分化肝细胞中的血管性脂细胞病的诱导和特征

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

在这项研究中,我们描述了用脂肪酸盐酸钠酸化酸酸诱导分化肝细胞中肝囊性性性软体炎的详细方案,并采用脂质积累检测和定量的方法,包括相干抗斯托克斯拉曼散射 (CARS) 显微镜、细胞氟分析、油红色 O 染色和 qPCR。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Di Cocco, S., Belloni, L., Nunn, A. D., Salerno, D., Piconese, S., Levrero, M., Pediconi, N. Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells. J. Vis. Exp. (149), e59843, doi:10.3791/59843 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

肝性性性性性脂肪病是一种代谢功能障碍,由肝细胞中含甘油三酯的脂滴积累产生。过量的脂肪积累导致非酒精性脂肪肝(NAFLD),这是潜在的可逆的,并可能演变为非酒精性脂肪性肝炎(NASH),并最终肝硬化和肝细胞癌(HCC)。将肝细胞中的脂质积累与NASH进展、不可逆转的肝损伤、纤维化、肝硬化,甚至HCC联系起来的分子机制仍不清楚。为此,已经开发出几种体外和体内模型,以阐明引起NAFLD的病理过程。在本研究中,我们描述了一种肝囊性性性骨质化诱导的细胞模型,该模型由用脂肪酸盐酸钠油酸盐处理的DMSO分化的人类肝肝肝糖细胞组成。事实上,经油酸钠处理的HepaRG细胞在细胞质中积累脂液滴,并表现出性增生的典型特征。这种体外人类模型代表了体内小鼠模型以及主要人类肝细胞的宝贵替代品。我们还比较了HepaRG细胞脂肪积累定量和评估的几种方法,包括油红O染色、细胞氟度代谢测量、qPCR代谢基因表达分析、相干抗斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜。CARS 成像将拉曼光谱(一种在材料科学应用中广为人知的化学分析技术)的化学特异性与高速、高分辨率非线性光学显微镜的优点相结合,可实现精确脂质积累和脂滴动力学的定量。建立有效的体外诱导水塞性脂质模型,以及脂质积累定量和表征的准确方法,可以导致NAFLD早期诊断的发展。分子标记的识别,并产生新的治疗策略。

Introduction

肝性性性脂肪分解为肝内脂肪积累,在含甘油三酯的脂滴内,至少为肝脏重量的5%。长期肝脂储存是一个潜在的可逆过程,然而,它可能导致肝代谢功能障碍,炎症和非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的晚期形式,慢性肝病的主要原因在许多地方世界1,2NAFLD是一种多因素疾病,可能演变为更具攻击性的非酒精性脂肪性肝炎(NASH),进而进展为肝硬化,在一小部分患者中,可发展到肝细胞癌(HCC)1、3。目前没有批准的治疗是作为NAFLD的一种特定治疗,饮食和生活方式的改变的组合仍然是NAFLD和NASH管理4,5,6的支柱。

导致NAFLD发病机制中肝性性性性性粘突发展的分子机制仍有待阐明。在此背景下,小鼠模型已被开发,以研究人类性脂蛋白病的进展。存在无数种不同的模型,每种模型都有其优缺点,包括结合不同方法的遗传、营养和化学诱导模型。转基因(转基因或淘汰)小鼠自发地发展为肝病。然而,应该指出,这些突变在人类中非常罕见,单个基因(例如,ob/ob mouse)的缺失或过度表达在分子级8、9中可能不能模仿多因素人类疾病的病因。同样,小鼠在饮食或药理学操作后获得的疾病,也不得模仿人类饮食对人类8人NAFLD发展的影响。然而,动物模型促进了对NAFLD的理解的发展,这种方法是目前实验室研究中最常用的策略。然而,在人类身上复制动物模型获得的结果屡屡失败,导致临床翻译不佳。

因此,NAFLD的体外模型在阐明NAFLD进展的分子机制方面可以发挥基础性作用,它们是筛选大量化合物的宝贵工具。原生细胞培养物、永生细胞系和肝脏活检已广泛用于研究目的11。原发性人类肝细胞与人类临床条件非常相似,但捐献者数量有限,由于细胞的变异性,原发性细胞培养表现出较差的可重复性。这些观察,加上伦理和后勤问题,导致人类原发性肝细胞的使用受到限制。因此,肝细胞系代表一种方便的替代方法,与初级培养体具有若干基本优势,因为肝细胞系生长稳定,寿命几乎不受限制,并且具有稳定的表型。此外,细胞系易于访问,肝细胞系的培养条件比原发性肝细胞简单,并且在不同的实验室之间标准化。

在这里,我们详细介绍了一个体外细胞为基础的肝囊性性性骨质化模型,由用脂肪酸酸钠油酸盐治疗的肝分化肝糖细胞表示。HepaRG细胞系是由一名感染丙型肝炎的女性患者和爱德蒙森I级分化良好的肝肿瘤14建立的。HepaRG细胞系是一种人类双能祖细胞系,在暴露于2%二甲基亚硫酸盐(DMSO)时,能够区分两种不同的细胞表型:胆汁状细胞和肝细胞状细胞。分化肝细胞 (dHepaRG) 与成人肝细胞共享一些特征和特性,并具有稳定表达肝脏特定基因的能力,如白蛋白、AldolaseB、细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1) 和细胞色素 P450 3A4 (CYP3A4)13(步骤 3)。用脂肪酸盐酸钠(250μM)治疗dHepaRG细胞5天,导致细胞质脂滴的产生,模仿脂肪肝14、15、17、18的影响(步骤 4)。血脂液滴的积累可以很容易地通过油红O染色(步骤5),溶酶脂溶性染料,染色中性甘油三酯和脂质红橙色。为了有效地量化脂肪 dHepaRG 中的脂质,这里我们演示了在染色后使用 4,4-二氟罗-1,3,5,7-四甲基-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene(Bodipy 505/515)(步骤6)的细胞氟度分析,这是一种用于局部的嗜脂荧光探针细胞内脂质体,并已用于标记脂滴19。此外,这里我们展示了如何通过定量聚合酶链反应(qPCR)(步骤7)基因表达解除dHepaRG细胞中几个代谢基因的脂质分质化。为了进一步描述和量化油酸钠处理后脂滴的积累,我们进行了相干抗斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜(步骤8),这是一种创新技术,使脂液滴没有标签20,21。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 培养介质和试剂的制备

  1. 增殖介质:用GlutaMAX补充威廉E培养基,10%胎儿牛血清(FBS),1%青霉素/链霉素,5μg/mL胰岛素和0.5μM氢皮质酮血酸酯。
  2. 分化介质:用GlutaMAX补充威廉E培养基,10%FBS,1%青霉素/链霉素,5μg/mL胰岛素,50μM氢皮质松血酸和2%DMSO。
  3. 冷冻介质:用10%DMSO补充增殖介质。
  4. 油酸钠:在100mM浓度下溶解在99%甲醇中,搅拌O/N,储存在-20°C。
  5. 油红O:准备库存溶液。称量0.35克油红O,溶解在100 mL异丙醇中。搅拌 O/N、过滤器 (0.2 μm)并储存在 RT. 准备工作溶液:将 6 mL 的油红色 O 库存溶液与 4 mL ddH2O 混合。在室温 (RT) 下等待 20 分钟,然后用 0.2 μm 过滤器进行过滤。强烈建议进行适当的过滤,以便成功染色,避免背景。
  6. Bodipy (505/515): 以 100 μM 库存浓度在 DMSO 中溶解 Bodipy (505/515) 染料,在黑暗中储存在 -20 °C,最后 100 nM 浓度使用。
  7. 获得用于CARS实验的透明玻璃底盘。

2. 肝细胞的解冻、扩增和冷冻保存

  1. 将一批浸入37°C的浴中,直到解冻,解冻氮冷冻肝细胞。选择低通道批 (<20)。肝细胞是商用的。
  2. 迅速将细胞转移到含有10 mL增殖介质的15 mL管中,并离心5分钟(200 x g,4°C)。
  3. 丢弃上清液,用5 mL增殖培养基重新悬浮细胞。
  4. 计数细胞并稀释,以板 2.5 x 104细胞/厘米2
  5. 每 2 或 3 天续订一次介质。细胞增殖时间翻倍约24小时。
  6. 分离肝细胞时,在80%汇合3-5分钟孵育与胰蛋白酶溶液0.05%。在增殖培养基和离心机中收集细胞5分钟(200 x g,4°C)。
  7. 丢弃上清液,用5 mL增殖培养基重新悬浮细胞。
  8. 计数细胞并稀释,以板 2.5 x 104细胞/厘米2
  9. 在此阶段,通过重复步骤 2.5-2.8 来扩增细胞,以便达到适当数量的细胞以开始实验,或如步骤 2.10 中那样的冷冻保存。
  10. 要冷冻保存肝细胞,在电镀后24小时分离细胞,用胰蛋白酶溶液0.05%孵育3-5分钟。在增殖培养基和离心机中收集细胞5分钟(200 x g,4°C)。丢弃上清液,将细胞重新悬浮在1mL/批次冷冻培养基中,1.5 x 106个细胞/批次,并将这些细胞冷冻在液氮中保存。

3. 肝细胞分化(第0-21天) (图1A)

  1. 第 0 天。低密度(2.5 x 104细胞/cm2)的种子HepaRG细胞进入具有适当体积增殖培养基的培养处理皿中(图1B)。每个测定需要镀两个盘子(油红O染色,FACS分析,qPCR):一个用于控制细胞,一个用于经油处理的细胞。如果执行 CARS 测量(步骤 8),将细胞平行播种到透明的玻璃底盘中。作为对照,收获一个未经处理的碟子(增殖细胞第0天),对分化标记基因进行基因表达分析(见步骤3.6)。
  2. 第 2 天和第 4 天。用适当的增殖培养量改变培养基,让细胞生长到汇合。
  3. 第7天。细胞必须是100%的汇入 (图1C)。用1倍磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞一次。去除 1x PBS 并添加适当的分化介质体积。
  4. 第8天,第9天,第12天,15天,第18天。 用1x PBS清洗细胞一次。去除 1x PBS 并添加适当的分化介质体积。
  5. 第21天。在显微镜下观察HepaRG细胞,确保细胞是融合分化培养物的(图1D)。
  6. 作为对照,收获一个对照盘(分化细胞第21天)执行基因表达分析(步骤7)的分化标记基因(图1E)。
  7. 在第21天,分化的肝细胞可以在液氮中冷冻保存。

4. 眼膜炎的诱导(第21天至第26天)

  1. 第21天。稀释油酸钠(100 mM),具有适当体积的完整分化介质,最终浓度为250 μM (1:400)。将 99% 甲醇 1:400(与油酸钠相同体积)加入另一种异位差别介质中,进行车辆控制处理。(例如:将25 μL的烯酸钠添加到10 mL的介质中,并并行将25 μL的99%甲醇添加到10 mL的介质中)。用1x PBS清洗细胞一次,并添加车辆或钠油酸培养基。
  2. 第23天和第25天。如步骤 4.1 中那样,使用适当体积的新鲜制备介质更换介质。
  3. 第26天。通过光学显微镜观察,脂液滴积聚在经氯酸钠处理的细胞中,在细胞质中很容易作为半透明液滴可见,如图2A所示。

5. 脂质过载和脂质诱导评价:油红O染色

  1. 用1x PBS洗一次细胞,完全去除1xPBS。
  2. 加入4%的甲醛(在1xPBS中稀释),在RT孵育15分钟。
    警告:甲醛是有毒的,所以这一步必须在烟罩中进行,并配备防护设备,包括手套、实验室外套和面罩。
  3. 去除甲醛,用1x PBS清洗细胞两次。细胞可在4°C的1xPBS中保存几天,然后再染色。用铝箔包裹,用铝箔盖住,防止细胞干燥。
  4. 删除 1x PBS。在RT用60%异丙醇孵育细胞5分钟。
  5. 去除异丙醇,让细胞在RT处完全干燥。
  6. 加入油红O工作溶液,在RT孵育30分钟。每个样品所需的工作溶液量与用于培养细胞的介质量相对应。
  7. 去除油红O溶液,并立即添加ddH2O.用ddH2O清洗细胞4次。
  8. 在显微镜下获取图像进行分析 (图 2B)。
  9. 洗脱油红O染料:去除所有水,并允许干燥;加入1mL的100%异丙醇,孵育10分钟,在RT轻轻摇动。
  10. 将异丙醇与洗脱油红 O 染料上下多次移,确保所有油红 O 都在溶液中。将溶液转移到比色皿中。通过分光光度测量OD500 nm,并使用100%异丙醇作为空白(图2C)。

6. 脂质过载和脂质诱导评价:脂质染色和细胞氟度分析

  1. 用1x PBS清洗细胞一次。在37°C下,在黑暗中用100 nM的Bodipy稀释在1xPBS中孵育40分钟。流量细胞测量中应包含未染色的控制。从这一点出发,尽可能保护样品免受光线照射。
    注:每个样品所需的染色溶液量与培养细胞所用的介质体积相对应。
  2. 去除染色溶液,用1x PBS清洗细胞一次。继续执行步骤 6.3-6.6。用于FACS(荧光激活细胞分类)分析或步骤6.7进行显微镜成像。
  3. 用 1x PBS 轻轻刮擦细胞并将其转移到 15 mL 管中。离心10分钟(200 x g,4°C)。
  4. 轻轻去除上生子,而不会干扰颗粒,用 3 mL 的 1x PBS 清洗。离心5分钟(200 x g,4°C)。
  5. 取出上生子,在 300 μL 的 1x PBS 中重新悬浮,然后转移到 FACS 管中。
  6. 立即通过激发/发射波长为505/515 nm的细胞氟分析测量博迪比荧光强度(图3A,B)。
  7. 用1x PBS清洗细胞一次,并完全去除PBS。
  8. 加入4%的甲醛(在1xPBS中稀释),在RT孵育15分钟。
    警告:甲醛是有毒的,所以这一步必须在烟罩中进行,并配备防护设备,包括手套、实验室外套和面罩。
  9. 在PBS中去除甲醛,将样品清洗3次5分钟。细胞可以保存在1xPBS在4°C或立即成像(图3C)。对于存储,用铝箔包裹和盖,以防止细胞干燥。

7. 脂质过载和脂质诱导评价:qPCR

  1. 用1x PBS清洗细胞一次。用1xPBS刮取细胞,以200 x g离心,并丢弃上清液。在此步骤中,细胞可以在-80°C下收获或像步骤7.2那样进行处理。
  2. 按照制造商的说明,使用商业试剂使用标准方法执行总RNA分离。
  3. 通过 UV 分光光度测量评估 RNA 浓度,根据 A260/A280 读数确保 RNA 纯度高(接近 2.0)。
  4. 使用标准 cDNA 合成试剂盒从 1 μg 的总 RNA 合成 cDNA。
  5. 用H2O将cDNA稀释到最后50μL体积。
  6. 按 qPCR 分析三联体中的每个 cDNA 样本:准备一个 qPCR 主混合物(表 1),足以满足每个引源所需的反应,包括三个内务管理基因作为对照的引体:滑翔机-3-fosfatodeidrogenasi (GAPDH),行为素B和核糖体18S(参见材料的引物序列):
  7. 在 PCR 多壁板中每孔分配 18 μL 的主混合物。
  8. 在每个井中加入2μL的cDNA样品。密封板。
  9. 根据热循环器指令运行样品。

8. 脂质过载和脂质诱导的评估:CARS

  1. 修复了以前在玻璃底餐具上制备的细胞,如步骤 5.1-5.3 中所述。
  2. 打开商业可调皮秒脉冲激光系统,对其进行调谐以获得两个不同波长的输出。输出之间的频率差必须为2,840cm-1,才能产生与亚甲对称拉伸对应的强CARS光信号;对于 1,064 nm("斯托克斯"光)的固定波长输出,其他波长应调谐到 817 nm("泵"光)。
  3. 确保 817 nm 输出在空间和时间上与 1,064 nm 输出重叠:使用适当的二色镜(即,切割在 817 和 1,064 nm 之间)将光束进行空间组合,并使用光学延迟线获得激光的时间重叠脉冲。
  4. 确保两个共体光束均合用,且其直径具有与显微镜内光学系统相似的值,这些光学系统将聚焦到样品上;如有必要,在组合它们的二色镜前单独组合光束。
  5. 打开商用倒置显微镜系统,该系统应包括红外激光扫描单元和双通道红/绿表观检测单元,并将共丙激光束对准扫描单元。
  6. 打开双通道表观检测单元,移除滤镜立方体,并将其红色波长检测滤波器替换为带通滤波器,该滤波器可以选择 2,840 厘米-1 CARS 信号,该信号以 663 nm 为中心,用于 817/1,064 nm 泵/斯托克斯激励方案。窄带宽(20 nm)滤波器是为了避免收集高级别的荧光背景信号的首选。
  7. 将一个盘子放在倒置的CARS显微镜的舞台上,并使用100倍油浸物目标,移动目标的垂直位置,以聚焦在细胞上。
  8. 设置显微镜软件,在跨越 127 μm x 127 μm 的视场上收集高分辨率 (1024 x 1024 像素) 图像。
  9. 设置显微镜软件以连续获取和显示 127 μm x 127 μm 视场的图像,并检查显示的图像,同时优化图像收集参数。确保激光功率平衡,以便快速收集图像并减少伤害,根据需要在光束路径中插入适当的中性密度滤波器,并选择一个像素驻点时间,以便收集具有良好信号到噪声的图像在选定的激光功率条件下的比例。
  10. 在优化条件下获取并保存盘中几个不同视场的图像。或者,由绿色波长发射(主要来自 817 nm 的双光子激发)生成的多光子荧光图像可通过另一个表观探测器同时收集。对每道菜重复步骤 8.7-8.10。
  11. 对于 CARS 图像分析,使用 IMAGEJ 的 FIJI 实现处理图像。在进一步分析之前,对每幅图像操作 Despeckle 函数(或类似的去噪工具),以提高信噪比,而不会丢失细节。
  12. 使用 FIJI 手动选择细胞,然后自动计算分割的单个单元格中的脂液滴,以生成每个细胞的脂液滴区域和数字以及每个培养皿的整个图像数据集的统计信息。

9. MTT 细胞活力测定

  1. 板分化的HepaRG细胞进入96孔板,密度为1 x 105细胞/孔,在最终100μL体积的分化培养培养基。
  2. 播种后24小时,用99%甲醇(车)和100μM、250μM和500μM酸钠和棕榈酸钠在100μL的分化培养基/井中稀释的细胞。
  3. 用 99% 甲醇和 100 μM、250 μM 和 500 μM 酸钠和棕榈酸钠在 100 μL 的分化培养基/井中每 24 小时稀释一次的介质更换介质。
  4. 甲醇/烯酸钠/棕榈酸钠处理后96小时,用2μM多索鲁比素在100μL的分化培养基/井中作为对照处理细胞。
  5. 多索布辛处理后18小时,用100μL的分化培养基改变培养基。
  6. 将 20 μL 的 3-(4,5-二甲基硫磷-2-yl)-5-(3-卡博基乙氧基)-2-(4-磺苯)-2H-四氧化二氮试剂 MTT(材料表)放入含有100 μL分化培养基中细胞的96孔测定板的每个孔中.通过将 20 μL 试剂移入对照井,在三重基化的 100 μL 分化培养基中不带细胞,包括背景控制。
  7. 在加湿的5%CO2大气中在37°C下孵育板。
  8. 使用 MTT 四氧化二氮试剂孵育 30、60 和 90 分钟后,使用 96 孔板读卡器将吸光度记录在 490 nm。从其他样品的吸光度值中减去无细胞控制孔的背景吸光度。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

该协议描述了一种通过氧化钠处理在DMSO分化肝糖细胞中诱导和表征环状性骨质化的有效方法(图1A)。

肝细胞的分化。
为了有效地诱导分化,增殖细胞必须在增殖培养基中以低密度(2.5 x 104细胞/cm2)播种。当在低密度下播种时,细胞会主动分裂并获取一个长而未分化的形态(图1B)。细胞应在增殖培养基中生长7天,直到达到100%的汇合(图1C)。暴露于2%的DMSO后,细胞开始分化,形成典型的肝细胞状菌落,周围是胆皮上皮状细胞(图1D)。分化的肝细胞表达肝特异性标记,如白蛋白、Cyp3A4和Aldolase B。为了验证正确的分化,qPCR(图1E)分析了这些肝标记基因在分化细胞(第21天)和增殖细胞(第0天)中的表达水平。与增殖的肝细胞相比,白蛋白、Cyp3A4和Aldolase B基因在分化的HepaRG细胞中应得到提高调节,我们观察到了这一趋势,证实了我们分化方案的有效性。

通过酸钠治疗诱导肝糖细胞的脉孔性脂质。
dHepaRG细胞的油酸钠处理诱导脂肪积累,在光学显微镜下作为细胞质中的脂液滴可见(图2A)。为了验证粘质酶的有效诱导,对肝细胞进行了油酸处理和控制,用油红O染料染色。染色后,脂液滴很容易作为红液滴可见(图2B),可通过用异丙醇洗脱的油红O染料的分光光度测量进行量化(图2C)。洗脱油红O从细胞吸收与细胞质脂滴积累成正比。

精酸钠浓度和暴露时间由MTT色度细胞可行性测定确定(步骤9)。将酸钠治疗与棕榈酸钠治疗进行比较,将凋亡药物多索布金(2 μM)用作对照(图2D)。MTT利用含有MTT四氧化二氮的商业化合物(材料表)对化合物的毒性进行了评价。水溶性黄色MTT四氧化二氮化合物由代谢活性细胞生物转化为紫色水不溶性非溶性马赞产品。formazan 产物的吸收率为 490 nm,其量与培养中的活细胞数量成正比(图 2D)。

油酸钠处理肝糖细胞中脉虫性软体炎的定量
为了量化油酸钠处理后细胞脂质含量的增加,我们用Bodipy染料进行了染色,这是一种标记脂液滴的探针。使用细胞氟度分析,可以通过Bodipy平均荧光强度量化甘油三酯含量,与对照细胞相比,在经油酸处理的细胞中,荧光强度更高(图3A,B),表明有效脂肪油性处理后积累。事实上,Bodipy染色细胞的图像显示,在控制细胞中不可见的经油液处理的细胞中,有明亮的绿色荧光脂液滴(图3C)。

dHepaRG细胞的酸钠治疗可调节脂质代谢和炎症基因表达。为了评估水泡性脂质病的有效诱导,我们用qPCR分析了与对照细胞相比,在经钠油酸处理的细胞中选定基因的表达水平(图4)。乙酰-CoA卡贝塞酶β(ACACB),甘油-3-磷酸乙酰转移酶线粒体(GPAM),危险素(PLIN2,PLIN4),脂蛋白B(APOB),丙酸脱氢酶激酶酶是4(PDK4),肉碱棕榈基转移酶1A(CPT1A)和白细胞介素6(IL6)在经油酸处理的dHepaRG细胞中受到调节,而溶质载体家族2成员1(SLC2A1)、脂蛋白C-III(APOC3)和stearoyl-CoA脱盐酶(SCD)被降管制(图4)。为了在添加油酸钠到分化的HepaRG细胞时进一步描述和量化液滴中的脂质储存,我们采用了一种创新的显微镜技术,即相干抗斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜,使无标签的脂液滴的可视化和定量(图5A)。使用CARS图像对单细胞水平上的脂液滴在数量、分布和形态方面进行了统计量化。使用油酸钠(250 μM)治疗可导致脂滴数量显著增加(图5B),导致每个细胞的总液滴面积增加(图5C)和每细胞的液滴面积增加(图5D,与对照细胞相比,表明dHepaRG细胞在油酸钠处理后有效积累脂肪。

Figure 1
图 1:肝细胞分化。(A) 显示步骤 3 和 4 中所述的 HepaRG 细胞分化/治疗方案的代表性图。(B-D)图像显示未染色增殖的肝细胞在播种后(B)第0天,在汇合日7后播种(C),和分化的肝细胞(dHepaRG)在播种后第21天(D )。(E) 从增殖和dHepaRG细胞中提取总RNA,用qPCR对qPCR进行合成和分析,使用指定基因的引物(材料表)。样本归一化为GAPDH、活性B和核糖体18S内务管理基因的平均值。直方图显示增殖的折叠感应(第 0 天)与分化的单元格(第 21 天)(柱表示 S.D.;p 值由学生的 t 测试计算)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:氧化钠油酸处理dHepaRG细胞诱导脂滴积累。(A) 使用车辆(控制)或 250 μM 油酸钠(右图)处理 5 天的未染色分化肝糖 (dHepaRG) 细胞的图像。(B) 治疗后,细胞上沾有油红O染料;脂液滴在红色中可见。(C) 油红O染料洗脱,OD测量在570nm。结果以三个独立实验的方式表示(柱表示 S.D.;按学生 t 检验表示 p 值)。(D) dHepaRG 细胞载体 (99% 甲醇) 的细胞活力评估 (Ctrl) 处理或用酸钠和棕榈酸钠 (100 μM、 250 μM 或 500 μM) 处理 5 天,或用多索鲁布辛 (2 μM) 处理 18 h。 根据制造商的指示,使用MTT测定试剂盒(材料表)对细胞毒性进行评估,记录490nm的吸光性。结果以三个独立实验的方式表示(柱表示 S.D.;p 值是使用学生的 t 检验确定: ±0.01 = p < 0.05; ±0.001 = p < 0.01; _p < 0.01)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:通过Bodip染色处理油酸钠后脂肪积累定量。分化的肝糖(dHepaRG)细胞用车辆(控制)或250μM钠油酸处理5天。治疗后,dHepaRG细胞被沾染了博迪比染料,并通过流细胞学进行分析。(A) 代表性叠加型材(最大占比:最大染色强度的百分比)。(B) 直方图显示平均荧光强度 (MFI) 作为三个独立实验中经过处理的细胞控制百分比(柱表示 S.D.;p 值使用学生的 t 检验确定: ±0.01 = p < 0.05; ±0.001 = p < 0.01;< 0.001)。(C) 细胞用4%的甲醛固定。图片显示,在绿色中沾满血脂的血滴。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:dHepaRG细胞的油酸钠治疗诱导脂质代谢和炎症基因表达的调节。分化的肝糖(dHepaRG)细胞用车辆(控制)或250μM钠油酸处理5天。cDNA用qPCR对引基进行分析,结果归一化为GAPDH、活性B和核糖体18S内务基因的均值;引物在材料表中给出。直方图将指示基因的表达水平作为对照上处理过的细胞的折叠感应(条表示 S.D.;p 值由学生的 t 检验计算)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:CARS显微镜治疗油酸钠后脂滴积累表征。分化的肝糖(dHepaRG)细胞用车辆(控制)或250μM烯酸钠处理5天,并通过CARS显微镜进行分析。(A) 代表图像显示脂质滴 CARS 以红色对比.(B) 显示每个细胞脂滴数的直方图。(C) 直方图显示每个细胞由飞沫覆盖的总图像区域。(D) 直方图显示每细胞的飞沫覆盖的滴面积百分比。所有结果均以三个独立实验的方式表示(柱表示 S.E.;p 值由学生的 t 检验确定:[0.01] p < 0.05;±0.001 = p < 0.01;#p < 0.01)。请点击此处查看此图的较大版本。

试剂 单次反应的体积 (μL)
2x SYBR 绿色荧光染料 10
PCR 等级 H2O 6
前进底漆 (μM) 1
反向引漆 (μM) 1

表 1:qPCR 主组合。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

该协议描述了如何区分肝糖细胞,以及如何通过油酸钠治疗诱导水泡性骨质化(图1A)。事实上,与其他人类肝细胞癌 (HCC) 细胞系相比,HepaRG 细胞系具有成年人类肝细胞的特征,是外体培养原发人肝细胞13、14 的宝贵替代品 ,15.HepaRG细胞系已广泛应用于肝细胞毒性研究、药物代谢和病毒学研究15、16、22。

与肝细胞相比,其他HCC细胞系,如HepG2、HUH7、HUH6和Hep3B,其代谢能力较低,缺乏大量肝脏特异性功能23、24,并表现出较高的基础水平。细胞脂肪积累储存在脂液滴中。因此,这些HCC细胞系在脂质过载后诱导水泡性脂质的模型作用不如HepaRG细胞系。

协议中的关键步骤
当在低密度(2.5 x 104细胞/cm2)播种时,HepaRG细胞获得一个长而未分化的形态,主动分裂;在达到100%汇合后,它们能够在暴露于2%DMSO时进行区分,并形成典型的肝细胞状菌落,周围是胆道上皮状细胞(图1D)。这种混合胆细胞/肝细胞培养物重述肝脏组织的特征,类似于生理状况,尽管缺乏其他肝细胞类型(正弦细胞或库普弗)。

分化过程中的一个关键步骤是细胞的汇合。细胞必须在低密度(2.5 x 104细胞/cm2)下播种(图1B),并允许在增殖培养基中积极生长至少1周(第0-7天)。在第7天,在加入2%DMSO以开始分化过程之前,细胞必须在100%汇合处(图1C)。如果在第7天(步骤2.2)尚未达到完全汇合,强烈建议允许细胞在增殖培养基中继续生长一些额外几天,直到达到100%汇合。

协议的限制
据观察,加入分化培养基后,一些细胞会受损,通常10%的细胞在随后的2-3天内死亡。在此阶段,必须继续每天清洗和更换介质(步骤 2.4),以丢弃漂浮的死细胞。使用特定的FBS(材料表)来补充分化和增殖介质,应可提高7-21天(步骤2.4)期间的分化效率和降低细胞死亡。强烈建议将细胞保持至通道20,并选择较低的通道(<20)来区分细胞:最年轻的HepaRG细胞的细胞死亡较少。此外,HepaRG分化在35毫米和60毫米的菜肴中似乎更有效,而当在100毫米和150毫米的菜中播种时,细胞往往遭受更多。

修改和故障排除
暴露于棕榈酸和油性脂肪酸的不同比例已被证明会导致形成内西体血脂液滴25,26。然而,我们观察到,在脂质积累和细胞活力的有效诱导方面,对分化的HepaRG细胞的油酸钠处理比棕榈酸暴露效果更好(图2D)。事实上,棕榈酸处理证明对分化的肝细胞有毒(图2D),与肝细胞系和人类和大鼠肝细胞原培养物的文献数据一致,将棕榈酸描述为相当细胞毒性剂25,26,27,28,29。此外,由于棕榈素的溶解度较低,在基于细胞的测定中利用棕榈素具有挑战性。然而,由于细胞系的内在变异性,建议验证油酸钠的工作浓度和治疗时间长度,在具有细胞活力测定的时程实验中测试不同浓度。

脂质检测技术的意义与比较
在这项研究中,通过许多不同的方法,建立了细胞中脂质量的准确测定。通过油红O染色、博迪比染色和CARS成像获得的结果之间观察到了定性和近似定量的一致。对于快速估计细胞群中的脂质数量,使用博迪比流细胞测定仪或油红O等染色剂是理想的选择。为了更详细地检查细胞的脂滴含量,最好采用成像方式。此外,血脂污渍(如油红 O20、30)的特异性问题也已报告,我们观察到,在某些情况下,Bodipy 染色的容量低于 CARS 专门标记其他细胞中的脂液滴的能力细胞器(未显示数据)。因此,使用无标签的显微成像技术(如 CARS)为脂部化定量和表征提供了显著的优势。与典型的荧光花相比,由于脂质分子体积小,避免使用大型荧光标签使CARS成像变得有利;因此,为了检测脂质,无标签的方法是可取的,甚至比观察大蛋白质分子更可取。脂质 CARS 信号是仅在样品中发生非线互时生成的光发射。只有当聚焦在样品上的两个激励激光器的频率与拉伸振动频率的亚甲基 (CH 2) 匹配时,才能检测到这种相互作用。脂质中亚甲基组的丰富性会产生具有高信噪比的非常强烈的信号,光学相互作用的非线性也意味着CARS显微镜中具有高空间分辨率。如本研究所示,CARS图像的优良质量一般可以收集脂液滴的大小和数量统计数据。此外,其他研究还表明,使用CARS显微镜将不同的亚细胞定位和大小脂滴与不同的治疗联系起来18,并通过使用不同波长的补充CARS测量,或宽带CARS或类似刺激拉曼的方法,研究人员已经表明,有可能描述不同类型的脂肪酸在脂滴31,32。此外,CARS图像采集的快速性使活细胞能够进行原位成像,以检查脂滴生长和聚集的时间演化33。

未来应用
近几十年来,关于脂液滴在细胞生物学中的作用和作用的观点已经演变。以前被认为是基本上惰性存储囊泡,他们现在被理解为高度动态的细胞细胞器,他们在疾病中的作用日益被承认34,35,36。虽然在肝病的情况下,脂质积累(脂质增)长期以来被认为是一个关键方面,但脂液滴参与疾病进展的确切机制并不完全清楚。因此,诸如CARS等能够描述脂液滴动态行为的方法对于发展对包括NAFLD在内的疾病的分子理解至关重要。qPCR的代谢基因表达分析对通过CARS对脂质的分子成像具有很强的互补性,如先前的研究17、18所示,有助于更深入地了解疾病机制。在本研究中,我们观察到脂肪酸的积累,其脂质代谢和炎症基因表达的调节作用有所减缓,这可能有助于构建一个用于早期疾病诊断的生物标记组。

莱酸钠处理的dHepaRG细胞模型可以增加对分子机制的了解,不仅涉及在发病,而且在NAFLD的进展,为开发更好的治疗方法的疾病的基础。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

提交人宣称,他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

我们感谢克里斯蒂安·特雷波教授(INSERM U871,法国里昂),他友好地提供了HepaRG细胞。我们感谢丽塔·阿波迪亚提供行政帮助。这项工作得到了MIUR-部长-德尔斯特鲁齐奥内、意大利大学(FIRB 2011-2016 RBAP10XKNC)和罗马萨皮恩扎大学(Prot.)的支持。C26A13T8PS;波特。C26A142MCH;波特。C26A15LSXL)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyclone HyClone Fetal Clone II  GE Healthcare SH30066
William’s E medium with GlutaMAX  Thermofisher 32551087
Penicillin/streptomycin  SIGMA P4333
Insulin  SIGMA I9278
Hydrocortisone hemisuccinate SIGMA H2270
DMSO, dimethyl sulfoxide SIGMA D2438   
Sodium Oleate SIGMA O7501 
Methanol SIGMA 179337
Isopropanol SIGMA 278475
BODIPY 505/515 Thermofisher D3921
PBS Thermofisher 14190-250
Formaldehyde solution SIGMA 252549
RNAse free DNAseI Promega M198A 
Glass-bottomed dishes Willco Wells GWST-5040
Oil Red solution SIGMA O625
CellTiter 96 AQueous One Solution Promega  G3582
q-PCR oligo name Sequence
ACACB FOR CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
β-actin FOR GCACTCTTCCAGCCTTCCT
β-actin REV AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FOR TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR GCATCTGTCAGCAGAATGGA 
ALDOB REV TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV  CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FOR CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FOR TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FOR TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FOR CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FOR ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FOR TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FOR AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REV GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR TCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REV TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FOR TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FOR CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV TTGGCAAATGCTTTCGCTC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51, (5), 1820-1832 (2010).
  2. Byrne, C. D., Targher, G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology. 62, (1), Suppl 47-64 (2015).
  3. Marra, F., Gastaldelli, A., Svegliati Baroni, G., Tell, G., Tiribelli, C. Molecular basis and mechanisms of progression of non- alcoholic steatohepatitis. Trends in Molecular Medicine. 14, 72-81 (2008).
  4. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67, (1), 328-357 (2018).
  5. Banini, B. A., Sanyal, A. J. Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Current Opinion in Gastroenterology. 33, (3), 134-141 (2017).
  6. Takahashi, Y., Sugimoto, K., Inui, H., Fukusato, T. Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 21, (13), 3777-3785 (2015).
  7. Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15, (1), 11-20 (2018).
  8. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68, (2), 230-237 (2018).
  9. Nagarajan, P., Mahesh Kumar, M. J., Venkatesan, R., Majundar, S. S., Juyal, R. C. Genetically modified mouse models for the study of nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of. Gastroenterology. 18, (11), 1141-1153 (2012).
  10. Oseini, A. M., Cole, B. K., Issa, D., Feaver, R. E., Sanyal, A. J. Translating scientific discovery: the need for preclinical models of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology International. 12, (1), 6-16 (2018).
  11. Ramboer, E., Vanhaecke, T., Rogiers, V., Vinken, M. Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes. Methods in Molecular Biology. 1250, 53-76 (2015).
  12. Gómez-Lechón, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Current Drug Metabolism. 5, (5), 443-462 (2004).
  13. Marion, M. J., Hantz, O., Durantel, D. The HepaRG cell line: biological properties and relevance as a tool for cell biology, drug metabolism, and virology studies. Methods in Molecular Biology. 640, 261-272 (2010).
  14. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, (24), 15655-15660 (2002).
  15. Anthérieu, S., Rogue, A., Fromenty, B., Guillouzo, A., Robin, M. A. Induction of vesicular steatosis by amiodarone and tetracycline is associated with up-regulation of lipogenic genes in HepaRG cells. Hepatology. 53, (6), 1895-1905 (2011).
  16. Rouge, A., et al. PPAR agonists reduce steatosis in oleic acid-overloaded HepaRG cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 276, (1), 73-81 (2014).
  17. Belloni, L., et al. Targeting a phospho-STAT3-miRNAs pathway improves vesicular hepatic steatosis in an in vitro and in vivo model. Scientific Reports. 8, 13638 (2018).
  18. Nunn, A. D. G., et al. The histone deacetylase inhibiting drug Entinostat induces lipid accumulation in differentiated HepaRG cells. Scientific Reports. 6, 28025 (2016).
  19. Donato, M. T., et al. Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells. Chemico-Biological Interactions. 181, (3), 417-423 (2009).
  20. Hellerer, T., Axäng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (37), 14658-14663 (2007).
  21. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7, (11), 51092 (2012).
  22. Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F., Guguen-Guillouzo, C. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168, (1), 66-73 (2007).
  23. Nelson, L. J., et al. Human hepatic HepaRG cells maintain an organotypic phenotype with high intrinsic CYP450 Activity/metabolism and significantly outperform standard HepG2/C3A cells for pharmaceutical and therapeutic applications. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 120, (1), 30-37 (2017).
  24. Gerets, H. H. J., Tilmant, K., Gerin, B., Chanteux, H., Depelchin, B. O., Dhalluin, S., Atienzar, F. A. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28, (2), 69-87 (2012).
  25. Pusl, T., et al. Free fatty acids sensitize hepatocytes to bile acid-induced apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371, (3), 441-445 (2008).
  26. Gentile, C. L., Pagliassotti, M. J. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Nutritional Biochemistry. 19, (9), 567-576 (2008).
  27. Mei, S., et al. Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes. Journal of Pharmacological Experimental Therapy. 339, 487-498 (2011).
  28. Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. Journal of Biological Chemistry. 281, 12093-12101 (2006).
  29. Moravcová, A., Červinková, Z., Kučera, O., Mezera, V., Rychtrmoc, D., Lotková, H. The effect of oleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity on rat hepatocytes in primary culture. Physiological Research. 64, Suppl 5 627-636 (2015).
  30. Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 133, (4), 477-480 (2010).
  31. Rinia, H. A., Burger, K. N., Bonn, M., Müller, M. Quantitative label-free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy. Biophysical Journal. 95, (10), 4908-4914 (2008).
  32. Waschatko, G., Billecke, N., Schwendy, S., Jaurich, H., Bonn, M., Vilgis, T. A., Parekh, S. H. Label-free in situ imaging of oil body dynamics and chemistry in germination. Journal of The Royal Society Interface. 13, (123), (2016).
  33. Jüngst, C., Winterhalder, M. J., Zumbusch, A. Fast and long term lipid droplet tracking with CARS microscopy. Journal of Biophotonics. 4, (6), 435-441 (2011).
  34. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862, (10), Pt B 1260-1272 (2017).
  35. Cohen, S. Lipid droplets as organelles. International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).
  36. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139, (5), 855-860 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics