توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وصفنا بروتين كيناز جديد باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية: تحليل وصمة عار الغربية مع الأجسام المضادة مخصصة محددة على خطوط الخلايا المختلفة والأنسجة، والتفاعلات من قبل التجارب coimmunoprecipitation، نشاط كيناز الكشف عن طريق الغربية وصمة عار باستخدام الأجسام المضادة الفوسفاتية محددة وعن طريق γ [32P ] ATP وسم.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد حددت تسلسل الجينوم كله واسعة النطاق العديد من إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) توفير العديد من البروتينات المحتملة. هذه البروتينات قد يكون لها أدوار هامة للخلية، وقد تكشف عن عمليات خلوية جديدة. بين البروتينات, kinases هي الجهات الفاعلة الرئيسية لأنها تنتمي إلى مسارات إشارة الخلية ولها القدرة على تشغيل أو إيقاف العديد من العمليات الحاسمة لمصير الخلية, مثل نمو الخلايا, تقسيم, التمايز, الحركة, والموت.

في هذه الدراسة، ركزنا على بروتين كيناز محتمل جديد، LIMK2-1. لقد أثبتنا وجودها بواسطة بلوت الغربية باستخدام الأجسام المضادة محددة. قمنا بتقييم تفاعلها مع بروتين ما قبل الإنتاج المنظم باستخدام تجارب التهطال المناعية. Coimmunoprecipitation هو تقنية قوية جدا قادرة على الكشف عن التفاعل بين اثنين من البروتينات المستهدفة. ويمكن أيضا أن تستخدم للكشف عن شركاء جدد من بروتين الطعم. يمكن تنقية بروتين الطعم إما عن طريق علامة مصممة لتسلسلها أو عن طريق الأجسام المضادة التي تستهدفه على وجه التحديد. ويمكن بعد ذلك فصل هذه المجمعات البروتينية بواسطة SDS-PAGE (الصوديوم دوديكل كبريتات بولي أكريلاميد هلام) وتحديدها باستخدام الطيف الكتلي. كما تم استخدام LIMK2-1 المناعي لاختبار نشاطكيفي في المختبر عن طريق γ[32P] ATP وسم. وقد يستخدم هذا الخضوع الراسخ العديد من الركيزة المختلفة، ويمكن استخدام نسخ من الطعم المتحولة لتقييم دور المخلفات المحددة. ويمكن أيضا تقييم آثار العوامل الدوائية لأن هذه التقنية هي على حد سواء حساسة للغاية وكمية. ومع ذلك، يتطلب التعامل مع النشاط الإشعاعي الحذر بشكل خاص. ويمكن أيضا تقييم نشاط كيناز مع الأجسام المضادة محددة تستهدف مجموعة فوسفو من الأحماض الأمينية المعدلة. هذه الأنواع من الأجسام المضادة ليست متاحة تجاريا لجميع بقايا الفوسفو المعدلة.

Introduction

على مدى عقود عديدة، تم توضيح العديد من مسارات الإشارات وأظهرت مشاركتها في العمليات الخلوية الحاسمة مثل تقسيم الخلايا، والتمايز، والحركة، وموت الخلايا المبرمجة، والمناعة وعلم الأحياء العصبية. Kinases تلعب دورا هاما في هذه المسارات إشارة كما أنها غالبا ما تنظم بدقة تنشيطها أو تعطيل هات هي جزء من المجمعات متعددة الاستخدامات العابرة التي تستجيب للمحفزات الخارجية1,2,3. الطفرة وخلل التنظيم من الكيناز غالبا ما يؤدي إلى أمراض في البشر، وبالتالي فقد أصبحت واحدة من أهم أهداف المخدرات على مدى السنوات الأربعين الماضية4.

وفي هذا السياق، من المهم أن تكون قادرة على الكشف عن تفاعل الكيناز مع الجهات التنظيمية في المراحل الأولى أو الركيزة النهائية، وتحديد شركاء جدد. تنقية التقارب والمناعية هي تقنيات قوية جدا لعزل مجمعات البروتين5. قد يكون المفتاح البروتين الطعم أو كيناز الموسومة مع تسلسل الببتيد محددة مما يسمح باستخدام الخرز التجاري التكافؤ إلى جانب الأجسام المضادة التي تستهدف الببتيد. هذه المادة تسمح بتكرار عاليةفي التجارب 6،8. البروتينات الذاتية قد تكون أيضا ً مناعية باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف مباشرة بروتين الطعم. الأجسام المضادة قد تكون مرتبطة عبر البروتين A أو البروتين G أغروز الخرز أو ببساطة حاضنة مع هذه الخرز قبل إضافة lysate. يجب تحسين المخازن المؤقتة للتحلل للسماح بذوبان البروتين دون فقدان التفاعل وتجنب تدهور البروتين. ومن العيوب الرئيسية لهذا النهج أن التفاعل يتم الكشف عنه عند الخلايا اللايائية؛ ولذلك، قد غاب عن التفاعلات عابرة أو ضعيفة، جنبا إلى جنب مع تلك التي تتطلب السياق دون الخلوي. ويمكن استخدام تقنيات أخرى للعمل مباشرة في الخلية مثل ربط القرب (PLA)9، في الجسم الحي عبر ربط بمساعدة تنقية التقارب (XAP)10، الحيوي الرنين نقل الطاقة (BRET) أو فورستر الرنين الطاقة نقل (FRET)11،12. وعلاوة على ذلك، فإن الترسيب المناعي ليس مناسباً لتحديد الثوابت الديناميكية الحرارية للربط، والتي تتطلب تقنيات فيزيائية مثل "بلازمون السطح" أو قياس المعايرة الحرارية الإسمترية أو الميكرومتراتي 13,14.

ويمكن تقييم نشاط كيناز باستخدام تقنيات متعددة. هنا، ركزنا على الأجسام المضادة الفوسفو محددة وغاما في المختبر[32P] ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) وسم. تستهدف الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو تعديل الفوسفات لبقايا معينة داخل البروتين. ويمكن استخدامها في غرب Blot أو ELISA (اختبار المناعة المرتبطة انزيم) بعد تحليل الخلايا، للكيمياء المناعية، وأيضا على الخلايا السليمة باستخدام تدفق الخلايا أو الفلور المناعي. قد تشمل عيوبها افتقارها إلى التحديد، والتي يمكن تقييمها باستخدام نسخة متحولة من البروتين المستهدف، وعدم توافرها تجاريا لجميع البروتينات. في المختبرγ[32P] ATP وسم هو وسيلة قوية جدا، راسخة وحساسة للغاية15. ويمكن استخدام البروتينات المناعية أو المؤتلفة، ويمكن اختبار ركائز مختلفة. ويمكن أيضا تقييم آثار المخدرات لأن هذه الطريقة كمية. والعيب الرئيسي في ذلك هو أن النشاط الإشعاعي المرتبط بهذا النهج يتطلب التعامل بحذر. طرق بديلة ممكنة أيضا على أساس قياس الفلور أو الركيزة الببتيد الإنارة والاستفادة من خصائص الفلورسنت /الانارة المعدلة على الفوسفور. وتتيح هذه الأساليب أيضاً إنتاجية عالية، وهو ما هو مطلوب، على سبيل المثال، في فحص الجزيئات التي قد تكون مثبطات محتملة للكيناز المستهدف. في الواقع، تمثل الكيناز واحدة من أكبر فئات أهداف الأدوية التي تسعى شركات الأدوية16.

في هذه الدراسة، ركزنا على بروتين ليمك2-1 (ليمك2-1 لتقف على Lin11، Isle1، Mec3 Kinase isoform 2-1). تم وصف بروتين كيناز ليمك2 لأول مرة في عام 199517. يتم إنتاج ثلاثة أشكال متساوية من LIMK2 بواسطة الربط البديل: LIMK2a، LIMK2b و LIMK2-1. في الوقت الحاضر، تم وصف LIMK2-1 فقط على مستوى مرنا في دراسة واحدة18. هنا، نحن نميز هذا البروتين كيناز الجديدة المحتملة على المستوى الجزيئي باستخدام النهج البيوكيميائية قوية. أولا، نحن نبرهن على أن LIMK2-1 هو في الواقع توليفها. على غرار نظيراتها اثنين، LIMK2a وLIMK2b، فإنه يتفاعل مع كيناز المنبع روك (رو المرتبطة البروتين كيناز). نظهر LIMK2-1 لديه نشاط كيناز على البروتين الأساسي الميلين (MBP)، ولكن ليس على cofilin، الركيزة الكنسية من كيناز ليم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد خلية للتَنَيَكَل

تحذير: يجب تنفيذ جميع خطوات ثقافة الخلية في مختبر مخصص، ويتم التلاعب بالخلايا داخل خزانة الميكروبيولوجية من الفئة 2.

  1. خلايا الخلايا البذرة HEK-293 (الكلى الجنينية البشرية) في لوحات 10 سم في 10 مل من DMEM (دولبيككو تعديل النسور المتوسطة) تكملها 10٪ مصل عجل الجنين. الثقافة لمدة 3 إلى 5أيام تحت 5٪ ثاني 2، في 37 درجة مئوية، حتى تصل الخلايا إلى ~ 90٪ التقاء.
  2. علاج Ø 10 سم لوحات مع الكولاجين R لزيادة التصاق الخلية إلى لوحات من البلاستيك.
    1. أضف 5 مل من محلول كولاجين R، 200 ضعف مخفف في الفوسفات المالح ة (PBS) في طبق 10 سم. تُسطح السائل على سطح اللوحة بالكامل.
    2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
    3. إزالة محلول الكولاجين، وتجاهله. إضافة 5 مل من PBS، ونشره في جميع أنحاء سطح لوحة، وإزالتها وتجاهلها. كرر هذا الغسيل مرة واحدة.
    4. أضف 8 مل من DMEM مع 10٪ مصل عجل الجنين. الحفاظ على لوحات أعدت داخل مجلس الوزراء السلامة الحيوية.
  3. خذ لوحات HEK-293 من الخطوة 1.1 داخل خزانة السلامة البيولوجية. إزالة المتوسطة من لوحات وتجاهله في سلة المهملات التبييض مخصصة. إضافة 2 مل من DMEM التكميلية، ومسح الخلايا لفصلها باستخدام تدفق ميكروبليت 1 مل، مع الحرص على تجنب صنع رغوة.
  4. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل وإضافة 4 مل من DMEM التكميلية. تجانس مع ماصة 10 مل، عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 3 مرات.
  5. خذ 2 مل من هذا الحل الخلية وإضافتها إلى لوحات الكولاجين المعالجة التي تحتوي على DMEM التكميلية من الخطوة 1.2.4.
  6. تنمو لمدة 24 ساعة في الحاضنة في 5٪ ثاني2 و 37 درجة مئوية. يجب أن تكون الخلايا 50-80% تُتّمّي في وقت التَّتَرَك.

2. التغوط العابر

  1. إزالة المتوسطة من لوحات، وتجاهله في سلة المهملات التبييض مخصصة، وإضافة 10 مل من DMEM الطازجة التكميلية. ضع الصفائح مرة أخرى في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية أثناء تحضير خليط الامتصاص.
  2. في أنبوب 15 مل، إضافة 450 μL من 10 m تريس-HCl درجة الحموضة 7.5/1 M EDTA (ثلاثي ة لتقف على ثلاثي (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان، وEDTA لحمض الاثيلين) و 50 μL من 2.5 M CaCl2 الحل. مزيج عن طريق الانعكاس.
  3. إضافة 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي (حمض ديوكسيريبونوكليك) أعدت من إعداد ميدي على ثقافة سائلة من البكتيريا التي تحولت مع البلازميد مخصصة. مزيج عن طريق الانعكاس.
  4. تحت التحريك السلس على دوامة، إضافة 500 ميكرولتر من BES المخزنة 2x التركيز المالحة (التركيب: BES، 10.7 غرام / لتر، كلوريد الصوديوم، 16.0 غرام / لتر، Na2HPO0.27 ز / لتر. BES لتقف على N، N-Bis(2-هيدروكسيإثيل)-2-أمينوإيثانسلفونيتش حمض، N، N-Bis(2-هيدروكسيإيثيل)تورين) انخفاض ببطء عن طريق قطرة.
  5. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل (تصل إلى 45 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. لا دوامة، لا تخلط! نقل الأنابيب بعناية فائقة لا لزعزعة تشكيل معقدة بين الحمض النووي وفوسفات الكالسيوم.
  6. خذ اللوحات من الخطوة 2.1 إلى خزانة الأمان. إضافة مجمعات الحمض النووي بعناية فائقة، قطرة قطرة، على الخلايا في جميع أنحاء سطح اللوحة.
  7. احتضان لمدة 24 إلى 72 ساعة في الحاضنة في 37 درجة مئوية. عادة ما يتم الوصول إلى الحد الأقصى للتعبير البروتين في غضون 48 ساعة.

3. الليسه

ملاحظة: العمل على الجليد، ومع المخازن المؤقتة الباردة لمنع تدهور البروتين.

  1. إعداد العازلة lysis: 50 m Tris-HCl، درجة الحموضة 7.5، 100 mM NaCl، 5 mEDTA، 0.1٪ تريتون X-100، 50 m NaF، 10 mm الصوديوم بيروفوسفات، 1 م نا3VO20 m-الفوسفات p-nitrophenyl، 20 مللي أمبير-غليسيروفوسفات، 10 ميكروغرام / مل aprotinin، 0.05 ميكروغرام / مل حمض الأوكليك ، 1 ميكروغرام /مل ليوبيبتين، و 1 مللي م PMSF (فلوريد ميثيل سلفونيل). مطلوب حوالي 4 مل من العازلة lysis لكل لوحة المنقولة.
  2. إزالة لوحات مع الخلايا المنقولة من الحاضنة. ضعهم على الجليد
    ملاحظة: من هذه الخطوة، فمن الممكن العمل على "عادي" مقاعد البدلاء.
  3. إزالة وسائل الإعلام، وتجاهلها في سلة المهملات التبييض مخصصة.
  4. غسل مرتين مع 3 مل من PBS الباردة: إضافة 3 مل من PBS على جانب لوحة قطرة قطرة لتجنب فصل الخلايا المصابة، تنتشر في جميع أنحاء سطح اللوحة، وإزالة PBS وتجاهله؛ كرر هذه الخطوة مرة أخرى. في النهاية، إزالة بعناية بقية PBS عن طريق إمالة لوحة لمنع تخفيف العازلة lysis للخطوة التالية.
  5. إضافة 500 μL من العازلة lysis الباردة على الخلايا المغسولة المنقولة. نشره في جميع أنحاء سطح اللوحة.
  6. احتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. من وقت لآخر (مرتين على الأقل)، انتشرت مرة أخرى في العازلة في جميع أنحاء سطح اللوحة.
  7. الخردة الخلايا وجمعها في أنبوب ميكروسينترال.
  8. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 10000 x غ عند 4 درجة مئوية.
  9. جمع supernatant في أنبوب microcentrifuge جديد. هذا الكسر يتوافق مع الليسات (استخراج الخلية بأكملها). تخلص من بيليه الذي يتوافق مع الحطام غشاء الخلية.
  10. جمع a aliquot من هذا الجزء إلى أنبوب microcentrifuge جديد (حوالي 50 ميكرولتر). هذا الكسر يتوافق مع "جزء المجموع" أو "خلية Lysate" أو "استخراج الخلية الكاملة" مما يسمح بتحليل ما إذا كان يتم التعبير عن البروتينات المنقولة من قبل وصمة عار الغربية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن استخدام العينات مباشرة لتحليلات وصمة عار الغربية. ويجب إضافة حاجز Laemmli إلى العينة، ثم تسخينها عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والطرد المركزي في 10000 x g لمدة 5 دقائق، وتحميلها على SDS-PAGE المناسبة. ويمكن أيضا تخزين عينات في -80 درجة مئوية.

4. المناعية الترسيب

  1. بلطف اوقف خرز أجاروز إلى جانب الأجسام المضادة المناسبة: HA (هيماغلوتينين الأنفلونزا البشرية)، العلم، أو GFP (البروتين الفلورسنت الأخضر) عن طريق عكس سلس.
  2. قطع نهاية طرف 200 ميكروبليت ميكروبليت للسماح الخرز لدخول طرف. ماصيت الخرز صعودا وهبوطا عدة مرات لتشبع غيض لضمان اتخاذ الحجم الصحيح من الخرز.
  3. خذ 40 ميكرولتر من الخرز في أنبوب ميكروسينترال.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من TENET (30 m Tris-HCl درجة الحموضة 7.5، 120 mM كلوريد الصوديوم، 5 m EDTA، 1٪ تريتون X-100) العازلة. مزيج عن طريق الانعكاس. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غرام عند 4 درجة مئوية. إزالة بعناية supernatant وتجاهله. إضافة 500 μL من TENET. تحضن لمدة ساعة على الأقل عند 4 درجة مئوية على عجلة دوارة.
    ملاحظة: هذه الخطوة قبل الحضانة في TENET يسمح للحد من التفاعلات غير محددة وذلك لتقليل إشارة الخلفية.
  5. غسل الخرز مرتين مع 500 μL من العازلة lysis.
    1. جهاز طرد مركزي 2 دقيقة عند 1000 x غرام عند 4 درجة مئوية.
    2. إزالة العازلة supernatant بعناية، وتجاهله.
      ملاحظة: الحرص على عدم ازهب الخرز خلال هذه الخطوات الغسيل.
    3. إضافة 500 μL من العازلة lysis. تجانس عن طريق عكس الأنبوب.
    4. كرر الخطوات 4.5.1- 4.5.3.
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غرام عند 4 درجة مئوية. إزالة العازلة supernatant بعناية، وتجاهله.
  7. تحنيب الخرز مع lysate من الخطوة 3.9 لمدة 2 إلى 4 ساعات في 4 درجة مئوية على عجلة الدورية.
  8. غسل الخرز المناعي.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، قد يتم غسل الخرز المناعي خمس مرات مع العازلة lysis، ومن ثم eluted مع العازلة Laemmli. ويمكن استخدام الإيلوت لتحليل البقعة الغربية أو تخزينها عند -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، يمكن غسل الخرز مرتين مع العازلة lysis ثم ثلاث مرات مع العازلة كيناز لأداء γ[32P] ATP وسم.

5 - تحليلات التهطال المناعية

  1. غسل الخرز المناعي من الخطوة 4.7 مع العازلة lysis.
    1. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غ في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجة مئوية.
    2. إزالة بعناية supernatant، وتجاهله.
    3. إضافة 500 μL من العازلة lysis. تجانس عن طريق عكس الأنبوب.
    4. كرر الخطوات من 5.1.1 إلى 5.1.3 أربع مرات.
  2. الأوتيون
    1. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غ في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجة مئوية.
    2. إزالة بعناية supernatant، وتجاهله. إزالة قطرات الأخيرة من supernatant مع حقنة هاملتون من أجل تجنب الطموح من الخرز، وتجاهل supernatant.
    3. أضف 40 ميكرولتر من العازل العازل لـ 4x Laemmli (200 m Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% الجلسرين, 0.5 مليون β-mercaptoethanol, 0.02% بروموفينول الأزرق). تجانس عن طريق التنصت بلطف على أنبوب.
    4. تحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق في 10000 x ز في درجة حرارة الغرفة.
    6. مع حقنة هاملتون، وإزالة supernatant وجمعها في أنبوب ميكروسينترال الجديد. هذا الكسر يتوافق مع "Eluate"، والتي يمكن تخزينها عند -80 درجة مئوية، أو تحليلها مباشرة من قبل Blot الغربية.

6. تقييم كيناز

  1. إعداد العازل كيناز: 50 m HEPES-NAOH درجة الحموضة 7.5 (HEPES ل4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبيرازين إيثانسولفولفينيك حمض)،150 مل كلوريد الصوديوم، 5 m MgCl 2، 5 mM MM MnCl50 mM NaF، 1 م Na3VO20 مللي م β-غليسيروفوسفات، 1 ميكروغرام/ مل الليبيبتين، و 1 m PMSF. مطلوب حوالي 2 مل من العازل كيناز لكل حالة من امنالترسيب.
  2. غسل الخرز المناعي من الخطوة 4.7 مرتين مع 500 μL من العازلة lysis.
    1. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غ في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجة مئوية.
    2. إزالة بعناية supernatant، وتجاهله. إضافة 500 μL من العازلة lysis. تجانس من قبل الانعكاس.
    3. كرر الخطوات 6.2.1 و 6.2.2.
  3. غسل الخرز المناعي ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من العازلة كيناز.
    1. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غ في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجة مئوية.
    2. إزالة بعناية supernatant، وتجاهله. إضافة 500 μL من الكيناز المخزن المؤقت. تجانس من قبل الانعكاس.
    3. كرر الخطوات 6.3.1 و 6.3.2 مرتين.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غ في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجة مئوية.
  5. إزالة بعناية supernatant، وتجاهله. إزالة قطرات الأخيرة من supernatant مع حقنة هاملتون من أجل تجنب الطموح من الخرز، وتجاهل supernatant.
  6. إضافة 40 μL من الكيناز العازلة إلى الخرز المناعي. إعادة تعليق الخرز عن طريق التنصت بلطف على أنبوب.
  7. إعداد المزيج لγ[32P] ATP وسم (حجم النهائي هو 22.5 μL، كاملة مع العازلة كيناز) في قفل آمن أنبوب.
    1. إضافة حجم المطلوبة من الكيناز المخزن المؤقت للوصول إلى حجم نهائي من 22.5 μL.
    2. قطع نهاية طرف 20 ميكروبوريت ميكروبولتر. إعادة تعليق الخرز المناعي من الخطوة 6.6 عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات. جمع 10 μL من هذه الخرز في أنبوب قفل آمن.
    3. أضف ATP من محلول مخزون 10 μM للوصول إلى 50 m M من تركيز النهائي. وفقا لعدد من عينة تعامل، ويقترح تخفيف محلول الأسهم من ATP في العازلة كيناز للسماح للماصة 1 إلى 2 ميكرولتر، للتأكد من أن حجم صحيح.
    4. إضافة 2.5 ميكروغرام من الركيزة (الكوفيلين أو البروتين الأساسي الميلين، MBP في حالة الدراسة الحالية).
  8. إضافة 5 μCiمن γ[32 P] ATP (3,000 Ci/mmol) لبدء رد الفعل. مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ببطء.
    تحذير: من هذه النقطة، يجب القيام بالعمل في مكان آمن مخصص للتلاعب بالنشاط الإشعاعي مع الاحتياطات الحذرة، والحماية المخصصة والضوابط المناسبة (الدروع المشعة، عداد جيجر، وجمع النفايات المحددة، والثدي الشخصية و شارات الأصابع للكشف عن التعرض للإشعاع، نصائح التصفية).
  9. احتضان لمدة 20 دقيقة في 30 درجة مئوية.
  10. إيقاف رد الفعل مع 6 μL من 5X العازلة Laemmli.
  11. الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  12. جهاز طرد مركزي في 10000 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  13. تحميل على صفحة SDS. انتقل إلى الهجرة.
    ملاحظة: الحرص على أن الخط الأمامي من γ الحرة[32P] ATP لا يخرج من هلام لتجنب تلوث خزان الهجرة.
  14. وصمة عار على الجل في درجة حرارة الغرفة.
    1. إزالة الجل من لوحات الزجاج.
    2. المضي قدما مع ثلاثة حمامات في الماء في درجة حرارة الغرفة.
    3. وصمة عار هلام بين عشية وضحاها مع Coomassie الأزرق في درجة حرارة الغرفة.
    4. اللطال مع عدة حمامات غسل مع الماء في درجة حرارة الغرفة.
  15. لف الجل بغلاف بلاستيكي.
  16. كشف لليلة واحدة أو أكثر على شاشة فسفوريمسر.
  17. قراءة الشاشة على phosphorimager للكشف عن العصابات المسماة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم توليف البروتين LIMK2-1
[ليمك2-1] ذكرت في [دتبنك], غير أنّ [س فر] فقط واحدة ورقة قد أبدى الوجود من ه [مرنا]18. بالمقارنة مع اثنين من homologs، ليمك2a وLIMK2b، ليمك2-1 لديه مجال C-محطة إضافية محددة كمجال البروتين فوسفاتاز 1 المثبطة (PP1i). صممنا جسم مضاد يستهدف ببتيد من هذا المجال، الأحماض الأمينية 671-684 (الشكل1A).
وأظهرت البحوث BLAST ضد قواعد بيانات البروتين البشري أن بروتين واحد فقط، PHI-1 (فوسفاتاتيز مثبط الهولوزيم 1)، لديه تشابه تسلسل قوي مع هذا التسلسل 12 الأحماض الأمينية. ومع ذلك، يهاجر PHI-1 في 23 kDa على المواد الهلامية SDS-PAGE، بعيدا عن LIMK2-1، والتي من المتوقع أن تهاجر حوالي 75 كدا (أي، يجب أن لا تتداخل الاثنان). قمنا بالتحقق من صحة هذا الجسم المضاد أولا لخلايا HEK-293 نقل العدوى إما مع LIMK2-1، LIMK2a، أو LIMK2b وأظهرت أن الأجسام المضادة PP1I كان قادرا على التعرف على العدوى ليمك2-1 (pCMV-LIMK2-1) وHA-الموسومة ليمك2-1، ولكن لم تتفاعل مع العدوى HA-الموسومة LIMK2a أو LIMK2b (الشكل1B). لاحظنا مجموعة من LIMK2-1 الذاتية في خلايا HEK التي تم نقلها مع إصدارات ذات علامات HA من ISOFORMS LIMK2 (يشار إليها بسهم في وصمة عار PP1i المضادة؛ الشكل 1 باء). ثانيا، تحققنا ما إذا كانت الإشارة التي يسببها المضادة PP1i المضادة كانت محددة لLIMK2-1 باستخدام siRNA استهداف المتغيرات الثلاثة من LIMK2 (الشكل1C). في وجود LIMK2 siRNA، لوحظ انخفاض قابل للتكرار وكبير في نطاق الاهتمام (يشار إليه او سهم في الشكل 1C)مقارنة بشروط التحكم، مما يشير إلى أن الأجسام المضادة محددة لLIMK2-1. بعد ذلك، استخدمنا الأجسام المضادة PP1i للكشف عن LIMK2-1 في مقتطفات خط الخلية المختلفة: HEK-293 (خلايا الكلى الجنينية البشرية)، وهيلا (خلايا الرحم الظهارية البشرية)، وC6 (الخلايا الجرذ الدماغ غليال). يتم تعطيل هذه الخلايا في المخزن المؤقت للانتلاخ الذي يحتوي على 1٪ تريتون X-100. باستخدام في تحليل السيليكو، وأظهرت LIMK2-1 أن يكون هومينيداي الرئيسيات محددة19. تحليل وصمة عار الغربية باستخدام الأجسام المضادة PP1i أظهرت أن LIMK2-1 يبدو أن أعرب في HEK-293 وهيلا ولكن ليس في خطوط الخلايا C6 كما هو متوقع من في الدراسات السيليكو (الشكل 1D). وقد تكررت هذه التجارب مع الأنسجة البشرية المختلفة، مما يدل على أن مستويات البروتين LIMK2-1 تختلف تبعا للأنسجة: تم العثور على أعلى المستويات في الكبد، ومستويات أقل في البنكرياس، وأدنى في الخصية والرئة. لم يكن ليمك2-1 قابلاً للكشف في أنسجة الدماغ (الشكل 1E). لاحظنا انخفاض نطاقات الوزن الجزيئي في جميع عينات الأنسجة باستثناء الكبد، مما يشير إلى تدهور البروتين الكامل ربما بسبب ظروف تحلل هذه العينات التجارية (هذا العازلة تحلل يحتوي على مزيج من مثبطات غير محددة على ورقة البيانات، والتي قد تكون أقل كفاءة من العديد من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز التي نستخدمها في المخزن المؤقت لدينا مصنوعة في المنزل). وتبين هذه البيانات أن البروتين LIMK2-1 الإنسان يتم توليفها ويعبر عنها بشكل مختلف في الأنسجة التي تم اختبارها.

ليمك2-1 يتفاعل مع الكيناسي المنبع روك
وقد وصفت LIMK2-1 homologs، LIMK2a وLIMK2b، بأنها تنظمها صخرة كيناز المنبع. قمنا بتقييم تفاعل LIMK2-1 مع ROCK باستخدام تجارب التهطال المناعية. وقد شاركت خلايا HEK في نقلها بناقلات ترميز CMYC-tagged ROCK1 وإما واحدة من إصدار الـ HA-tagged من ISOFORMS LIMK2، أو البروتين Larp6 غير المرتبط بعلامة HA. Larp6 بمثابة التحكم السلبي، مما يسمح بالكشف عن التفاعلات غير المحددة. تم lysed الخلايا والمضادة للها المناعية تم تنفيذها. تم تحليل الليسات (مستخلصات الخلايا الكاملة) والمناعة من قبل Blot الغربية، وذلك باستخدام الأجسام المضادة للها ومكافحة cMyc. كما هو موضح في الشكل 2 (لوحات اليسار; Lysates)، كل من البروتينات المختلفة المشفرة من قبل ناقلات المنقولة بشكل جيد. الثلاثة [إيسفورم] من [ليمك2], [أس ولّ س] [لّب6], بكفاءة [إيمّوبل] (شكل2, أسفل يصحّ لوح; الأواع). في ال [إلوأتس], اكتشفت صخرة ولذلك [كمنوبك] [كمنوبك] مع الثلاثة [إيسفورم] من [ليمك2], غير أنّ لا مع [لرب6] (شكل 2, لوح علويّة يصحّ; الأواع). وهذا يدل على أن روك يتفاعل مع ثلاثة isoforms من LIMK2، وخاصة مع الأيزوفورم يتميز حديثا LIMK2-1. هذا التفاعل هو محدد منذ السيطرة السلبية (Larp6) لا تتفاعل مع روك.

هنا، ونحن نقدم البيانات عن الترسيب المناعي ة مع الأجسام المضادة للها; ومع ذلك، يمكن اختبار التفاعل في الاتجاه المعاكس عن طريق الصخور المناعية مع الخرز مترافق مع الأجسام المضادة cMyc وتحليل eluates مع الأجسام المضادة HA للكشف عن الترسيب المناعي LIMK.

نشاط كيناز
الفسفو-كوفلين في الخلايا السليمة
وقد تبين أن homologs من ليمك2-1، ليمك2أ وLIMK2b، لفسفوريلات الكوفيلين، عامل إزالة البوليمرات actin، على Serine3. باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف على وجه التحديد فوسفو-سيرين3 من كوفيلين، درسنا نشاط كيناز ليمك2 عن طريق قياس مستوى الفوسفو-كوفلين الذاتية في خلايا HEK المبالغة في التعبير عن واحدة من ISOFORMS ليمك2. تم نقل خلايا HEK مع ناقلات ترميز إما واحدة من ISOFORMS LIMK2 مع العلامة HA، أو متجه فارغة المقابلة كتحكم سلبي. تم تحليل الخلايا، وتم تحليل الليسات المختلفة من قبل Blotting الغربية باستخدام الأجسام المضادة cofilin المضادة phospho-Serine3. وقد تسبب التعبير المفرط عن LIMK2a وLIMK2b في حدوث زيادة كبيرة وقابلة للتكرار في مستويات الفوسفو-كوفيلين بالنسبة لظروف السيطرة، في حين أن وجود LIMK2-1 لم يكن له تأثير قابل للكشف (الشكلاللوحة اليسرى).

كررنا نفس التجربة مع C-محطة YFP الموسومة (البروتين الفلورسنت الأصفر) نسخة من ثلاثة أشكال الأيزوفورمات ليمك2 ونسخة غير موسومة من LIMK2-1 لاستبعاد التداخل المحتمل من قبل العلامة HA المحطة N. وكانت النتائج مطابقة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام إصدارات ذات علامات HA من ثلاثة isoforms (الشكل 3, اللوحة اليمنى التي تظهر النسخة الموسومة YFP). تم تقييم كفاءة التنقية للإصدار الذي يحمل علامة YFP من ISOFORMS LIMK باستخدام قياس تدفق الدفق للتحكم في أن هذه النتيجة ربما كانت بسبب اختلاف في التعبير البروتيني. وأظهرت المقاييس الثلاثة كفاءة مماثلة في التّنَزَب: 54% لـ LIMK2-1، و49% لـ LIMK2b و43% لـ LIMK2b.

اختبارات كيناز في المختبر
ثم درسنا نشاط كيناز من ISOFORMS LIMK2 عن طريق وضع العلامات في المختبر مع γ[32P] ATP. ويبين الشكل 4 ألف المخطط العام لهذا الوسم في المختبر. تم نقل خلايا HEK مع أي من الإصدارات ذات العلامات HA من ISOFORMS LIMK2 أو البروتين غير ذي الصلة، Larp6، الذي كان يستخدم كتحكم سلبي. تم قياس نشاط كيناز من المناعة المضادة للها باستخدام المؤتلف GST-cofilin كركيزة في وجود γ[32P] ATP. [ه-منيثمس] [لب6] أبدى ما من [كينس] نشاط على [كفيلين]. [ه-منيثمس] [ليمك2ا] و [ليمك2ب] فسفورة [كفيلين], حيث أنّ [ليمك2-1] لم (شكل [4ب]). حصلنا على نتائج مماثلة باستخدام إصدارات YFP الموسومة من ثلاثة isoforms المناعية مع الخرز فخ GFP في وجود cofilin المؤتلف وγ[32P] ATP (الشكل4D).

ثم اختبرنا ما إذا كان ليمك2-1 لم يكن نشاط كيناز أو إذا كان نشاطه على cofilin كان ضعيفا. كررنا تجربة وضع العلامات في المختبر باستخدام البروتين الأساسي الميلين (MBP)، وهي ركيزة فعالة للعديد من كيناز البروتين، بدلا من الكوفيلين. كانت هناك إشارة خلفية عالية في حالة التحكم عندما تم إجراء الفحص في وجود إصدارات ذات علامات HA: السيطرة السلبية، HA-مناعة Larp6، أنتجت إشارة قوية من الفوسفورية MBP، على الرغم من أنها ليست كيناز ( الشكل 4جيم). لقد تغلبنا على هذه المشكلة باستخدام الإصدار الموسوم بـ YFP من هذه البروتينات. وفي ظل هذه الظروف، كانت الخلفية في عنصر التحكم (برنامج الضوابط التنظيمية وحده) منخفضة، مما سمح بإجراء دراسات أكثر تحديدا. وأظهرت GFP المحاصرين YFP-LIMK2a، LIMK2b، وLIMK2-1 نشاط كيناز نحو MBP، على الرغم من أن نشاط ليمك2-1 كان أقل (الشكل4D). ومع ذلك، كان ليمك2-1 أيضا أقل كفاءة مناعة في ظل هذه الظروف (انظر Coomassie الأزرق اللامع (CBB) تلطيخ وغرب Blotting). وهكذا، أظهرت المقاييس الثلاثة نشاط ً مماثل على MBP عندما تم تطبيع phospho-MBP إلى مستويات LIMK2 المناعية بواسطة تلطيخ CBB (الشكل4D، لوحة أقل). كما تم تحليل الرواسب المناعية من قبل Blot الغربية باستخدام الأجسام المضادة للروك للتحقق مما إذا كان النشاط على MBP يمكن أن يكون بسبب وجود روك، والتي كان يمكن أن يكون coimmunoprecipitated مع LIMK2s. لم نتمكن من الكشف عن أي إشارة روك في مناعة LIMK2. لذلك لم يكن بسبب الفوسفورية MBP إلى ROCK ولكن إلى LIMK2s في حد ذاته.

وعموما، تظهر هذه البيانات أن LIMK2a وLIMK2b لديهم أنشطة مماثلة على cofilin وMBP. على الرغم من أن LIMK2-1 يظهر النشاط كيناز نحو MBP مماثلة لتلك التي متساوية اثنين آخرين، cofilin ليست ركيزة جيدة لذلك.

Figure 1
الشكل 1: دليل على وجود بروتين ليمك2-1. (أ) مخطط تخطيطي للأشكال الثلاثة من أشكال LIMK2 البشرية. [ليمك2] وصفت [إيسفورم] في [إنترز] مورثة: [ليمك2-1] ([نب][001026971.1]), [ليمك2ا] ([نب]-005560.1), [ليمك2ب] ([نب]+057952.1). يتم عرض مجالات مختلفة من LIMK2: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM' (أقصر المجال LIM), PDZ (PSD95, Dlg1, زو-1), S / P (سيرين بروليني الغنية), كيناسي' (أقصر المجال كيناز), وPP1 (البروتين فوسفاتتاسي 1 المثبطة). يظهر التسلسل الذي تم اختياره لتصميم الأجسام المضادة للPP1i باللون الأحمر. (باء وجيم) التحقق من صحة الأجسام المضادة ليمك2-1. (B) تم نقل خلايا HEK-293 مع غير الموسومة LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) أو واحدة من التساوي اتلومترات ذات العلامات HA من LIMK2. تم تحليل Lysates من قبل غرب النشاف باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها. (C) تم نقل خلايا HEK-293 إما مع LIMK2 سيرنا أو السيطرة على سيرنا. تم تحليل Lysates من قبل Blot الغربية. يتم التعبير عن LIMK2-1 في مختلف خطوط الخلايا البشرية (D) والأنسجة (E). تعطلت خلايا HEK-293 وهيلا وC6 في 1% Triton-X100 lysis المخزن المؤقت. تم شراء مقتطفات الأنسجة وتم تحليل عينات منها من قبل غرب Blotting. تم تعديل هذا الرقم من Vallee وآخرون، مجلة الكيمياء الحيوية، 2018، http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: ثلاثة أشكال متساوية من ليمك2 تتفاعل مع ROCK1. [هك-293] سلّة كان [ك-ترنّد] مع [ك][سك-لوج] [روك1] وإمّا واحدة من الثلاثة [ه-ثمد] [ليمك] 2 [إيسفورم] (2-1, 2[ا], [2ب]) أو البروتين غير ذي صلة, [لّب] 6. [لّستس] و [أنتي-ه] [إيمّونبلوس] كان عرضت إلى [بلوتّينغ] غربيّة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: لا يوجد لدى ليمك2-1 نشاط كيناز نحو الكوفيلين في الخلايا السليمة. تم نقل خلايا HEK-293 مع أي من ثلاثة أشكال متساوية من نوع LIMK2 ذات العلامات HA (1، 2a، 2b) أو المتجه اتّصل بالأبوية الفارغة، أو PCDNA3 (اللوحة اليسرى)، أو مع أي من الثلاثة الذين تحمل علامة YFP 2 LIMK2 أو YFP وحدها (اللوحة اليمنى). [لّستس] كان عرضت إلى [بلوتّينغ] غربيّة. يظهر القياس الكمي لنسبة الفوسفو-كوفلين مقابل الكوفيلين في الرسم البياني على اليمين. تم تطبيع نسبة الفوسفو-كوفيلين مقابل الكوفيلين من الخلايا الوهمية المصابة إلى 100. كل قيمة تمثل متوسط ± SE من ثلاث تجارب مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من Vallee وآخرون، مجلة الكيمياء الحيوية 2018، http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: لا يوجد في ليمك2-1 نشاط كيناز في المختبر نحو الكوفيلين، على الرغم من أنه الفوسفوريات MBP. (أ) مخطط عام من γ [32 P] ATP في المختبر وسم. (ب) ليمك2-1 لا فسفوريلات في المختبر. تم نقل خلايا HEK-293 مع أي من ثلاثة أشكال متساوية من نوع LIMK2 تحمل علامات HA (2-1، 2a، 2b) أو بروتين لا علاقة له بعلامة HA، Larp6، كتحكم سلبي. وقد استخدمت البروتينات المضادة للها المناعية وCOFILIN ضريبة السلع والخدمات في الفحص كيناز. كما تعرضت الرواسب المناعية المضادة للها إلى مناعة مضادة للها وتلطيخ اللون الأزرق من الكومسي. (C) له علامة HA- الترسيب المناعي إشارة خلفية قوية عند استخدام MBP كركيزة. تم نقل خلايا HEK-293 مع أي من ثلاثة أشكال متساوية من نوع LIMK2 تحمل علامات HA (2-1، 2a، 2b) أو بروتين لا علاقة له بعلامة HA، Larp6، كتحكم سلبي. وقد استخدمت البروتينات المضادة للها المناعية وMBP في الفحص كيناز. كما تعرضت الرواسب المناعية المضادة للها إلى مناعة مضادة للها وتلطيخ اللون الأزرق من الكومسي. (د) الثلاثة ليمك2 isoforms لديها نشاط كيناز نحو البروتين الأساسي الميلين (MBP). وقد تم نقل خلايا HEK-293 إما مع واحدة من ثلاثة من التساويات ليمك2 التي تحمل علامات YFP (2-1، 2a، 2b) أو YFP وحدها. وقد استخدمت مضادات GFP المناعية LIMK2 ISOFORMS وcofilin أو MBP في الفحص كيناز. كما تعرضت الرواسب المناعية المضادة لـ GFP إلى مناعة مضادة لـ GFP وتلطيخ اللون الأزرق من Coomassie. يظهر قياس كمية الفوسفات-الكوفيلين وفوسفو-مب في الرسم البياني السفلي. تم تطبيع مستويات الفوسفو-كوفيلين التي تم الحصول عليها مع LIMK2a المضادة للGFP المناعية إلى 100. كل قيمة تمثل متوسط ± SE من ثلاث تجارب مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من Vallee وآخرون، مجلة الكيمياء الحيوية، 2018، http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، استخدمنا أدوات كيميائية حيوية قوية لوصف على المستوى الجزيئي بروتين جديد، LIMK2-1، ويعتقد أن يكون كيناز على أساس تسلسلها وعلى homologs لها، LIMK2a و LIMK2b20.

أولا، أظهرنا وجود LIMK2-1 على مستوى البروتين باستخدام تحليل وصمة عار الغربية مع الأجسام المضادة محددة. بعد ذلك، قمنا بتقييم تفاعلها مع KINASE ROCK1 المنبع، والذي يعرف بتنظيم LIMK2a وLIMK2b، وهو التسجيلات المثلية لـ LIMK2-1. وأخيرا، قمنا بتقييم النشاط كيناز المحتملة من LIMK2-1 من خلال γ في المختبر[32P] ATP وسم والسيلولو من قبل Blot الغربية باستخدام الأجسام المضادة فوسفو محددة.

تكوين العازلة Lysis
عند دراسة البروتينات من أجل تحليلها من قبل Blot الغربية، مطلوب عناية خاصة فيما يتعلق تكوين العازلة تحلل. يجب النظر في عدة معلمات: '1'نوع المنظفات وتركيز21 ، و (2) مثبطات البروتياز.

يجب أن يتم تكييف تكوين العازلة lysis للبروتين المستهدف لتسهيل الذوبان شبه الكامل من أجل استخراجه قدر الإمكان والسماح بالكشف عنه من قبل Blot الغربية. للبروتينات القابلة للذوبان، غالباً ما تكون الظروف الخفيفة (مثل المنظفات الخفيفة بتركيز منخفض) كافية لتحقيق ذلك. بالنسبة للبروتينات الغشاءية، عادة ما تكون هناك حاجة إلى ظروف أقوى. توجد فئات مختلفة من المنظفات: '1' أيونية، مثل كبريتات دوديسيل (SDS)، وبروميد سيتيلتري ميثيل أمونيوم (CTAB)، و(2) غير أيوني مثل إيثير البولي إيثيلين غليكول سداسي ديسيل (BRIJ)، تريتون، أوكتيل غلوكوزايد (OG)، دوديسيل مالتوسيد (DDM)، و ( '3' الزواتيريوني ة 3-[(3-تشولاميدوبروبيل)ثنائي ميثيل يومنيو]-1-بروبانسلفونات (CHAPS) أو zwittergents. المنظفات القوية قد تعطل التفاعلات والمجمعات قد تضيع. وعلاوة على ذلك، لتجارب الترسيب المناعي، قد تكون الأجسام المضادة حساسة للظروف الشديدة. وبالمثل، قد يكون نشاط الإنزيم منزعجاً من وجود المنظفات التي قد تتكشف أو تشوه البروتين المدروس. قد يؤثر كل من نوع وكمية المنظفات المستخدمة على خصائص ونشاط البروتين. لبعض البروتينات، يتم التسامح مع مجموعة محدودة جدا من تركيز المنظفات للحفاظ على نشاط البروتين. تحت هذا النطاق يبقى البروتين غير قابل للذوبان في حين أن البروتين فوق هذا النطاق من التركيز، لم يعد نشطاً.

مثبطات البروتياز يجب أن تضاف إلى العازلة تحلل لمنع تدهور البروتين المستهدف عن طريق البروتياز الذاتية. الكوكتيلات مثبط البروتياز متاحة تجاريا. ويمكن استخدامها كنقطة انطلاق للدراسة. إذا واجهت مشاكل، يمكن للمرء أن ينظر في استخدام خليط من مثبطات أعدت مؤقتا من حلول المخزون المخزنة في -20 درجة مئوية. هذه المثبطات يجب أن تستهدف البروتياز سيرين وسيستين. يستخدم PMSF (فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل) بشكل شائع، إلا أنه غير مستقر جدًا في محلول مائي ويجب إضافته قبل الاستخراج مباشرةً. وينبغي أيضا أن تكون مثبطة ميتالابروتياز: المعادن الكواشف المخلبية، مثل EDTA (حمض الإثيلين (الإيثيلين حمض الإيثيلين) أو EGTA (الإيثيلين غليكول-بيس (2-أمينوإيثيلثير) - حمض رباعي الاسيتيك)، التي تربط إلى 2ملغ +، وتستخدم في هذا الغرض. للحفاظ على البروتين في شكل هاونفسلووبالتالي تنشيطها، فمن المستحسن أيضا إضافة مثبطات الفوسفاتيز إلى العازلة lysis. هذه المثبطات يجب أن تستهدف القلوية, حمض, سيرين, الثيروزين, وفوسفاتاز التيروزين. كما ينصح بالعمل في درجة حرارة منخفضة (4 درجة مئوية) من أجل إبطاء معدل التحلل البروتيني.

البروتينات المستهدفة
هنا، ركزنا على البروتينات الموسومة بعلامات التلخيص. العلامات (العلم، HA، cMyc، GFP، الخ) هي مفيدة جدا من أجل الكشف عن وتنقية البروتينات، والأجسام المضادة والخرز إلى جانب الأجسام المضادة متوفرة تجاريا وهي مواد قابلة للاستنساخ بسهولة. ومع ذلك، فإن حجم وموضع العلامة يجب أن تؤخذ في الاعتبار لأن هذا قد يؤثر على النشاط، وتوطين أو وظيفة البروتين المستهدف6،7،8. ومن الممكن أيضا للعمل مع البروتينات الذاتية. في هذه الحالة، يجب استخدام الأجسام المضادة التي تستهدف هذا البروتين معينة. قد تكون مقترنة الخرز (البروتين A أو البروتين G) covalently (عبر الارتباط) أو أن يكون حاضنة مع lysate ثم مع الخرز. عند العمل مع البروتينات الموسومة، التي يتم التعبير عن الجينات على البلازميد، فمن السهل التحول إلى نسخة متحولة من هذا البروتين عن طريق الطفرات من الجين. ومن الممكن بعد ذلك العمل على مختلف المسوخ لتقييم الوظائف البيولوجية.

مناعوية
المناعية هو تقنية قوية جدا لعزل شركاء من البروتين المستهدف5. تكوين العازلة lysis (وخاصة المنظفات) يجب أن تكون راسخة بعناية للحفاظ على التفاعلات (انظر أعلاه). من الممكن الكشف عن التفاعل بين بروتينين محددين. قد يكون البروتينات الذاتية أو البروتينات المفرطة. عندما يتم التعبير عن البروتينات في وفرة منخفضة، قد يكون من الضروري المبالغة لهم من أجل الحصول على إشارات أقوى. مطلوب غسل واسعة من الخرز المناعي لإزالة البروتينات أو الملوثات التفاعل غير محددة. قبل تحديد كفاءة الترسيب المناعي أو وجود الشريك المُسبق من قبل المناعة، من المهم التحقق من أن الشركاء المختلفين يتم التعبير عنهم بشكل جيد وحاضرين في الليسات من خلال تحليل ليسات الخلية بأكملها أو جزء الإدخال من قبل ويسترن لطخه. وعلاوة على ذلك، فإنه باستخدام تجارب التهطال المناعي، من الممكن أيضا تحديد شركاء جدد للبروتين المستهدف وعزل المجمعات الجديدة. ويمكن تحديد هؤلاء الشركاء الجدد عن طريق قياس الطيف الكتلي.

وقد يلعب هؤلاء الشركاء دوراً هاماً كعوامل تنشيط للبروتين المستهدف مما يسمح بأنشطته الكاملة لإجراء مزيد من الاختبارات البيولوجية. من ناحية أخرى، يمكن استخدام البروتينات غير المرغوب فيها المنقّبة كحجة أنه لا يوجد تفاعل مباشر بين شريكين محددين، ولكن بدلاً من ذلك فإن التفاعل المكتشف من قبل الترسيب المشترك يرجع إلى شريك آخر غير معروف. في هذه الحالة المحددة، للتأكد من التفاعل المباشر، هناك حاجة إلى جهاز تجريبي آخر، مثل العمل على بروتينات الثدييات المنقى من البكتيريا.

نشاط كيناز
ويمكن تقييم نشاط كيناز بواسطة تقنيات مختلفة. هنا، ركزنا على التحليل في المختبر عن طريق γ[32P] ATP وسم وعلى تحليل استخراج الخلية الكاملة من قبل Blot الغربية باستخدام الأجسام المضادة phospho-specific. γ[32P] ATP وسم هو تقنية حساسة جدا وكمية مما يسمح للكشف عن النشاط كيناز ضعيفة15. يسمح دمج النشاط الإشعاعي من ATP إلى الركيزة المستهدفة بإجراء قياس مباشر لنشاط الإنزيم. من الممكن العمل مع ركائز مختلفة لتقييم نشاط كيناز من البروتين درس على أهداف مختلفة. ومن الممكن أيضا لتحديد الأحماض الأمينية حاسمة لنشاط كيناز عن طريق تحول لهم عندما يتم overexpressed البروتين. يتطلب نشاط كيناز تُشكّل ثنائي التكافؤ مثل Mg2+، والذي يجب أن يكون موجودًا في المخزن المؤقت للكيناز.

والعيب الرئيسي في هذا النهج هو معالجة النشاط الإشعاعي، الذي يتطلب مرافق مخصصة للتجارب وجمع النفايات. توجد طرق بديلة، مثل مجموعات الفلورسنت أو الانارة التي تكشف عن المنتجات الثانوية من رد الفعل، مثل ADP (أدينوسين ثنائي الفوسفات)16. ويمكن أيضا دراسة الفوسفورية البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي، ومع ذلك، هناك حاجة إلى كمية أكبر من المواد لهذه التحليلات. في حالتنا، حاولنا تقييم نشاط كيناز ليمك2 باستخدام الكهربائي الشعري لزيادة كفاءتنا ولكن هذا للأسف لم يكن ناجحا.

الأجسام المضادة الفوسفومحددة هي أداة أخرى لدراسة الفوسفورية من البروتين. واسعة عامّة [أنتي-فوسفو] [سرين] و [تروستين] أجسام مضادّة يتواجد, يمكن أن يميّز [فوسفو-سر] أو [فوسفو-تر] من أيّ بروتينات. في السنوات الأخيرة، تم تطوير الأجسام المضادة التي تستهدف موقع فوسفو محدد من البروتين المستهدف على نطاق واسع وعادة ما تعترف كل من مجموعة فوسفو والأحماض الأمينية المحيطة بها. هناك حاجة إلى عناية خاصة عند البدء في العمل مع مثل هذه الأجسام المضادة، حيث يجب فحص خصائصها على سبيل المثال مع التحكم السلبي، مثل البروتين المستهدف المتحول على موقع فوسفو. عند التحقيق في وصمة عار مع الأجسام المضادة للفوسفو، يجب أن لا يكون الحل حجب الحليب، وهذا يحتوي على البروتينات الفسفورية التي قد تتفاعل مع الأجسام المضادة. ينصح ألبومين مصل البقر (BSA)، ويمكن إضافة مثبطات الفوسفاتيز في محلول الحجب لمنع إطلاق الفوسفات. لا ينبغي تجميد العينات وذوبانها، بل إعدادها كعينات aliquots التي يتم الاحتفاظ بها عند -80 درجة مئوية. في الواقع، تعديلات الفوسفو هي لابيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل رابطة مكافحة السرطان، ورابطة الأورام العصبية الليفية وريكلينغهاوزن، ومركز لا ريجيون فال دي لوار. شكراجزيلا لأوريلي كوسون وديبورا كاساس لبيانات قياس التدفق السيتومتري، وإلى كيرون هيكمان لويس لتنقيح المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics