler) i C57BL/6 vill type mus mottakere ved intravenøs injeksjon som beskrevet av Cahalan, et al.12. Bruk mus som vanligvis er 6 – 12 ukers alder.
    Merk: Dette trinnet er valgfritt og bare nødvendig for å spore antigen-spesifikke CD8+ T-celler.

2. Listeria monocytogenes infeksjon

  1. Utvid L. monocytogenes genmodifiserte å uttrykke OVA (lm-OVA)13 til en eksponentiell fase av veksten i buljong hjerte infusjon ved 37 ° c under skånsom omrøring til OD600 når 0.08 – 0,1, som tidligere beskrevet i referanse 14i det.
  2. Injiser 100 μL (maksimalt volum = 200 μL) på 0,1 – 0,5 LD50 lm-OVA fortynnet i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved intravenøs injeksjon ved hjelp av en 29 G insulinsprøyte, i C57BL/6 Wild type mus mottakere som lager OTI-GFP eller OTI-RFP-celler når det indikeres.
    Merk: I våre hender, 0,1 x LD50 lm-OVA tilsvarer 2 x 104 KOLONI forming enheter (CFU). L. monocytogenes genmodifiserte å uttrykke OVA brukes til å aktivere tidligere overført OTI CD8+ T-celler, men andre stammer av L. monocytogenes kan brukes.

3. behandling med Brefeldin A (BFA) til Block cytokin sekresjon

  1. Injiser 250 μg av BFA i 200 μL av PBS intraperitonealt 6 h før muse ofring ved hjelp av en 29 G insulinsprøyte.
    Merk: Lyofilisert BFA er først resuspendert i dimethyl sulfoxide (DMSO) for å forberede lager av 25 mg/mL konsentrasjon. BFA blir deretter fortynnet i PBS ved romtemperatur (RT) for å unngå krystallisering før injeksjon. Hemming av cytokin sekresjon induserer akkumulering av IFNγ i celler. Dette er avgjørende for cytokin deteksjon.

4. høsting av milten

  1. Euthanize musene ved hjelp av stigende konsentrasjon av CO2 etterfulgt av cervical forvridning.
    Merk: Følg den lokale institusjonen retningslinjer for Human døds aktiv av mus.
  2. Rens magen med 70% etanol, gjør et snitt med saks for å lage en 1-2 cm skjære gjennom huden på venstre flanke av musen, der milten er plassert. Nøye gjøre et snitt i peritoneum å eksponere milten og ta den ut med pinsett. Høste milten, å være forsiktig med å klemme den med tang eller kutte den for å unngå å forstyrre milten arkitekturen.

5. fiksering av milten med Paraformaldehyde (PFA)

  1. Klargjør bindemiddel løsningen ved å blande 3,75 mL av PBS og 3,75 mL av 0,2 M L-lysin. Tilsett 21 mg natrium m-periodate og bland godt. Legg deretter til 2,5 mL på 4% PFA og 20 μL av 12 N NaOH.
    Merk: Bruk den bindemiddel løsningen på samme dag og kast overflødig. Ikke oppbevar den. Dette fikserings trinnet er viktig hvis prøven inneholder fluorescerende proteiner som GFP. Bruk ikke PFA som inneholder spor av metanol, da det denatures fluorescerende proteiner.
    Forsiktig: PFA er giftig og må håndteres med forsiktighet.
  2. Senk milten i bindemiddel og fest i minst 4 timer, typisk 16 – 20 timer ved 4 ° c under skånsom omrøring.
  3. Kast den bindemiddel løsningen og tilsett 5 mL PBS i 5 minutter ved RT under skånsom omrøring.
  4. Bytt PBS med 5 mL fersk PBS ruge for 1 h ved 4 ° c under skånsom omrøring.
  5. Bytt PBS med 5 mL 30% sukrose, ruge for 12 – 24 timer.
    Merk: Denne metoden bidrar til å opprettholde vevet morfologi. Etter inkubasjons med sukrose løsning, bør orgelet synke i bunnen av brønnen.

6. frysing og snitting

  1. Sett tørr is i en stor beholder og Plasser en mindre beholder inne som inneholder rundt 50 mL ren metanol og noen få biter av tørr is.
  2. Tørk forsiktig milten på en lofri klut.
  3. Plasser milten inne i en base mold inneholder en dråpe optimal skjæring temperatur (OCT) sammensatte nederst. Vær forsiktig så du ikke produserer noen bobler. Legg til OCT over milten.
  4. Med tang, setter basen mold på overflaten av metanol, noe som gjør at den ikke berører OCT. frysing av vevet så raskt som mulig for å minimere artefakter.
  5. Når det er frosset, fortsetter du med snitting.
    Merk: Frossen milt kan oppbevares ved-80 ° c i flere måneder.
  6. § Vevet ved hjelp av en cryomicrotome.
    1. Sett kammertemperaturen på kryostaten skal til-21 ° c. Skjær deler av ønsket tykkelse (vanligvis rundt 10 μm). Denne protokollen fungerer med tykkelser opptil 30 μm.
  7. Samle seksjoner på glass mikroskop lysbilder (se tabell over materialer) og inspisere visuelt.
    Merk: Seksjoner kan oppbevares ved-80 ° c i flere måneder.

7. Immunofluorescent farging

  1. La inndelingen komme til RT.
  2. Tegn en sirkel med en flytende blokkering (f.eks. PAP-penn) rundt vevs delen. Tegn utenfor OCT eller det vil ikke holde.
  3. Når den har tørket, rehydrate prøven ved å plassere PBS på vevs delen i 5 min.
    Merk: Volumet som settes på seksjonen, avhenger av størrelsen på seksjonen. Vi bruker vanligvis 100 – 300 μL. Ikke la seksjonene tørke når de er rehydrert.
  4. Skyll med PBS minst to ganger for å sikre at delen er godt festet til lysbildet.
  5. Legg til blokkerings løsning i delen for å redusere ikke-spesifikk binding av antistoffer.
    1. Klargjør blokkerings løsningen som følger: PBS med 0,1% Triton X100% fosterets kalv serum (FCS), 2,5 μg/mL FC reseptor blokkering (anti-mus CD16/32). Deretter tilsett 2-5% normalt serum av arten av hvert sekundære antistoff av fargepanelet.
      Merk: Hvis Antistoffene er direkte bøyd/biotinylated, tilsett 5% normalt serum av arten av hver primære antistoff. Hvis en primær antistoff og en av de sekundære Antistoffene er fra samme Art (f. eks, primære antistoff oppvokst i kanin og sekundære kanin anti-rotte), ikke bruk den normale serum arter som det vil øke bakgrunns signal.
    2. Fjern forsiktig PBS fra seksjonen ved aspirasjon og tilsett 100 μL av blokkerings løsningen per prøve seksjon. Ruge i et dekket vått kammer i minst 1 time ved RT.
  6. Stain med primære antistoffer.
    1. Fortynne primær antistoffer ved optimal konsentrasjon i blokkerings løsningen. Generelt utgangspunkt antistoff konsentrasjon er 5 μg/mL, men det bør være optimalisert for hvert antistoff og vev.
      Merk: Hvis Antistoffene er direkte bøyd, sentrifuger antistoff Mix ved 17,135 x g (13,500 RPM) i 15 min ved 4 ° c før du bruker den. Fluorophores kan utløse. Dette trinnet vil pellet precipitates og dermed hindre ikke-spesifikk deponering av de igangsatte antistoffer på lysbildet.
    2. Bytt ut blokkerings løsningen med den primære antistoff blandingen for hver prøve.
    3. Ruge for 4 timer ved RT eller over natten (OVN) ved 4 ° c i et dekket vått kammer.
  7. Utfør vasking.
    1. Forbered vask buffer ved å legge 2% FCS til PBS.
    2. Vask 4 ganger med vaskebuffer: en rask (uten inkubasjons), en for 10 min og to i 5 min. Deretter utfører du en endelig vask med PBS for 5 min.
  8. Farging med sekundære antistoffer.
    1. Fortynne sekundære antistoffer av interesse på optimal konsentrasjon i blokkering løsning. Sentrifuger blandingen, som beskrevet for den primære antistoffer.
    2. Fjern den endelige vaskeløsningen. Legg til den sekundære antistoff blandingen på toppen av seksjonen og ruge for 1 – 4 timer ved RT i et dekket vått kammer.
  9. Vask 4 ganger med vaskebuffer: en rask (uten inkubasjons), en for 10 min og to i 5 min. Deretter utfører du en endelig vask med PBS for 5 min.
  10. Fjern den endelige vaskeløsningen. La PBS fordampe, men ikke over-tørr delen. Plasser en dråpe på festemiddelet på toppen av prøven og Plasser dekselet forsiktig oppå det. Monterings mediet må gjenopprette hele seksjonen. La det polymerase OVN på RT beskyttet mot lys.
    Merk: Tegn en sirkel rundt inndelingen på baksiden av lysbildet før du bruker monterings mediet. Når monterings mediet påføres, kan vevet bli vanskelig å se.
  11. Oppbevar lysbildene i mørket ved 4 ° c til klar til bilde.

8. Imaging og analyse

  1. Utfør bildebehandling av farging med et konfokalmikroskopi mikroskop.
    Merk: I denne protokollen, en invertert Spectral laserskanning mikroskop ble brukt (se tabell over materialer), sammen med målene 10X/na 0,40 eller 60X/na 1,4 (for analyse av cytokin sub-Cellular lokalisering). Bølgelengder av eksitasjon og utslipp vises for hver fluoroforen og fluorescerende protein i tabellen av materialer.
  2. Utfør analyse-og kvantifisering etter behov ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (for eksempel Imaris eller Fiji).

Representative Results

IFNγ produsert innen de første 24 h etter Listeria monocytogenes infeksjon er avgjørende for å kontrollere spredningen av denne patogen. Ved hjelp av denne protokollen, kan vi visualisere ikke bare hvilke celler som produserer IFNγ men også om de er plassert i en bestemt mikromiljøet. For å hjelpe oss med å avgrense arkitekturen i milten, merket vi celler kjent for å ha bestemt plassering i milten. Markøren F4/80 etiketter alle makrofager og fremhever den røde massen. Markøren B220 etiketter B celler og høydepunkter B celle sekker rundt T celle sonen. Markøren CD169 etikettene marginale sonen makrofager, rundt den hvite massen (figur 1). De fleste OTI celler, enten de uttrykker IFNγ eller ikke, er til stede i den hvite massen og som sådan, alle bildene er de av den hvite massen, med mindre det er angitt.

Et kritisk trinn i denne protokollen er bruk av BFA å hemme cytokin sekresjon. Faktisk ble påvisning av IFNγ av NK celler sterkt svekket når mus ikke ble behandlet med BFA (figur 2). Ved hjelp av vår protokoll, kunne vi finne at minst to celletyper produsere IFNγ 24 h etter smitte-NK celler og antigen-spesifikke CD8+ T celler (Figur 3)-på samme måte som det har blitt funnet tidligere ved flyt flowcytometri3.

I situ avbildning av IFNγ produserende celler avslørte at IFNγ produksjonen ikke er spredt utover milten, men konsentrert til diskrete områder (Figur 4). Faktisk fant vi at T-celler ble aktivert i løpet av milten (fremhevet av T celle Clustering), og dette ikke nødvendigvis samsvarer med IFNγ produksjon. En sannsynlig forklaring er at IFNγ produksjonen er begrenset til plasseringen av de infiserte cellene15,16, og T celle aktivering-representert ved Clustering-kan støttes av både infiserte (IFNγ positive) og ikke-infiserte (IFNγ negativ) antigen-presentere celler. Andre flekker vil være nødvendig for å finne den nøyaktige plasseringen og få en indikasjon på mekanismen som begrenser IFNγ produksjon til dette området og dens forhold til antigen overføring. Interessant, fant vi at aktivert, gruppert, antigen-spesifikke T-celler er plassert i hele den hvite massen av milten, men de produserer IFNγ bare i områder hvor NK celler er coexisting med dem (figur 5). Som sådan, tilstedeværelsen av NK celler delineates en bestemt mikromiljøet i den hvite massen, der klynger T-celler produsere IFNγ i motsetning til gruppert T-celler i den andre delen av den hvite massen. Dette tyder på at T celle aktivering er ikke tilstrekkelig til å diktere IFNγ produksjon på dette tidspunktet punktet.

En annen interessant funksjon fremhevet av vår protokoll er de ulike sub-cellulære lokalisering av IFNγ i NK versus CD8+ T celler5. Som vist i figur 6, mens IFNγ lokalisering i NK celler er diffust i stoffer, CD8+ T celler ofte rekruttere IFNγ mot en annen T celle.

Figure 1
Figur 1: markører som fremhever milten. Mus ble smittet med 2 x 104 CFU lm-OVA og euthanized 24 h innlegg infeksjon. Milten ble eksplanterte og behandlet som beskrevet i protokollen. (A) seksjoner ble FLEKKETE for NK celler (anti-NCR1 etterfulgt av anti-geit IGG-FITC; Green), OTI-RFP celler (rød) og makrofager (anti-F4/80-APC; magenta). RP = rød Pulp; WP = hvit Pulp. Scale bar = 200 μm. (B) seksjoner ble farget for B-celler (anti-B220-Pacific Blue; Blå), OTI-GFP celler (GFP signal vist i rødt) og marginale sonen makrofager (anti-CD169-Alexa647; magenta). RP = rød Pulp; BF = B celle hårsekken; TZ = T celle sone. Scale bar = 50 μm. Dette er et representativt bilde av 3 uavhengige eksperimenter (N = 4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: BFA behandling tillater påvisning av intracellulære IFNγ in situ. Nγ produksjonen er begrenset til bestemte områder i sple mus ble smittet med 2 x 104 CFU lm-OVA og behandlet med BFA (A) eller venstre ubehandlet (B) etter 18 h. mus var euthanized 24 h innlegg infeksjon. Milten ble eksplanterte og behandlet som beskrevet i protokollen. Seksjoner ble flekkete for NK celler (anti-NCR1 etterfulgt av anti-geit IgG-FITC; grønn), OTI-RFP celler (rød) og IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). Scale bar = 5 μm. Dette er et representativt bilde av NK celle-rike områder fra 3 uavhengige eksperimenter (N = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: IFNγ produserende celler i milten. Mus ble smittet med 2 x 104 CFU lm-OVA når indikert og behandlet med BFA etter 18 h. mus ble euthanized 24 h innlegg infeksjon. Milten ble eksplanterte og behandlet som beskrevet i protokollen. Seksjoner ble flekkete for NK celler (anti-NCR1 etterfulgt av anti-geit IgG-FITC; grønn), OTI-RFP celler (rød) og IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). (A) representative bilde av en milt fra en un-smittet naiv mus for å demonstrere fravær av IFNγ ikke-spesifikke flekker. Hvite linjer avgrense den hvite massen. WP = hvit masse; RP = rød masse. (B) representative bilde av den hvite massen fra milten av en mus infisert av lm-OVA, viser INVASJONEN av NK celler til den hvite cellulose og produksjon av IFNΓ av NK celler, OTI celler og ikke-merkede celler. Bildene er representative fra 4 uavhengige eksperimenter (N = 4). Skala stolper = 70 μm (A); og 20 μm (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: IFNγ produksjonen er begrenset til bestemte områder i milten etter lm-OVA infeksjon. Mus ble smittet med 2 x 104 CFU lm-OVA og behandlet med BFA etter 18 h. mus ble euthanized 24 h innlegg infeksjon. Milten ble eksplanterte og behandlet som beskrevet i protokollen. Alle seksjoner ble farget for B-celler (B220-Pacific Blue AB, Blue) og IFNγ (anti-IFNγ-biotin etterfulgt av streptavidin-PE; cyan). OTI-GFP-celler (GFP-signal vist i rødt). Cyan linjer tilsvarer områder med høy IFNγ-produksjon. De er representative bilder av 4 uavhengige eksperimenter (N = 4). (A) seksjoner ble beiset for marginale sonen makrofager (anti-CD169-Alexa 647, magenta). Scale bar = 50 μm. (B) seksjoner ble flekkete for alle makrofager (F4/80). Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: IFNγ produksjon av aktiverte OTI celler oppstår i en bestemt mikromiljøet. Mus ble smittet med 2 x 104 CFU lm-OVA og behandlet med BFA etter 18 h. mus ble euthanized 24 h innlegg infeksjon. Spleens ble eksplanterte og behandlet som beskrevet i protokollen. Seksjoner ble flekkete for NK celler (anti-NCR1 etterfulgt av anti-geit IgG-FITC; grønn), OTI-RFP celler (rød) og IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). Grønne og røde linjer uthever henholdsvis NK-og OTI-celle soner. Hvit pil indikerer eksempler på T celle klynger som ikke produserer IFNγ. Grønne piler eksempler på T celle klynger som produserer IFNγ. Scale bar = 100 μm. Dette er et representativt bilde av fire uavhengige eksperimenter (N = 4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: sub-Cellular lokalisering av IFNγ i NK celler og T-celler. Mus ble smittet med 2 x 104 CFU lm-OVA og behandlet med BFA etter 18 h. mus ble euthanized 24 h innlegg infeksjon. Milten ble eksplanterte og behandlet som beskrevet i protokollen. Alle seksjoner var flekkete for IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). Hvite linjer avgrense celle kanter og hvite piler viser retningen av sekresjon. Dette er et representativt bilde av to uavhengige eksperimenter (N = 5). (A)-OTI-RFP-celler er vist i rødt. Scale bar = 5 μm. (B) seksjoner ble BEISET for NK celler (anti-NCR1 etterfulgt av anti-geit IGG-FITC; grønn. Scale bar = 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I dette manuskriptet presenterer vi en metode for å visualisere IFNγ produksjon i milten etter L. monocytogenes infeksjon i mus. Denne protokollen er enkel og kan tilpasses andre vev og cytokin triggere, men følgende aspekter må vurderes. Celler ofte skiller raskt ut cytokiner de produserer, og cytokiner er raskt plukket opp av nærliggende celler. Det er så vanskelig å oppdage cytokiner in situ. En vanlig metoden å rask re-innviet cytokin produksjon er å re-stimulere cellene ex vivo føle etter av cytokin oppdagelsen inne mediet av enzym-sammenkoblet immunosorbentanalyse analysen. I denne konteksten går all informasjon om den romlige lokaliseringen til cytokin-produserende celler tapt. I tillegg reflekterer cytokin produksjon etter re-stimulering ikke nødvendigvis om cytokiner faktisk produseres og skilles ut i Vivo, men angir i stedet kapasiteten til en gitt cellepopulasjon for å produsere cytokiner. Derfor vil begge metodene gi ulik informasjon, og man bør vurdere hvilken informasjon som er mest verdifull for eksperimentet.

For å oppdage intracellulære cytokiner, bruker vår metode en intracellulære protein transport inhibitor for å felle cytokiner inne i cellene og øke signal deteksjon. Det er imidlertid viktig å merke seg at disse hemmere påvirker normal transport av proteiner fra endothelial retikulum (RE) til Golgi apparater og til sekretoriske vesicle svekke deres utgivelse, noe som kan føre til toksisitet. Som en konsekvens, BFA, eller andre inhibitor, bør brukes for en kort periode, vanligvis ikke mer enn noen få timer. Derfor er det viktig å finne den rette balansen mellom inhibitor dosen og tid for behandling for å optimalisere nivået av cytokiner fanget inne i cellen uten å forårsake alvorlige cytotoksisk effekter. Disse variablene kan variere mellom cytokiner og administrasjons veien for BFA. I vår infeksjon modellen, den BFA var administreres intraperitonealt for å gi en rask systemisk dispersjon, men det kan også leveres intravenøst.

De mest brukte intracellulære protein transport hemmere er BFA, brukt her, og monensin (MN). Disse hemmere brukes ofte utydelig å akkumulere og studere cytokin produksjon, men de har små forskjeller i sine virkningsmekanismer. MN hemmer transport av proteiner i Golgi apparatet dermed akkumulere proteiner i Golgi17 mens BFA hindrer coatomer protein Complex-i rekruttering, hemme den retrograd bevegelsen av proteiner til endoplasmatiske RETIKULUM (er) og dermed fremme akkumulering av cytokiner i ER18. Som sådan, velger det best intracellulære protein transport inhibitor ville avhenger av annerledes faktorene, som det cytokin å bli oppdaget. For eksempel har det vært vist i lipopolysakkarid-indusert intracellulære farging av monocytter som BFA er mer effektiv for å måle cytokiner IL-1β, IL-6 og TNF enn MN19.

Denne protokollen innebærer visualisering av cytokin in situ av konfokalmikroskopi mikroskopi og derfor er det bare et begrenset antall markører enn kan brukes til å studere cytokin-produserende celler og deres mikromiljøet. Det er også nødvendig å vurdere at protein transport hemmere som BFA eller MN forstyrrer normal uttrykk for flere proteiner og dermed deres bruk når man studerer samtidige uttrykk for visse aktiverings celleoverflaten markører må nærmet Nøye. For eksempel blokkerer BFA men ikke MN uttrykket av CD69 i murine-lymfocytter20. Til tross for denne begrensningen, konfokalmikroskopi Imaging muliggjør sub-mobiltelefon lokalisering av cytokiner, samt retning av cytokin sekresjon i cellen. Dataene som genereres ved hjelp av denne protokollen tyder på at NK celler har en tendens til å skille IFN-y i et diffus mønster mens CD8+ t celler synes å lede IFNγ sekresjon mot andre CD8+ t celler som er i direkte interaksjon med dem5.

For å konkludere, er denne protokollen egnet til å visualisere en rekke cytokiner in situ og identifisere produserende celler og deres mikromiljøet etter mange triggere som infeksjon eller autoimmunitet. Innhentet informasjon er medvirkende til å forstå viktigheten av in vivo romlige orkestrering av ulike celletyper og cytokin de produserer, nødvendig for en effektiv immunrespons.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Kennedy Institute Imaging Facility personell for teknisk assistanse med Imaging. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Kennedy Trust (til A.G.), og bioteknologi og biologiske vitenskaper Research Council (BB/R015651/1 til A.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brefeldin A Cambridge bioscience CAY11861
Paraformaldehyde Agar scientific R1018
L-Lysin dihydrochloride Sigma lifescience L5751
Sodium meta-periodate Thermo Scientific 20504
D(+)-saccharose VWR Chemicals 27480.294
Precision wipes paper Kimtech science Kimberly-Clark Professional 75512
O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy VWR Chemicals 361603E
Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 Biolegend 101302 Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml
Microscope slides - Superfrost Plus VWR Chemicals 631-0108
anti-CD169 - AF647 Biolegend 142407 Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml
Excitation wavelength: 650
Emission wavelength: 65
anti-F4/80 - APC Biolegend 123115 Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml
Excitation wavelength: 650
Emission wavelength: 660
anti-B220 - PB Biolegend 103230 Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/mL
Excitation wavelength: 410
Emission wavelength: 455
anti-IFNg - biotin Biolegend 505804 Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL
anti-IFNg - BV421 Biolegend 505829 Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL
Excitation wavelength: 405
Emission wavelength: 436
anti-Nkp46/NCRI R&D Systems AF2225 Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/mL
anti-goat IgG-FITC Novusbio NPp 1-74814 Antibody clone and Concentration used: 1 mg/mL
Excitation wavelength: 490
Emission wavelength: 525
Streptavidin - PE Biolegend 405203 Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mL
Excitation wavelength: 565
Emission wavelength: 578
Streptavidin - FITC Biolegend 405201 Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mlL
Excitation wavelength: 490
Emission wavelength: 525
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
Cover glasses 22 mm x 40 mm Menzel-Glazer 12352128
Liquid blocker super PAP PEN mini Axxora CAC-DAI-PAP-S-M
Imaris - Microscopy Image Analysis Software Bitplane
Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope Olympus
Cryostat - CM 1900 UV Leica
Base mould disposable Fisher Scientific UK Ltd 11670990
PBS 1x Life Technologies Ltd 20012068
BHI Broth VWR Brand 303415ZA
GFP
Excitation wavelength: 484
Emission wavelength: 507
RFP
Excitation wavelength: 558
Emission wavelength: 583
Insulin syringe, with needle, 29 G VWR International BDAM324824
C57BL/6 wild type mice Charles River

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16, (4), 343-353 (2015).
  2. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3, (1), 109-117 (1995).
  3. Kubota, K., Kadoya, Y. Innate IFN-gamma-producing cells in the spleen of mice early after Listeria monocytogenes infection: importance of microenvironment of the cells involved in the production of innate IFN-gamma. Frontiers in Immunology. 2, (26), (2011).
  4. Dunn, P. L., North, R. J. Early gamma interferon production by natural killer cells is important in defense against murine listeriosis. Infection and Immunity. 59, (9), 2892-2900 (1991).
  5. Krummel, M. F., et al. Paracrine costimulation of IFN-gamma signaling by integrins modulates CD8+ T cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (45), 11585-11590 (2018).
  6. Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Lins, D. C., Mescher, M. F. Autocrine IFN-gamma promotes naive CD8+ T cell differentiation and synergizes with IFN-alpha to stimulate strong function. Journal of Immunology. 189, (2), 659-668 (2012).
  7. Hosking, M. P., Flynn, C. T., Whitton, J. L. Antigen-specific naive CD8++ T cells produce a single pulse of IFN-gamma in vivo within hours of infection, but without antiviral effect. Journal of Immunology. 193, (4), 1873-1885 (2014).
  8. Croxford, A. L., Buch, T. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132, (1), 1-8 (2011).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8++ T cells. Nature Immunology. 14, (4), 356-363 (2013).
  10. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, (3), 402-417 (2012).
  11. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. Journal of Visualized Experiments. (9), 409 (2007).
  12. Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).
  13. Pope, C., et al. Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 166, (5), 3402-3409 (2001).
  14. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance. Current Protocols in Microbiology. 31, 1-7 (2013).
  15. Kang, S. J., Liang, H. E., Reizis, B., Locksley, R. M. Regulation of hierarchical clustering and activation of innate immune cells by dendritic cells. Immunity. 29, (5), 819-833 (2008).
  16. Chang, S. R., et al. Characterization of early gamma interferon (IFN-gamma) expression during murine listeriosis: identification of NK1.1+ CD11c+ cells as the primary IFN-gamma-expressing cells. Infection and Immunity. 75, (3), 1167-1176 (2007).
  17. Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1031, (2), 225-246 (1990).
  18. Helms, J. B., Rothman, J. E. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature. 360, (6402), 352-354 (1992).
  19. Schuerwegh, A. J., Stevens, W. J., Bridts, C. H., De Clerck, L. S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry. 46, (3), 172-176 (2001).
  20. Nylander, S., Kalies, I. Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69 expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. Journal of Immunology Methods. 224, (1-2), 69-76 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics