Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het uitgebreide gehele genoom rangschikken heeft vele open lezings kaders (ORFs) geïdentificeerd die vele potentiële proteïnen verstrekken. Deze eiwitten kunnen belangrijke rollen voor de cel en kunnen ontrafelen nieuwe cellulaire processen. Onder eiwitten, kinases zijn belangrijke acteurs als ze behoren tot cel signalering paden en hebben de mogelijkheid om in-of uitschakelen vele processen van cruciaal belang voor het lot van de cel, zoals celgroei, divisie, differentiatie, beweeglijkheid, en de dood.

In deze studie, concentreerden wij ons op een nieuwe potentiële kinase proteïne, LIMK2-1. Wij toonden zijn bestaan door westelijke vlek gebruikend een specifiek antilichaam aan. We evalueerden de interactie met een upstream regulerend eiwit met behulp van coimmunoprecipitation experimenten. Coimmunoprecipitation is een zeer krachtige techniek in staat om de interactie tussen twee doel eiwitten te detecteren. Het kan ook worden gebruikt om nieuwe partners van een aas proteïne te ontdekken. Het aas proteïne kan of via een markering worden gezuiverd die aan zijn opeenvolging of via een antilichaam wordt ontworpen dat specifiek het richt. Deze eiwitcomplexen kunnen vervolgens worden gescheiden door SDS-pagina (natrium dodecyl sulfaat Polyacrylamide gel) en geïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie. Immunoprecipitated LIMK2-1 werd ook gebruikt om zijn kinase activiteit in vitro te testen door γ [32P] ATP etikettering. Deze gerenommeerde assay kan gebruik maken van veel verschillende substraten, en gemuteerde versies van het aas kan worden gebruikt om de rol van specifieke residuen te beoordelen. De effecten van farmacologische agentia kunnen ook worden geëvalueerd, aangezien deze techniek zowel zeer gevoelig als kwantitatief is. Toch vereist de behandeling van radioactiviteit bijzondere voorzichtigheid. Kinase activiteit kan ook worden beoordeeld met specifieke antilichamen gericht op de phospho groep van het gemodificeerde aminozuur. Dit soort antilichamen zijn niet commercieel beschikbaar voor alle phospho gemodificeerde residuen.

Introduction

Voor vele decennia, zijn talrijke signalering trajecten opgehelderd en hun betrokkenheid bij cruciale cellulaire processen zoals celdeling, differentiatie, beweeglijkheid, geprogrammeerde celdood, immuniteit en Neurobiology, is aangetoond. Kinases spelen een belangrijke rol in deze signalering trajecten als ze vaak fijn reguleren hun activering of inactivatie en zijn onderdeel van voorbijgaande veelzijdige complexen die reageren op externe stimuli1,2,3. Mutatie en ontregeling van kinases vaak leiden tot ziekten bij de mens, en ze hebben daarom uitgegroeid tot een van de belangrijkste drug targets in de afgelopen 40 jaar4.

In deze context is het belangrijk om de kinase interactie met hun stroomopwaartse regulatoren of stroomafwaartse substraten te kunnen detecteren en nieuwe partners te identificeren. De reiniging van de affiniteit en Immunoprecipitation zijn zeer krachtige technieken voor de isolatie van eiwitcomplexen5. Het aas proteïne of kinase kan met een specifieke peptide opeenvolging worden geëtiketteerdd toestaand het gebruik van commerciële parels in combinatie met antilichamen die het peptide richten. Dit materiaal laat een hoge reproduceerbaarheid toe in experimenten6,7,8. Endogene proteïnen kunnen ook worden immunoprecipitated gebruikend antilichamen die direct het aas proteïne richten. De antilichamen kunnen cross-linked aan proteïne A of proteïne G agarose parels of eenvoudig met deze parels voorafgaand aan het toevoegen van lysate worden uitgebroed. Lysis buffers moeten worden geoptimaliseerd om proteïne oplosbaar maken te laten zonder interactie te verliezen en eiwit degradatie te vermijden. Een belangrijk nadeel van deze aanpak is dat de interactie wordt gedetecteerd op Cell Lysis; Daarom kunnen voorbijgaande of zwakke interacties, samen met die die subcellulaire context vereisen worden gemist. Andere technieken kunnen worden gebruikt om direct te werken in de cel, zoals proximity afbinding assay (PLA)9, in vivo cross-linking-Assisted affiniteit zuivering (XAP)10, bioluminescentie resonantie energieoverdracht (BRET) of Förster resonantie energie Overdracht (fret)11,12. Bovendien is Immunoprecipitation niet geschikt om de thermodynamische constanten van de binding te bepalen, waarvoor fysische technieken zoals oppervlakte Plasmon resonantie, isotherme titratie calorimetrie of Microscale Thermophoresis zijn vereist 13,14.

Kinase activiteit kan worden beoordeeld met behulp van meerdere technieken. Hierin hebben we ons geconcentreerd op phospho antilichamen en in vitro γ [32P] ATP (adenosine trifosfaat) etikettering. Phospho-specifieke antilichamen richten de fosfaat wijziging van een bepaald residu binnen een proteïne. Zij kunnen in westelijke vlek of ELISA (enzym-verbonden ImmunoSorbent assay) na cel lysis, voor Immunohistochemistry, en ook op intacte cellen worden gebruikt gebruikend Stroom Cytometry of immunofluorescentie. Hun nadelen kunnen hun gebrek aan specificiteit omvatten, die kan worden geëvalueerd gebruikend een gemuteerde versie van de doel proteïne, en hun die niet commercieel beschikbaar voor alle proteïnen zijn. In vitro γ [32P] ATP labeling is een zeer robuuste, goed gevestigde en zeer gevoelige methode15. Immunoprecipitated of recombinante eiwitten kunnen worden gebruikt, en verschillende substraten kunnen worden getest. De effecten van drugs kunnen ook worden beoordeeld als deze methode is kwantitatief. Het belangrijkste nadeel is dat de radioactiviteit in verband met de aanpak vereist behandeling met voorzichtigheid. Alternatieve methoden zijn ook mogelijk op basis van de meting van fluorescerende of lichtgevende peptide substraten en gebruik te maken van gewijzigde TL/lichtgevende eigenschappen op phosphorylation. Dergelijke methoden kunnen ook een hoge doorvoersnelheid, die nodig is, bijvoorbeeld in de screening van moleculen die kunnen worden potentiële remmers van de doelgroep kinase. Inderdaad, kinases vertegenwoordigen een van de grootste klassen van drugs doelstellingen nagestreefd door farmaceutische bedrijven16.

In deze studie concentreerden we ons op de LIMK2-1 proteïne (LIMK2-1 staat voor Lin11, Isle1, Mec3 kinase isovorm 2-1). De LIMK2 kinase proteïne werd voor het eerst beschreven in 199517. Drie isovormen van LIMK2 worden geproduceerd door alternatieve splicing: LIMK2a, LIMK2b en LIMK2-1. Momenteel, is LIMK2-1 slechts beschreven op het niveau mRNA in één enkele studie18. Hierin karakteriseren we deze potentiële nieuwe kinase proteïne op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen. Ten eerste tonen we aan dat LIMK2-1 inderdaad gesynthetiseerd is. Gelijkaardig aan zijn twee tegenhangers, LIMK2a en LIMK2b, communiceert het met de stroomopwaarts kinase rots (Rho-bijbehorend proteïne kinase). We tonen LIMK2-1 heeft een kinase activiteit op myeline Basic protein (MBP), maar niet op cofilin, de canonieke substraat van LIM kinases.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell voorbereiding voor Transfectie

Let op: alle stappen van de cel cultuur moet worden uitgevoerd in een dedicated laboratorium, en cellen worden gemanipuleerd binnen een klasse 2 microbiologische kabinet.

  1. Zaad HEK-293 (menselijke embryonale nier) cellen in Ø 10 cm platen in 10 mL DMEM (Dulbecco modified Eagles medium) aangevuld met 10% foetale kalf serum. Cultuur voor 3 tot 5 dagen onder 5% CO2, bij 37 °c, tot de cellen bereiken ~ 90% samenloop.
  2. Behandel Ø 10 cm platen met collageen R om de hechting van de cellen aan de plastic platen te verhogen.
    1. Voeg 5 mL van een oplossing van collageen R toe, 200-voudig verdund in fosfaat zout buffer (PBS) in een plaat van Ø 10 cm. Bedek de vloeistof over het hele oppervlak van de plaat.
    2. Incubeer bij kamertemperatuur voor ten minste 1 uur in het bioveiligheid kabinet.
    3. Verwijder collageen oplossing, en gooi het. Voeg 5 mL PBS, verspreid het over het oppervlak van de plaat, verwijder het en gooi het. Herhaal deze wasbeurt een keer.
    4. Voeg 8 mL DMEM aangevuld met 10% foetale kalf serum. Bewaar de voor bereide platen in het bioveiligheid kabinet.
  3. Neem HEK-293 platen van stap 1,1 binnen het bioveiligheid kabinet. Verwijder het medium van de platen en gooi het in een speciale Bleach prullenbak. Voeg 2 mL van de aangevulde DMEM toe en spoel de cellen om ze los te maken met de stroom van een 1 mL micropipet en zorg ervoor dat er geen schuim ontstaat.
  4. Verzamel de cellen in een 15 mL buis en voeg 4 mL van de aangevulde DMEM. Meng met een pipet van 10 mL, door 3 maal omhoog en omlaag te pipetteren.
  5. Neem 2 mL van deze cel oplossing en voeg ze toe aan collageen-behandelde platen met aangevuld DMEM van stap 1.2.4.
  6. Groeien voor 24 uur in de incubator op 5% CO2 en 37 ° c. Cellen moeten worden 50-80% Confluent op het moment van transfectie.

2. voorbijgaande transfections

  1. Verwijder het medium uit de platen, gooi het in een speciale Bleach prullenbak, en voeg 10 mL verse aangevuld DMEM. Zet de platen terug in de incubator op 37 °C tijdens de voorbereiding van de transfectie mengsel.
  2. Voeg in een buis van 15 mL 450 l van een 10 mM tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA toe (tris staat voor tris (hydroxymethyl) aminomethane, en EDTA voor ethylenedinitrilotetraacetic acid) oplossing en 50 l van een 2,5 M CaCl2 oplossing. Mix door inversie.
  3. Voeg 10 μg van plasmide DNA (desoxyribonucleïnezuur zuur) toe die van een voorbereiding van Midi op een vloeibare cultuur van bacteriën wordt voorbereid die met de specifieke plasmide worden omgezet. Mix door inversie.
  4. Onder gladde agitatie op een Vortex, voeg 500 l van BES gebufferde zoutoplossing 2x concentraat (samenstelling: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, na2HPO4, 0,27 g/l; BES tribunes voor N, N-BIB (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic zuur, N, N-bis (2-hydroxyethyl) taurine) langzaam daling door daling.
  5. Incubeer gedurende ten minste 15 min (tot 45 min) bij kamertemperatuur binnen het bioveiligheid kabinet. Niet vortexen, niet mengen! Verplaats de buizen zeer zorgvuldig om de complexe vorming tussen DNA en calciumfosfaat niet te verstoren.
  6. Neem de platen van stap 2,1 naar de veiligheidskast. Voeg de complexen van DNA toe zeer zorgvuldig, daling door daling, op de cellen helemaal over de oppervlakte van de plaat.
  7. Incubeer gedurende 24 tot 72 uur in de incubator bij 37 °C. Gewoonlijk wordt de maximum eiwituitdrukking bereikt binnen 48 uren.

3. lysis

Nota: het werk aangaande ijs, en met koude buffers om eiwit degradatie te verhinderen.

  1. Bereid lysis buffer: 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Natriumpyrofosfaat, 1 mM na3vo4, 20 mm p-Nitrophenyl fosfaat, 20 mm β-glycerophosphate, 10 μg/ml aprotinin, 0,05 μg/ml okaidic zuur , 1 μg/mL leupeptin, en 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride). Voor elke transfected plaat is ongeveer 4 mL lysis buffer vereist.
  2. Verwijder platen met transfected cellen uit de incubator. Leg ze op ijs.
    Nota: van deze stap, is het mogelijk om aan een "normale" Bank te werken.
  3. Verwijder de media, en gooi het in een speciale Bleach prullenbak.
  4. Was tweemaal met 3 mL koude PBS: Voeg 3 mL PBS aan de kant van de plaat daling door daling toe om het losmaken van transfected cellen te vermijden, die helemaal over de oppervlakte van de plaat worden uitgespreid, PBS verwijderen en het verwerpen; Herhaal deze stap nogmaals. Aan het eind, verwijder zorgvuldig de rest van PBS door de plaat te overhellen om lysis buffer verdunning voor volgende stap te verhinderen.
  5. Voeg 500 l van koude lysis buffer op de transfected gewassen cellen. Verspreid het allemaal over het oppervlak van de plaat.
  6. Incubeer gedurende 10 minuten op het ijs. Van tijd tot tijd (ten minste tweemaal), verspreid opnieuw de buffer over het oppervlak van de plaat.
  7. Schraap de cellen en Verzamel ze in een micro centrifugebuis.
  8. Centrifugeer gedurende 10 min bij 10.000 x g bij 4 °c.
  9. Verzamel bovendrijvende in een nieuwe micro centrifugebuis. Deze fractie komt overeen met de lysate (whole Cell extract). Gooi de pellet die overeenkomt met celmembraan puin.
  10. Verzamel een hoeveelheid van deze fractie naar een nieuwe micro centrifugebuis (rond 50 l). Deze fractie komt overeen met de "totale breuk" of "cel lysate" of "hele cel-extract" waardoor de analyse van de vraag of transfected eiwitten worden uitgedrukt door Western Blot.
    Nota: op dit punt, kunnen de steekproeven direct voor westelijke vlek analyses worden gebruikt. Laemmli buffer moet worden toegevoegd aan de steekproef, die vervolgens wordt verwarmd op 95 °C voor 5 min, centrifugeren bij 10.000 x g voor 5 min, en geladen op passende sds-pagina. Monsters kunnen ook worden opgeslagen bij-80 ° c.

4. Immunoprecipitation

  1. Voorzichtig hersuspenderen agarose kralen in combinatie met de juiste antilichaam: HA (humaan influenza hemagglutinin), vlag, of GFP (groene fluorescerende eiwit) door gladde inversie.
  2. Snijd het uiteinde van een 200 l-Tip van een micropipet zodat de kralen de tip kunnen binnengaan. Pipetteer de kralen meerdere malen op en neer om de tip te verzadigen om ervoor te zorgen dat de juiste hoeveelheid kralen te nemen.
  3. Neem 40 l van de kralen in een micro centrifugebuis.
  4. Voeg 500 l van principe (30 mM tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) buffer toe. Mix door inversie. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g bij 4 °c. Verwijder zorgvuldig bovendrijvende en gooi het. Voeg 500 l van principe toe. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 4 °C op een roterend wiel.
    Nota: deze pre-incubatie stap in principe staat toe om niet-specifieke interactie te verminderen en zo achtergrond signaal te verminderen.
  5. Was de kralen tweemaal met 500 l van lysis buffer.
    1. Centrifugeer 2 min bij 1.000 x g bij 4 °c.
    2. Verwijder zorgvuldig bovendrijvende buffer, en gooi het.
      Opmerking: Zorg ervoor dat u niet aspireren kralen tijdens deze wassen stappen.
    3. Voeg 500 l van lysis buffer toe. Meng door de buis te omkeren.
    4. Herhaal stappen 4.5.1-4.5.3.
  6. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g bij 4 °c. Verwijder voorzichtig bovendrijvende buffer, en gooi het.
  7. Incubeer kralen met de lysate van stap 3,9 voor 2 tot 4 uur bij 4 °C op een roterend wiel.
  8. Was immunoprecipitated kralen.
    Nota: op dit punt, kunnen de immunoprecipitated parels vijf keer met de lysis buffer worden gewassen, en dan geëlueerd met Laemmli buffer. Eluaat kan voor westelijke vlek analyses worden gebruikt of worden opgeslagen bij-80 °C. Alternatief, kunnen de parels tweemaal met de lysis buffer en dan drie keer met de kinase buffer worden gewassen om γ [32P] ATP etikettering uit te voeren.

5. Coimmunoprecipitation analyses

  1. Was immunoprecipitated kralen van stap 4,7 met de lysis buffer.
    1. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °c.
    2. Verwijder zorgvuldig de bovendrijvende, en gooi het.
    3. Voeg 500 l van lysis buffer toe. Meng door de buis te omkeren.
    4. Herhaal de stappen 5.1.1-5.1.3 vier keer.
  2. Elutie
    1. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °c.
    2. Verwijder zorgvuldig de bovendrijvende, en gooi het. Verwijder de laatste druppels bovendrijvende met een Hamilton spuit om aspiratie van de kralen te vermijden, en gooi de bovendrijvende.
    3. Voeg 40 l van 4x Laemmli buffer (200 mM tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% glycerol, 0,5 M β-mercaptoethanol, 0,02% bromophenol blauw) toe. Meng door voorzichtig te tikken op de buis.
    4. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Centrifugeer gedurende 5 min bij 10.000 x g bij kamertemperatuur.
    6. Met een Hamilton spuit, verwijder de bovendrijvende en verzamel het in een nieuwe micro centrifugebuis. Deze fractie komt overeen met de "eluaat", die kan worden opgeslagen bij-80 ° c, of direct geanalyseerd door Western Blot.

6. kinase assay

  1. Bereid de kinase buffer voor: 50 mM HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES staat voor 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic zuur), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2,5mm MnCl2, 50 mM NAF, 1 mm na3vo4, 20 mm β-glycerophosphate, 1 μg/ml leupeptin, en 1 mM PMSF. Voor elke Immunoprecipitation conditie is ongeveer 2 mL van de kinase buffer vereist.
  2. Was immunoprecipitated kralen van stap 4,7 tweemaal met 500 l van lysis buffer.
    1. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °c.
    2. Verwijder voorzichtig bovendrijvende, en gooi het. Voeg 500 l van lysis buffer toe. Meng door inversie.
    3. Herhaal stap 6.2.1 en 6.2.2.
  3. Was immunoprecipitated kralen drie keer met 500 l van kinase buffer.
    1. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °c.
    2. Verwijder voorzichtig bovendrijvende, en gooi het. Voeg 500 l van kinase buffer toe. Meng door inversie.
    3. Herhaal de stappen 6.3.1 en 6.3.2 tweemaal.
  4. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °c.
  5. Verwijder voorzichtig bovendrijvende, en gooi het. Verwijder de laatste druppels bovendrijvende met een Hamilton spuit om aspiratie van de kralen te vermijden, en gooi de bovendrijvende.
  6. Voeg 40 l van de kinase buffer toe aan de immunoprecipitated kralen. Hersuspendeer de kralen door voorzichtig te tikken op de buis.
  7. Bereid de mix voor de γ [32P] ATP labeling (eindvolume is 22,5 l, compleet met kinase buffer) in een veilige Lock-Tube.
    1. Voeg het vereiste volume van de kinase buffer toe om een eindvolume van 22,5 l te bereiken.
    2. Snijd het uiteinde van een 20 l punt van een micropipet. Hersuspendeer de immunoprecipitated kralen van stap 6,6 door meerdere malen op en neer te pipetteren. Verzamel 10 l van deze kralen in de Safe-lock Tube.
    3. Voeg ATP van een 10 μM voorraad oplossing te bereiken 50 mM van de finale concentratie. Volgens het aantal behandelde monsters wordt een verdunning van de voorraadoplossing van ATP in de kinase buffer voorgesteld om pipet 1 tot 2 l toe te staan, om er zeker van te zijn dat het volume correct is.
    4. Voeg 2,5 μg van substraat (cofilin of myeline Basisproteïne, MBP in het huidige studie geval) toe.
  8. Voeg 5 μCi van γ [32P] ATP (3.000 CI/mmol) toe om de reactie te initiëren. Meng door op en neer te pipetteren langzaam.
    Let op: vanaf dit punt, moet het werk worden gedaan op een veilige plaats gewijd voor radioactiviteit manipulaties met voorzichtige voorzorgsmaatregelen, speciale bescherming en passende controles (radioactieve schilden, Geiger teller, specifieke afval verzamelen, persoonlijke borst-en vinger badges op te sporen radioactieve blootstelling, filter tips).
  9. Incubeer gedurende 20 min bij 30 °C.
  10. Stop de reactie met 6 l van 5x Laemmli buffer.
  11. Warmte bij 95 ° C voor 5 min.
  12. Centrifugeer bij 10.000 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
  13. Belasting op een SDS-pagina. Ga verder met migratie.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de voorste lijn van de vrije γ [32P] ATP niet de gel te verlaten om verontreiniging van de migratie tank te voorkomen.
  14. Vlek de gel bij kamertemperatuur.
    1. Verwijder de gel uit de glazen platen.
    2. Ga verder met drie baden in het water bij kamertemperatuur.
    3. Vlek de gel 's nachts met Coomassie blauw bij kamertemperatuur.
    4. Devlek de gel met verschillende wassen baden met water bij kamertemperatuur.
  15. Wikkel de gel met plastic wrap.
  16. Expose voor een nacht of meer op een phosphorimager scherm.
  17. Lees het scherm op een phosphorimager om gelabelde bands te detecteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LIMK2-1 proteïne wordt samengesteld
LIMK2-1 wordt vermeld in databanken, maar tot dusver heeft slechts één document het bestaan van zijn mRNA18getoond. Vergeleken met de twee homologs, LIMK2a en LIMK2b, LIMK2-1 heeft een extra C-Terminal domein geïdentificeerd als een eiwit fosfatase 1 remmende domein (PP1i). We hebben een antilichaam ontworpen dat een peptide van dit domein target, aminozuren 671-684 (Figuur 1a).
BLAST onderzoek tegen menselijke eiwit databases toonde aan dat slechts een eiwit, PHI-1 (fosfatase holoenzyme remmer 1), heeft een sterke sequentie gelijkenis met deze 12 aminozuursequentie. Echter, PHI-1 migreert op 23 kDa op SDS-pagina gels, ver weg van LIMK2-1, die naar verwachting migreren rond 75 kDa (dat wil zeggen, de twee mag niet bemoeien). Wij bevestigden dit antilichaam eerst voor HEK-293 cellen transfected of met LIMK2-1, LIMK2a, of LIMK2b en toonden aan dat het anti-PP1i antilichaam transfected LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) en HA-geëtiketteerde LIMK2-1 kon erkennen, maar niet cross-react met transfected HA-Tagged LIMK2a of LIMK2b (Figuur 1b). We zagen een band van endogene LIMK2-1 in HEK cellen transfected met HA-gelabelde versies van de LIMK2 isovormen (aangegeven door een pijl in de anti-PP1i Blot; Figuur 1b). Ten tweede, controleerden wij of het signaal dat door het anti-PP1i antilichaam wordt veroorzaakt specifiek aan LIMK2-1 gebruikend siRNA die de drie gesplitste varianten van LIMK2 (figuur 1c) richt. In aanwezigheid van LIMK2 siRNA, werd een reproduceerbare en significante daling van de band van belang waargenomen (die door een pijl in figuur 1cwordt vermeld) vergeleken bij controlevoorwaarden, die voorstellen dat het antilichaam voor LIMK2-1 specifiek is. Na dit, gebruikten wij het anti-PP1i antilichaam om LIMK2-1 in verschillende de lijn uittreksels van de cel te ontdekken: HEK-293 (menselijke embryonale cellen van de nier), HeLa (menselijke epitheelcellen van de baarmoederhals), en C6 (de hersenen glial cellen van de rat). Deze cellen worden verstoord in de lysis buffer met 1% Triton X-100. Met behulp van in silico analyse, LIMK2-1 werd aangetoond dat Hominidae primaat-specifieke19. Western Blot analyse met behulp van de anti-PP1i antilichaam bleek dat LIMK2-1 bleek te zijn uitgedrukt in HEK-293 en HeLa, maar niet in C6 cel lijnen zoals verwacht van in silico studies (figuur 1d). Deze experimenten werden herhaald met verschillende menselijke weefsels, waaruit blijkt dat de niveaus van LIMK2-1 eiwit gevarieerd, afhankelijk van het weefsel: de hoogste niveaus werden gevonden in de lever, mindere niveaus in de alvleesklier, en de laagste in de testis en de longen. LIMK2-1 was niet detecteerbaar in hersenweefsel (Figuur 1e). We waargenomen lagere moleculaire gewicht bands in alle weefselmonsters, behalve lever, wat suggereert de afbraak van het volledige eiwit waarschijnlijk te wijten aan de lysis voorwaarden van deze commerciële monsters (deze lysis buffer bevat een cocktail van de remmers niet gespecificeerd op de Datasheet, die kan minder efficiënt zijn dan de vele protease en fosfatase remmers we gebruiken in onze zelfgemaakte buffer). Deze gegevens tonen aan dat humaan LIMK2-1 eiwit wordt gesynthetiseerd en anders uitgedrukt in de geteste weefsels.

LIMK2-1 communiceert met zijn upstream kinase rots
LIMK2-1 homologs, LIMK2a en LIMK2b, zijn beschreven zoals geregeld door de stroomopwaarts kinase rots. We beoordeelden de interactie van LIMK2-1 met ROCK met behulp van coimmunoprecipitation experimenten. HEK cellen waren co-transfected met vectoren codering cMyc-Tagged ROCK1 en ofwel een van de HA-tagged versie van LIMK2 isovormen, of de niet-gerelateerde HA-Tagged eiwit Larp6. Larp6 fungeert als een negatieve controle, waardoor de opsporing van niet-specifieke interacties. Cellen werden lysed en anti-HA Immunoprecipitation werd uitgevoerd. Lysaten (gehele cel uittreksels) en immunoprecipitates werden geanalyseerd door westelijke vlek, gebruikend anti-HA en anti-cMyc antilichamen. Zoals afgebeeld in Figuur 2 (linker panelen; Lysaten), zijn elk van de verschillende proteïnen die door de transfected vectoren worden gecodeerd goed uitgedrukt. De drie isovormen van LIMK2, evenals Larp6, zijn efficiënt immunoprecipitated (Figuur 2, rechtsonder paneel; Eluates). In de eluates, wordt de rots ontdekt en zo coimmunoprecipitated met drie isovormen van LIMK2, maar niet met Larp6 (Figuur 2, hoogste recht paneel; Eluates). Dit toont aan dat ROCK samenwerkt met de drie isovormen van LIMK2, vooral met de nieuw gekenmerkte isovorm LIMK2-1. Deze interactie is specifiek aangezien de negatieve controle (Larp6) niet met rots in wisselwerking staat.

Hierin presenteren we gegevens voor de Immunoprecipitation uitgevoerd met anti-HA antilichamen; Nochtans, kan de interactie in de tegenovergestelde richting door immunoprecipitating rots met parels worden getest die met cMyc antilichamen worden vervoegd en eluates met HA antilichamen analyseren om LIMK coimmunoprecipitation te ontdekken.

Kinase activiteit
Phospho-cofilin in intacte cellen
De homologatie van LIMK2-1, LIMK2a en LIMK2b, is aangetoond dat phosphorylate cofilin, een actine depolymerisatie factor, op zijn Serine3. Gebruikend een antilichaam dat specifiek de phospho-Serine3 van cofilin richt, bestudeerden wij LIMK2 kinase activiteit door het niveau van endogene phospho-cofilin in HEK cellen te meten die één van LIMK2 isovormen overexpresseren. HEK cellen werden transfected met vectoren codering ofwel een van de HA-Tagged LIMK2 isovormen, of de overeenkomstige lege vector als een negatieve controle. De cellen waren lysed, en de verschillende lysaten werden geanalyseerd door het westelijke bevlekken gebruikend het anti-phospho-Serine3 cofilin antilichaam. De overexpressie van LIMK2a en LIMK2b veroorzaakte een significante en reproduceerbare toename van phospho-cofilin niveaus ten opzichte van controle omstandigheden, terwijl de aanwezigheid van LIMK2-1 geen waarneembaar effect had (Figuur 3, linkerpaneel).

We herhaalden hetzelfde experiment met een C-Terminal YFP-Tagged (geel fluorescerende eiwit) versie van de drie LIMK2 isovormen en een niet-gecodeerde versie van LIMK2-1 uit te sluiten mogelijke interferentie door de N-Terminal HA-tag. De resultaten waren identiek aan die verkregen met behulp van HA-Tagged versies van de drie isovormen (Figuur 3, rechter paneel met de YFP tagged versie). Transfectie efficiency werd beoordeeld voor de YFP-gelabelde versie van LIMK isovormen met behulp van flow Cytometry uit te sluiten dat dit resultaat kan zijn te wijten aan verschil van eiwitexpressie. Drie isovormen toonden gelijkaardige transfectie efficiency: 54% voor LIMK2-1, 49% voor LIMK2b en 43% voor LIMK2b.

In vitro kinase tests
Vervolgens hebben we de kinase activiteit van de LIMK2 isovormen bestudeerd door in vitro labeling met γ [32P] ATP. Figuur 4a toont de algemene regeling van deze in-vitro-etikettering. HEK cellen werden transfected met ofwel een van de HA-gecodeerde versies van de LIMK2 isovormen of de niet-verwante eiwitten, Larp6, die werd gebruikt als een negatieve controle. De kinase activiteit van de anti-HA immunoprecipitates werd gemeten met behulp van recombinant GST-cofilin als een substraat in de aanwezigheid van γ [32P] ATP. HA-immunoprecipitated Larp6 toonde geen kinase activiteit op cofilin. HA-immunoprecipitated LIMK2a en LIMK2b phosphorylated cofilin, terwijl LIMK2-1 niet (figuur 4b). We verkregen vergelijkbare resultaten met behulp van YFP-gecodeerde versies van de drie isovormen immunoprecipitated met GFP-trap kralen in de aanwezigheid van recombinant cofilin en γ [32P] ATP (figuur 4D).

Vervolgens hebben we getest of LIMK2-1 had geen kinase activiteit of als de activiteit op cofilin was aangetast. We herhaalden de in vitro labeling experiment met behulp van myeline Basic protein (MBP), een efficiënt substraat voor tal van eiwitten kinases, in plaats van cofilin. Er was een hoge achtergrond signaal in de controle staat wanneer de assay werd uitgevoerd in de aanwezigheid van HA-Tagged versies: de negatieve controle, HA-immunoprecipitated Larp6, produceerde een sterk signaal van phosphorylated MBP, hoewel het niet een kinase ( Figuur 4C). We overwon dit probleem met behulp van de YFP-tagged versie van deze eiwitten. Onder deze omstandigheden, de achtergrond in de controle (YFP alleen) was laag, waardoor meer specifieke studies worden uitgevoerd. GFP-Trapped YFP-LIMK2a, LIMK2b, en LIMK2-1 toonden de activiteit van het kinase naar MBP, hoewel de activiteit van LIMK2-1 lager was (figuur 4D). Echter, LIMK2-1 was ook minder efficiënt immunoprecipitated onder deze omstandigheden (Zie Coomassie Brilliant Blue (CBB) kleuring en West-bevlekken). Zo, de drie isovormen toonde vergelijkbare activiteit op MBP toen phospho-MBP werd genormaliseerd tot immunoprecipitated LIMK2 niveaus door CBB kleuring (figuur 4D, onderste paneel). Immunoprecipitates werden ook geanalyseerd door westelijke vlek gebruikend anti-rots antilichamen om te controleren of de activiteit op MBP aan de aanwezigheid van rots zou kunnen toe te schrijven zijn, die coimmunoprecipitated met LIMK2s zou geweest zijn. We konden niet detecteren een ROCK signaal in LIMK2 immunoprecipitates. Dus MBP phosphorylation is niet te wijten aan ROCK, maar om LIMK2s per se.

Globaal, tonen deze gegevens aan dat LIMK2a en LIMK2b gelijkaardige activiteiten op cofilin en MBP hebben. Hoewel LIMK2-1 toont kinase activiteit naar MBP vergelijkbaar met die van de andere twee isovormen, cofilin is geen goede ondergrond voor.

Figure 1
Figuur 1: bewijs voor het bestaan van de LIMK2-1 proteïne. Aschematisch schema van de drie isovormen van de menselijke LIMK2. LIMK2 isovormen worden beschreven in Entrez gen: LIMK2-1 (NP_ 001026971.1), LIMK2a (NP_ 005560.1), LIMK2b (NP_ 057952.1). De verschillende domeinen van LIMK2 worden getoond: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM ' (kortere LIM domein), PDZ (PSD95, Dlg1, zo-1), S/P (serine Proline rijk), kinase ' (kortere kinase domein), en PP1i (proteïne fosfatase 1 remmende). De opeenvolging die voor anti-PP1i antilichamen ontwerp wordt gekozen wordt getoond in rood. (B en C) Validatie van het anti-LIMK2-1 antilichaam. (B) HEK-293 cellen werden transfected met niet-gecodeerde LIMK2-1 (PCMV-LIMK2-1) of een van de ha-Tagged ISOVORMEN van LIMK2. Lysaten werden geanalyseerd door het westelijke bevlekken gebruikend de vermelde antilichamen. (C) HEK-293 cellen werden transfected hetzij met LIMK2 siRNA of controle siRNA. Lysaten werd geanalyseerd door westelijke vlek. LIMK2-1 wordt uitgedrukt in verschillende menselijke cel lijnen (D) en weefsels (E). HEK-293, HeLa en C6 cellen werden verstoord in 1% Triton-X100 lysis buffer. De uittreksels van het weefsel werden gekocht en de steekproeven daarvan werden geanalyseerd door het westelijke bevlekken. Dit cijfer werd gewijzigd van Vallee et al., biochemisch dagboek, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: De drie isovormen van LIMK2 interageren met ROCK1. HEK-293 cellen waren co-transfected met cMyc-Tagged ROCK1 en ofwel een van de drie HA-Tagged LIMK2 isovormen (2-1, 2a, 2b) of de niet-gerelateerde eiwitten, Larp6. Lysaten en anti-HA immunoprecipitates werden onderworpen aan het westelijke bevlekken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: LIMK2-1 heeft geen kinase activiteit naar cofilin in intacte cellen. HEK-293 cellen werden transfected met ofwel een van de drie HA-Tagged LIMK2 isovormen (1, 2a, 2b) of de lege ouderlijke vector, pcDNA3 (linker paneel), of met een van de drie YFP-tag LIMK2 isovormen of YFP alleen (rechter paneel). Lysaten werden onderworpen aan het westelijke bevlekken. De kwantificering van de verhouding van phospho-cofilin versus cofilin wordt weergegeven in de grafiek aan de rechterkant. De phospho-cofilin versus cofilin verhouding van mock transfected cellen werd genormaliseerd tot 100. Elke waarde vertegenwoordigt de gemiddelde ± SE van drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer werd gewijzigd van Vallee et al., biochemisch dagboek 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: LIMK2-1 heeft geen in vitro kinase activiteit naar cofilin, hoewel het PHOSPHORYLATES MBP. Aalgemene regeling van γ [32P] ATP in vitro labeling. B LIMK2-1 niet phosphorylate cofilin in vitro. HEK-293 cellen werden transfected met ofwel een van de drie HA-Tagged LIMK2 isovormen (2-1, 2a, 2b) of een niet-verwante HA-Tagged eiwit, Larp6, als een negatieve controle. Anti-HA immunoprecipitated eiwitten en GST-cofilin werden gebruikt in de kinase assay. De anti-HA immunoprecipitates werden ook onderworpen aan anti-HA immunoblotting en Coomassie blauwe kleuring. (C) ha-Tagged Immunoprecipitation heeft een sterke achtergrond signaal wanneer MBP wordt gebruikt als een substraat. HEK-293 cellen werden transfected met ofwel een van de drie HA-Tagged LIMK2 isovormen (2-1, 2a, 2b) of een niet-verwante HA-Tagged eiwit, Larp6, als een negatieve controle. Anti-HA immunoprecipitated eiwitten en MBP werden gebruikt in de kinase assay. De anti-HA immunoprecipitates werden ook onderworpen aan anti-HA immunoblotting en Coomassie blauwe kleuring. (D) de drie LIMK2 isovormen hebben kinase activiteit naar myeline Basic protein (MBP). HEK-293 cellen werden transfected met ofwel een van de drie YFP-Tagged LIMK2 isovormen (2-1, 2a, 2b) of YFP alleen. Anti-GFP immunoprecipitated LIMK2 isovormen en cofilin of MBP werden gebruikt in de kinase assay. De anti-GFP immunoprecipitates werden ook onderworpen aan anti-GFP immunoblotting en Coomassie blauwe kleuring. De kwantificering van phospho-cofilin en phospho-MBP wordt in de onderste grafiek weergegeven. Phospho-cofilin niveaus die met anti-GFP immunoprecipitated LIMK2a worden verkregen werden genormaliseerd aan 100. Elke waarde vertegenwoordigt de gemiddelde ± SE van drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer werd gewijzigd van Vallee et al., biochemisch dagboek, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hierin hebben we gebruik gemaakt van krachtige biochemische instrumenten te karakteriseren op moleculair niveau een nieuw eiwit, LIMK2-1, vermoedelijk een kinase gebaseerd op de volgorde en op de homologsen, LIMK2a en LIMK2b20.

Ten eerste, toonden wij het bestaan van LIMK2-1 op het eiwit niveau gebruikend westelijke vlek analyse met een specifiek antilichaam. Na dit, evalueerden wij zijn interactie met het stroomopwaarts kinase ROCK1, dat gekend is om LIMK2a en LIMK2b, de homologs van LIMK2-1 te regelen. Tot slot beoordeelden wij de potentiële kinase activiteit van LIMK2-1 door in vitro γ [32P] ATP etikettering en in cellulo door westelijke vlek gebruikend een specifiek phospho-antilichaam.

Lysis buffer samenstelling
Wanneer het bestuderen van proteïnen om hen door westelijke vlek te analyseren, is de bijzondere zorg vereist met betrekking tot lysis buffer samenstelling. Er moeten verschillende parameters worden overwogen: (i) wasmiddel type en concentratie21, en (II) proteaseremmers.

De lysis buffer samenstelling moet aan de doel proteïne worden aangepast om zijn dichtbijgelegen volledige oplosbaar maken te vergemakkelijken om het zo veel mogelijk te halen en zijn opsporing door westelijke vlek toe te staan. Voor oplosbare eiwitten, milde omstandigheden (bijv. een mild wasmiddel bij lage concentratie) zijn vaak voldoende om dit te bereiken. Voor membraan proteïnen, zijn de sterkere voorwaarden typisch vaak vereist. Er bestaan verschillende categorieën detergenten: (i) Ionische, zoals natrium dodecyl sulfaat (SDS), cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), (II) niet-ionische, zoals polyethyleenglycol Hexadecyl ether (BRIJ), Triton, octylGlucoside (OG), doDecylMaltoside (DDM), en ( III) zwitterionic zoals 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPs) of zwittergents. Sterke wasmiddelen kunnen verstoren interacties en complexen kunnen worden verloren. Bovendien, voor immunoprecipitation experimenten, antilichamen kunnen gevoelig zijn voor ernstige aandoeningen. Evenzo kan enzymactiviteit worden verstoord door de aanwezigheid van detergenten die kunnen ontvouwen of denatureren van de bestudeerde eiwitten. Zowel het type en de hoeveelheid van het gebruikte wasmiddel kan invloed hebben op de eigenschappen en de activiteit van een eiwit. Voor sommige eiwitten, een zeer beperkt bereik van de concentratie van wasmiddel wordt getolereerd om de activiteit van het eiwit te behouden. Onder deze waaier blijft de proteïne onoplosbaar terwijl boven deze waaier van concentratie, de proteïne niet meer actief is.

De inhibitors van de protease moeten aan de lysis buffer worden toegevoegd om degradatie van de doel proteïne door endogene proteasen te verhinderen. Protease remmer cocktails zijn in de handel verkrijgbaar. Zij kunnen als uitgangspunt van een studie worden gebruikt. Als er problemen zijn ondervonden, kan men overwegen het gebruik van een mengsel van remmers extemporarily bereid uit voorraad oplossingen opgeslagen op-20 ° c. Deze remmers moeten richten serine en cysteïne proteasen. PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride) wordt vaak gebruikt, maar het is zeer instabiel in waterige oplossing en moet worden toegevoegd vlak voor de extractie. Metalloproteasen moet ook worden geremd: metaal chelaat reagentia, zoals EDTA (Ethylenedinitrilotetraacetic zuur) of EGTA (ethyleenglycol-bis (2-aminoethylether)-tetraacetic zuur), die binden aan mg2 +, worden gebruikt in dit doel. Om proteïne in hun phosphorylated en zo geactiveerde vorm te houden, wordt het ook geadviseerd om fosfatase inhibitors aan de lysis buffer toe te voegen. Deze inhibitors moeten alkalisch, zuur, serine, Threonine, en tyrosine fosfatasen richten. Het werken bij lage temperatuur (4 °C) wordt ook geadviseerd om het tarief van proteolyse te vertragen.

Doel eiwitten
Hierin hebben we ons geconcentreerd op epitope-Tagged eiwitten. De markeringen (vlag, HA, cMyc, GFP, enz.) zijn zeer nuttig om proteïnen te ontdekken en te zuiveren, aangezien de antilichamen en de antilichaam gekoppelde parels commercieel beschikbaar zijn en gemakkelijk reproduceerbare materialen zijn. Nochtans, moet de grootte en de positie van de markering worden overwogen aangezien dit de activiteit, de localisatie of de functie van het doel proteïne6,7,8kan beïnvloeden. Het is ook mogelijk om te werken met endogene eiwitten. In dit geval, moeten de antilichamen die dit bepaalde proteïne richten worden gebruikt. Zij kunnen aan parels (proteïne A of proteïne G) worden gekoppeld covalente (dwars-verbinding) of met de lysate en dan met de parels worden uitgebroed. Bij het werken met gecodeerde eiwitten, waarvan het gen wordt uitgedrukt op een plasmide, is het gemakkelijk om over te schakelen naar een gemuteerde versie van dit eiwit door mutagenese van het gen. Het is dan mogelijk om te werken aan verschillende mutanten om biologische functies te beoordelen.

Immunoprecipitation
Immunoprecipitation is een zeer krachtige techniek om partners van het doel eiwit5te isoleren. De samenstelling van de lysis buffer (vooral wasmiddel) moet zorgvuldig worden vastgesteld om interacties te behouden (zie hierboven). Het is mogelijk om de interactie tussen twee geïdentificeerde eiwitten te detecteren. Het kan endogene eiwitten of overexpresseerde eiwitten. Wanneer eiwitten worden uitgedrukt in een lage overvloed, kan het nodig zijn om ze te overdrukken om sterkere signalen te hebben. Uitgebreide wasbeurten van immunoprecipitated kralen zijn nodig om niet-specifiek werkende eiwitten of contaminanten te verwijderen. Voorafgaand aan de bepaling van Immunoprecipitation efficiency of co-immunoprecipitated partner aanwezigheid, is het belangrijk om te controleren of de verschillende partners zijn goed uitgedrukt en aanwezig zijn in de lysate door het analyseren van de hele cel lysate of de input fractie door westerse Vlek. Bovendien is het gebruik van immunoprecipitation experimenten ook mogelijk om nieuwe partners van een doel proteïne te identificeren en nieuwe complexen te isoleren. Deze nieuwe partners kunnen worden geïdentificeerd door massaspectrometrie.

Dergelijke partners kunnen een belangrijke rol spelen als Activators van het doel eiwit dat zijn volledige activiteit voor verdere biologische tests toestaat. Aan de andere kant, kunnen cogezuiverd ongewenste eiwitten worden gebruikt als een argument dat er geen directe interactie tussen twee geïdentificeerde partners, maar in plaats daarvan dat de gedetecteerde interactie door Co-Immunoprecipitation is te wijten aan een andere onbekende partner. In dit specifieke geval, om zeker te zijn van een directe interactie, een ander experimenteel apparaat nodig is, zoals het werken op zoogdieren eiwitten gezuiverd van bacteriën.

Kinase activiteit
Kinase activiteit kan worden beoordeeld door verschillende technieken. Hierin, concentreerden wij zich op in vitro analyse door γ [32P] ATP etikettering en op gehele cel uittreksel analyse door westelijke vlek gebruikend een specifiek phospho-antilichaam. γ [32P] ATP etikettering is een zeer gevoelige en kwantitatieve techniek waardoor de opsporing van zwakke kinase activiteit15. De integratie van de radioactiviteit van ATP aan het doel substraat staat een directe maatregel van te maken enzymactiviteit toe. Het is mogelijk om met verschillende substraten te werken om de kinase activiteit van het bestudeerde eiwit op verschillende doelen te beoordelen. Het is ook mogelijk om aminozuren te identificeren van cruciaal belang voor kinase activiteit door muteren hen wanneer het eiwit is overexpressed. Kinase activiteit vereist een divalent catie zoals mg2 +, die aanwezig moet zijn in de kinase buffer.

Het belangrijkste nadeel van deze aanpak is de behandeling van radioactiviteit, waarvoor speciale faciliteiten nodig zijn voor experimenten en voor het inzamelen van afval. Alternatieve methoden bestaan, zoals TL-of lichtgevende kits die bijproducten van de reactie te detecteren, zoals ADP (adenosine difosfaat)16. De proteïne phosphorylation kan ook door massaspectrometrie worden bestudeerd, echter, is een grotere hoeveelheid materialen vereist voor deze analyses. In ons geval, probeerden wij om LIMK2 kinase activiteit te beoordelen gebruikend capillaire elektroforese om onze efficiency te verhogen maar dit was jammer genoeg niet succesvol.

Phosphospecific antilichamen zijn een verder hulpmiddel om de phosphorylation van een proteïne te bestuderen. Brede algemene anti-phospho serine en tyrosine antilichamen bestaan, bekwaam om phospho-ser of phospho-Tyr van om het even welke proteïnen te erkennen. In de afgelopen jaren, antilichamen gericht op een specifieke phospho-site van een doel eiwit zijn op grote schaal ontwikkeld en meestal herkennen ze zowel de phospho groep en de omliggende aminozuren. Speciale zorg is nodig wanneer het beginnen met dergelijke antilichamen te werken, aangezien hun specificiteit moet worden gecontroleerd bijvoorbeeld met een negatieve controle, zoals de doel proteïne die op de phospho plaats wordt gemuteerd. Wanneer het sonderen van een vlek met een anti-phospho antilichaam, moet de blokkerende oplossing geen melk zijn, aangezien dit phosphoproteins bevat die met het antilichaam kunnen interageren. Boviene serum albumine (BSA) wordt aanbevolen, en fosfatase remmers kunnen worden toegevoegd in de blokkerende oplossing om fosfaat release te voorkomen. De monsters mogen niet worden bevroren en ontdooid, maar wel bereid als een hoeveelheid die bij-80 °C wordt bewaard. Inderdaad, phospho wijzigingen zijn labiele.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door la Ligue contre le cancer, l'Association neurofibromatoses et Recklinghausen, en la Région Centre Val de Loire. Veel dank aan Aurélie Cosson en Déborah Casas voor flow Cytometry Data, en naar Keyron Hickman-Lewis voor grondige proeflezen van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics