Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Biochemistry

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Summary

Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.

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Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

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Abstract

Die umfangreiche Sequenzierung des gesamten Genoms hat viele Open Reading Frames (ORFs) identifiziert, die viele potenzielle Proteine liefern. Diese Proteine können wichtige Rollen für die Zelle spielen und neue zelluläre Prozesse entwirren. Unter den Proteinen sind Kiinasen wichtige Akteure, da sie zu Zellsignalwegen gehören und die Fähigkeit haben, viele Prozesse ein- oder auszuschalten, die für das Schicksal der Zelle entscheidend sind, wie Zellwachstum, Teilung, Differenzierung, Beweglichkeit und Tod.

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf ein neues potenzielles Kinase-Protein, LIMK2-1. Wir haben seine Existenz durch Western Blot mit einem spezifischen Antikörper demonstriert. Wir haben seine Wechselwirkung mit einem vorgelagerten regulierenden Protein anhand von Coimmunopräzipitationsexperimenten bewertet. Coimmunoprecipitation ist eine sehr leistungsfähige Technik, die in der Lage ist, die Wechselwirkung zwischen zwei Zielproteinen zu erkennen. Es kann auch verwendet werden, um neue Partner eines Köderproteins zu erkennen. Das Köderprotein kann entweder über ein auf seine Sequenz konstruiertes Tag oder über einen Antikörper gereinigt werden, der speziell auf es abzielt. Diese Proteinkomplexe können dann durch SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamidE Gel) getrennt und mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Immunpräzipitor LIMK2-1 wurde auch verwendet, um seine Kinase-Aktivität in vitro durch die ATP-Kennzeichnung zu testen. Dieser etablierte Assay kann viele verschiedene Substrate verwenden, und mutierte Versionen des Köders können verwendet werden, um die Rolle spezifischer Rückstände zu beurteilen. Die Wirkung pharmakologischer Wirkstoffe kann ebenfalls bewertet werden, da diese Technik sowohl hochsensibel als auch quantitativ ist. Dennoch erfordert die Behandlung von Radioaktivität besondere Vorsicht. Die Kinase-Aktivität kann auch mit spezifischen Antikörpern bewertet werden, die auf die Phosphogruppe der modifizierten Aminosäure abzielen. Diese Arten von Antikörpern sind nicht für alle phosphomodifizierten Rückstände kommerziell erhältlich.

Introduction

Seit vielen Jahrzehnten werden zahlreiche Signalwege aufgeklärt und ihre Beteiligung an entscheidenden zellulären Prozessen wie Zellteilung, Differenzierung, Beweglichkeit, programmiertem Zelltod, Immunität und Neurobiologie gezeigt. Kinasen spielen eine wichtige Rolle in diesen Signalwegen, da sie oft ihre Aktivierung oder Inaktivierung fein regulieren und Teil vorübergehender vielseitiger Komplexe sind, die auf äußere Reize reagieren1,2,3. Mutation und Dysregulation von Kiinasen führen oft zu Krankheiten beim Menschen, und sie sind daher zu einem der wichtigsten Drogenziele in den letzten vierzig Jahrengeworden 4.

In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Kinase-Wechselwirkung mit ihren vorgelagerten Regulatoren oder nachgelagerten Substraten erkennen zu können und neue Partner zu identifizieren. Affinitätsreinigung und Immunpräzipitation sind sehr leistungsfähige Techniken zur Isolierung von Proteinkomplexen5. Das Köderprotein oder die Ködernase kann mit einer bestimmten Peptidsequenz markiert werden, die die Verwendung von kommerziellen Perlen kovalent gekoppelt mit Antikörpern ermöglicht, die auf das Peptid abzielen. Dieses Material ermöglicht eine hohe Reproduzierbarkeit in den Experimenten6,7,8. Endogene Proteine können auch mit Antikörpern immunpräzipiert werden, die direkt auf das Köderprotein abzielen. Die Antikörper können mit Protein A oder Protein G Agarose Perlen vernetzt oder einfach mit diesen Perlen vor der Zugabe von Lysat inkubiert werden. Lysepuffer müssen optimiert werden, um eine Proteinlösung ohne Wechselwirkung zu ermöglichen und den Proteinabbau zu vermeiden. Ein großer Nachteil dieses Ansatzes ist, dass die Wechselwirkung bei der Zelllyse erkannt wird; daher können vorübergehende oder schwache Wechselwirkungen zusammen mit solchen, die einen subzellulären Kontext erfordern, übersehen werden. Andere Techniken können verwendet werden, um direkt in der Zelle zu arbeiten, wie Proximity Ligation Assay (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) oder Förster Resonance Energy Transfer (FRET)11,12. Darüber hinaus ist die Immunpräzipitation nicht geeignet, die thermodynamischen Konstanten der Bindung zu bestimmen, für die physikalische Techniken wie Surface Plasmon Resonance, Isothermale Titrationskalorimetrie oder Mikroskalige Thermophorese erforderlich sind. 13,14.

Die Kinase-Aktivität kann mit mehreren Techniken bewertet werden. Dabei konzentrierten wir uns auf phosphospezifische Antikörperund in vitro-ATP-Etikettierung (Adenosin-TriPhosphat). Phosphospezifische Antikörper zielen auf die Phosphatmodifikation eines bestimmten Rückstands innerhalb eines Proteins ab. Sie können in Western Blot oder ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) nach der Zelllyse, für die Immunhistochemie und auch auf intakten Zellen mit Durchflusszytometrie oder Immunfluoreszenz verwendet werden. Ihre Nachteile können ihr Mangel an Spezifität sein, die mit einer mutierten Version des Zielproteins bewertet werden kann, und sie sind nicht kommerziell für alle Proteine verfügbar. Die In-vitro-ATP-Kennzeichnung ist eine sehr robuste, etablierte und hochempfindliche Methode15. Immunpräzipierte oder rekombinante Proteine können verwendet werden, und verschiedene Substrate können getestet werden. Die Wirkung von Arzneimitteln kann auch bewertet werden, da diese Methode quantitativ ist. Sein Hauptnachteil ist, dass die Radioaktivität, die mit dem Ansatz verbunden ist, einen vorsichtigen Umgang erfordert. Alternative Methoden sind auch möglich, basierend auf der Messung von fluoreszierenden oder lumineszierenden Peptidsubstraten und unter Ausnutzung veränderter fluoreszierender/lumineszierender Eigenschaften bei phosphorylierter Phosphorylierung. Solche Methoden ermöglichen auch einen hohen Durchsatz, der z. B. beim Screening von Molekülen erforderlich ist, die potenzielle Inhibitoren der Zielkinase sein können. Tatsächlich stellen Kinasen eine der größten Klassen von Arzneimittelzielen dar, die von Pharmaunternehmen verfolgt werden16.

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf das LIMK2-1 Protein (LIMK2-1 steht für Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). Das LIMK2-Kinase-Protein wurde erstmals1995 17 beschrieben. Durch alternatives Spleißen werden drei Isoformen von LIMK2 hergestellt: LIMK2a, LIMK2b und LIMK2-1. Derzeit wurde LIMK2-1 nur auf mRNA-Ebene in einer einzigen Studie18beschrieben. Hierbei charakterisieren wir dieses potentielle neue Kinase-Protein auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen. Erstens zeigen wir, dass LIMK2-1 tatsächlich synthetisiert ist. Ähnlich wie seine beiden Pendants LIMK2a und LIMK2b interagiert es mit der vorgelagerten Kinase ROCK (Rho-assoziierte Proteinkinase). Wir zeigen, dass LIMK2-1 eine Kinase-Aktivität auf Myelin Basic Protein (MBP) hat, aber nicht auf Cofilin, dem kanonischen Substrat von LIM-Kinasen.

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Protocol

1. Zellvorbereitung zur Transfektion

VORSICHT: Alle Schritte der Zellkultur müssen in einem speziellen Labor durchgeführt werden, und Zellen werden in einem mikrobiologischen Schrank der Klasse 2 manipuliert.

  1. Samen HEK-293 (Human Embryonic Kidney) Zellen in 10 cm Platten in 10 ml DMEM (Dulbecco es Modified Eagles Medium) ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum. Kultur für 3 bis 5Tage unter 5% CO2 , bei 37 °C, bis die Zellen 90% Zusammenfluss erreichen.
  2. Behandeln Sie platten von 10 cm mit Kollagen R, um die Zellhaftung an den Kunststoffplatten zu erhöhen.
    1. Fügen Sie 5 ml einer Lösung von Kollagen R, 200-fach in Phosphat-Saline-Puffer (PBS) in einer Platte von 10 cm verdünnt. Überlagern Sie die Flüssigkeit über die gesamte Oberfläche der Platte.
    2. Bei Raumtemperatur mindestens 1 h im Biosicherheitsschrank inkubieren.
    3. Entfernen Sie die Kollagenlösung, und entsorgen Sie sie. Fügen Sie 5 ml PBS hinzu, verteilen Sie es über die gesamte Oberfläche der Platte, entfernen Sie sie und entsorgen Sie sie. Wiederholen Sie diese Wäsche einmal.
    4. Fügen Sie 8 ml DMEM hinzu, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum. Bewahren Sie die vorbereiteten Platten im Biosicherheitsschrank auf.
  3. Nehmen Sie DIE HEK-293-Platten aus Schritt 1.1 innerhalb des Biosicherheitsschranks. Entfernen Sie das Medium von den Platten und entsorgen Sie es in einem speziellen Bleichmüll. Fügen Sie 2 ml ergänztes DMEM hinzu, und spülen Sie die Zellen, um sie mit dem Fluss einer 1 ml Mikropipette zu lösen, wobei Darauf zu achten ist, dass Schaum vermieden wird.
  4. Sammeln Sie die Zellen in einem 15 ml Rohr und fügen Sie 4 ml ergänztes DMEM hinzu. Homogenisieren Sie mit einer 10 ml Pipette, indem Sie 3 Mal nach oben und unten pfeifen.
  5. Nehmen Sie 2 ml dieser Zelllösung und fügen Sie sie zu kollagenbehandelten Platten hinzu, die ergänztes DMEM ab Schritt 1.2.4 enthalten.
  6. Wachsen Sie 24 Stunden im Inkubator bei 5% CO2 und 37 °C. Die Zellen sollten zum Zeitpunkt der Transfektion 50-80% konfluent sein.

2. Transiente Transfektionen

  1. Entfernen Sie das Medium von den Platten, entsorgen Sie es in einem speziellen Bleichmüll und fügen Sie 10 ml frisch ergänztes DMEM hinzu. Legen Sie die Platten bei 37 °C wieder in den Inkubator, während Sie die Transfektionsmischung vorbereiten.
  2. In einem 15 ml-Rohr 450 l einer 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris steht für Tris(Hydroxymethyl)aminomethan und EDTA für Ethylenedinitrilotetraessigsäure) und 50 l einer 2,5 M CaCl 2-Lösung. Mix durch Inversion.
  3. Fügen Sie 10 g plasmidische DNA (Deoxyribonukleinsäure) hinzu, die aus einer Midi-Zubereitung auf einer flüssigen Bakterienkultur hergestellt wird, die mit dem speziellen Plasmid transformiert wird. Mix durch Inversion.
  4. Unter glatter Rührung auf einem Wirbel 500 l BES gepuffertes Saline-2x-Konzentrat hinzufügen (Zusammensetzung: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, Na2HPO4, 0,27 g/l; BES steht für N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonsäure, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) langsam Tropfen für Tropfen.
  5. Mindestens 15 min (bis zu 45 min) bei Raumtemperatur im Biosicherheitsschrank inkubieren. Wirbel nicht, nicht mischen! Bewegen Sie die Rohre sehr vorsichtig, um die komplexe Bildung zwischen DNA und Calciumphosphat nicht zu stören.
  6. Nehmen Sie die Platten von Schritt 2.1 bis zum Sicherheitsschrank. Fügen Sie die DNA-Komplexe sehr sorgfältig, Tropfen für Tropfen, auf die Zellen auf der ganzen Oberfläche der Platte.
  7. 24 bis 72 Stunden im Inkubator bei 37 °C inkubieren. In der Regel wird die maximale Proteinexpression innerhalb von 48 Stunden erreicht.

3. Lysis

HINWEIS: Arbeiten Sie auf Eis und mit kalten Puffern, um den Proteinabbau zu verhindern.

  1. Vorbereiten des Lysepuffers: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Na3VO4, 20 mMP p-Nitrophenylphosphat, 20 mM , 1 g/ml Leupeptin und 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid). Für jede transfizierte Platte werden ca. 4 ml Lysepuffer benötigt.
  2. Entfernen Sie Platten mit transfizierten Zellen aus dem Inkubator. Legen Sie sie auf Eis.
    HINWEIS: Ab diesem Schritt ist es möglich, auf einer "normalen" Bank zu arbeiten.
  3. Entfernen Sie das Medium, und entsorgen Sie es in einem speziellen Bleichmüll.
  4. Zweimal mit 3 ml kaltem PBS waschen: 3 ml PBS auf der Seite der Platte Tropfen für Tropfen hinzufügen, um zu vermeiden, transfizierte Zellen zu lösen, über die gesamte Oberfläche der Platte zu verteilen, PBS zu entfernen und zu entsorgen; Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Entfernen Sie am Ende vorsichtig den Rest von PBS, indem Sie die Platte kippen, um eine Verdünnung des Lysepuffers für den nächsten Schritt zu verhindern.
  5. Fügen Sie 500 l kaltlysePuffer auf die transfizierten gewaschenen Zellen hinzu. Verteilen Sie es über die gesamte Oberfläche der Platte.
  6. 10 min auf Eis bebrüten. Von Zeit zu Zeit (mindestens zweimal) den Puffer wieder über die Oberfläche der Platte verteilen.
  7. Verschrotten Sie die Zellen und sammeln Sie sie in einem Mikrozentrifugenrohr.
  8. Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g bei 4 °C.
  9. Sammeln Sie Überstand in einem neuen Mikrozentrifugenrohr. Dieser Anteil entspricht dem Lysat (Vollzellextrakt). Entsorgen Sie das Pellet, das Zellmembranablagerungen entspricht.
  10. Sammeln Sie ein Aliquot dieser Fraktion in einem neuen Mikrozentrifugenrohr (ca. 50 l). Dieser Anteil entspricht der "TOTAL-Fraktion" oder "Zelllysat" oder "Ganzzellextrakt", die eine Analyse ermöglicht, ob transfizierte Proteine durch Western Blot exprimiert werden.
    HINWEIS: An dieser Stelle können Proben direkt für Western Blot-Analysen verwendet werden. Der Laemmli-Puffer muss der Probe zugesetzt werden, die dann bei 95 °C für 5 min erhitzt, bei 10.000 x g für 5 min zentrifugiert und auf entsprechende SDS-PAGE geladen wird. Proben können auch bei -80 °C gelagert werden.

4. Immunitizipation

  1. Heben Sie Agaroseperlen in Verbindung mit dem entsprechenden Antikörper sanft aus: HA (Human Influenza Hemagglutinin), Flag oder GFP (Green Fluorescent Protein) durch sanfte Inversion.
  2. Schneiden Sie das Ende einer 200-L-Spitze aus einer Mikropipette, damit Perlen in die Spitze gelangen können. Pipette die Perlen auf und ab mehrmals, um die Spitze zu sättigen, um sicherzustellen, dass das richtige Volumen der Perlen zu nehmen.
  3. Nehmen Sie 40 L Perlen in einem Mikrozentrifugenrohr ein.
  4. Fügen Sie den TENET-Puffer (30 mM Tris-HCl pH 7.5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) um 500 l zu. Mix durch Inversion. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g bei 4 °C. Entfernen Sie sorgfältig Überstand und entsorgen Sie es. Fügen Sie 500 L VON TENET hinzu. Mindestens 1 Stunde bei 4 °C auf einem rotierenden Rad inkubieren.
    HINWEIS: Dieser Schritt vor der Inkubation in TENET ermöglicht es, unspezifische Interaktionen zu reduzieren und so das Hintergrundsignal zu verringern.
  5. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 500 l Lysepuffer.
    1. Zentrifuge 2 min bei 1.000 x g bei 4°C.
    2. Entfernen Sie sorgfältig Überstand Puffer, und verwerfen Sie es.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, während dieser Waschschritte keine Perlen zu aspirieren.
    3. Fügen Sie 500 L Lysepuffer hinzu. Homogenisieren Sie durch Invertieren des Rohres.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 4.5.1- 4.5.3.
  6. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g bei 4°C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstandspuffer, und verwerfen Sie ihn.
  7. Inkubieren Sie Perlen mit dem Lysat von Schritt 3.9 für 2 bis 4 Stunden bei 4 °C auf einem rotierenden Rad.
  8. Waschen Sie immunvorzipitierte Perlen.
    HINWEIS: An dieser Stelle können die immunpräzipierten Perlen fünfmal mit dem Lysepuffer gewaschen und dann mit dem Laemmli-Puffer eluiert werden. Das Eluat kann für Western Blot-Analysen verwendet oder bei -80 °C gelagert werden. Alternativ können Perlen zweimal mit dem Lysepuffer und dann dreimal mit dem Kinase-Puffer gewaschen werden, um die ATP-Kennzeichnung von32P durchzuführen.

5. Coimmunozipitationsanalysen

  1. Immunpräzipitierte Perlen ab Schritt 4.7 mit dem Lysepuffer waschen.
    1. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn.
    3. Fügen Sie 500 L Lysepuffer hinzu. Homogenisieren Sie durch Invertieren des Rohres.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1-5.1.3 viermal.
  2. Elution
    1. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Entfernen Sie die letzten Tropfen des Überstandes mit einer Hamilton-Spritze, um das Streben der Perlen zu vermeiden, und entsorgen Sie den Überstand.
    3. 40 L 4x Laemmli Puffer hinzufügen (200 mM Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% Glycerin, 0,5 M '-Mercaptoethanol, 0.02% Bromophenolblau). Homogenisieren Sie durch sanftes Antippen des Rohres.
    4. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Zentrifuge für 5 min bei 10.000 x g bei Raumtemperatur.
    6. Mit einer Hamilton-Spritze den Überstand entfernen und in einem neuen Mikrozentrifugenrohr sammeln. Dieser Anteil entspricht dem "Eluat", das bei -80 °C gelagert oder direkt von Western Blot analysiert werden kann.

6. Kinase-Assay

  1. Bereiten Sie den Kinasepuffer vor: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES steht für 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 20 mM bei Glycerophosphat, 1 g/mL Leupeptin und 1 mM PMSF. Für jede Immunpräzipitationsbedingung werden ca. 2 ml des Kinasepuffers benötigt.
  2. Waschen Sie immunpräzipierte Perlen aus Schritt 4.7 zweimal mit 500 l Lysepuffer.
    1. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie 500 L Lysepuffer hinzu. Homogenisieren durch Inversion.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.1 und 6.2.2.
  3. Waschen Sie immunpräzipierte Perlen dreimal mit 500 l Kinasepuffer.
    1. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie 500 l Kinase-Puffer hinzu. Homogenisieren durch Inversion.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 6.3.1 und 6.3.2 zweimal.
  4. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C.
  5. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Entfernen Sie die letzten Tropfen des Überstandes mit einer Hamilton-Spritze, um das Streben der Perlen zu vermeiden, und entsorgen Sie den Überstand.
  6. Fügen Sie den immunvoreiligen Perlen 40 L Kinasepuffer hinzu. Setzen Sie die Perlen wieder auf, indem Sie sanft auf das Rohr tippen.
  7. Bereiten Sie die Mischungfür die ATP-Etikettierung von 32 P in einem sicheren Verriegelungsrohr vor (Endvolumen beträgt 22,5 l, komplett mit Kinase-Puffer).
    1. Fügen Sie das erforderliche Volumen des Kinasepuffers hinzu, um ein Endvolumen von 22,5 l zu erreichen.
    2. Schneiden Sie das Ende einer 20-L-Spitze einer Mikropipette. Setzen Sie die immunpräzipierten Perlen aus Schritt 6.6 wieder auf, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen. Sammeln Sie 10 L dieser Perlen in das Safe-Lock-Rohr.
    3. Fügen Sie ATP aus einer 10-M-Lagerlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 50 mM zu erreichen. Je nach Anzahl der behandelten Proben wird eine Verdünnung der ATP-Stammlösung im Kinase-Puffer vorgeschlagen, um pipette 1 bis 2 l zu ermöglichen, um sicherzustellen, dass das Volumen korrekt ist.
    4. Fügen Sie im vorliegenden Studienfall 2,5 g Substrat (Cofilin oder Myelin Basic Protein, MBP) hinzu.
  8. Fügen Sie 5 'Ci von '[32P] ATP (3.000 Ci/mmol) hinzu, um die Reaktion zu initiieren. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten langsam.
    VORSICHT: Ab diesem Zeitpunkt muss an einem Sicherheitsort für Radioaktivitätsmanipulationen mit vorsichtshalber Vorsicht, speziellem Schutz und geeigneten Kontrollen (radioaktive Schutzschilde, Geigerzähler, spezifische Abfallsammlung, persönliche Brust und Fingerabzeichen zur Erkennung radioaktiver Exposition, Filterspitzen).
  9. 20 min bei 30 °C inkubieren.
  10. Stoppen Sie die Reaktion mit 6 l 5x Laemmli Puffer.
  11. Erhitzen Bei 95° C für 5 min.
  12. Zentrifuge bei 10.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  13. Laden Sie eine SDS-PAGE. Fahren Sie mit der Migration fort.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dassdie Frontlinie des kostenlosen ATP das Gel nicht verlässt, um eine Kontamination des Migrationstanks zu vermeiden.
  14. Das Gel bei Raumtemperatur färben.
    1. Entfernen Sie das Gel von den Glasplatten.
    2. Fahren Sie mit drei Bädern im Wasser bei Raumtemperatur fort.
    3. Das Gel über Nacht mit Coomassie Blue bei Raumtemperatur färben.
    4. Das Gel mit mehreren Waschbädern mit Wasser bei Raumtemperatur entsalzen.
  15. Wickeln Sie das Gel mit Plastikfolie.
  16. Stellen Sie sie für eine oder mehrere Nächte auf einem Phosphorimager-Bildschirm zur Unterlegen.
  17. Lesen Sie den Bildschirm auf einem Phosphorimager, um beschriftete Bänder zu erkennen.

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Representative Results

LIMK2-1 Protein wird synthetisiert
LIMK2-1 wird in Datenbanken erwähnt, aber bisher hat nur ein Papier die Existenz seiner mRNA18gezeigt. Im Vergleich zu seinen beiden Homologen LIMK2a und LIMK2b verfügt LIMK2-1 über eine zusätzliche C-Terminal-Domäne, die als Proteinphosphatase 1 Inhibitory Domain (PP1i) identifiziert wurde. Wir haben einen Antikörper entwickelt, der auf ein Peptid dieser Domäne abzielt, Aminosäuren 671-684 (Abbildung 1A).
BLAST-Forschung enden gegen menschliche Proteindatenbanken zeigte, dass nur ein Protein, PHI-1 (Phosphatase Holoenzym-Inhibitor 1), eine starke Sequenzähnlichkeit mit dieser 12 Aminosäuresequenz hat. Allerdings migriert PHI-1 bei 23 kDa auf SDS-PAGE Gelen, weit weg von LIMK2-1, das voraussichtlich um 75 kDa migriert (d.h. die beiden sollten nicht stören). Wir validierten diesen Antikörper zunächst für HEK-293-Zellen, die entweder mit LIMK2-1, LIMK2a oder LIMK2b transfiziert wurden, und zeigten, dass der Anti-PP1i-Antikörper in der Lage war, transfizierte LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) und HA-markierte LIMK2-1 zu erkennen, mit HA-Tags LIMK2a oder LIMK2b (Abbildung 1B). Wir beobachteten ein Band von endogenen LIMK2-1 in HEK-Zellen, transfiziert mit HA-markierten Versionen der LIMK2-Isoformen (angezeigt durch einen Pfeil im Anti-PP1i-Blot; Abbildung 1B). Zweitens haben wir geprüft, ob das durch den Anti-PP1i-Antikörper induzierte Signal spezifisch für LIMK2-1 war, indem siRNA verwendet wurde, das auf die drei gespleißten Varianten von LIMK2 abzielte (Abbildung 1C). In Gegenwart von LIMK2 siRNA wurde eine reproduzierbare und signifikante Abnahme des Interessenbandes (angezeigt durch einen Pfeil in Abbildung 1C) im Vergleich zu den Kontrollbedingungen beobachtet, was darauf hindeutet, dass der Antikörper spezifisch für LIMK2-1 ist. Anschließend verwendeten wir den Anti-PP1i-Antikörper, um LIMK2-1 in verschiedenen Zelllinienextrakten zu detektieren: HEK-293 (Human Embryonic Kidney Cells), HeLa (Human Epithelial Cervix cells) und C6 (Rat Brain Glial cells). Diese Zellen werden im Lysepuffer unterbrochen, der 1% Triton X-100 enthält. Bei der Silico-Analyse wurde LIMK2-1 als Hominidae-Primaten-spezifische19nachgewiesen. Die Western Blot-Analyse mit dem Anti-PP1i-Antikörper zeigte, dass LIMK2-1 in HEK-293 und HeLa exprimiert zu sein schien, aber nicht in C6-Zelllinien, wie in Silico-Studien erwartet (Abbildung 1D). Diese Experimente wurden mit verschiedenen menschlichen Geweben wiederholt, was zeigte, dass die Konzentrationen von LIMK2-1 Protein je nach Gewebe variierten: die höchsten Konzentrationen wurden in der Leber gefunden, geringere Konzentrationen in der Bauchspeicheldrüse und die niedrigsten in den Hoden und der Lunge. LIMK2-1 war im Hirngewebe nicht nachweisbar (Abbildung 1E). Wir beobachteten niedrigere Molekulargewichtsbänder in allen Gewebeproben mit Ausnahme der Leber, was auf den Abbau des vollständigen Proteins hindeutet, wahrscheinlich aufgrund der Lysebedingungen dieser kommerziellen Proben (dieser Lysepuffer enthält einen Cocktail von Inhibitoren, die nicht auf der Datenblatt, das möglicherweise weniger effizient ist als die zahlreichen Protease- und Phosphatase-Inhibitoren, die wir in unserem hausgemachten Puffer verwenden). Diese Daten zeigen, dass menschliches LIMK2-1-Protein synthetisiert und in den getesteten Geweben unterschiedlich ausgedrückt wird.

LIMK2-1 interagiert mit seiner vorgelagerten Kinase ROCK
LIMK2-1-Homologs, LIMK2a und LIMK2b, wurden als reguliert durch die vorgeschaltete Kinase ROCK beschrieben. Wir bewerteten die Wechselwirkung von LIMK2-1 mit ROCK anhand von Coimmunopräzipitationsexperimenten. HEK-Zellen wurden mit Vektoren kodiert, die mit rock1 und entweder einer der HA-markierten Versionen von LIMK2-Isoformen oder dem nicht verwandten HA-markierten Protein Larp6 kodiert sind. Larp6 dient als Negativkontrolle, die die Erkennung unspezifischer Wechselwirkungen ermöglicht. Die Zellen wurden lysiert und Anti-HA-Immunpräzipitation durchgeführt. Lysate (ganze Zellextrakte) und Immunpräcipitate wurden von Western Blot mit Anti-HA und Anti-CMyc-Antikörpern analysiert. Wie in Abbildung 2 dargestellt (linke Bedienfelder; Lysate), jedes der verschiedenen Proteine, die von den transfizierten Vektoren kodiert werden, sind gut exprimiert. Die drei Isoformen von LIMK2 sowie Larp6 sind effizient immunwirksam (Abbildung2, untere rechte Platte; Eluates). In den Eluaten wird ROCK mit den drei Isoformen von LIMK2, nicht aber mit Larp6 (Abbildung 2, obere rechte Platte; Eluates). Dies zeigt, dass ROCK mit den drei Isoformen von LIMK2 interagiert, insbesondere mit der neu charakterisierten Isoform LIMK2-1. Diese Interaktion ist spezifisch, da die Negativkontrolle (Larp6) nicht mit ROCK interagiert.

Hierbei stellen wir Daten für die Immunpräzipitation mit Anti-HA-Antikörpern vor; Die Wechselwirkung kann jedoch in die entgegengesetzte Richtung getestet werden, indem ROCK mit mit cMyc-Antikörpern konjugierten Perlen immunpräzipiert und Eluate mit HA-Antikörpern analysiert werden, um LIMK-Coimmunzipitantizipation zu erkennen.

Kinase-Aktivität
Phospho-Cofilin in intakten Zellen
Die Homologe von LIMK2-1, LIMK2a und LIMK2b haben gezeigt, dass Cofilin, ein Actin-Depolymerisationsfaktor, auf seinem Serin3 phosphoryliert wird. Mit einem Antikörper, der speziell auf das Phospho-Serin3 von Cofilin abzielte, untersuchten wir die LIMK2-Kinase-Aktivität, indem wir den Gehalt an endogenem Phospho-Cofilin in HEK-Zellen überexziert haben, das eine der LIMK2-Isoformen überexzessiert. HEK-Zellen wurden mit Vektoren transfiziert, die entweder eine der HA-markierten LIMK2-Isoformen oder den entsprechenden leeren Vektor als Negativkontrolle kodieren. Die Zellen wurden lysiert, und die verschiedenen Lysate wurden durch Western Blotting mit dem Anti-Phospho-Serin3-Cofilin-Antikörper analysiert. Die Überexpression von LIMK2a und LIMK2b führte zu einem signifikanten und reproduzierbaren Anstieg der Phospho-Cofilin-Spiegel im Verhältnis zu den Kontrollbedingungen, während das Vorhandensein von LIMK2-1 keine nachweisbare Wirkung hatte (Abbildung3, linkes Panel).

Wir wiederholten das gleiche Experiment mit einer C-terminalen YFP-getaggten (Yellow Fluorescent Protein) Version der drei LIMK2 Isoformen und einer nicht markierten Version von LIMK2-1, um mögliche Interferenzen durch das N-Terminal HA-Tag auszuschließen. Die Ergebnisse waren identisch mit denen, die mit HA-markierten Versionen der drei Isoformen erzielt wurden (Abbildung3, rechtes Bedienfeld mit der YFP-markierten Version). Die Transfektionseffizienz wurde für die YFP-markierte Version von LIMK-Isoformen unter Verwendung der Durchflusszytometrie bewertet, um auszuschließen, dass dieses Ergebnis möglicherweise auf eine unterschiedliche Proteinexpression zurückzuführen ist. Die drei Isoformen zeigten eine ähnliche Transfektionseffizienz: 54% für LIMK2-1, 49% für LIMK2b und 43% für LIMK2b.

In-vitro-Kinase-Tests
Anschließend untersuchten wir die Kinase-Aktivität der LIMK2-Isoformendurch In-vitro-Etikettierung mit ATP. Abbildung 4A zeigt das allgemeine Schema dieser In-vitro-Etikettierung. HEK-Zellen wurden entweder mit einer der HA-markierten Versionen der LIMK2-Isoformen oder dem nicht verwandten Protein Larp6 transfiziert, das als Negativkontrolle verwendet wurde. Die Kinase-Aktivität der Anti-HA-Immunpräcipitate wurde mit rekombinantem GST-Cofilin als Substrat in Gegenwart von ATP mit32P gemessen. HA-immunpräzipitiertes Larp6 zeigte keine Kinaseaktivität auf Cofilin. HA-immunpräzipiertelimisierteLIMK2a und LIMK2b phosphoryliertes Cofilin, während LIMK2-1 nicht (Abbildung4B). Ähnliche Ergebnisse erzielten wir mit YFP-markierten Versionen der drei Isoformen, die mit GFP-Trap-Perlen in Gegenwart von rekombinantem Cofilin immunpräzipiert wurden, und mit ATP mit32P (Abbildung 4D).

Wir testeten dann, ob LIMK2-1 keine Kinase-Aktivität hatte oder ob seine Aktivität auf Cofilin beeinträchtigt war. Wir wiederholten das In-vitro-Etikettierungsexperiment mit Myelin Basic Protein (MBP), einem effizienten Substrat für zahlreiche Proteinkiinasen, anstelle von Cofilin. Es gab ein hohes Hintergrundsignal in der Kontrollbedingung, wenn der Test in Gegenwart von HA-markierten Versionen durchgeführt wurde: die Negativkontrolle, HA-immunoprecipitated Larp6, erzeugte ein starkes Signal von phosphoryliertem MBP, obwohl es sich nicht um eine Kinase handelt ( Abbildung 4C). Wir haben dieses Problem mit der YFP-markierten Version dieser Proteine überstanden. Unter diesen Bedingungen war der Hintergrund in der Kontrolle (YFP allein) gering, so dass spezifischere Studien durchgeführt werden konnten. GFP-trapped YFP-LIMK2a, LIMK2b und LIMK2-1 zeigten Kinaseaktivität in Richtung MBP, obwohl die Aktivität von LIMK2-1 geringer war (Abbildung 4D). Allerdings wurde LIMK2-1 unter diesen Bedingungen auch weniger effizient immunprezipiert (siehe Coomassie Brilliant Blue (CBB) Färbung und Western Blotting). So zeigten die drei Isoformen eine vergleichbare Aktivität auf MBP, als Phospho-MBP durch CBB-Färbung auf immunpräzipierte LIMK2-Spiegel normalisiert wurde (Abbildung4D, unteres Panel). Immunpräcipitates wurden auch von Western Blot mit Anti-ROCK-Antikörpern analysiert, um zu überprüfen, ob die Aktivität auf MBP auf das Vorhandensein von ROCK zurückzuführen sein könnte, das mit LIMK2s koimmunisiert worden wäre. Wir konnten kein ROCK-Signal in LIMK2-Immunpräcipitaten erkennen. Die MBP-Phosphorylierung ist also nicht auf ROCK zurückzuführen, sondern auf LIMK2s per se.

Insgesamt zeigen diese Daten, dass LIMK2a und LIMK2b ähnliche Aktivitäten auf Cofilin und MBP haben. Obwohl LIMK2-1 eine Kinaseaktivität gegenüber MBP zeigt, die mit der der beiden anderen Isoformen vergleichbar ist, ist Cofilin kein gutes Substrat dafür.

Figure 1
Abbildung 1: Nachweis für die Existenz des LIMK2-1-Proteins. (A) Schematische Darstellung der drei Isoformen des menschlichen LIMK2. LIMK2 Isoformen sind in Entrez Gene beschrieben: LIMK2-1 (NP_001026971.1), LIMK2a (NP_005560.1), LIMK2b (NP_057952.1). Gezeigt werden die verschiedenen Bereiche von LIMK2: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM' (kürzere LIM-Domäne), PDZ (PSD95, Dlg1, Zo-1), S/P (Serin proline rich), Kinase' (kürzere Kinase-Domäne) und PP1i (Protein Phosphatase 1 hemmend). Die für das Anti-PP1i-Antikörperdesign gewählte Sequenz ist rot dargestellt. (B und C) Validierung des Anti-LIMK2-1-Antikörpers. (B) HEK-293-Zellen wurden mit nicht markiertem LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) oder einer der HA-markierten Isoformen von LIMK2 transfiziert. Lysate wurden von Western Blotting mit den angegebenen Antikörpern analysiert. (C) HEK-293-Zellen wurden entweder mit LIMK2 siRNA oder KontrollsiRNA transfiziert. Lysate wurden von Western Blot analysiert. LIMK2-1 wird in verschiedenen menschlichen Zelllinien (D) und Geweben (E) exprimiert. HEK-293, HeLa und C6 Zellen wurden in 1% Triton-X100 Lyse Puffer gestört. Gewebeextrakte wurden gekauft und Proben davon wurden von Western Blotting analysiert. Diese Zahl wurde von Vallee et al., The Biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die drei Isoformen von LIMK2 interagieren mit ROCK1. HEK-293-Zellen wurden mit cMyc-tagged ROCK1 und entweder einer der drei HA-markierten LIMK2-Isoformen (2-1, 2a, 2b) oder dem nicht verwandten Protein Larp6 kotransfiziert. Lysate und Anti-HA-Immunpräcipitate wurden Western Blotting unterzogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: LIMK2-1 hat keine Kinase-Aktivität gegenüber Cofilin in intakten Zellen. HEK-293-Zellen wurden entweder mit einer der drei HA-markierten LIMK2-Isoformen (1, 2a, 2b) oder dem leeren Elternvektor pcDNA3 (linkes Panel) oder mit einer der drei YFP-markierten LIMK2-Isoformen oder yFP allein (rechtes Panel) transfiziert. Lysate wurden dem westlichen Blotting unterworfen. Die Quantifizierung des Verhältnisses von Phospho-Cofilin zu Cofilin ist in der Grafik rechts dargestellt. Das Phospho-Cofilin-Verhältnis von verspotteten transfizierten Zellen wurde auf 100 normalisiert. Jeder Wert stellt den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten dar. Diese Zahl wurde von Vallee et al., The Biochemical Journal 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: LIMK2-1 hat keine In-vitro-Kinase-Aktivität in Richtung Cofilin, obwohl es MBP phosphoryliert. (A) AllgemeinesSchema der IN-vitro-Etikettierung von ATP. (B) LIMK2-1 phosphoryliert Cofilin nicht in vitro. HEK-293-Zellen wurden entweder mit einer der drei HA-markierten LIMK2-Isoformen (2-1, 2a, 2b) oder einem nicht verwandten HA-markierten Protein Larp6 als Negativkontrolle transfiziert. Anti-HA immunpräzipierte Proteine und GST-Cofilin wurden im Kinase-Assay verwendet. Die Anti-HA-Immunpräcipitate wurden auch Anti-HA-Immunoblotting und Coomassie-Blaufärbung unterzogen. (C) HA-markierte Immunpräzipitation hat ein starkes Hintergrundsignal, wenn MBP als Substrat verwendet wird. HEK-293-Zellen wurden entweder mit einer der drei HA-markierten LIMK2-Isoformen (2-1, 2a, 2b) oder einem nicht verwandten HA-markierten Protein Larp6 als Negativkontrolle transfiziert. Anti-HA immunpräzipierte Proteine und MBP wurden im Kinase-Assay verwendet. Die Anti-HA-Immunpräcipitate wurden auch Anti-HA-Immunoblotting und Coomassie-Blaufärbung unterzogen. (D) Die drei LIMK2-Isoformen haben Kinase-Aktivität in Richtung Myelin Basic Protein (MBP). HEK-293-Zellen wurden entweder mit einer der drei YFP-markierten LIMK2-Isoformen (2-1, 2a, 2b) oder YFP allein transfiziert. Anti-GFP immunpräzipierte LIMK2-Isoformen und Cofilin oder MBP wurden im Kinase-Assay verwendet. Die Anti-GFP-Immunpräcipitate wurden auch Anti-GFP-Immunoblotting und Coomassie-Blaufärbung unterzogen. Die Quantifizierung von Phospho-Cofilin und Phospho-MBP ist im unteren Graphen dargestellt. Phospho-Cofilin-Spiegel mit Anti-GFP-immunpräzipitiertlimisiert LIMK2a wurden auf 100 normalisiert. Jeder Wert stellt den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten dar. Diese Zahl wurde von Vallee et al., The Biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Hierbei haben wir robuste biochemische Werkzeuge eingesetzt, um auf molekularer Ebene ein neues Protein, LIMK2-1, zu charakterisieren, von dem angenommen wird, dass es sich um eine Kinase handelt, die auf ihrer Sequenz und ihren Homologen LIMK2a und LIMK2b20basiert.

Erstens haben wir die Existenz von LIMK2-1 auf Proteinebene anhand der Western Blot-Analyse mit einem spezifischen Antikörper nachgewiesen. Anschließend evaluierten wir seine Wechselwirkung mit der vorgelagerten Kinase ROCK1, die bekanntermaßen LIMK2a und LIMK2b, die Homologe von LIMK2-1, reguliert. Schließlich bewerteten wir die potentielle Kinase-Aktivität von LIMK2-1 durch in vitro- [32P] ATP-Kennzeichnung und in Cellulo durch Western Blot mit einem spezifischen Phospho-Antikörper.

Lysis-Pufferzusammensetzung
Bei der Untersuchung von Proteinen, um sie durch Western Blot zu analysieren, ist besondere Sorgfalt in Bezug auf die Lysepufferzusammensetzung erforderlich. Mehrere Parameter sind zu berücksichtigen: (i) Waschmitteltyp und Konzentration21und (ii) Proteasehemmer.

Die Lysepufferzusammensetzung muss an das Zielprotein angepasst werden, um seine nahezu vollständige Löslichkeit zu erleichtern, um es so weit wie möglich zu extrahieren und seine Detektion durch Western Blot zu ermöglichen. Für lösliche Proteine reichen dafür oft milde Bedingungen (z.B. ein mildes Reinigungsmittel bei geringer Konzentration) aus. Für Membranproteine sind in der Regel stärkere Bedingungen erforderlich. Es gibt verschiedene Kategorien von Waschmitteln: i) i) ionisch, wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), (ii) nicht-ionisch wie Polyethylenglykolhexadecylether (BRIJ), Triton, OctylGlucosid (OG), doDecylMaltoside (DDM) und ( iii) zwitterionisch wie 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) oder zwittergents. Starke Reinigungsmittel können Wechselwirkungen stören und Komplexe können verloren gehen. Darüber hinaus können Antikörper bei Immunpräzipitationsexperimenten empfindlich auf schwere Bedingungen reagieren. In ähnlicher Weise kann die Enzymaktivität durch das Vorhandensein von Reinigungsmitteln gestört werden, die sich entfalten oder denaturiert das untersuchte Protein. Sowohl die Art als auch die Menge des verwendeten Reinigungsmittels können die Eigenschaften und die Aktivität eines Proteins beeinflussen. Bei einigen Proteinen wird ein sehr begrenzter Konzentrationsbereich von Reinigungsmittel toleriert, um die Aktivität des Proteins zu erhalten. Unterhalb dieses Bereichs bleibt das Protein unlöslich, während das Protein oberhalb dieses Konzentrationsbereichs nicht mehr aktiv ist.

Protease-Inhibitoren müssen dem Lysepuffer zugesetzt werden, um den Abbau des Zielproteins durch endogene Proteasen zu verhindern. Protease-Hemmer-Cocktails sind im Handel erhältlich. Sie können als Ausgangspunkt einer Studie verwendet werden. Wenn Probleme auftreten, kann man die Verwendung eines Gemischs von Inhibitoren in Betracht ziehen, die extemporär aus Lagerlösungen hergestellt werden, die bei -20 °C gelagert sind. Diese Inhibitoren müssen auf Serin- und Cysteinproteasen abzielen. PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) wird häufig verwendet, ist jedoch in wässriger Lösung sehr instabil und muss kurz vor der Extraktion zugegeben werden. Metalloproteasen sollten ebenfalls gehemmt werden: Metallchelatisazien wie EDTA (Ethylenedinitrilotetraessäure) oder EGTA (Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-Tetraessigsäure), die an Mg2+binden, werden zu diesem Zweck verwendet. Um das Protein in ihrer phosphorylierten und damit aktivierten Form zu halten, wird auch empfohlen, dem Lysepuffer Phosphatase-Inhibitoren hinzuzufügen. Diese Inhibitoren müssen auf Alkali-, Säure-, Serin-, Threonin- und Tyrosinphosphatasen abzielen. Auch Arbeiten bei niedriger Temperatur (4 °C) werden empfohlen, um die Proteolyserate zu verlangsamen.

Zielproteine
Dabei konzentrierten wir uns auf epitopgemarkierte Proteine. Tags (Flag, HA, cMyc, GFP, etc.) sind sehr nützlich, um Proteine zu erkennen und zu reinigen, da Antikörper und Antikörper gekoppelte Perlen im Handel erhältlich sind und leicht reproduzierbare Materialien sind. Die Größe und Position des Tags muss jedoch berücksichtigt werden, da dies die Aktivität, Lokalisierung oder Funktion des Zielproteins6,7,8beeinflussen kann. Es ist auch möglich, mit endogenen Proteinen zu arbeiten. In diesem Fall müssen Antikörper verwendet werden, die auf dieses Protein abzielen. Sie können kovalent an Perlen (Protein A oder Protein G) gekoppelt werden (Kreuzverknüpfung) oder mit dem Lysat und dann mit den Perlen inkubiert werden. Bei der Arbeit mit markierten Proteinen, deren Gen auf einem Plasmid exprimiert wird, ist es einfach, durch Mutagenese des Gens zu einer mutierten Version dieses Proteins zu wechseln. Es ist dann möglich, an verschiedenen Mutanten zu arbeiten, um biologische Funktionen zu bewerten.

Immunopräzipitation
Immunpräzipitation ist eine sehr leistungsfähige Technik, um Partner des Zielproteins5zu isolieren. Die Zusammensetzung des Lysepuffers (insbesondere Waschmittel) muss sorgfältig festgelegt werden, um Wechselwirkungen zu erhalten (siehe oben). Es ist möglich, die Wechselwirkung zwischen zwei identifizierten Proteinen zu erkennen. Es kann endogene Proteine oder überexprimierte Proteine sein. Wenn Proteine in geringer Fülle exprimiert werden, kann es notwendig sein, sie zu überexprimieren, um stärkere Signale zu haben. Umfangreiche Kawass von immunpräzipierten Perlen sind erforderlich, um nicht spezifisch interagierende Proteine oder Kontaminanten zu entfernen. Vor der Bestimmung der Immunpräzipitizipationseffizienz oder der koimmunpräzipierten Partnerpräsenz ist es wichtig, zu überprüfen, ob die verschiedenen Partner im Lysat gut exprimiert sind, indem das gesamte Zelllysat oder die Eingangsfraktion durch Western analysiert wird. klecks. Darüber hinaus ist es mit Immunpräzipitationsexperimenten auch möglich, neue Partner eines Zielproteins zu identifizieren und neue Komplexe zu isolieren. Diese neuen Partner können durch Massenspektrometrie identifiziert werden.

Solche Partner können eine wichtige Rolle als Aktivatoren des Zielproteins spielen, was seine volle Aktivität für weitere biologische Tests ermöglicht. Auf der anderen Seite können kogereinigte unerwünschte Proteine als Argument verwendet werden, dass es keine direkte Interaktion zwischen zwei identifizierten Partnern gibt, sondern dass die nachgewiesene Wechselwirkung durch Co-Immunpräzipation auf einen anderen unbekannten Partner zurückzuführen ist. In diesem speziellen Fall, um sicher zu sein, eine direkte Interaktion, ist ein anderes experimentelles Gerät erforderlich, wie die Arbeit an Säugetierproteinen, die von Bakterien gereinigt werden.

Kinase-Aktivität
Die Kinase-Aktivität kann mit verschiedenen Techniken beurteilt werden. Dabei konzentrierten wir uns auf dieIn-vitro-Analyse durch die ATP-Kennzeichnung von 32 P] und auf die Analyse von ganzen Zellextrakten durch Western Blot mit einem spezifischen Phospho-Antikörper. DieATP-Kennzeichnung ist eine sehr empfindliche und quantitative Technik, die die Detektion schwacher Kinase-Aktivitätermöglicht 15. Die Radioaktivitätsintegration von ATP in das Zielsubstrat ermöglicht eine direkte Messung der Enzymaktivität. Es ist möglich, mit verschiedenen Substraten zu arbeiten, um die Kinase-Aktivität des untersuchten Proteins auf verschiedenen Targets zu bewerten. Es ist auch möglich, Aminosäuren zu identifizieren, die für die Kinase-Aktivität entscheidend sind, indem sie mutiert werden, wenn das Protein überexprimiert wird. Die Kinase-Aktivität erfordert ein divalentes Kation wie Mg2+, das im Kinase-Puffer vorhanden sein muss.

Der Hauptnachteil dieses Ansatzes ist der Umgang mit Radioaktivität, der spezielle Einrichtungen für Experimente und für die Sammlung von Abfällen erfordert. Es gibt alternative Methoden wie fluoreszierende oder lumineszierende Kits, die Nebenprodukte der Reaktion erkennen, wie ADP (Adenosindiphosphat)16. Die Proteinphosphorylierung kann auch durch Massenspektrometrie untersucht werden, jedoch ist für diese Analysen eine größere Menge an Materialien erforderlich. In unserem Fall haben wir versucht, die LIMK2-Kinase-Aktivität mit Kapillarelektrophorese zu bewerten, um unsere Effizienz zu steigern, aber dies war leider erfolglos.

Phosphospezifische Antikörper sind ein weiteres Instrument zur Untersuchung der Phosphorylierung eines Proteins. Es gibt allgemeine allgemeine Antiphospho-Serin- und Tyrosin-Antikörper, die phospho-Ser oder Phospho-Tyr von Proteinen erkennen können. In den letzten Jahren wurden Antikörper, die auf eine bestimmte Phospho-Site eines Zielproteins abzielen, weit entwickelt und in der Regel erkennen sie sowohl die Phosphogruppe als auch die umgebenden Aminosäuren. Besondere Vorsicht ist geboten, wenn man mit solchen Antikörpern zu arbeiten beginnt, da ihre Spezifität beispielsweise mit einer Negativkontrolle überprüft werden muss, wie z. B. das Zielprotein, das auf der Phospho-Site mutiert ist. Bei der Untersuchung eines Flecks mit einem Anti-Phospho-Antikörper darf die blockierende Lösung keine Milch sein, da diese Phosphoproteine enthält, die mit dem Antikörper interagieren können. Bovine Serum Albumin (BSA) wird empfohlen, und Phosphatase-Inhibitoren können in der Blockierlösung hinzugefügt werden, um phosphatfrei zu verhindern. Die Proben sollten nicht eingefroren und aufgetaut werden, sondern als Aliquots zubereitet werden, die bei -80°C gehalten werden. Tatsächlich sind Phospho-Modifikationen labil.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen und la Région Centre Val de Loire. Vielen Dank an Aurélie Cosson und Déborah Casas für Flow-Zytometrie-Daten und an Keyron Hickman-Lewis für das gründliche Korrekturlesen des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

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References

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