使用新激酶蛋白的强生化方法在分子水平上进行表征

Biochemistry

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Summary

我们使用强大的生化方法对一种新的激酶蛋白进行了定性:用特殊抗体对不同细胞系和组织进行西带体分析,通过共免疫沉淀实验相互作用,由西方检测到的激酶活性使用磷特异性抗体和由 β+32P+ ATP 标记的斑点。

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Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

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Abstract

广泛的全基因组测序已经确定了许多开放阅读框架(ORFs),提供了许多潜在的蛋白质。这些蛋白质可能对细胞有重要作用,并可能解开新的细胞过程。在蛋白质中,激酶是主要参与者,因为它们属于细胞信号通路,能够打开或关闭许多对细胞命运至关重要的过程,如细胞生长、分裂、分化、运动和死亡。

在这项研究中,我们重点研究了一种新的潜在激酶蛋白LIMK2-1。我们用特定的抗体证明了它的存在。我们使用共免疫沉淀实验评估其与上游调节蛋白的相互作用。共免疫沉淀是一种非常强大的技术,能够检测两个目标蛋白之间的相互作用。它也可以用来检测诱饵蛋白的新伙伴。诱饵蛋白可以通过设计到其序列的标签进行纯化,或者通过专门针对它的抗体进行纯化。然后,这些蛋白质复合物可以通过SDS-PAGE(硫酸二苯基苯甲酸钠聚丙烯酰胺凝胶)分离,并使用质谱法进行鉴定。免疫沉淀LIMK2-1也用于通过β+32P+ ATP标签在体外测试其激酶活性。这种成熟的测定可能使用许多不同的基质,诱饵的突变版本可用于评估特定残留物的作用。药理剂的作用也可以评估,因为这种技术是高度敏感和定量的。尽管如此,放射性处理需要特别小心。激酶活性也可以评估与特定抗体针对改性氨基酸的磷组。这些类型的抗体并非适用于所有磷改性残留物。

Introduction

几十年来,许多信号通路已被阐明,并表明它们参与关键的细胞过程,如细胞分裂、分化、运动、程序化细胞死亡、免疫和神经生物学。激酶在这些信号通路中起着重要作用,因为它们经常精细地调节其激活或失活,是响应外部刺激1,2,3的瞬态多功能复合物的一部分。激酶的突变和调节障碍经常导致人类疾病,因此在过去四十年中,它们已成为最重要的药物靶点之一。

在此背景下,能够检测激酶与其上游稳压器或下游基板的相互作用并识别新的合作伙伴非常重要。亲和纯化和免疫沉淀是分离蛋白质复合物5的非常强大的技术。诱饵蛋白或激酶可以标记与特定的肽序列允许使用商业珠子共价结合抗体针对肽。这种材料允许在实验6,7,8中具有很高的可重复性。内源性蛋白也可以使用直接靶饵蛋白的抗体进行免疫沉淀。抗体可能与蛋白A或蛋白GAagagarose珠子交联,或在添加赖沙之前用这些珠子孵育。莱沙缓冲液必须经过优化,使蛋白质溶解而不失去相互作用,并避免蛋白质降解。这种方法的一个主要缺点是相互作用在细胞赖沙时被检测到;因此,瞬态或弱相互作用,以及那些需要亚细胞上下文可能错过。其他技术可用于直接在细胞中工作,如接近结扎测定(PLA)9、体内交联辅助亲亲纯化(XAP)10、生物发光共振能量转移(BRET)或Fürster共振能量转移 (FRET)11,12。此外,免疫沉淀不适合确定结合的热力学常数,需要表面质原共振、等温分滴热量测定或微尺度热泳等物理技术13,14.

可使用多种技术评估激酶活性。在此,我们专注于磷特异性抗体和体外β=32P+ ATP(腺苷三磷酸)标签。磷特异性抗体针对蛋白质中特定残留物的磷酸盐修饰。它们可用于细胞裂解后西布洛特或ELISA(酶链接免疫吸附测定),用于免疫组织化学,以及使用流细胞学或免疫荧光的完整细胞。其缺点可能包括缺乏特异性,可以使用目标蛋白的突变版本进行评估,并且它们不能用于所有蛋白质。体外β=32P+ ATP标签是一种非常健壮、成熟和高度敏感的方法15。可使用免疫沉淀蛋白或重组蛋白,并测试不同的基质。药物的影响也可以评估,因为这种方法是定量的。其主要缺点是,与该方法相关的放射性需要谨慎处理。根据荧光或发光肽基质的测量,利用荧光/发光特性在磷酸化上改变的特性,也可以采用替代方法。这些方法还允许高通量,例如,在筛选可能成为目标激酶潜在抑制剂的分子时,这是必要的。事实上,激酶是制药公司追求的最大药物目标类别之一。

在这项研究中,我们重点研究了LIMK2-1蛋白(LIMK2-1代表Lin11,岛1,Mec3激酶等形2-1)。LIMK2激酶蛋白于1995年首次被描述17。通过替代拼接产生三种 LIMK2 等形:LIMK2a、LIMK2b 和 LIMK2-1。目前,LIMK2-1仅在一项研究18中描述了mRNA水平。在此,我们使用强大的生化方法在分子水平上描述这种潜在的新激酶蛋白。首先,我们证明了LIMK2-1确实是合成的。与LIMK2a和LIMK2b的两种对应物类似,它与上游激酶ROCK(Rho相关蛋白激酶)相互作用。我们显示LIMK2-1在Myelin基本蛋白(MBP)上有激酶活性,但在LIM激酶的规范基质cofilin上没有。

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Protocol

1. 转染的细胞制备

注意:细胞培养的所有步骤必须在专门的实验室中执行,并且细胞在2类微生物柜内操作。

  1. 种子HEK-293(人类胚胎肾)细胞在10 mL的DMEM(Dulbeco的改性鹰中等)的10厘米板中,辅以10%的胎儿小牛血清。在5%CO2下培养3至5天,在37°C下,直到细胞达到+90%的汇合。
  2. 使用胶原蛋白 R 处理 ± 10 厘米板,以增加细胞对塑料板的附着力。
    1. 加入5 mL的胶原蛋白R溶液,在±10 cm的板中稀释磷酸盐盐碱缓冲液(PBS)200倍。将液体覆盖在板的整个表面上。
    2. 在室温下在生物安全柜内孵育至少1小时。
    3. 去除胶原蛋白溶液,并丢弃它。加入 5 mL 的 PBS,将其铺在板面上,取出并丢弃。重复此洗涤一次。
    4. 加入8 mL的DMEM补充10%胎儿小牛血清。将准备好的盘子放在生物安全柜内。
  3. 从生物安全柜内的步骤 1.1 中取取 HEK-293 板。从盘子中取出介质,并将其丢弃在专用漂白垃圾中。加入2 mL的补用DMEM,用1 mL微管的流量冲洗细胞以分离它们,注意避免产生泡沫。
  4. 收集细胞在15 mL管,并添加4 mL的补充DMEM。使用 10 mL 移液器进行均匀化,向上和向下移液 3 次。
  5. 取2 mL的这种细胞溶液,并把它们添加到胶原蛋白处理板含有补充DMEM从步骤1.2.4。
  6. 在 5% CO2和 37 °C 下在培养箱中生长 24 小时。细胞在转染时应为50-80%的结对。

2. 瞬态转染

  1. 从盘子中取出介质,将其丢弃在专用漂白垃圾桶中,并加入 10 mL 的新鲜补充 DMEM。在制备转染混合物时,在37°C下将板放回培养箱中。
  2. 在 15 mL 管中,加入 450 μL 的 10 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA(Tris 代表 Tris(羟基甲基)氨基甲烷,EDTA 用于乙烯四乙酸溶液和 50 μL 的 2.5 M CaCl2溶液。通过反转混合。
  3. 在用专用质粒转化的液体培养体上加入10μg的质质DNA(脱氧核糖核酸)。通过反转混合。
  4. 在涡旋下平滑搅拌下,加入500 μL的BES缓冲盐水2x浓缩物(成分:BES,10.7 g/L,NaCl,16.0 g/L,Na2HPO4, 0.27 g/L;BES 代表 N、N-Bis(2-羟基乙醚)-2-氨基硫酸、N、N-Bis(2-羟基乙醚)牛磺酸)缓慢地滴落。
  5. 在生物安全柜内室温下孵育至少15分钟(最多45分钟)。不要涡旋,不要混合!非常小心地移动管子,以免干扰DNA和磷酸钙之间的复杂形成。
  6. 将板从步骤 2.1 带到安全柜。非常小心地加入DNA复合物,一滴一滴地加入板表面的细胞上。
  7. 在37°C的培养箱中孵育24至72小时。通常在48小时内达到最大的蛋白质表达。

3. 莱西斯

注:在冰上工作,用冷缓冲液防止蛋白质降解。

  1. 制备莱沙缓冲液:50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM 焦磷酸钠, 1 mM Na3VO4, 20 mM p-硝基磷酸, 20 mM β-乙二醇, 10 μg/mL 丙氨酸, 0.05 μg/m l okiaid 酸,1 μg/mL 白蛋白和1 mM PMSF(苯基硫磺酸氟化物)。每个转染板需要大约 4 mL 的莱沙缓冲液。
  2. 从培养箱中取出具有转染细胞的板。把它们放在冰上
    注: 从此步骤中,可以在"正常"工作台上工作。
  3. 取出介质,并将其丢弃在专用漂白垃圾桶中。
  4. 用3 mL的冷PBS清洗两次:在板侧滴加入3mL的PBS,以避免分离转染细胞,铺在板的表面,取出PBS并丢弃;再次重复此步骤。最后,通过倾斜板来小心地去除 PBS 的其余部分,以防止下一步的液化缓冲液稀释。
  5. 在转染过用的洗涤细胞上加入500μL的冷液化缓冲液。把它铺在盘子的表面。
  6. 在冰上孵育10分钟。不时(至少两次),再次将缓冲液铺在板的表面。
  7. 将细胞报废,并收集在微离心管中。
  8. 在 4 °C 下在 10,000 x g下离心 10 分钟。
  9. 在新的微离心管中收集上清液。此分数对应于解物(整个细胞提取物)。丢弃与细胞膜碎片对应的颗粒。
  10. 将此分数的等分收集到新的微离心管(约 50 μL)。此分数对应于"TOTAL 分数"或"细胞解酶"或"全细胞提取物",允许分析转染的蛋白质是否由西布洛特表示。
    注:此时,样品可直接用于西布洛特分析。Laemmli 缓冲液必须添加到样品中,然后在 95°C 加热 5 分钟,在 10,000 x g下离心 5 分钟,并加载到适当的 SDS-PAGE 上。样品也可储存在-80°C。

4. 免疫沉淀

  1. 通过平滑反转轻轻重新悬浮抗胶珠与适当的抗体:HA(人类流感血凝素)、旗或GFP(绿色荧光蛋白)。
  2. 从微移液器中切下 200 μL 尖端的末端,让珠子进入尖端。上下多次移珠,使尖端饱和,以确保取正确体积的珠子。
  3. 在微离心管中取40μL的珠子。
  4. 添加 500 μL 的 TENET(30 mM Tris-HCl pH 7.5、120 mM NaCl、5 mM EDTA、1% Triton X-100)缓冲液。通过反转混合。在 4 °C 下在 1,000 x g下离心 2 分钟。小心地取出上清液并丢弃它。添加 500 μL 的 TENET。在旋转的车轮上在 4°C 下孵育至少 1 小时。
    注:TENET 中的此预孵化步骤可减少非特定相互作用,从而减少背景信号。
  5. 用500 μL的莱沙缓冲液清洗珠子两次。
    1. 在 4°C 下在 1,000 x g下离心 2 分钟。
    2. 小心地取出上清缓冲液,然后丢弃它。
      注意:在这些洗涤步骤中,注意不要吸珠。
    3. 添加500 μL的莱沙缓冲液。通过反转管进行均质化。
    4. 重复步骤 4.5.1- 4.5.3。
  6. 在 4°C 下在 1,000 x g下离心 2 分钟。小心地删除上清缓冲液,并丢弃它。
  7. 在旋转轮上4°C下用步骤3.9中的解酶孵育珠2至4小时。
  8. 清洗免疫沉淀珠子。
    注:此时,免疫沉淀的珠子可用溶酶缓冲液洗涤五次,然后用莱姆利缓冲液洗净。洗液可用于西布洛特分析或储存在-80°C。或者,珠子可以使用交相缓冲液洗涤两次,然后用激酶缓冲液洗涤三次,以执行β=32P+ ATP标签。

5. 共免疫沉淀分析

  1. 使用莱沙缓冲液从步骤 4.7 中清洗免疫沉淀珠子。
    1. 在4°C的冷冻离心机中,在1,000 x g下离心2分钟。
    2. 小心地取出上清液,然后丢弃它。
    3. 添加500 μL的莱沙缓冲液。通过反转管进行均质化。
    4. 重复步骤 5.1.1-5.1.3 四次。
  2. 洗 脱
    1. 在4°C的冷冻离心机中,在1,000 x g下离心2分钟。
    2. 小心地取出上清液,然后丢弃它。用汉密尔顿注射器取出最后一滴上清液,以避免珠子的吸入,并丢弃上清液。
    3. 加入40μL的4x莱姆利缓冲液(200 mM Tris/HCl pH 6.8,4%SDS,40%甘油,0.5M β-甲基苯丙醇,0.02%溴酚蓝色)。轻轻敲击管子,使同质化。
    4. 在室温下孵育5分钟。
    5. 在室温下在10,000 x g下离心5分钟。
    6. 使用汉密尔顿注射器,取出上清液,并将其收集到新的微离心管中。此分数对应于"Eluate",它可以存储在-80°C,或由西布洛特直接分析。

6. 激酶测定

  1. 准备激酶缓冲液: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES 代表 4-(2-羟基乙)-1-管乙酸, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 50 mM M M NaF, 1 mM Na3VO4,20 mM M = -乙酸, 1μg利肽和 1 mM PMSF。每个免疫沉淀条件需要大约 2 mL 的激酶缓冲液。
  2. 用500μL的莱沙缓冲液两次从步骤4.7洗涤免疫沉淀珠子。
    1. 在4°C的冷冻离心机中,在1,000 x g下离心2分钟。
    2. 小心地去除上清液,并丢弃它。添加500 μL的莱沙缓冲液。通过反转进行均质化。
    3. 重复步骤 6.2.1 和 6.2.2。
  3. 用500μL的激酶缓冲液清洗免疫沉淀珠三次。
    1. 在4°C的冷冻离心机中,在1,000 x g下离心2分钟。
    2. 小心地去除上清液,并丢弃它。加入500μL的激酶缓冲液。通过反转进行均质化。
    3. 重复步骤 6.3.1 和 6.3.2 两次。
  4. 在4°C的冷冻离心机中,在1,000 x g下离心2分钟。
  5. 小心地去除上清液,并丢弃它。用汉密尔顿注射器取出最后一滴上清液,以避免珠子的吸入,并丢弃上清液。
  6. 向免疫沉淀珠中加入40μL激酶缓冲液。轻轻敲击管子,重新悬挂珠子。
  7. 在安全锁管中准备用于 +32P+ ATP 标签的混合物(最终体积为 22.5 μL,带激酶缓冲液)。
    1. 添加所需的激酶缓冲液体积,最终体积达到22.5 μL。
    2. 切割微管20μL尖端的末端。通过上下移液,从步骤6.6中重新悬浮免疫沉淀珠子。将这些珠子收集到安全锁管中。
    3. 从 10 μM 库存溶液中添加 ATP,达到 50 mM 的尾数浓度。根据处理的样本数量,建议稀释激酶缓冲液中的ATP库存溶液,以允许移液器1至2μL,以确保体积正确。
    4. 加入2.5μg基质(蛋白或骨髓基本蛋白,MBP,在本研究案例中)。
  8. 加入5[Ci]+32 P+ATP(3,000 Ci/mmol)以启动反应。缓慢上下移液混合。
    注意:从此时起,工作必须在专用于放射性操作的安全场所进行,并谨慎防范、专门保护和适当的控制(放射性防护罩、盖革计数器、特定废物收集、个人乳房和手指徽章检测放射性暴露,过滤提示)。
  9. 在30°C下孵育20分钟。
  10. 用 6 μL 的 5x 莱姆利缓冲液停止反应。
  11. 在 95°C 下加热 5 分钟
  12. 在室温下以10,000 x g离心5分钟。
  13. 加载到 SDS-PAGE 上。继续迁移。
    注:请注意,自由 +32P+ ATP 的前端不会退出凝胶,以避免迁移罐受到污染。
  14. 在室温下染色凝胶。
    1. 从玻璃板上取出凝胶。
    2. 在室温下在水中洗三个澡。
    3. 在室温下用库马西蓝染色凝胶过夜。
    4. 在室温下用水冲洗凝胶。
  15. 用塑料包装包裹凝胶。
  16. 在荧光仪屏幕上曝光一晚或更长时间。
  17. 读取荧光仪上的屏幕以检测标记的带。

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Representative Results

合成LIMK2-1蛋白
LIMK2-1在数据库中被提及,但到目前为止只有一篇论文表明其mRNA18的存在。与LIMK2a和LIMK2b的两个同源体相比,LIMK2-1有一个额外的C端域,被识别为蛋白磷酸酶1抑制域(PP1i)。我们设计了一种针对该领域的肽的抗体,氨基酸671-684(图1A)。
针对人类蛋白质数据库的BLAST研究表明,只有一种蛋白质,PHI-1(磷酸酶全酶抑制剂1),与这12个氨基酸序列有很强的序列相似性。然而,PHI-1在SDS-PAGE凝胶上以23 kDa迁移,远离LIMK2-1,预计它大约在75 kDa左右迁移(即,两者不应干扰)。我们首先验证了这种抗体,用于用LIMK2-1、LIMK2a或LIMK2b转染的HEK-293细胞,并表明抗PP1i抗体能够识别转染的LIMK2-1(pCMV-LIMK2-1)和HA标记LIMK2-1,但没有与转染 HA 标记 LIMK2a 或 LIMK2b (图 1B)。我们观察到HEK细胞中的内源性LIMK2-1带转染了用HA标记版本的LIMK2异构体(用反PP1i斑点中的箭头表示;图 1B.其次,我们检查了抗PP1i抗体诱导的信号是否特定于LIMK2-1,使用siRNA靶向LIMK2的三个拼接变异(图1C)。在LIMK2 siRNA的存在下,与对照条件相比,观察到兴趣带的可重复和显著减少(如图1C中的箭头所示),这表明抗体是LIMK2-1的特异性。之后,我们使用抗PP1i抗体检测不同细胞系提取物中的LIMK2-1:HEK-293(人类胚胎肾细胞)、HeLa(人类胚胎细胞)和C6(大鼠脑胶质细胞)。这些细胞在含有1%Triton X-100的莱沙缓冲液中被破坏。使用硅分析,LIMK2-1被证明是霍米尼达灵长类动物特异性19。使用抗PP1i抗体的西布洛特分析表明,LIMK2-1似乎以HEK-293和HeLa表示,但在C6细胞系中没有如在硅酸盐研究中预期的那样表示(图1D)。这些实验与各种人体组织重复,表明LIMK2-1蛋白水平因组织而异:肝脏含量最高,胰腺含量较低,睾度和肺含量最低。LIMK2-1在脑组织中无法检测到 (图1E)。我们观察到除肝脏以外的所有组织样本的分子量带较低,这表明完整蛋白质的降解可能是由于这些商业样品的开利条件(此流化缓冲液包含未在数据表,可能比我们在自制缓冲液中使用的众多蛋白酶和磷酸酶抑制剂效率更低)。这些数据表明,人类LIMK2-1蛋白在被测组织中被合成和表达的方式不同。

LIMK2-1 与其上游激酶 ROCK 相互作用
LIMK2-1同源,LIMK2a和LIMK2b,被描述为受上游激酶ROCK的调节。我们使用共免疫沉淀实验评估了LIMK2-1与ROCK的相互作用。HEK细胞与编码cMyc标记ROCK1的载体和LIMK2异构体HA标记版本或不相关的HA标记蛋白Larp6共同转染。Larp6 用作负控制,允许检测非特定相互作用。细胞被解杀,并进行了抗HA免疫沉淀。利用抗HA和抗cMyc抗体,用西布洛特分析莱沙(全细胞提取物)和免疫沉淀物。如图2所示(左侧面板;透脂),转染载体编码的每个不同蛋白质都表达得很好。LIMK2和Larp6的三种等同形式是有效的免疫沉淀(图2,右下角面板;埃卢特)。在 eluates 中,ROCK 被检测到,因此与 LIMK2 的三个同种体共同免疫,但不与 Larp6(2,右上角面板);埃卢特)。这表明ROCK与LIMK2的三个等体相互作用,特别是与新特征的等形LIMK2-1相互作用。这种交互是特定的,因为负对照 (Larp6) 不与 ROCK 交互。

在这里,我们提供与抗HA抗体进行的免疫沉淀数据;然而,通过免疫沉淀ROCK与cMyc抗体结合的珠子,并分析与HA抗体的eluate物,以检测LIMK共免疫沉淀,可以相反的方向测试相互作用。

激酶活动
完整细胞中的磷-cofilin
LIMK2-1、LIMK2a和LIMK2b的同源物已被证明在其Serine3上磷酸化cofilin,一种行为素去聚合因子。我们使用专门针对cofilin磷-Serine3的抗体,通过测量HEK细胞中过度表达LIMK2异构体之一的内源性磷-cofilin水平,研究了LIMK2激酶活性。HEK 细胞被转染,用矢量编码其中一个 HA 标记 LIMK2 异构体,或相应的空矢量作为负对照。细胞被解杀,用抗磷-Serine3cofilin抗体对不同的酶酸盐进行分析。LIMK2a和LIMK2b的过度表达导致磷脂蛋白水平相对于控制条件显著且可重复增加,而LIMK2-1的存在没有可检测的效果(图3,左面板)。

我们重复了三个 LIMK2 异形体的 C 端 YFP 标记(黄色荧光蛋白)版本和未标记版本的 LIMK2-1 的相同实验,以排除 N 端 HA 标记的可能干扰。结果与使用 HA 标记版本的三个等形的相同结果(3,显示 YFP 标记版本的右侧面板)。使用流式细胞测定法对YFP标记的LIMK异形体进行了转染效率,以排除这一结果可能是由于蛋白质表达的差异。三种异形显示类似的转染效率:LIMK2-1为54%,LIMK2b为49%,LIMK2b为43%。

体外激酶测试
然后,我们研究了LIMK2等形物的激酶活性,通过体外标记与β+32P+ ATP。图4A显示了这种体外标记的一般方案。HEK细胞被转染与LIMK2异形的HA标记版本之一或不相关的蛋白质,Larp6,这是用作阴性对照。在存在β=32P+ ATP的情况下,使用重组剂GST-cofilin作为基质测量抗HA免疫沉淀物的激酶活性。HA免疫沉淀的拉普6对cofilin没有激酶活性。HA 免疫沉淀 LIMK2a 和 LIMK2b 磷酸化 cofilin,而 LIMK2-1 没有 (图 4B)。我们使用YFP标记的三种异形免疫化版本获得了类似的结果,在重组性cofilin和β=32P+ ATP(图4D)的情况下,用GFP陷阱珠进行免疫沉淀。

然后,我们测试了LIMK2-1是否没有激酶活性,或者其在软糖上的活性是否受损。我们重复了使用Myelin基本蛋白(MBP)的体外标记实验,这是一种用于多种蛋白激酶的有效基质,而不是cofilin。当在 HA 标记版本存在的情况下执行测定时,控制条件中存在高背景信号:阴性对照 HA 免疫沉淀 Larp6 产生磷酸化 MBP 的强烈信号,尽管它不是激酶(图 4C.我们使用这些蛋白质的YFP标记版本克服了这个问题。在这些条件下,控制(仅YFP)的背景较低,允许进行更具体的研究。GFP捕获的YFP-LIMK2a、LIMK2b和LIMK2-1显示对MBP的激酶活性,尽管LIMK2-1的活动较低(图4D)。然而,LIMK2-1在这些条件下的免疫沉淀效率也较低(参见库马西亮蓝色(CBB)染色和西印)。因此,当磷-MBP通过CBB染色(图4D,下面板)归一化为免疫沉淀LIMK2水平时,三种异种在MBP上表现出类似的活性。西布洛特还用抗ROCK抗体对免疫沉淀物进行了分析,以检查MBP上的活性是否可能是由于ROCK的存在,而ROCK与LIMK2s是共免疫的。在LIMK2免疫沉淀物中,我们无法检测到任何ROCK信号。因此,MBP磷酸化不是由于ROCK,而是由于LIMK2s本身。

总体而言,这些数据表明LIMK2a和LIMK2b在软性林和MBP上也有类似的活动。虽然LIMK2-1显示对MBP的激酶活性与其他两种等形物相当,但柯菲林不是很好的基质。

Figure 1
图1:LIMK2-1蛋白存在的证据。(A) 人类 LIMK2 三个等形的原理图.在 Entrez Gene 中描述了 LIMK2 异构体:LIMK2-1 (NP_001026971.1)、LIMK2a (NP_005560.1)、LIMK2b (NP_057952.1)。显示 LIMK2 的各个域:LIM(LIN11、Isl1、Mec3)、LIM'(较短的 LIM 域)、PDZ(PSD95、Dlg1、Zo-1)、S/P(肾上腺素 Proline 丰富)、激酶(较短的激酶域)和 PP1i(蛋白磷酸酶 1 抑制)。为抗PP1i抗体设计选择的序列以红色显示。(B 和 C)抗LIMK2-1抗体的验证。(B) HEK-293细胞用未标记的LIMK2-1(pCMV-LIMK2-1)或LIMK2的HA标记异种之一转染。使用指示的抗体通过西方印迹分析莱萨茨。(C) HEK-293细胞被用LIMK2siRNA转染或对照siRNA。西布洛特对莱萨特进行了分析。LIMK2-1以各种人类细胞系 (D) 和组织 (E) 表示。HEK-293、HeLa和C6细胞在1%的Triton-X100液化缓冲液中被中断。采购组织提取物,并通过西方印迹分析其样本。这个数字是从瓦莱等人,《生物化学杂志》,2018年,http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long月20日修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:LIMK2的三个等同形式与ROCK1相互作用。HEK-293细胞与cMyc标记ROCK1和三个HA标记LIMK2异种(2-1,2a,2b)或不相关的蛋白质Larp6共同转染。莱萨特和抗HA免疫沉淀物受到西印。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:LIMK2-1在完整细胞中对凝血酶没有激酶活性。HEK-293 细胞使用三个 HA 标记 LIMK2 异种(1、2a、2b)或空的父载体 pcDNA3(左侧面板)之一,或使用三个 YFP 标记 LIMK2 等形体或 YFP 单独(右面板)之一进行转染。莱萨特受到西方的印迹。右图所示,磷-cofilin与cofilin的比例定量。模拟转染细胞的磷-cofilin与cofilin的比例被归一化为100。每个值表示三个独立实验的平均值 = SE。这个数字是从瓦莱等人,《生物化学杂志2018》,20http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:LIMK2-1对软体酶没有体外激酶活性,尽管它磷酸化MBP。(A) ATP 体外标签的一般方案 =32P+ ATP。(B) LIMK2-1在体外不磷酸酯cofilin。 HEK-293细胞被转染三个HA标记LIMK2异种(2-1,2a,2b)或不相关的HA标记蛋白,Larp6,作为阴性对照。抗HA免疫沉淀蛋白和GST-cofilin用于激酶测定。抗HA免疫沉淀物也受到抗HA免疫浸渍和库马西蓝色染色。(C) HA 标记的免疫沉淀在使用 MBP 作为基质时具有强背景信号。HEK-293细胞被转染三个HA标记LIMK2异种(2-1,2a,2b)或不相关的HA标记蛋白,Larp6,作为阴性对照。在激酶测定中使用了抗HA免疫沉淀蛋白和MBP。抗HA免疫沉淀物也受到抗HA免疫浸渍和库马西蓝色染色。(D)三种LIMK2等体对骨髓基本蛋白(MBP)有激酶活性。HEK-293细胞仅使用三个YFP标记LIMK2异形(2-1、2a、2b)或YFP中的一种进行转染。抗GFP免疫沉淀LIMK2等形物和cofilin或MBP用于激酶测定。抗GFP免疫沉淀物也受到抗GFP免疫浸渍和库马西蓝色染色。下图显示了磷-cofilin 和磷-MBP 的定量。用抗GFP免疫沉淀LIMK2a获得的磷脂-软性水平被归一化为100。每个值表示三个独立实验的平均值 = SE。这个数字是从瓦莱等人,《生物化学杂志》,2018年,http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long月20日修改。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

在这里,我们使用了强大的生化工具,在分子水平上描述一种新的蛋白质LIMK2-1,它被认为是基于其序列和同源性、LIMK2a和LIMK2b20的激酶。

首先,利用西布洛特与特定抗体的分析,在蛋白质水平上证明了LIMK2-1的存在。之后,我们评估了它与上游激酶ROCK1的相互作用,后者已知调节LIMK2a和LIMK2b,LIMK2-1的同源。最后,我们通过体外β32 P+ ATP标签和西布洛特在纤维素中使用特定的磷抗体评估了LIMK2-1的潜在激酶活性。

莱西斯缓冲组合物
当研究蛋白质,以便分析它们由西布洛特,需要特别注意有关莱沙缓冲成分。必须考虑几个参数:(一)洗涤剂类型和浓度21,和(二)蛋白酶抑制剂。

流解缓冲液组合物必须适应靶蛋白,以促进其近乎完全的溶解,以便尽可能地提取它,并允许西布洛特检测它。对于可溶性蛋白质,温和的条件(例如,低浓度的轻度洗涤剂)通常足以达到这一目的。对于膜蛋白,通常需要更坚固的条件。存在不同类别的洗涤剂:(i) 离子,如硫酸钠 (SDS)、乙酰三甲基溴铵 (CTAB)、(ii) 非离子(如聚乙烯乙二醇六聚氰胺醚 (BRIJ)、Triton、八角糖苷 (OG)、多基马尔托赛德 (DDM)iii) 电偶,如 3-*(3-巧克力多丙基)二甲基胺-1-丙酸酯 (CHAPS) 或 zwittergents。强洗涤剂可能会破坏相互作用,复合物可能会丢失。此外,对于免疫沉淀实验,抗体可能对严重情况敏感。同样,酶活性可能会受到可能展开或变性所研究的蛋白质的洗涤剂的存在。使用的洗涤剂的类型和数量都可能影响蛋白质的特性和活性。对于某些蛋白质,可以容忍非常有限的洗涤剂浓度范围,以保持蛋白质的活性。在此范围以下的蛋白质保持不溶性,而超过此浓度范围时,蛋白质不再活跃。

蛋白酶抑制剂必须添加到解液缓冲液中,以防止靶蛋白因内源性蛋白而降解。蛋白酶抑制剂鸡尾酒是市售的。它们可用作研究的起点。如果遇到麻烦,可以考虑使用从储存在-20°C的库存溶液中临时制备的抑制剂混合物。这些抑制剂必须针对丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。PMSF(苯基硫磺酸氟化物)是常用的,但它在水溶液中非常不稳定,必须在提取前添加。金属蛋白酶也应被抑制:用于此目的的金属包合试剂,如EDTA(乙酰乙酰乙二醇乙二醇(乙二醇乙二醇)-四乙酸。为了保持蛋白质的磷酸化,从而激活的形式,也建议添加磷酸酶抑制剂的莱沙缓冲液。这些抑制剂必须针对碱性、酸、丝氨酸、酪氨酸和酪氨酸磷酸酶。也建议在低温(4°C)下工作,以减缓蛋白解的速度。

靶蛋白
在这里,我们专注于表位标记的蛋白质。标签(Flag、HA、cMyc、GFP 等)对于检测和纯化蛋白质非常有用,因为抗体和抗体耦合珠子是市售的,并且易于重现。然而,标签的大小和位置必须考虑,因为这可能会影响目标蛋白6、7、8的活动、定位或功能。也可以与内源性蛋白质一起工作。在这种情况下,必须使用针对这种特定蛋白质的抗体。它们可能与珠子(蛋白A或蛋白G)共价(交叉链接)耦合,或与解结一起孵育,然后与珠子结合。当使用标记的蛋白质时,其基因在质粒上表达,很容易通过基因的突变切换到这种蛋白质的突变版本。然后,可以处理不同的突变体来评估生物功能。

免疫沉淀
免疫沉淀是一种非常强大的技术,以分离目标蛋白5的伙伴。必须仔细建立莱沙缓冲液(特别是洗涤剂)的组成,以保持相互作用(见上文)。可以检测两种识别的蛋白质之间的相互作用。它可能是内源性蛋白质或过度表达的蛋白质。当蛋白质在低丰度下表达时,为了有更强的信号,可能有必要过度表达它们。需要大量地处理免疫沉淀珠子,以去除非特有相互作用的蛋白质或污染物。在确定免疫沉淀效率或共免疫沉淀伙伴存在之前,通过分析整个细胞赖萨茨或西方的输入分数,检查不同伙伴在赖沙中是否表达良好和存在,这一点很重要。杂交。此外,利用免疫沉淀实验,还可以确定靶蛋白的新伙伴,并分离出新的复合物。这些新伙伴可以通过质谱法确定。

这种伙伴可以发挥重要作用,作为目标蛋白的活化剂,允许其充分活动进行进一步的生物测试。另一方面,共纯化的不需要的蛋白质可以用作一种论点,即两个已识别的伙伴之间没有直接的相互作用,而是通过共免疫沉淀检测到的相互作用是由于另一个未知的伙伴。在此特定情况下,为了确保直接相互作用,需要另一个实验装置,例如研究从细菌中纯化的哺乳动物蛋白质。

激酶活动
激酶活性可以通过不同的技术进行评估。本文重点研究了通过β+32 P+ATP标签进行体外分析,以及采用特定磷抗体对西布洛特的全细胞提取物分析。[] 32P+ ATP标签是一种非常敏感的定量技术,允许检测弱激酶活性15。从ATP到目标基质的放射性结合允许直接测量酶活性。可以使用不同的基质来评估所研究的蛋白质在不同靶点上的激酶活性。当蛋白质表达过度时,通过改变氨基酸来识别对激酶活性至关重要的氨基酸。激酶活性需要二价阳离子,如Mg2+,必须在激酶缓冲液中存在。

这种方法的主要缺点是放射性的处理,这需要专门的实验设施和废物收集。存在替代方法,如检测反应副产品的荧光或发光试剂盒,如ADP(二磷酸腺苷)16。蛋白质磷酸化也可以通过质谱法进行研究,但是,这些分析需要大量的材料。在我们的案例中,我们尝试使用毛细管电泳来评估 LIMK2 激酶活性,以提高我们的效率,但不幸的是没有成功。

磷酸抗体是研究蛋白质磷酸化的进一步工具。广泛的一般抗磷血清和酪氨酸抗体存在,能够识别磷-Ser或磷-Tyr的任何蛋白质。近年来,针对目标蛋白特定磷位点的抗体得到了广泛开发,通常它们能识别磷团和周围的氨基酸。当开始使用这种抗体时,需要特别小心,例如必须用阴性对照检查其特异性,例如磷基站点上突变的目标蛋白。当用抗磷抗体探测斑点时,阻断溶液不能是牛奶,因为其中含有可能与抗体相互作用的磷蛋白。建议在阻断溶液中加入磷酸酶抑制剂,以防止磷酸盐释放。样品不应冷冻和解冻,而应作为等分制备,保持在-80°C。事实上,磷的修饰是实验室的。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了癌症协会、L'L'协会神经纤维瘤病和雷克林豪森协会和瓦尔·卢瓦尔共和国中心的支持。非常感谢奥雷利·科松和德博拉·卡萨提供流式细胞学数据,感谢凯龙·希克曼-刘易斯对手稿进行彻底校对。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

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