एक नई Kinase प्रोटीन के मजबूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर आणविक स्तर पर विशेषता

Biochemistry

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Summary

हम मजबूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर एक नया kinase प्रोटीन की विशेषता: विभिन्न सेल लाइनों और ऊतकों पर एक समर्पित विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण, coimmunosiactivity प्रयोगों द्वारा बातचीत, kinase गतिविधि पश्चिमी द्वारा पता लगाया फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके और [32पी] एटीपी लेबलिंग द्वारा ब्लॉट।

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Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

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Abstract

व्यापक पूरे जीनोम अनुक्रमण कई ओपन रीडिंग फ्रेम्स (ORFs) कई संभावित प्रोटीन प्रदान की पहचान की है. इन प्रोटीन सेल के लिए महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती है और नई सेलुलर प्रक्रियाओं को जानने सकता है. प्रोटीन के अलावा, kinases प्रमुख अभिनेता हैं के रूप में वे सेल संकेतन रास्ते के हैं और पर या सेल के भाग्य के लिए महत्वपूर्ण कई प्रक्रियाओं बंद स्विच करने की क्षमता है, जैसे सेल विकास, विभाजन, भेदभाव, गतिशीलता, और मौत.

इस अध्ययन में, हम एक नई संभावित kinase प्रोटीन, LIMK2-1 पर ध्यान केंद्रित किया. हम एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी ब्लॉट द्वारा अपने अस्तित्व का प्रदर्शन किया. हम coimmunoprecipitation प्रयोगों का उपयोग कर प्रोटीन को विनियमित करने के लिए एक अपस्ट्रीम के साथ अपनी बातचीत का मूल्यांकन किया. Coimmunoveriveriveriveris एक बहुत शक्तिशाली दो लक्ष्य प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगाने में सक्षम तकनीक है. यह भी एक चारा प्रोटीन के नए भागीदारों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चारा प्रोटीन या तो एक टैग के माध्यम से अपने अनुक्रम के लिए इंजीनियर शुद्ध किया जा सकता है या विशेष रूप से इसे लक्षित एक एंटीबॉडी के माध्यम से. इन प्रोटीन परिसरों तो एसडीएस-पेज (सोडियम Dodecyl सल्फेट PolyAcrylamide जेल) द्वारा अलग किया जा सकता है और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर की पहचान की. इम्यूनोप्रिसिपेटेड LIMK2-1 का उपयोग इन विट्रो में अपनी काइनेज़ गतिविधि का परीक्षण करने के लिए भी किया जाता था [32P] एटीपी लेबलिंग। यह अच्छी तरह से स्थापित परख कई अलग अलग substrates का उपयोग कर सकते हैं, और चारा के उत्परिवर्तित संस्करणों विशिष्ट अवशेषों की भूमिका का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. औषधीय एजेंटों के प्रभाव का भी मूल्यांकन किया जा सकता है क्योंकि यह तकनीक अत्यधिक संवेदनशील और मात्रात्मक दोनों है। फिर भी, रेडियोधर्मिता हैंडलिंग विशेष सावधानी की आवश्यकता है. Kinase गतिविधि भी संशोधित एमिनो एसिड के फॉस्फो समूह को लक्षित विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है. इस प्रकार के एंटीबॉडी सभी फॉस्फो संशोधित अवशेषों के लिए वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं।

Introduction

कई दशकों के लिए, कई संकेतन रास्ते स्पष्ट किया गया है और इस तरह के सेल विभाजन, भेदभाव, गतिशीलता, क्रमादेशित सेल मौत, प्रतिरक्षा और neurobiology के रूप में महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में उनकी भागीदारी, दिखाया गया है। किनेस इन संकेतन पथों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है क्योंकि वे प्राय : अपने सक्रियण या निष्क्रियता को सूक्ष्म रूप से नियंत्रित करते हैं और क्षणिक बहुमुखी परिसरों का हिस्सा होते हैं जो बाह्य उद्दीपकों1,2,3का जवाब देते हैं . किनेस के उत्परिवर्तन और अपघटन अक्सर मनुष्यों में बीमारियों का कारण बन जाते हैं, और इसलिए वे पिछले चालीस वर्षों में 4 वर्षों में सबसे महत्वपूर्ण दवा लक्ष्यों में से एक बन गए हैं .

इस संदर्भ में, यह महत्वपूर्ण है कि वे अपने अपस्ट्रीम विनियामकों या डाउनस्ट्रीम सबस्ट्राट्स के साथ काइनाज संपर्क का पता लगा सकें और नए भागीदारों की पहचान कर सकें। एफ़िनिटी शुद्धि और इम्यूनोप्रीफिकेशन प्रोटीन परिसरों के अलगाव के लिए बहुत शक्तिशाली तकनीकहै 5. चारा प्रोटीन या kinase एक विशिष्ट पेप्टाइड अनुक्रम के साथ टैग किया जा सकता है वाणिज्यिक मोती covalently पेप्टाइड को लक्षित एंटीबॉडी के साथ युग्मित का उपयोग की अनुमति. यह सामग्री6,7,8के प्रयोगों में उच्च पुनरूत्थानीयता की अनुमति देती है . अंतर्जात प्रोटीन भी सीधे चारा प्रोटीन को लक्षित एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रतिरक्षा preprecipitated किया जा सकता है. एंटीबॉडी को प्रोटीन ए या प्रोटीन जी अगारोस मोतियों से क्रॉस-लिंक किया जा सकता है या lysate जोड़ने से पहले इन मोतियों के साथ बस इनक्यूबे को इनक्यूबेट किया जा सकता है। Lysis बफ़र्स बातचीत खोने के बिना प्रोटीन solubilization अनुमति देने के लिए और प्रोटीन गिरावट से बचने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस दृष्टिकोण का एक प्रमुख दोष यह है कि सेल lysis पर बातचीत का पता चला है; इसलिए, क्षणिक या कमजोर बातचीत, उपकोशिकीय संदर्भ की आवश्यकता होती है उन लोगों के साथ याद किया जा सकता है. अन्य तकनीकों के लिए इस तरह के निकटता लिगेशन परख (पीएलए)9के रूप में सेल में सीधे काम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, vivo पार से जोड़ने की मदद से आत्मीयता शुद्धि (XAP)10, Bioluminscence अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (BRET) या F$rster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (FRET)11,12. इसके अलावा, प्रतिरक्षा बाइंडिंग के ऊष्मागतिक स्थिरांकों को निर्धारित करने के लिए उपयुक्त नहीं है, जिसके लिए भौतिक तकनीकजैसे सतह प्लासमोन अनुनाद, आइसोथर्मन कैलोरीमिति या माइक्रोस्केल थर्मोफोरोसिस की आवश्यकता होती है। 13,14.

Kinase गतिविधि कई तकनीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. इसमें, हमने फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी और इन विट्रो पर ध्यान केंद्रित किया [32पी] एटीपी (एडिनोसाइन ट्राइफॉस्फेट) लेबलिंग। फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रोटीन के भीतर एक विशेष अवशेषों के फॉस्फेट संशोधन को लक्षित करते हैं। वे सेल lysis के बाद पश्चिमी ब्लॉट या ELISA (एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोर्बेंट परख) में इस्तेमाल किया जा सकता है, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए, और भी बरकरार कोशिकाओं पर प्रवाह साइटोमेट्री या इम्यूनोफ्लूरसेंस का उपयोग कर. उनकी कमियों में विशिष्टता की कमी शामिल हो सकती है, जिसे लक्ष्य प्रोटीन के उत्परिवर्तित संस्करण का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है, और उनके सभी प्रोटीन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं किया जा रहा है। इन विट्रो में[ 32P] एटीपी लेबलिंग एक बहुत मजबूत, अच्छी तरह से स्थापित और अत्यधिक संवेदनशील विधि15है। इम्यूनोप्रिसिपेटयाट या रिकॉमबिनेंट प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है, और विभिन्न substrates परीक्षण किया जा सकता है. दवाओं के प्रभाव का भी मूल्यांकन किया जा सकता है क्योंकि यह विधि मात्रात्मक है। इसकी प्रमुख खामी यह है कि दृष्टिकोण से जुड़ी रेडियोधर्मिता को सावधानी से निपटने की आवश्यकता है। वैकल्पिक तरीकों भी फ्लोरोसेंट या luminescent पेप्टाइड substrates की माप के आधार पर संभव हो रहे हैं और फॉस्फोरिलेशन पर बदल फ्लोरोसेंट / इस तरह के तरीकों को भी उच्च थ्रूपुट की अनुमति है, जो आवश्यक है, उदाहरण के लिए, अणुओं की स्क्रीनिंग में जो लक्ष्य kinase के संभावित inhibitors हो सकता है. वास्तव में, kinases दवा कंपनियों द्वारा अपनाई गई दवा लक्ष्यों के सबसे बड़े वर्गों में से एक का प्रतिनिधित्व करतेहैं 16.

इस अध्ययन में, हम LIMK2-1 प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित (LIMK2-1 Lin11, Isle1, Mec3 Kinase आइसोफॉर्म 2-1) के लिए खड़ा है. LIMK2 kinase प्रोटीन पहली बार 199517में वर्णित किया गया था . LIMK2 के तीन समरूप वैकल्पिक splicing द्वारा उत्पादित कर रहे हैं: LIMK2a, LIMK2b और LIMK2-1. वर्तमान में, LIMK2-1 केवल एक ही अध्ययन18में MRNA स्तर पर वर्णित किया गया है. यहाँ, हम मजबूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर आणविक स्तर पर इस संभावित नए kinase प्रोटीन की विशेषता है. सबसे पहले, हम प्रदर्शित करता है कि LIMK2-1 वास्तव में संश्लेषित है. अपने दो समकक्षों के समान, LIMK2a और LIMK2b, यह अपस्ट्रीम kinase रॉक (रो संबद्ध प्रोटीन kinase) के साथ सूचना का आदान-इन करता है। हम दिखाते हैं LIMK2-1 Myelin बुनियादी प्रोटीन (MBP) पर एक kinase गतिविधि है, लेकिन cofilin पर नहीं, LIM kinases के विहित सब्सट्रेट.

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Protocol

1. ट्रांसफेक्शन के लिए सेल की तैयारी

चेतावनी: सेल संस्कृति के सभी चरणों को एक समर्पित प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए, और कोशिकाओं को एक वर्ग 2 microbiological कैबिनेट के भीतर हेरफेर कर रहे हैं.

  1. बीज HEK-293 (मानव भ्रूण गुर्दे) में कोशिकाओं $ 10 सेमी प्लेटों में DMEM के 10 एमएल (Dulbecco के संशोधित ईगल्स मध्यम) 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक. 5% सीओ2के तहत 3 से 5 दिनों के लिए संस्कृति, 37 डिग्री सेल्सियस पर, जब तक कोशिकाओं तक पहुँचने $90% संगम.
  2. प्लास्टिक प्लेटों के लिए सेल आसंजन को बढ़ाने के लिए कोलेजन आर के साथ 10 सेमी प्लेटों का इलाज करें।
    1. कोलेजन आर के समाधान के 5 एमएल जोड़ें, 200 गुना एक $ 10 सेमी प्लेट में फॉस्फेट Saline बफर (पीबीएस) में पतला. प्लेट की पूरी सतह पर तरल ओवरले.
    2. जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर कम से कम 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    3. कोलेजन समाधान निकालें, और इसे छोड़ दें. पीबीएस के 5 एमएल जोड़ें, यह थाली की सतह पर सभी फैला है, इसे हटाने और इसे त्याग दें. इस धोको एक बार दोहराएँ.
    4. DMEM के 8 एमएल जोड़ें 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक. तैयार प्लेटों को जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें।
  3. जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर कदम 1.1 से HEK-293 प्लेटें ले लो. प्लेटों से माध्यम निकालें और यह एक समर्पित ब्लीच कचरे में छोड़ दें. पूरक DMEM के 2 एमएल जोड़ें, और उन्हें एक 1 एमएल micropipette के प्रवाह का उपयोग कर अलग करने के लिए कोशिकाओं फ्लश, फोम बनाने से बचने के लिए देखभाल ले.
  4. एक 15 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा और पूरक DMEM के 4 एमएल जोड़ें. एक 10 एमएल पिपेट के साथ Homogenize, ऊपर और नीचे 3 बार पाइपिंग द्वारा.
  5. इस सेल समाधान के 2 एमएल ले लो और चरण 1.2.4 से पूरक DMEM युक्त कोलेजन का इलाज प्लेटों के लिए उन्हें जोड़ने.
  6. 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए आगे बढ़ें। ट्रांसफेक्शन के समय कोशिकाओं को 50-80% अनुकूल होना चाहिए।

2. क्षणिक transfections

  1. प्लेटों से माध्यम निकालें, यह एक समर्पित ब्लीच कचरा में छोड़ दें, और ताजा पूरक DMEM के 10 एमएल जोड़ें. ट्रांसफेक्शन मिश्रण तैयार करते समय 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में प्लेटों को वापस रखें।
  2. 15 एमएल ट्यूब में 10 एमएम ट्रास-एचसीएल पीएच 7.5/1 एमएम एड्टा (ट्रिस के लिए खड़ा है( हाइड्रॉक्सीमेथिल) एमिनोमेथेन, और एटेटा एथिलीनडिनिट्रिलोट्राएट्राएटिक एसिड के लिए समाधान और 2.5 एम सीसीएल2 समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। व्युत्क्रम द्वारा मिक्स.
  3. समर्पित प्लाज्मिड के साथ परिवर्तित बैक्टीरिया की एक तरल संस्कृति पर एक मिडी तैयारी से तैयार प्लाज्मिडी डीएनए (Deoxyribonucleic एसिड) के 10 डिग्री ग्राम जोड़ें। व्युत्क्रम द्वारा मिक्स.
  4. एक भंवर पर चिकनी आंदोलन के तहत, BES बफरेड नमकीन 2x ध्यान केंद्रित के 500 $L जोड़ें (संयोजन: BES, 10.7 g/L, NaCl, 16.0 g/L, Na2HPO4, 0.27 g/ बीईएस एन,एन-बिस(2-हाइड्रोक्सीएथिल)-2-एमिनोएथेनेसल्फोनिक एसिड, एन,एन-बिस (2-हाइड्रोक्सीएथिल)) धीरे-धीरे ड्रॉप होने से होता है।
  5. जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर कमरे के तापमान पर कम से कम 15 मिनट (45 मिनट तक) के लिए इनक्यूबेट। भंवर मत करो, मिश्रण नहीं है! ट्यूब बहुत ध्यान से ले जाएँ डीएनए और कैल्शियम फॉस्फेट के बीच जटिल गठन परेशान नहीं करने के लिए।
  6. कदम 2.1 से सुरक्षा कैबिनेट के लिए प्लेटें ले लो. डीएनए परिसरों बहुत ध्यान से जोड़ें, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, सभी प्लेट की सतह पर कोशिकाओं पर.
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 24 से 72 घंटे के लिए इनक्यूबेट। आमतौर पर अधिकतम प्रोटीन अभिव्यक्ति 48 घंटे के भीतर पहुँच जाता है.

3. लाइसिस

नोट: बर्फ पर काम करते हैं, और प्रोटीन गिरावट को रोकने के लिए ठंड बफ़र्स के साथ।

  1. lysis बफर तैयार करें: 50 एमएम Tris-HCl, पीएच 7.5, 100 एमएम नैकल, 5 एमएम एडीटीए, 0.1% ट्राइटन एक्स-100, 50 एमएम नैफ, 10 एमएम सोडियम पायरोफॉस्फेट, 1 एमएम ना3वीओ4,20 एमएम पी-ननिट्रोफेनिल फॉस्फेट, 20 एमएम-जेड ग्लिसरो फॉस्फेट, 10 डिग्री ग्राम/एमएल एप्रोटिनिन, 0.05 एम एल/ , 1 $g/एमएल ल्यूपटिन, और 1 एम एम पी एस एफ (फेनिलमेथिलसल्फोनिल फ्लोराइड)। प्रत्येक ट्रांसफेक्टेड प्लेट के लिए लगभग 4 एमएल lysis बफर की आवश्यकता होती है।
  2. इनक्यूबेटर से ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के साथ प्लेटें निकालें। उन्हें बर्फ पर रखो.
    नोट: इस कदम से, यह एक "सामान्य" बेंच पर काम करने के लिए संभव है.
  3. मीडिया निकालें, और यह एक समर्पित ब्लीच ट्रैश में छोड़ दें.
  4. 3 एमएल ठंड पीबीएस के साथ दो बार धोएं: ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को अलग करने से बचने के लिए ड्रॉप द्वारा प्लेट ड्रॉप के किनारे पर 3 एमएल पीबीएस जोड़ें, प्लेट की सतह पर फैले, पीबीएस को हटा दें और इसे छोड़ दें; इस चरण को एक बार फिर दोहराएँ. अंत में, अगले चरण के लिए lysis बफर कमजोर पड़ने को रोकने के लिए प्लेट झुकाव द्वारा ध्यान से PBS के बाकी हटा दें।
  5. ट्रांसफेक्टेड धोया कोशिकाओं पर ठंड lysis बफर के 500 डिग्री एल जोड़ें। यह सब थाली की सतह पर फैला.
  6. बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। समय-समय पर (कम से कम दो बार), प्लेट की सतह पर बफर फिर से फैल गया।
  7. कोशिकाओं स्क्रैप और उन्हें एक microcentrifuge ट्यूब में इकट्ठा.
  8. 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x g पर।
  9. एक नया microcentrifuge ट्यूब में supernatant लीजिए. यह अंश lysate (पूरे सेल निकालने) से मेल खाती है। कोशिका झिल्ली के मलबे से मेल खाती गोली को छोड़ दें।
  10. एक नया microcentrifuge ट्यूब (लगभग 50 डिग्री सेल्सियस) के लिए इस अंश के एक aliquot ले लीजिए. यह अंश "कुल अंश" या "सेल Lysate" या "पूरे सेल निकालने" कि transfected प्रोटीन पश्चिमी ब्लॉट द्वारा व्यक्त कर रहे हैं के विश्लेषण की अनुमति से मेल खाती है.
    नोट: इस बिंदु पर, नमूने सीधे पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Laemli बफर नमूना है, जो तो 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया जाता है, 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर centrifuged, और उपयुक्त एसडीएस-पेज पर लोड करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए। नमूने भी -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. प्रतिरक्षण

  1. धीरे से उचित एंटीबॉडी के साथ युग्मित agarose मोती resuspend: हा (मानव इन्फ्लूएंजा hemaglutinin), झंडा, या GFP (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) चिकनी उलटा द्वारा.
  2. मोती टिप में प्रवेश करने के लिए अनुमति देने के लिए एक micropipette से एक 200 डिग्री एल टिप के अंत में कटौती. मोती ऊपर और नीचे कई बार मोती की सही मात्रा लेने के लिए सुनिश्चित करने के लिए टिप तर करने के लिए पिपेट मोती।
  3. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 40 डिग्री सेल्सियस मोती लें।
  4. TENET के 500 $L जोड़ें (30 एमएम Tris-HCl पीएच 7.5, 120 एमएम NaCl, 5 एमएम EDTA, 1% Triton X-100) बफर. व्युत्क्रम द्वारा मिक्स. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x g पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। ध्यान से supernatant निकालें और इसे छोड़ दें. TENET के 500 $L जोड़ें. एक घूर्णन पहिया पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: TENET में यह पूर्व इनक्यूबेशन चरण गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन को कम करने और पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए अनुमति देता है।
  5. 500 डिग्री सेल्सियस लाइसिस बफर के साथ दो बार मोती धो लें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज 2 मिनट।
    2. ध्यान से supernatant बफर निकालें, और इसे छोड़ दें.
      नोट: इन धोने के चरणों के दौरान मोती aspirate करने के लिए नहीं ध्यान रखना।
    3. lysis बफर के 500 $L जोड़ें. ट्यूब को उलटकर होमोजेनीकरण करें।
    4. दोहराएँ चरण 4.5.1- 4.5.3.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। ध्यान से supernatant बफर निकालें, और इसे छोड़ दें.
  7. एक घूर्णन पहिया पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 से 4 घंटे के लिए चरण 3.9 से lysate के साथ इनक्यूबेट मोती।
  8. प्रतिरक्षापूर्वित मोती धोएं।
    नोट: इस बिंदु पर, इम्यूनोप्रिसिपेट किए गए मोती को lysis बफ़र के साथ पांच बार धोया जा सकता है, और फिर Laemli बफर के साथ euted किया जा सकता है। एल्यूएट का उपयोग पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है या -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, मोती दो बार lysis बफर के साथ धोया जा सकता है और फिर तीन बार kinase बफर के साथ प्रदर्शन करने के लिए [32P] एटीपी लेबलिंग.

5. Coimmunosisiसिस विश्लेषण

  1. lysis बफर के साथ कदम 4.7 से इम्यूनोप्रिसिपेट किए गए मोती धोएं।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटेड अपकेंद्रित्र में 1,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    2. ध्यान से supernatant निकालें, और इसे छोड़ दें.
    3. lysis बफर के 500 $L जोड़ें. ट्यूब को उलटकर होमोजेनीकरण करें।
    4. 5.1.1-5.1.3 चार बार चरणों को दोहराएँ.
  2. Elution (एल्यूशन)
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटेड अपकेंद्रित्र में 1,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    2. ध्यान से supernatant निकालें, और इसे छोड़ दें. मोती की आकांक्षा से बचने के लिए एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ supernatant की अंतिम बूँदें निकालें, और supernatant त्यागें.
    3. 4x Laemli बफर के 40 डिग्री एल जोड़ें (200 मिमी Tris/HCl पीएच 6.8, 4% एसडीएस, 40% ग्लिसरॉल, 0.5 एम जेड-mercaptoethanol, 0.02% ब्रोमोफेनोल नीले). धीरे ट्यूब दोहन द्वारा Homogenize.
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    5. कमरे के तापमान पर 10,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    6. एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ, supernatant को हटाने और यह एक नया microcentrifuge ट्यूब में इकट्ठा. यह अंश "एल्यूएट" से मेल खाता है, जिसे -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, या सीधे पश्चिमी ब्लॉट द्वारा विश्लेषित किया जा सकता है।

6. Kinase परख

  1. किनेस बफर तैयार करें: 50 एमएम HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineeessulfonic एसिड, 150 m M NaCl, 5 एमएम MgCl2, 5एमएमएम एम एन सीएल2, 50 एमएम NaF, 1 m M Na 3 VO 4, 20 m-gofsoft, $m ल्यूपटिन, और 1 एम एम पी एस एफ। प्रत्येक इम्यूनोप्रिसिएटिसिस स्थिति के लिए लगभग 2 एमएल का काइनेज बफर की आवश्यकता होती है।
  2. 500 डिग्री सेल्सियस लाइसिस बफर के साथ कदम 4.7 से दो बार इम्यूनोप्रिसिपेट किए गए मोती धोएं।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटेड अपकेंद्रित्र में 1,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    2. ध्यान से supernatant निकालें, और इसे छोड़ दें. lysis बफर के 500 $L जोड़ें. व्युत्क्रम द्वारा Homogenize.
    3. चरणों को दोहराएँ 6.2.1 और 6.2.2.
  3. 500 डिग्री सेल्सियस का काइनाज बफर के साथ तीन बार प्रतिरक्षाीकृत मोती धोएं।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटेड अपकेंद्रित्र में 1,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    2. ध्यान से supernatant निकालें, और इसे छोड़ दें. kinase बफर के 500 $L जोड़ें. व्युत्क्रम द्वारा Homogenize.
    3. चरणों को दोहराएँ 6.3.1 और 6.3.2 दो बार.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटेड अपकेंद्रित्र में 1,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  5. ध्यान से supernatant निकालें, और इसे छोड़ दें. मोती की आकांक्षा से बचने के लिए एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ supernatant की अंतिम बूँदें निकालें, और supernatant त्यागें.
  6. इम्यूनोप्रिसिपेट किए गए मोतियों में 40 डिग्री सेल्सियस का काइनाज बफर जोड़ें। धीरे ट्यूब दोहन द्वारा मोती को पुन: निलंबित.
  7. एक सुरक्षित लॉक-ट्यूब में $32पी जेड एटीपी लेबलिंग (अंतिम मात्रा 22.5 डिग्री सेल्सियस, काइनेज़ बफर के साथ पूर्ण) के लिए मिश्रण तैयार करें।
    1. 22.5 डिग्री सेल्सियल के अंतिम खंड तक पहुँचने के लिए काइनेज़ बफर का अपेक्षित आयतन जोड़ें।
    2. माइक्रोपाइपेट के 20 डिग्री एल टिप के सिरे को काटें। कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा कदम 6.6 से इम्यूनोप्रिसिपेट किए गए मोतियों को पुन: निलंबित करें। इन मोतियों में से 10 डिग्री सेल्सियस को सुरक्षित-लॉक ट्यूब में लीजिए।
    3. अंतिम एकाग्रता के 50 MM तक पहुँचने के लिए एक 10 डिग्री एम स्टॉक समाधान से एटीपी जोड़ें। इलाज नमूना की संख्या के अनुसार, kinase बफर में एटीपी के शेयर समाधान के एक कमजोर पड़ने के लिए pippette करने के लिए अनुमति देने के लिए सुझाव दिया है 1 करने के लिए 2 $L, सुनिश्चित करें कि मात्रा सही है.
    4. वर्तमान अध्ययन मामले में सब्सट्रेट (कोफिलिन या माइलिन बेसिक प्रोटीन, एमबीपी) के 2.5 डिग्री ग्राम जोड़ें।
  8. अभिक्रिया आरंभ करने के लिए 5 [Ci]32च] एटीपी (3,000 Ci/mmol) जोड़ें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मिक्स करें।
    चेतावनी: इस बिंदु से, काम सतर्क एहतियात के साथ रेडियोधर्मिता जोड़तोड़ के लिए समर्पित एक सुरक्षा जगह में किया जाना चाहिए, समर्पित सुरक्षा और उचित नियंत्रण (रेडियोएक्टिव ढाल, Geiger काउंटर, विशिष्ट अपशिष्ट इकट्ठा, व्यक्तिगत स्तन और उंगली बैज रेडियोधर्मी जोखिम का पता लगाने के लिए, फिल्टर युक्तियाँ).
  9. 30 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  10. 5x Laemli बफर के 6 डिग्री एल के साथ प्रतिक्रिया बंद करो.
  11. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी।
  12. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  13. एक एसडीएस-पेज पर लोड करें। माइग्रेशन पर आगे बढ़ें.
    नोट: ध्यान रखें कि मुक्त की फ्रंट लाइन [32पी] एटीपी प्रवास टैंक के संदूषण से बचने के लिए जेल से बाहर नहीं निकलता है।
  14. कमरे के तापमान पर जेल दाग.
    1. कांच की प्लेटों से जेल निकालें.
    2. कमरे के तापमान पर पानी में तीन स्नान के साथ आगे बढ़ें।
    3. कमरे के तापमान पर Coomasie ब्लू के साथ रात भर जेल दाग.
    4. कमरे के तापमान पर पानी के साथ कई धोने स्नान के साथ जेल को कम करें।
  15. प्लास्टिक की चादर के साथ जेल लपेटें.
  16. एक रात या अधिक के लिए एक phosphorimager स्क्रीन पर उजागर.
  17. लेबल बैंड का पता लगाने के लिए एक phosphorimager पर स्क्रीन पढ़ें.

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Representative Results

LIMK2-1 प्रोटीन संश्लेषित है
LIMK2-1 डेटाबैंक्स में उल्लेख किया है, लेकिन इस प्रकार अभी तक केवल एक कागज अपने MRNA18के अस्तित्व को दिखाया गया है. इसके दो homologs, LIMK2a और LIMK2b की तुलना में, LIMK2-1 एक अतिरिक्त सी-टर्मिनल डोमेन एक प्रोटीन Phosphatase 1 अवरोधक डोमेन (PP1i) के रूप में पहचान की है. हमने एक एंटीबॉडी तैयार किया है जो इस डोमेन के पेप्टाइड को लक्षित करता है, एमिनो अम्ल 671-684 (चित्र 1क)।
मानव प्रोटीन डेटाबेस के खिलाफ BLAST अनुसंधान से पता चला है कि केवल एक प्रोटीन, PHI-1 (फॉस्फेटेस holoenzyme अवरोध करनेवाला 1), इस 12 एमिनो एसिड अनुक्रम के साथ एक मजबूत अनुक्रम समानता है. हालांकि, PHI-1 एसडीएस-पेज जैल पर 23 केडीए में माइग्रेट करता है, जो LIMK2-1 से बहुत दूर है, जो 75 केडीए (यानी, दोनों को हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए) के आसपास स्थानांतरित होने की उम्मीद है। हम इस एंटीबॉडी को सबसे पहले HEK-293 कोशिकाओं के लिए मान्य किया या तो LIMK2-1, LIMK2a, या LIMK2b के साथ transfected और पता चला कि विरोधी PP1i एंटीबॉडी transfected LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) और हा टैग LIMK2-1) को पहचानने में सक्षम था, लेकिन पार नहीं किया transfected हा टैग LIMK2a या LIMK2b (चित्र 1B) . हम HEK कोशिकाओं में अंतर्जात LIMK2-1 के एक बैंड LIMK2 आइसोफॉर्म्स के HA-टैग संस्करणों के साथ transfected देखा (विरोधी PP1i धब्बा में एक तीर द्वारा संकेत दिया; चित्र 1B) दूसरे, हमने जाँच की कि क्या एंटी-पीपी1आई एंटीबॉडी द्वारा प्रेरित सिग्नल LIMK2-1 के लिए विशिष्ट था, जिसका उपयोग सिर्ना ने LIMK2 के तीन spliced भिन्नरूपों को लक्षित किया था (चित्र 1C)। LIMK2 siRNA की उपस्थिति में, ब्याज के बैंड में एक reproduible और महत्वपूर्ण कमी मनाया गया ( चित्र 1Cमें एक तीर द्वारा इंगित ) नियंत्रण की स्थिति की तुलना में, सुझाव है कि एंटीबॉडी LIMK2-1 के लिए विशिष्ट है. इस के बाद, हम विभिन्न सेल लाइन अर्क में LIMK2-1 का पता लगाने के लिए विरोधी PP1i एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया: HEK-293 (मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं), Hela (मानव Epithelial Cervix कोशिकाओं), और C6 (रत मस्तिष्क Glial कोशिकाओं). इन कोशिकाओं को 1% Triton एक्स-100 युक्त lysis बफर में बाधित कर रहे हैं. सिलिको विश्लेषण में प्रयोग करते हुए, LIMK2-1 को होमिनिडी प्राइमेट-विशिष्ट19दिखाया गया था। एंटी-पीपी1i एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण से पता चला कि LIMK2-1 HEK-293 और Hela में व्यक्त किया गया था, लेकिन सिलिको अध्ययन में से अपेक्षित के रूप में C6 सेल लाइनों में नहीं (चित्र 1D)। इन प्रयोगों के विभिन्न मानव ऊतकों के साथ दोहराया गया, दिखा रहा है कि LIMK2-1 प्रोटीन के स्तर के ऊतकों के आधार पर विविध: उच्चतम स्तर जिगर में पाए गए, अग्न्याशय में कम स्तर, और वृषण और फेफड़ों में सबसे कम. LIMK2-1 मस्तिष्क के ऊतकों में पता लगाने योग्य नहीं था (चित्र 1E) हम जिगर को छोड़कर सभी ऊतक नमूनों में कम आणविक वजन बैंड मनाया, शायद इन वाणिज्यिक नमूनों की lysis शर्तों के कारण पूर्ण प्रोटीन की गिरावट का सुझाव (इस lysis बफर inhibitors के एक कॉकटेल पर निर्दिष्ट नहीं होता है डेटा शीट, जो कई protease और फॉस्फेटेज inhibitors हम अपने घर में बनाया बफर में उपयोग कर रहे हैं की तुलना में कम कुशल हो सकता है). इन आंकड़ों से पता चलता है कि मानव LIMK2-1 प्रोटीन संश्लेषित है और परीक्षण ऊतकों में अलग ढंग से व्यक्त की.

LIMK2-1 अपने अपस्ट्रीम kinase रॉक के साथ सूचना का आदान-पास
LIMK2-1 homologs, LIMK2a और LIMK2b, अपस्ट्रीम kinase रॉक द्वारा विनियमित के रूप में वर्णित किया गया है. हम COimmunosiperis प्रयोगों का उपयोग कर रॉक के साथ LIMK2-1 की बातचीत का मूल्यांकन किया. HEK कोशिकाओं को सह-transfected वैक्टर एन्कोडिंग cMyc-टैग ्ड ROCK1 और या तो एक HA-टैग किए गए संस्करण के LIMK2 isoforms, या असंबंधित हा टैग प्रोटीन Larp6 के साथ transfected थे. Larp6 एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, गैर विशिष्ट बातचीत का पता लगाने की अनुमति. कोशिकाओं lysed थे और विरोधी हा इम्यूनोवेरेशन प्रदर्शन किया गया था. Lysates (पूरे सेल अर्क) और इम्यूनोप्रिसिपेट्स का विश्लेषण पश्चिमी ब्लाट द्वारा किया गया था, एंटी-एचए और एंटी-cMyc एंटीबॉडी का उपयोग कर। जैसा कि चित्र 2 में दर्शाया गया है (बाएं पैनल; Lysates), transfected सदिशों द्वारा इनकोडिंग विभिन्न प्रोटीन के प्रत्येक अच्छी तरह से व्यक्त कर रहे हैं. LIMK2 के तीन समरूप, साथ ही Larp6, कुशलता से प्रतिरक्षा कर रहे हैं (चित्र 2, नीचे सही पैनल; एल्यूएट्स)। eluates में, रॉक का पता लगाया है और इस तरह LIMK2 के तीन समरूपों के साथ coimmunoprecipitated, लेकिन Larp6 के साथ नहीं (चित्र 2, शीर्ष सही पैनल; एल्यूएट्स)। यह दर्शाता है कि रॉक LIMK2 के तीन isoforms के साथ सूचना का आदान-कहना है, विशेष रूप से नए विशेषता आइसोफॉर्म LIMK2-1 के साथ. यह सहभागिता विशिष्ट है क्योंकि नकारात्मक नियंत्रण (Larp6) ROCK के साथ सहभागिता नहीं करता है।

इसमें, हम एंटी-एचए एंटीबॉडी के साथ निष्पादित इम्यूनोप्रीसेप्शन के लिए डेटा प्रस्तुत करते हैं; हालांकि, बातचीत cMyc एंटीबॉडी के साथ संयुग्मी मोती के साथ रॉक इम्यूनोप्रिसिपेटिंग द्वारा विपरीत दिशा में परीक्षण किया जा सकता है और LIMK coimmunopreicipiniciping का पता लगाने के लिए हा एंटीबॉडी के साथ eluates का विश्लेषण.

काइनेज़ गतिविधि
अक्षुण्ण कोशिकाओं में फॉस्फो-कोफिलिन
LIMK2-1, LIMK2a और LIMK2b के होमोलॉग को फॉस्फोरिलेट कोफिलिन को दिखाया गया है, जो इसके सेरिन3 पर एक actin depolymerization कारक है। विशेष रूप से cofilin के फॉस्फो-Serine3 को लक्षित एक एंटीबॉडी का उपयोग करना, हम HEK कोशिकाओं में अंतर्जात फॉस्फो-कोफिलिन के स्तर को मापने के द्वारा LIMK2 kinase गतिविधि का अध्ययन किया LIMK2 isoforms में से एक overexpressing. HEK कक्षों को HA-टैग किए गए LIMK2 isoforms, या संगत रिक्त वेक्टर को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एन्कोड करने वालेकों के साथ ट्रांसफेक्टेड किया गया था. कोशिकाओं lysed थे, और विभिन्न lysates विरोधी phospho-Serine3 cofilin एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी Blotting द्वारा विश्लेषण किया गया. LIMK2a और LIMK2b के overexpression नियंत्रण स्थितियों के सापेक्ष फॉस्फो-कोफिलिन के स्तर में एक महत्वपूर्ण और reproducible वृद्धि प्रेरित, जबकि LIMK2-1 की उपस्थिति कोई पता लगाने योग्य प्रभाव था (चित्र 3, बाएँ पैनल).

हमने तीन LIMK2 आइसोफॉर्म्स के C-terminal YFP-टैग किए गए (Yellow Fluorescent Protein) संस्करण और N-terminal HA टैग द्वारा संभावित हस्तक्षेप को खारिज करने के लिए LIMK2-1 के अनटैग किए गए संस्करण के साथ एक ही प्रयोग दोहराया. परिणाम तीन समरूपों के HA-टैग किए गए संस्करणों का उपयोग करके प्राप्त किए गए परिणामों के समान थे (चित्र 3, सही पैनल जिसे YFP टैग किया गया संस्करण दिखाया गया है). Transfection दक्षता का आकलन किया गया था YFP-टैग संस्करण के लिए LIMK आइसोफॉर्म्स प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए बाहर शासन है कि इस परिणाम प्रोटीन अभिव्यक्ति के अंतर के कारण हो सकता है. तीन isoforms समान transfection दक्षता से पता चला: LIMK2-1 के लिए 54%, LIMK2b के लिए 49% और LIMK2b के लिए 43%.

इन विट्रो काइनेज़ परीक्षण
हम तो limK2 आइसोफॉर्म्स के kinase गतिविधि का अध्ययन इन विट्रो लेबलिंग के साथ [32P] एटीपी. चित्र 4क इस इन विट्रो लेबलिंग की सामान्य योजना को दर्शाता है। HEK कोशिकाओं को या तो एक के साथ transfected थे हा टैग संस्करणों में से एक LIMK2 आइसोफॉर्म्स या असंबंधित प्रोटीन, Larp6, जो एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. एंटी-हा इम्यूनोप्रिपेट्स की काइनेस गतिविधि को रिकॉमबिनेंट GST-cofilin का उपयोग करके मापा गया था, जो कि $32पी जेड एटीपी की उपस्थिति में एक सबस्ट्रेट के रूप में मापा गया था। हा-प्रतिरक्षा Larp6 cofilin पर कोई kinase गतिविधि दिखाया. हा-प्रतिरक्षा रूपक2a और LIMK2b फॉस्फोरिलेटिड कोफिलिन, जबकि LIMK2-1 नहीं था (चित्र 4B)। हम तीन आइसोफॉर्म्स के YFP टैग संस्करणों का उपयोग कर इसी तरह के परिणाम प्राप्त GFP-ट्रैप मोती के साथ recombinant cofilin की उपस्थिति में और [32P] एटीपी (चित्र 4D)।

हम तो परीक्षण किया है कि क्या LIMK2-1 कोई kinase गतिविधि थी या अगर cofilin पर अपनी गतिविधि बिगड़ा हुआ था. हम इन विट्रो लेबलिंग प्रयोग Myelin बुनियादी प्रोटीन (MBP), कई प्रोटीन kinases के लिए एक कुशल सब्सट्रेट का उपयोग कर दोहराया, बजाय cofilin. वहाँ नियंत्रण हालत में एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत था जब परख हा टैग संस्करणों की उपस्थिति में किया गया था: नकारात्मक नियंत्रण, हा-प्रतिरक्षा Larp6, फॉस्फोरीलेटेड MBP का एक मजबूत संकेत का उत्पादन किया, हालांकि यह एक kinase नहीं है ( चित्र 4C). हम इन प्रोटीन के YFP टैग संस्करण का उपयोग कर इस समस्या overcame. इन शर्तों के तहत, नियंत्रण में पृष्ठभूमि (केवल YFP) कम था, और अधिक विशिष्ट अध्ययन आयोजित करने की अनुमति. GFP-ट्रैप YFP-LIMK2a, LIMK2b, और LIMK2b, और LIMK2-1 MBP की ओर kinase गतिविधि दिखाया, हालांकि LIMK2-1 की गतिविधि कम थी (चित्र 4D). हालांकि, LIMK2-1 भी कम कुशलता से इन शर्तों के तहत immunoprecipitated था (Coomassie शानदार ब्लू (CBB) धुंधला और पश्चिमी Blotting देखें). इस प्रकार, तीन isoforms MBP पर तुलनीय गतिविधि दिखाया जब फॉस्फो-MBP सीबीबी धुंधला द्वारा इम्यूनोप्रिसिपेट्ड LIMK2 स्तर के लिए सामान्यीकृत किया गया था (चित्र 4D, कम पैनल). इम्यूनोप्रिसिटेट्स का विश्लेषण पश्चिमी ब्लॉट द्वारा एंटी-रॉक एंटीबॉडी का उपयोग करके यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या एमबीपी पर गतिविधि रॉक की उपस्थिति के कारण हो सकती है, जिसे LIMK2s के साथ coimmunoprecipitated किया गया होगा। हम LIMK2 इम्यूनोप्रिटिपेट्स में किसी भी रॉक सिग्नल का पता नहीं लगा सके। तो MBP फॉस्फोरिलेशन रॉक के कारण नहीं है, लेकिन LIMK2s प्रति से.

कुल मिलाकर, इन आंकड़ों से पता चलता है कि LIMK2a और LIMK2b cofilin और MBP पर इसी तरह की गतिविधियों है. हालांकि LIMK2-1 MBP की ओर kinase गतिविधि अन्य दो isoforms की तुलना में पता चलता है, cofilin इसके लिए एक अच्छा सब्सट्रेट नहीं है.

Figure 1
चित्र 1: LIMK2-1 प्रोटीन के अस्तित्व के लिए साक्ष्य. (क) मानव LIMK2 के तीन समरूपों का योजनाबद्ध आरेख। LIMK2 isoforms Entrez जीन में वर्णित हैं: LIMK2-1 (NP$001026971.1), LIMK2a (NP]005560.1), LIMK2b (NP]057952.1). LIMK2 के विभिन्न डोमेन दिखाए जाते हैं: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM' (छोटे LIM डोमेन), पीडीजेड (PSD95, Dlg1, ज़ो-1), S/P (सेरीन प्रोलाइन अमीर), Kinase '(कम kinase डोमेन), और PP1i (प्रोडोसिस 1 निरोधात्मक). विरोधी PP1i एंटीबॉडी डिजाइन के लिए चुना अनुक्रम लाल रंग में दिखाया गया है. (बी और सी) विरोधी LIMK2-1 एंटीबॉडी का सत्यापन. (B) HEK-293 कोशिकाओं untagged LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) या एक हा टैग isoforms के LIMK2-1 के साथ transfected थे. Lysates संकेत एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी Blotting द्वारा विश्लेषण किया गया. (ग) एचईके-293 कोशिकाओं को या तो LIMK2 siRNA या नियंत्रण siRNA के साथ transfected थे. Lysates पश्चिमी ब्लॉट द्वारा विश्लेषण किया गया. LIMK2-1 विभिन्न मानव कोशिका लाइनों (डी) और ऊतकों () में व्यक्त की है. HEK-293, HeLa और C6 कोशिकाओं में बाधित किया गया 1% Triton-X100 lysis बफर. ऊतक के अर्क खरीदे गए थे और उसके नमूनों का विश्लेषण पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा किया गया था। यह आंकड़ा Vallee एट अल से संशोधित किया गया था,Biochemical जर्नल, 2018, 20 http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: LIMK2 के तीन समरूप ROCK1 के साथ बातचीतकरते हैं। HEK-293 कोशिकाओं cMyc टैग ROCK1 और या तो तीन हा टैग LIMK2 आइसोफॉर्म (2-1, 2a, 2b) या असंबंधित प्रोटीन, Larp6 में से एक के साथ सह-transfected थे. Lysates और विरोधी हा इम्यूनोप्रिसिपेट्स पश्चिमी Blotting के अधीन थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: LIMK2-1 बरकरार कोशिकाओं में cofilin के प्रति कोई kinase गतिविधि है. HEK-293 कोशिकाओं या तो तीन हा टैग LIMK2 आइसोफॉर्म्स (1, 2a, 2b) या खाली माता पिता का वेक्टर, pcDNA3 (बाएं पैनल) में से एक के साथ या तो तीन YFP टैग LIMK2 isoforms या YFP अकेले (दाएं पैनल) के साथ transfected थे. Lysates पश्चिमी Blotting के अधीन थे. फास्फो-कोफिलिन बनाम कोफिलिन के अनुपात का परिमाणीकरण दाईं ओर ग्राफ में दिखाया गया है। नकली ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के फॉस्फो-कोफिलिन बनाम कोफिलिन अनुपात को 100 तक सामान्यीकृत किया गया था। प्रत्येक मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य - एसई का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा Vallee एट अल से संशोधित किया गया था, Biochemical जर्नल 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: LIMK2-1 cofilin की दिशा में इन विट्रो kinase गतिविधि नहीं है, हालांकि यह फॉस्फोरिलेट MBP. (क) विट्रो लेबलिंग में 32 पीजेड एटीपी की सामान्य योजना। () LIMK2-1 इन विट्रो में फॉस्फोरिलेट कोफिलिन नहीं करता है. HEK-293 कोशिकाओं तीन हा टैग LIMK2 आइसोफॉर्म्स (2-1, 2a, 2b) या एक असंबंधित हा टैग प्रोटीन, Larp6, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में में से किसी एक के साथ transfected थे. विरोधी हा इम्यूनोप्रिसिएटप्रोटीन और जीएसटी-कोफिलिन का उपयोग कानेज परख में किया गया था। एंटी-हा इम्यूनोप्रिसिपेटीज को एंटी-एचए इम्युनोब्लोटिंग और कोमासी ब्लू धुंधला करने के लिए भी किया गया था। (सी) हा टैग इम्यूनोवेसक्शंस एक मजबूत पृष्ठभूमि संकेत है जब MBP एक सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है. HEK-293 कोशिकाओं तीन हा टैग LIMK2 आइसोफॉर्म्स (2-1, 2a, 2b) या एक असंबंधित हा टैग प्रोटीन, Larp6, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में में से किसी एक के साथ transfected थे. विरोधी हा इम्यूनोप्रिसिपेटेड प्रोटीन और एमबीपी का उपयोग कानेज परख में किया गया था। एंटी-हा इम्यूनोप्रिसिपेटीज को एंटी-एचए इम्युनोब्लोटिंग और कोमासी ब्लू धुंधला करने के लिए भी किया गया था। (डी) तीन LIMK2 आइसोफॉर्म्स में माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी) के प्रति काइनेज गतिविधि होती है। HEK-293 कोशिकाओं या तो तीन YFP टैग LIMK2 आइसोफॉर्म्स (2-1, 2a, 2b) या अकेले YFP में से एक के साथ transfected थे. एंटी-जीएफपी इम्यूनोप्रिपेटेड LIMK2 आइसोफॉर्म्स और कोफिलिन या एमबीपी का उपयोग कानेज परख में किया गया था। एंटी-जीएफपी इम्यूनोप्रिसिपेट्स को एंटी-जीएफपी इम्यूनोब्लोटिंग और कोमासी ब्लू धुंधला करने के लिए भी किया गया था। फास्फो-कोफिलिन और फॉस्फो-एमबीपी का परिमाणीकरण नीचे ग्राफ में दिखाया गया है। एंटी-जीएफपी इम्यूनोप्रिसिपेटेड LIMK2a के साथ प्राप्त फॉस्फो-कोफिलिन स्तर को 100 तक सामान्यीकृत किया गया था। प्रत्येक मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य - एसई का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा Vallee एट अल से संशोधित किया गया था,Biochemical जर्नल, 2018, 20 http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इसमें, हमने आणविक स्तर पर एक नया प्रोटीन, LIMK2-1 की विशेषता के लिए मजबूत जैव रासायनिक उपकरणों का उपयोग किया है, जो इसके अनुक्रम के आधार पर और इसके समलॉग, LIMK2a और LIMK2b20पर एक काइनेज माना जाता है।

सबसे पहले, हम एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण का उपयोग प्रोटीन स्तर पर LIMK2-1 के अस्तित्व का प्रदर्शन किया. इस के बाद, हम upstream kinase ROCK1, जो LIMK2a और LIMK2b, LIMK2-1 के homologs को विनियमित करने के लिए जाना जाता है के साथ अपनी बातचीत का मूल्यांकन किया. अंत में, हमने एक विशिष्ट फॉस्फो-एंटीबॉडी का उपयोग करतेहुए LIMK2-1 की विट्रो में 32 पी जेड एटीपी लेबलिंग और सेलूलो में पश्चिमी ब्लाट द्वारा संभावित काइनेज़ गतिविधि का मूल्यांकन किया।

Lysis बफर संरचना
जब प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए उन्हें पश्चिमी ब्लॉट द्वारा विश्लेषण करने के लिए, विशेष देखभाल lysis बफर संरचना के संबंध में आवश्यक है. कई मापदंडों पर विचार करना होगा: (i) डिटर्जेंट प्रकार और एकाग्रता21, और (ii) प्रोटीज़ अवरोधक।

lysis बफर संरचना लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि यह संभव के रूप में ज्यादा निकालने के लिए और पश्चिमी ब्लाट द्वारा इसका पता लगाने की अनुमति देने के लिए अपने पास पूरा solubilization की सुविधा के लिए. घुलनशील प्रोटीन के लिए, हल्के शर्तों (उदाहरण के लिए, कम एकाग्रता पर एक हल्के डिटर्जेंट) अक्सर इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं। झिल्ली प्रोटीन के लिए, मजबूत शर्तों आम तौर पर अक्सर आवश्यक हैं. डिटर्जेंट की विभिन्न श्रेणियां मौजूद हैं: (i) आयनिक, जैसे सोडियम डोडिसिल सल्फेट (एसडीएस), सेटिलट्रिमिथिलमोनियम ब्रोमाइड (CTAB), (ii) गैर-आयनिक जैसे पॉलीथीन ग्लाइकोल हेक्साडेसिल ईथर (बृज), ट्राइटन, ऑक्टाइलग्लूकोसाइड (ओजी), डॉक्सिल (डीडीएम), और (डीडीएम) iii) zwitterionic जैसे 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamono]-1-propanesulfonet (CHAPS) या zwittergents. मजबूत डिटर्जेंट बातचीत को बाधित कर सकते हैं और परिसरों खो सकता है. इसके अलावा, इम्यूनोप्रीसेप्शन प्रयोगों के लिए, एंटीबॉडी गंभीर स्थितियों के प्रति संवेदनशील हो सकते हैं। इसी तरह, एंजाइम गतिविधि डिटर्जेंट की उपस्थिति से परेशान हो सकती है जो अध्ययन किए गए प्रोटीन को प्रकट या विकृत कर सकती है। इस्तेमाल किया डिटर्जेंट के प्रकार और मात्रा दोनों गुण और एक प्रोटीन की गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं. कुछ प्रोटीन के लिए, डिटर्जेंट की एकाग्रता का एक बहुत ही प्रतिबंधित रेंज प्रोटीन की गतिविधि को बनाए रखने के लिए सहन किया जाता है। इस श्रेणी के नीचे प्रोटीन अविलेय रहता है जबकि एकाग्रता की इस श्रेणी से ऊपर, प्रोटीन अब सक्रिय नहीं है।

अंतर्जात proteases द्वारा लक्ष्य प्रोटीन की गिरावट को रोकने के लिए प्रोटीज़ अवरोधकों lysis बफर करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए। प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। वे एक अध्ययन के एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि परेशानियों का सामना करना पड़ता है, तो कोई -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत स्टॉक समाधानों से समकालीन रूप से तैयार अवरोधकों के मिश्रण के उपयोग पर विचार कर सकता है। इन अवरोधकों को सेरीन और सिस्टीन प्रोटीज़ को लक्षित करना चाहिए। पीएमएसएफ (Phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड) आमतौर पर प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह जलीय समाधान में बहुत अस्थिर है और बस निष्कर्षण से पहले जोड़ा जाना चाहिए. धातुप्रोटोटिज़ को भी बाधित किया जाना चाहिए: धातु chelating अभिकर्मकों, जैसे EDTA (एथिलीनडिनिट्राइलोट्राएटिक एसिड) या EGTA (एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (2-एमिनोएथिलथेर)-tetraacetic एसिड), जो Mg2+के लिए बाध्य करते हैं, इस उद्देश्य में उपयोग किया जाता है। उनके फॉस्फोरीलेटाइज्ड और इस प्रकार सक्रिय रूप में प्रोटीन रखने के लिए, यह भी lysis बफर करने के लिए फॉस्फेटेज inhibitors जोड़ने के लिए सिफारिश की है। इन अवरोधकों क्षारीय, एसिड, serine, threonine, और tyrosine फॉस्फेट को लक्षित करना चाहिए. प्रोटीओलिसिस की दर को धीमा करने के लिए कम तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) पर कार्य करने की भी सिफारिश की जाती है।

लक्ष्य प्रोटीन
यहाँ, हम epitope टैग प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित किया. टैग (फ्लैग, हा, cMyc, GFP, आदि) का पता लगाने और प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए बहुत उपयोगी होते हैं, एंटीबॉडी और एंटीबॉडी युग्मित मोती के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और आसानी से reproduible सामग्री हैं. तथापि, टैग के आकार और स्थिति पर विचार करना होगा क्योंकि इससे लक्ष्य प्रोटीन6,7,8की गतिविधि, स्थानीयकरण या कार्य प्रभावित हो सकता है। अंतर्जात प्रोटीन के साथ काम करना भी संभव है। इस मामले में, इस विशेष प्रोटीन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग किया जाना चाहिए। वे मोती के लिए युग्मित किया जा सकता है (प्रोटिन ए या प्रोटीन जी) सहसंयोजक (क्रॉस-लिंक) या lysate के साथ और फिर मोती के साथ incubated. टैग प्रोटीन, जिसका जीन एक प्लाज्मिड पर व्यक्त किया जाता है के साथ काम करते हैं, यह जीन के mutagenesis द्वारा इस प्रोटीन का एक उत्परिवर्तित संस्करण के लिए स्विच करने के लिए आसान है. यह तो जैविक कार्यों का आकलन करने के लिए विभिन्न म्यूटेंट पर काम करने के लिए संभव है।

प्रतिरक्षण
इम्यूनोप्रिसिएंस लक्ष्य प्रोटीन5के भागीदारों को अलग करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है। lysis बफर की संरचना (विशेष रूप से डिटर्जेंट) ध्यान से बातचीत को बनाए रखने के लिए स्थापित किया जाना है (ऊपर देखें). यह दो पहचान प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए संभव है. यह अंतर्जात प्रोटीन या overexpressed प्रोटीन हो सकता है. जब प्रोटीन कम बहुतायत में व्यक्त कर रहे हैं, यह उन्हें overexpress करने के लिए मजबूत संकेत है आवश्यक हो सकता है. गैर विशेष रूप से बातचीत प्रोटीन या contaminants को दूर करने के लिए इम्यूनोप्रिसिपेट ित मोती के व्यापक washes की आवश्यकता है। प्रतिरक्षा-पूर्वानुमेय दक्षता या सह-प्रतिरक्षा-पूर्वाभासी साथी उपस्थिति का निर्धारण करने से पहले, यह जांच करना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न भागीदारों को अच्छी तरह से व्यक्त किया जाता है और पूरे सेल lysate या पश्चिमी द्वारा इनपुट अंश का विश्लेषण करके lysate में मौजूद होते हैं ब्लॉट. इसके अलावा, इम्यूनोप्रीसिप्शन प्रयोगों का उपयोग करके, लक्ष्य प्रोटीन के नए भागीदारों की पहचान करना और नए परिसरों को अलग करना भी संभव है। इन नए भागीदारों मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना जा सकता है.

इस तरह के भागीदारों लक्ष्य प्रोटीन के उत्प्रेरक के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं आगे जैविक परीक्षण के लिए अपनी पूरी गतिविधि की अनुमति. दूसरी ओर, copurified अवांछित प्रोटीन एक तर्क है कि वहाँ दो पहचान भागीदारों के बीच एक सीधा बातचीत नहीं है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इसके बजाय कि सह-प्रतिरक्षा द्वारा पता चला बातचीत किसी अन्य अज्ञात साथी के कारण है. इस विशिष्ट मामले में, एक सीधा संपर्क के बारे में सुनिश्चित करने के लिए, एक और प्रयोगात्मक डिवाइस की जरूरत है, जैसे बैक्टीरिया से शुद्ध स्तनधारी प्रोटीन पर काम कर रहे.

काइनेज़ गतिविधि
Kinase गतिविधि विभिन्न तकनीकों द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. इसमें, हमने इन विट्रो विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया है द्वारा [32पी] एटीपी लेबलिंग और पश्चिमी ब्लॉट द्वारा पूरे सेल निकालने के विश्लेषण पर एक विशिष्ट फॉस्फो-एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए। [32P] एटीपी लेबलिंग एक बहुत ही संवेदनशील और मात्रात्मक तकनीक है जो कमजोर काइनेज़ गतिविधि15का पता लगाने की अनुमति देता है। लक्ष्य सब्सट्रेट करने के लिए एटीपी से रेडियोधर्मिता शामिल एंजाइम गतिविधि का एक सीधा उपाय किया जा करने के लिए अनुमति देता है। विभिन्न लक्ष्यों पर अध्ययन किए गए प्रोटीन की काइनाज गतिविधि का आकलन करने के लिए विभिन्न उपकेन्द्रों के साथ कार्य करना संभव है। यह भी संभव है अमीनो एसिड की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण kinase गतिविधि के लिए उन्हें उत्परिवर्तित जब प्रोटीन overexpressed है. काइनेस सक्रियता को द्विसंयोजक धनायन की आवश्यकता होती है, जैसे कि डह2़़,जो किनेज बफर में उपस्थित होना होता है।

इस दृष्टिकोण का प्रमुख दोष रेडियोधर्मिता की हैंडलिंग है, जिसके लिए प्रयोगों के लिए और कचरे के संग्रह के लिए समर्पित सुविधाओं की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक विधियाँ मौजूद हैं, जैसे फ्लोरोसेंट या ल्यूमिनसेंट किट जो प्रतिक्रिया के उपोत्पादों का पता लगाते हैं, जैसे एडीपी (एडेनोसिन डाइफॉस्फेट)16. प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन भी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अध्ययन किया जा सकता है, तथापि, सामग्री की एक बड़ी राशि इन विश्लेषणों के लिए आवश्यक है. हमारे मामले में, हम अपनी दक्षता बढ़ाने के लिए केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस का उपयोग कर LIMK2 kinase गतिविधि का आकलन करने की कोशिश की, लेकिन यह दुर्भाग्य से असफल रहा था।

फॉस्फोविशिष्ट एंटीबॉडी प्रोटीन के फॉस्फोरिलेशन का अध्ययन करने के लिए एक और उपकरण हैं। व्यापक सामान्य एंटी-फॉस्फो सेरिन और टायरोसिन एंटीबॉडी मौजूद हैं, जो किसी भी प्रोटीन के फॉस्फो-सेर या फॉस्फो-टायर को पहचानने में सक्षम हैं। हाल के वर्षों में, एक लक्ष्य प्रोटीन की एक विशिष्ट फॉस्फो साइट को लक्षित एंटीबॉडी व्यापक रूप से विकसित किया गया है और आम तौर पर वे दोनों फॉस्फो समूह और आसपास के एमिनो एसिड पहचान. इस तरह के एंटीबॉडी के साथ काम शुरू करते समय विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है, क्योंकि उनकी विशिष्टता को नकारात्मक नियंत्रण के साथ उदाहरण के लिए जांच की जानी चाहिए, जैसे फॉस्फो साइट पर उत्परिवर्तित लक्ष्य प्रोटीन। जब एक एंटी-फॉस्फो एंटीबॉडी के साथ एक दाग की जांच, अवरुद्ध समाधान दूध नहीं होना चाहिए, क्योंकि इसमें फॉस्फोप्रोटीन होते हैं जो एंटीबॉडी के साथ बातचीत कर सकते हैं। बोवाइन सीरम एल्बुमिन (BSA) की सिफारिश की है, और फॉस्फेट रिलीज को रोकने के लिए अवरुद्ध समाधान में फॉस्फेट अवरोधक जोड़ा जा सकता है। नमूने जमे हुए और thawed नहीं किया जाना चाहिए, बल्कि alicots जो -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है के रूप में तैयार किया। वास्तव में, फॉस्फो संशोधन लेबिल हैं।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम ला लिग contre ले कैंसर, l'Association Neurofibromatoses एट Recklinghausen, और ला R$gion केंद्र Val de Loire द्वारा समर्थित किया गया था. प्रवाह साइटोमेट्री डेटा के लिए Aurlie Cosson और डीबोरा Casas के लिए बहुत धन्यवाद, और पांडुलिपि की पूरी तरह से proofreading के लिए Keyron Hickman-Lewis के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

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References

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