मानव रक्त के म्यूटेशनलोड और क्लोनल संरचना की विशेषता

Genetics
 

Summary

कोशिकाओं में कायिक उत्परिवर्तन पैटर्न पिछले mutagenic जोखिम को प्रतिबिंबित और विकासवंशीय वंश संबंधों को प्रकट कर सकते हैं. यहाँ प्रस्तुत सूची और व्यक्तिगत hematopoietic स्टेम और जनक कोशिकाओं में दैहिक उत्परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए एक पद्धति है.

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Huber, A. R., Manders, F., Oka, R., van Boxtel, R. Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood. J. Vis. Exp. (149), e59846, doi:10.3791/59846 (2019).

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Abstract

हेमाटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं (एचपीएससी) धीरे-धीरे एक उम्र के दौरान डीएनए उत्परिवर्तन जमा, जो ल्यूकेमिया जैसे उम्र से जुड़े रोगों के लिए योगदान कर सकते हैं। उत्परिवर्तन संचय की विशेषता उम्र से जुड़े रोगों के ईटियोलॉजी की समझ में सुधार कर सकती है। यहाँ प्रस्तुत अलग-अलग HSPCs में दैहिक उत्परिवर्तनों को सूचीबद्ध करने के लिए एक विधि है, जो क्लोनल प्राथमिक सेल संस्कृतियों के पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) पर आधारित है। मूल कोशिका में मौजूद उत्परिवर्तनों को क्लोनल संस्कृति की सभी कोशिकाओं द्वारा साझा किया जाता है, जबकि कोशिका छँटाई के बाद इन विट्रो में प्राप्त उत्परिवर्तन कोशिकाओं के सबसेट में मौजूद होते हैं। इसलिए, इस विधि के लिए अलग-अलग HSPCs, जो जीवन के दौरान जमा के जीनोम में मौजूद दैहिक उत्परिवर्तनों का सही पता लगाने के लिए अनुमति देता है. दैहिक उत्परिवर्तनों की ये सूची हेमेटोपोएटिक ऊतक में सक्रिय उत्परिवर्तन प्रक्रियाओं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है और इन प्रक्रियाओं से ल्यूकेमोजेनेसिस में कैसे योगदान होता है। इसके अलावा, दैहिक उत्परिवर्तनों का आकलन करके जो एक ही व्यक्ति के कई HSPCs के बीच साझा किए जाते हैं, क्लोनल वंश संबंधों और रक्त आबादी की जनसंख्या गतिशीलता निर्धारित किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण एकल कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार में पर निर्भर करता है के रूप में, विधि पर्याप्त प्रतिकृति क्षमता के साथ hematopoietic कोशिकाओं तक सीमित है.

Introduction

अंतर्जात या बाह्य म्यूटेजेनिक स्रोतों के लिए हेमेटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं (एचपीएससी) का एक्सपोजर जीवनकालके दौरान डीएनए में उत्परिवर्तनों के क्रमिक संचय में योगदान देता है। HSPCs1 में क्रमिक उत्परिवर्तन संचय उम्र से संबंधित clonal hematopoiesis (ARCH)2,3,जो एक गैर-प्रतीक स्थिति ल्यूकेमिया-ड्राइवर उत्परिवर्तनले जाने के HSPCs द्वारा संचालित है में परिणाम कर सकते हैं। शुरू में, यह सोचा गया था कि ARCH के साथ व्यक्तियों ल्यूकेमिया2,3के लिए एक बढ़ा जोखिम है. हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है 95% ARCH के बुजुर्ग व्यक्तियों में4, द्रोह के साथ सहयोग कम स्पष्ट बनाने और क्यों ARCH के साथ कुछ व्यक्तियों अंततः करते हैं या द्रोह का विकास नहीं करते का सवाल उठा. फिर भी, HSPCs में दैहिक उत्परिवर्तन गंभीर स्वास्थ्य जोखिम पैदा कर सकते हैं, के रूप में myelodysplastic विकारों और ल्यूकेमिया विशिष्ट कैंसर चालक उत्परिवर्तनों की उपस्थिति की विशेषता है.

उत्परिवर्तन प्रक्रियाओं की पहचान करने और रक्त क्लोनिलिटी का अध्ययन करने के लिए, व्यक्तिगत HSPCs में उत्परिवर्तन संचय की विशेषता की जरूरत है. उत्परिवर्तनीय प्रक्रियाएं जीनोम में विशिष्ट पैटर्न छोड़ देती हैं, तथाकथित उत्परिवर्तनात्मक हस्ताक्षर, जिन्हें पहचाना जा सकता है और उत्परिवर्तनों के जीनोम-व्यापी संग्रह ों में मात्रा निर्धारित की जा सकतीहै। उदाहरण के लिए, यूवी प्रकाश, alkylating एजेंटों के संपर्क में, और डीएनए की मरम्मत रास्ते में दोष प्रत्येक एक अलग उत्परिवर्तन हस्ताक्षर6,7के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, उत्परिवर्तन संचय के stochastic प्रकृति के कारण, अधिग्रहीत उत्परिवर्तनों के सबसे (यदि सभी नहीं) कोशिकाओं के बीच अद्वितीय हैं. यदि एक ही व्यक्ति की अनेक कोशिकाओं के बीच उत्परिवर्तनों को साझा किया जाता है, तो यह इंगित करता है कि ये कोशिकाएं एक सामान्य पूर्वज8हैं। इसलिए, साझा उत्परिवर्तनों का आकलन करके, कोशिकाओं के बीच वंश संबंधों का निर्धारण किया जा सकता है और शाखा द्वारा एक विकासात्मक वंश के पेड़ का निर्माण किया जा सकता है। हालांकि, शारीरिक रूप से सामान्य कोशिकाओं में दुर्लभ दैहिक उत्परिवर्तनों को सूचीबद्ध करना स्वस्थ ऊतकों की पॉलीक्लोनल प्रकृति के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है।

यहाँ प्रस्तुत सही पहचान और व्यक्तिगत HSPCs के जीनोम में दैहिक उत्परिवर्तनों का निर्धारण करने के लिए एक विधि है. यह इन विट्रो में HSPCs के अलगाव और क्लोनल विस्तार शामिल है. इन क्लोनल संस्कृतियों मूल सेल के आनुवंशिक मेकअप को प्रतिबिंबित (यानी, मूल सेल में उत्परिवर्तन संस्कृति में अन्य सभी कोशिकाओं द्वारा साझा किया जाएगा). यह दृष्टिकोण हमें पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) के लिए पर्याप्त डीएनए प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है. हम पहले से पता चला है कि क्लोनल संस्कृति के दौरान इन विट्रो में जमा उत्परिवर्तन कोशिकाओं के एक सबसेट द्वारा साझा किया जाएगा. यह इन विट्रो उत्परिवर्तनों में सभी को फ़िल्टर करने में सक्षम बनाता है, क्योंकि ये विवो अर्जित उत्परिवर्तनों9की तुलना में रीड के एक छोटे अंश में मौजूद होंगे। पिछले तरीकों पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA)10का उपयोग कर WGS के लिए एक एकल कोशिका से पर्याप्त डीएनए प्राप्त किया है. हालांकि, WGA का मुख्य नुकसान जीनोम के अपने अपेक्षाकृत त्रुटि प्रवण और असंतुलित प्रवर्धन है, जो allele dropouts11में परिणाम कर सकते हैं. बहरहाल, के रूप में इस दृष्टिकोण एकल कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार पर निर्भर करता है, यह पर्याप्त प्रतिकृति क्षमता है, जो WGA निर्भर तरीकों के लिए मामला नहीं है के साथ रक्त कोशिकाओं तक ही सीमित है. इससे पहले के प्रयासों अनुक्रमण क्लोनल संस्कृतियों फीडर परतों का उपयोग करने पर भरोसा किया है एकल HSPCs12के क्लोनल प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए . हालांकि, फीडर परतों से डीएनए संभावित क्लोनल संस्कृतियों के डीएनए दूषित कर सकते हैं, बाद में उत्परिवर्तन बुला और छानने confounding. यहाँ प्रस्तुत विधि पूरी तरह से क्लोन एकल HSPCs का विस्तार करने के लिए निर्दिष्ट माध्यम पर निर्भर करता है, और इसलिए डीएनए संदूषण के मुद्दे से बचा जाता है. अब तक, हम सफलतापूर्वक मानव अस्थि मज्जा पर इस विधि लागू किया है, गर्भनाल रक्त, viably जमे हुए अस्थि मज्जा, और परिधीय रक्त.

Protocol

नमूने उचित नैतिकता प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त किया जाना चाहिए, और दाताओं प्रक्रिया से पहले सूचित सहमति देना चाहिए.

1. नमूना सामग्री की तैयारी

नोट: जब हौसले से प्राप्त सामग्री के साथ काम कर रहे हैं, कदम 1.1 के साथ शुरू करते हैं. जमे हुए सामग्री के साथ काम करते समय, चरण 1.2 के साथ शुरू करते हैं।

  1. ताजा अस्थि मज्जा, गर्भनाल रक्त, या परिधीय रक्त की तैयारी
    1. निर्माताओं के निर्देशों का पालन करके घनत्व ढाल जुदाई का उपयोग कर के नमूने से मोनोन्यूक्लियर अंश अलग करें (सामग्री की तालिकादेखें), और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर mononuclear कोशिकाओं की गिनती। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के बाद, चरण 1.3 के साथ जारी रखें।
    2. वैकल्पिक: HSPCs की एक पूर्ण 384 अच्छी तरह से थाली सॉर्ट करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की सिफारिश की संख्या 1-2 x 107है। यदि घनत्व प्रवणता अपकेंद्रण के दौरान अधिक कोशिकाओं को पृथक कर दिया जाता है, तो कोशिकाओं के अधिशेष को द्रव नाइट्रोजन में परिरंधदेही कीजिए।
    3. IMDM के 500 डिग्री एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित + 10% FBS प्रति 1 x 107 कोशिकाओं, और ड्रॉप-बाय-ड्रॉप IMDM के एक समान मात्रा में जोड़ें + 30% FBS + 20% DMSO IMDM के 1 एमएल में 1 x 107 कोशिकाओं के निलंबन को प्राप्त करने के लिए + 20% FBS + 10% DMSO.
    4. मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को 1 एमएल क्रायोजेनिक शीशियों में तुरंत स्थानांतरित करें और रात भर एक नियंत्रित दर सेल ठंड कंटेनर में -80 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को फ्रीज करें। कोशिकाओं को अगले दिन आगे के प्रसंस्करण पर एक तरल नाइट्रोजन भंडारण के लिए स्थानांतरण।
  2. अस्थि मज्जा, गर्भनाल रक्त, या परिधीय रक्त से जमे हुए मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की तैयारी
    1. Iscove के संशोधित ईगल मध्यम (IMDM) और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 5 एमएल के 45 एमएल युक्त सेल thawing माध्यम के 50 एमएल तैयार करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में गर्म।
    2. तरल नाइट्रोजन भंडारण से नमूना युक्त शीशी ले लो, सूखी बर्फ के लिए नमूना हस्तांतरण, और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जितनी जल्दी हो सके thaw.
    3. जब नमूना लगभग thawed है, 70% इथेनॉल के साथ शीशी पोंछ और एक 50 एमएल शंकु ट्यूब के लिए अपनी सामग्री हस्तांतरण. शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए पूर्व-वार्म्ड आईएमडीएम + 10% एफबीएस के 1 एमएल के साथ शीशी कुल्ला, और धीरे ट्यूब घूमता है, जबकि thawed नमूना करने के लिए इस समाधान dropwise (5 s प्रति ड्रॉप) जोड़ें।
    4. धीरे ट्यूब घूमता है, जबकि नमूने के लिए एक अतिरिक्त पूर्व-वार्म15 एमएल IMDM + 10% FBS dropwise जोड़ें।
    5. 350 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें .
    6. सुपरनेंट के सभी लेकिन $ 3 एमएल निकालें। शेष सुपरनेंट में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और आईएमडीएम के 20 एमएल + 10% एफबीएस ड्रॉप-बाय-ड्रॉप को जोड़कर धीरे-धीरे ट्यूब को हिलाते हुए पतला करें।
    7. सेल गिनती के लिए सेल निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस ले लो. इन 10 डिग्री सेल्सियस को 0ण्4% ट्रिपन ब्लू विलयन के 20 डिग्री सेल्सियस को जोड़कर तथा हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। सेल संख्या thawing पर कम कर सकते हैं, अप करने के लिए के साथ 50% सेल हानि thawing के बाद. सेल व्यवहार्यता 70% और 90% के बीच होनी चाहिए।
  3. यदि अस्थि मज्जा या गर्भनाल रक्त कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, एमएससी संस्कृति के लिए 5 x 106 मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को ले (कदम 2.1). परिधीय रक्त के साथ काम करते हैं, टी सेल अलगाव के लिए 2-5 x 106 कोशिकाओं को ले (चरण 2.2)
  4. गोली शेष कोशिकाओं 5 350 x ग्राम पर मिनट और FACS बफर के 3 एमएल में resuspend (0.05% बीएसए + 1 एम EDTA PBS में).
  5. स्थानांतरण 1 x 105 कोशिकाओं को एक microtube के लिए एफएसीएस बफर के 200 $L से भरा है, जो प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा (चरण 3.8), और बर्फ पर रहते हैं.

2. सेल संस्कृति

नोट: दैहिक रूप से अधिग्रहीत उत्परिवर्तनों की सूची प्राप्त करने के लिए, दाता-विशिष्ट जननरेखा भिन्नता को फ़िल्टर करने की आवश्यकता है। अस्थि मज्जा बायोप्सी या गर्भनाल रक्त के साथ शुरू करते समय, mesenchymal stromal कोशिकाओं (एमएससी) germline भिन्नता के लिए फिल्टर करने के लिए मिलान नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस स्थिति में, अनुभाग 2.1 का पालन करें। का उपयोग करते समय (mobilized) परिधीय रक्त को अलग करने के लिए चरण 2.2 का पालन करें और germline भिन्नता के लिए फ़िल्टर करने के लिए मिलान नियंत्रण नमूने के रूप में टी-कोशिकाओं का उपयोग करें (चित्र 1)। थोक टी सेल आबादी HSPCs के रूप में एक ही वंश संबंध का हिस्सा होगा.

  1. एमएससी संस्कृति
    1. 50 एमएल एमएससी माध्यम तैयार करें जिसमें 45 एमएल DMEM/F12 माध्यम, 10% एफबीएस, 500 डिग्री सेल्सियस ट्रिप्सिन या ट्रिप्सिन विकल्प, और 500 डिग्री सेल्सियस पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान शामिल हैं।
    2. प्लेट लगभग 5 x 105 मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं में 1.5 एमएल एमएससी मध्यम प्रति अच्छी तरह से. कोशिकाओं को आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखकर 5% ब्व्2.
    3. 24 ज के बाद माध्यम को बदलें, और बाद में हर 3 दिनों में मध्यम की जगह सुनिश्चित करें कि सभी हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं को धोया जाता है। संस्कृति के लिए जारी रखें जब तक संगम 100% है.
    4. यदि एमएससी अनुकूल हैं, तो 1 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं और 200 डिग्री सेल्सियस ट्रिप्सिन या ट्रिप्सिन विकल्प को अच्छी तरह से जोड़कर एमएससी को फसल करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं। एमएससी माध्यम के 800 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, और कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पाइप अच्छी तरह से थाली से कोशिकाओं को ढीला करने के लिए।
    5. एमएससी को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को 350 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा गोली करें । supernatant निकालें और डीएनए अलगाव के साथ जारी रखने के लिए या बाद में डीएनए अलगाव (धारा 4) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली की दुकान।
  2. टी-सेल आइसोलेशन
    नोट: यदि उपयोग (mobilized) परिधीय रक्त, टी कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है और germline नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया.
    1. विरोधी CD3 धुंधला समाधान (1:100 FACS बफर में विरोधी सीडी एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने) के 100 डिग्री एल में सेल गोली को फिर से निलंबित.
    2. FACS बफर के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। 350 x g पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं को गोली और FACS बफर के 300 डिग्री एल में resuspend.
    3. एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब में एक FACS-सॉर्टर का उपयोग कर कम से कम 5 x 105 CD3 + कोशिकाओं को अलग करें 1 एमएल FBS के साथ पहले से भरा।
    4. 350 x gपर 5 मिनट के लिए centrifugation का उपयोग कर हल कोशिकाओं गोली, supernatant को हटाने, और डीएनए अलगाव के साथ सीधे जारी रखने (धारा 4) या बाद में डीएनए अलगाव के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली की दुकान.

3. HSPC अलगाव, छंटनी, और संस्कृति

  1. 350 x g पर 5 मिनट के लिए 1-2 x 107 मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं पर नीचे स्पिन और एफएसीएस बफर के 50 डिग्री एल में resuspend (चरण 2.2.1 देखें)। कोशिकाओं को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: जब के साथ छँटाई gt;2 x 107 कोशिकाओं, एंटीबॉडी मिश्रण और FACS बफर संस्करणों तदनुसार वृद्धि.
  2. सारणी 1में दिखाई देने वाली विधि के अनुसार 2x एचएससी धुंधला मिश्रण का 50 डिग्री सेल्सियस तैयार करें।
एंटीबॉडी मात्रा [L]
BV421-CD34 5
FITC-लाइनेज मिश्रण (सीडी3/ 5
पीई-सीडी38
एपीसी- सीडी 90 0.5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA 5
PE/Cy7- CD49f 1
FITC - सीडी16 1
FITC-CD11 5
FACS बफर 25.5

तालिका 1: HSC छँटाई मिश्रण. दिखाया गया एक तालिका है जो एचएससी को सॉर्ट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने को दर्शाती है।

  1. तैयार एचएससी धुंधला मिश्रण के साथ सेल समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस मिलाएं और कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें या एंटीबॉडी को बांधने के लिए बर्फ पर 1 एच के लिए।
  2. 350 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगिंग द्वारा 1 एमएल एफएसीएस बफर और गोली जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  3. एफएसीएस बफर के 300 डिग्री एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और एक 35 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें-कैप्ड 5 एमएल पॉलीस्टाइरीन ट्यूब फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) से पहले सेल क्लंप्स को हटाने के लिए।
  4. एचएसपीसी संस्कृति माध्यम के 25 एमएल तैयार करें, जिसमें 1x एसएफईएम माध्यम शामिल है जिसमें 100 एनजी/एमएल एससीएफ, 100 एनजी/एमएल फ्लेट3, 50 एनजी/एमएल टीपीओ, 10 एनजी/एमएल आईएल-3, 20 एनजी/एमएल आईएल आईएल-6, और 100 एनजी/एमएल एंटीबायोटिक तैयार करना (सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से HSPC संस्कृति माध्यम के 75 डिग्री के साथ एक 384 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट भरें.
    नोट: बाहरी कुओं में माध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए, बाहरी कुओं को बाँझ पानी या पीबीएस के 75 डिग्री सेल्सियस से भरें, और सेल छँटाई के लिए इन कुओं का उपयोग न करें।
  6. एकल HSPCs सॉर्ट करना
    1. एक बेदाग नियंत्रण (कदम 1.9) और दाग नमूना से 10,000 कोशिकाओं के आधार पर HSPC छँटाई के लिए द्वार सेट करें. द्वार स्थापित करने के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम चित्र 1में दर्शाया गया है। रेखीय FSC-ऊँचाई बनाम FSC-क्षेत्र अंश के चारों ओर एक गेट ड्राइंग द्वारा गेट एकल कोशिकाओं. वंश- अंश के लिए गेट आकर्षित करने के लिए unstained नियंत्रण अंश का प्रयोग करें। CD34+ कोशिकाओं के लिए द्वार ड्रा और आगे CD38 के लिए एक विशिष्ट गेट की स्थापना करके इस सबसेट की विशेषता- CD45RA- कोशिकाओं.
    2. एफएसीएस मशीन पर 384 अच्छी तरह से प्लेट लोड और एकल कोशिकाओं को सॉर्ट करें।
      नोट: यदि FACS-मशीन के लिए लागू है, तो अनुक्रमणिका सॉर्टिंग डेटा सॉर्ट करने के लिए सॉर्ट किए गए कक्षों के पुन: ट्रैकिंग सक्षम करने के लिए रखने के लिए विकल्प पर टॉगल करें।
  7. culturing singly-sorted एचएससी
    1. 384 कूप प्लेट को 5% ब्व्2के साथ एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सीधे स्थानांतरित करें .
      नोट: संस्कृति के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए, पारदर्शी पॉलीथीन लपेटो में 384 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट (लड के साथ) लपेटो.
    2. 3-4 सप्ताह के लिए इनक्यूबेटर में 384 अच्छी तरह से प्लेट रखें जब तक दिखाई क्लोन दिखाई देते हैं। क्लोनल संस्कृति के प्रतिनिधि चित्र चित्र 2में चित्रित किए गए हैं। इनपुट सामग्री की स्थिति के आधार पर 5%-30% सॉर्ट किए गए कक्षों का क्लोनरूपी विस्तार होगा।

4. हार्वेस्टिंग एचएसपीसी क्लोन

  1. culturing के 4 सप्ताह के बाद, निर्धारित जो कुओं 30% या अधिक का एक संगम है.
  2. पीबीएस में 1% बीएसए के 1 एमएल के साथ 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब (प्रत्येक क्लोनल आउटग्रोथ के लिए) प्री-फिल () 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब और इसी कुएं के अनुसार ट्यूब को लेबल करें।
  3. पीबीएस में 1% बीएसए के साथ एक पिपेट टिप पूर्व गीला करने के लिए pippette टिप से चिपके हुए कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए।
  4. एक 200 डिग्री पिपेट (75 डिग्री सेल्सियस पर सेट) के साथ अच्छी तरह से जमकर (कम से कम 5 बार) में मध्यम पाइप्ट और अच्छी तरह से कोशिकाओं को ढीला करने के लिए अच्छी तरह से नीचे परिमार्जन, और अच्छी तरह से करने के लिए इसी लेबल microtube में सेल निलंबन इकट्ठा.
  5. पीबीएस में ताजा 1% बीएसए के 75 डिग्री सेल्सियस ले लो और कोशिकाओं की अधिकतम तेज सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से पाइपिंग दोहराने।
    नोट: क्लोनली सुसंस्कृत कोशिकाओं को अच्छी तरह से नीचे से चिपके रह सकते हैं. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं को एकत्र किया गया है, एक मानक उल्टे प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके कुओं का निरीक्षण करें।
  6. यदि सभी कुओं के साथ और 30% संगम काटा गया है, 384 अच्छी तरह से थाली वापस इनक्यूबेटर में जगह है. क्लोनल संस्कृतियों अप करने के लिए 5 सप्ताह के लिए proliferate कर सकते हैं.
  7. 350 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन नीचे स्पिन . एक छोटी सी गोली दिखाई जानी चाहिए.
  8. ध्यान से सभी लेकिन supernatant के बारे में 5 डिग्री एल हटा दें। कोशिका छर्रों -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए और डीएनए अलगाव से पहले कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

5. डीएनए अलगाव

  1. निम्न समायोजन के साथ निर्माता के निर्देश के अनुसार एक सूक्ष्म पैमाने पर डीएनए अलगाव किट का उपयोग कर HSPC और एमएससी / टी-सेल डीएनए अलग करें:
    1. अनुभाग 2 के दौरान बफर AL के अलावा के बाद RNase A के 2 $L जोड़ें। प्रोटीनाज के जोड़ने से पहले 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    2. 10 मिनट के बजाय 56 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    3. कम EDTA (10 एमएम Tris, 0.1 M EDTA) के साथ TE बफर के 50 डिग्री एल के साथ कॉलम लोड करके डीएनए Elute. इष्टतम elution के लिए, स्तंभ पर फिर से eluate पुनः लोड और फिर से स्पिन.
  2. डीएनए मापने का उपयोग कर डीएनए एकाग्रता का निर्धारण 2 $L प्रति क्लोन. डीएनए की उपज आमतौर पर 0ण्5-3 एनजी/जेडएल के बीच भिन्न होती है।

6. अनुक्रमण

  1. JAGer एट अल द्वारा वर्णित के रूप में डीएनए अनुक्रमण प्रदर्शन13

7. मानचित्रण और कायिक उत्परिवर्तन कॉलिंग

  1. अनुक्रमण के आउटपुट को संदर्भ जीनोम में मैप करें तथा जगर एट अल13 में वर्णित उत्परिवर्तनों को कॉल करें।
  2. इस तरह के नियंत्रण मुक्त 14 के रूप में एक प्रतिलिपि संख्या विश्लेषण उपकरण का उपयोगकर अनुक्रम क्लोन और थोक डेटा में aberant karyotypic परिवर्तन के लिए डेटा का निरीक्षण करें। अब तक, हम karyotypic aberrances के साथ किसी भी HSPCs की सूचना नहीं दी है.
  3. एक काली सूची उत्पन्न करें, जिसमें नमूनों के एक स्वयं के सेट से फ़िल्टरकरने के उद्देश्यों के लिए बेजोड़ सामान्य नमूनों का एक पैनल होता है, जैसा कि पहले 13 वर्णित किया गया है, या निम्न अपलोड की गई काली सूची का उपयोग करें: ]lt;https://data.mendeley.com/datasets/9y4yhwt5rp/3;.
  4. SNVFI और lt;https://github.com/ToolsVanBox/SNVFI और का उपयोग करके एकल न्यूक्लिओटाइड विविधताओं को फ़िल्टर करें।
    1. प्रीसेट SNVFI.config फ़ाइल, जैसे कि सहायक फ़ंक्शन के लिए सभी पथ सही हैं।
    2. पूरक फ़ाइल 1 (SNVFI.ini) में देखी गई सेटिंग्स के अनुसार कॉन्फ़िगर किया गया .ini फ़ाइल के साथ SNVFI चलाएँ। इन विट्रो प्रेरित उत्परिवर्तनों को बाहर करने के लिए हम एक VAF के लिए फिल्टर $0.39.
  5. SNVFI के भिन्न Allele अंश (VAF) आउटपुट की जाँच करें (चित्र 4). जाँच करें कि क्या घनत्व साजिश की चोटी 0.5 के पास है, नमूना क्लोनल है संकेत.
  6. वैकल्पिक: जीनोम जो छानने के दौरान कवर किया जाता है के भाग का निर्धारण करने के लिए, GERMline और नियंत्रण GATK से CallableLoci का उपयोग कर के साथ callable क्षेत्रों का निर्धारण (Genome विश्लेषण ToolKit):
    जावा -जार जीनोमविश्लेषणTK.zar |
    -T CallableLoci |
    -R reference.fasta |
    -I myreads.bam |
    -summary table.txt |
    -o callable]status.bed
  7. वैकल्पिक: CallableLoci उत्पादन से Callable क्षेत्रों को पुनः प्राप्त करें और नमूने और अजगर स्क्रिप्ट CallableLoci-processor.py का उपयोग कर के बीच pairwise intersections प्रदर्शन https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . परिणामस्वरूप बिस्तर फ़ाइलों को आगे SNVFI के उत्पादन को फ़िल्टर करने के लिए और खंड 9 में उत्परिवर्तन प्रोफ़ाइल का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:
    CallableLoci[processor.py dir]in dir[out sample]name bulk]name -samples sample1 sample2 sample3

8. इंडल कॉलिंग

  1. GATK SelectVariants का उपयोग करके raw$variants.vcf फ़ाइल में सभी सम्मिलन और विलोपन (Indels) का चयन करें:
    जावा -Xmx12G |
    -जार जीनोमAnalysisTK.zar |
    -T SelectVariants |
    -R reference[genome.fasta]
    -V raw[variants.vcf ]
    -o raw[INDELs.vcf]
    -SelectType INDEL
  2. INDELFI और lt;https://github.com/ToolsVanBox/INDELFI का उपयोग करके raw]INDELS.vcf सूची फ़िल्टर करें:
    perl INDELFI.pl -i input.vcf (चरण 8.1 से) |
    -s स्तंभ परीक्षण नमूना |
    -c स्तंभ नियंत्रण नमूना

9. म्यूटेशनल प्रोफाइल निरीक्षण

  1. चरण 7.6 से SNVFI उत्पादन से परिणामी .vcf फ़ाइलों का उपयोग करें (या वैकल्पिक callable loci विश्लेषण के साथ चरण 7.9 से) जीनोमिक उत्परिवर्तन प्रोफ़ाइल, उत्परिवर्तन प्रकार, और हस्ताक्षर विश्लेषण का विश्लेषण करने के लिए आर पैकेज MutationalPatterns15का उपयोग कर: और lt;http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/MutationalPatterns.html प्रतिनिधि आउटपुट के लिए जो परिणामी .vcf फ़ाइल जैसे कि 96-trinucleotide उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम के साथ उत्पादित किया जा सकता है, चित्र 5देखें।

10. बेस प्रतिस्थापन का उपयोग कर एक विकासात्मक वंश के पेड़ का निर्माण

  1. एक विकासात्मक वंश के पेड़ का निर्माण करने के लिए, क्लोन के बीच साझा उत्परिवर्तनों का पता लगाने। वंश वृक्ष की पहली शाखाओं में उपस्थित उत्परिवर्तन भी थोक नमूने (एमएससी/टी-कोशिकाओं) में उप-सीएलएन रूप से उपस्थित हो सकते हैं। बाद में शाखा वंश केवल HSPC क्लोन द्वारा साझा उत्परिवर्तनों द्वारा परिभाषित किया जाएगा.
  2. उन उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए जो क्लोन के सबसेट में मौजूद हैं और थोक में मौजूद हैं, निम्न चरणों का पालन करें।
  3. क्लोन के बीच साझा दैहिक उत्परिवर्तनों के लिए फ़िल्टर करने के लिए, यूनिक्स-आधारित टर्मिनल में filterSomatic.py स्क्रिप्ट चलाएँ। स्क्रिप्ट https://github.com/ToolsVanBox/filterSomaticमें पाया जा सकता है. इस स्क्रिप्ट को चलाने से पहले, पथ सेट करें और अन्य पैरामीटर समायोजित करने के लिए filterSomatic.ini फ़ाइल संपादित करें (पूरक फ़ाइल 2देखें).
  4. भागो filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py -i filterSomatic.ini).
  5. उन उत्परिवर्तनों के लिए फ़िल्टर करें जो कि कम-से-कम VAF-bulk का उपयोग करके बल्क में मौजूद होते हैं. एक यूनिक्स आधारित टर्मिनल में आर स्क्रिप्ट. स्क्रिप्ट https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_mutsपर पाया जा सकता है . यह साझा और अद्वितीय SNVs के लिए अलग .vcf फ़ाइलें जनरेट करेगा:
    Rscript Determine[lowVAF]bulk. आर
    --vcf Path/To/Filter[somatic]output.vcf
    --bulk]नाम
    --sample]नाम नमूना नाम
    --gender [M] एफजेड
    --out[dir out]dir
  6. क्लोन जो सभी उत्परिवर्तन पदों ओवरलैपिंग द्वारा थोक नमूने में मौजूद नहीं हैं के बीच साझा सभी उत्परिवर्तनों का निर्धारण (संवदेषित कॉलम 1 और 2 SNVFI उत्पादन के).
  7. आईजीवी 16 का उपयोग करते हुए मैनुअल निरीक्षण द्वारा चरण10.5 और 10.6 के दौरान प्राप्त झूठे सकारात्मकों को छोड़ दें। उत्परिवर्तनों को गलत माना जाता है जब उपस्थित न हों, जब उत्परिवर्तन जर्मलाइन में मौजूद होता है या जब खराब प्रतिचित्रित क्षेत्रों में होता है, तो चित्र 7को देखें।
    नोट: हम अत्यधिक स्वतंत्र रूप से लक्षित या sanger अनुक्रम का उपयोग कर सभी साझा loci फिर से अनुक्रम करने के लिए सलाह देते हैं।
  8. चरण 10.1 और 10.2 के दौरान प्राप्त साझा उत्परिवर्तनों का उपयोग करें, उत्परिवर्तनों बनाम अनुक्रम क्लोनों की एक द्विआधारी तालिका का निर्माण करने के लिए, 0 के साथ यह दर्शाता है कि उत्परिवर्तन मौजूद नहीं है और 1 उत्परिवर्तन की उपस्थिति का संकेत है।
  9. आर का उपयोग कर कोशिकाओं के बीच वंश संबंधों का संकेत एक डेन्ड्रोग्राम के साथ एक हीटमैप में के रूप में उत्परिवर्तन द्विआधारी तालिका आउटपुट। हीटमैप प्रत्येक कोशिका के लिए उत्परिवर्तनों की स्थिति को इंगित करता है। इस फलन का आउटपुट देखिए (चित्र 6)
            
    क्लोन ;lt;- read.table("Path/To/BinaryTable")
            
    my]palette[lt;- colorRampPalette(c("#cccccc", "#333333"))(n ] 2)
    कोल-ब्रेक्स;- ग(0,0.5,1)
            
    heatmap.2 (क्लोन, distfun]function(x) dist (x, method ] 'binary'),
    hclustfun]function(x) hclust(x, method ] औसत),
    डेन्ड्रोग्राम [ "स्तंभ", Rowv ] F,
    col[my]palette, टूट जाता है[col]breaks,
    ट्रेस करें["कोई नहीं", घनत्व.info]"कोई नहीं")

Representative Results

प्रायोगिक प्रक्रिया
प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह चित्र 1में दर्शाया गया है. इनपुट सामग्री के प्रकार के आधार पर, विभिन्न चरणों का पालन किया जाना चाहिए। चित्र 2 में गर्भनाल रक्त कोशिका प्रकार का प्रवाह साइटोमेट्रिक आउटपुट दर्शाया गया है। सबसे पहले, सभी monocytic कोशिकाओं ढीला इस आबादी के आसपास एक गेट ड्राइंग द्वारा चयन कर रहे हैं. फिर, एकल एक रेखीय FSC-H/FSC-A अनुपात के साथ कोशिकाओं के लिए चयन करके अलग कर रहे हैं, के रूप में एक कम FSC-H/FSC-A अनुपात doubts या सेल clumps शामिल हैं. बिना दाग वाले नियंत्रण नमूने का प्रयोग वंश के सेल छँटाई द्वारों को परिभाषित करने के लिए किया जाता है-, सीडी 34+, सीडी 38-, सीडी 45आरए-. इसके अतिरिक्त, CD90 और CD49f का उपयोग संतति कोशिकाओं या स्वयं-नवीनीकरण स्टेम कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकताहै 17 (चित्र 2)। अनुक्रमणिका सॉर्टिंग अलग-अलग कक्षों के पुन: ट्रैक करने में सक्षम बनाता है, और सॉर्ट किए गए कक्षों को भूरे रंग के बिंदुओं के रूप में चित्रित किया जाता है. सेल संस्कृति के दौरान, व्यक्तिगत क्लोन एक अलग गति से विस्तार कर सकते हैं, कुछ क्लोन 3 सप्ताह के भीतर विस्तार के साथ, जबकि अन्य क्लोन केवल पूरी तरह से संस्कृति के पांचवें सप्ताह तक विस्तार कर रहे हैं. प्रतिनिधि कॉलोनी के लिए चित्र 3A,B देखें। एक प्रतिनिधि चित्र चढ़ाना के बाद 11 दिनों में एक लगभग confluent एमएससी थोक संस्कृति का दिखाया गया है (चित्र 3C) .

अनुक्रमण और उत्परिवर्तन विश्लेषण के बाद गुणवत्ता की जाँच
दिखाया गया प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन के लिए जाँच करने के लिए नियंत्रण-FreeC14 द्वारा जनरेट की गई प्रतिलिपि संख्या विश्लेषण का एक उदाहरण आउटपुट है (चित्र 4)। Karyotypic जानकारी जो गुणसूत्रों एक SNVFI चलाने के दौरान बाहर करने के लिए संकेत कर सकते हैं (चरण 7.6). SNVFI द्वारा बनाई गई VAF साजिश (चित्र 5) नमूने में संस्करण allele आवृत्तियों का एक हिस्टोग्राम है. 0.5 पर घनत्व भूखंड में एक चोटी नमूना क्लोनल है इंगित करता है। उत्परिवर्तनों के पीछे अंतर्निहित जैविक कारणों में अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, इन का विश्लेषण आर पैकेज म्यूटेशनल पैटर्न्स15का उपयोग करके किया जा सकता है। यहाँ चित्रित एक विशिष्ट विश्लेषण है जो 96-ट्रिन्यूक्लिओटाइड आलेख का निर्माण करता है (चित्र 6)। विभिन्न उत्परिवर्तन प्रकार के परिमाणीकरण के अलावा, हस्ताक्षर निष्कर्षण भी इस उपकरण के साथ किया जा सकता है.

एक विकासात्मक वंश के पेड़ का निर्माण
क्लोन के बीच साझा उत्परिवर्तन या एक क्लोन में मौजूद (और कम VAF पर) germline नियंत्रण में आईजीवी का उपयोग कर मान्य कर रहे हैं. जब नमूने में उपस्थित होते हैं तो उत्परिवर्तनों को सही माना जाता है न कि जननरेखा में उच्च VAF स्तरपर (चित्र 7क) । आईजीवी में उपस्थित न होने पर उत्परिवर्तनों को गलत माना जाता है, जो खराब मैप किए गए क्षेत्रों में हो सकता है (चित्र 7ख)। अन्य मामलों में, SNVFI द्वारा पता लगाया घटनाओं germline उत्परिवर्तनों याद कर रहे हैं (चित्र 7C). लक्षित पुन: अनुक्रमद्वारा उत्परिवर्तनों का स्वतंत्र पुन: अनुक्रमन चयनित क्लोनों में इन उत्परिवर्तनों के लिए अत्यधिक अनुशंसित है।  क्लोन के बीच साझा दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने के बाद, एक द्विआधारी मैट्रिक्स उत्पन्न होता है (चरण 10.8). एक heatmap के साथ और साझा उत्परिवर्तनए एम के बिना कोशिकाओं से युक्त निर्माण किया है. इस ताप मानचित्र के ऊपर विकासात्मक वंश वृक्ष दर्शाया गया है (चित्र 8)

Figure 1
चित्र 1: फ्लोचार्ट इनपुट सामग्री पर आधारित प्रयोगात्मक प्रक्रिया का चित्रण करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: कक्ष सॉर्टिंग रणनीति. सबसे पहले, gating छोटे मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं पर किया जाता है. दूसरा, एकल कोशिकाओं रैखिक अंश के चयन द्वारा gated रहे हैं. वंश नकारात्मक कोशिकाओं द्वार कर रहे हैं. सभी CD34+ CD38- CD45- कक्ष एकल कक्ष-सॉर्ट किए गए हैं. भूरे रंग में कोशिकाओं के अंश ध्यान दिया जाना चाहिए, जो हल किए गए कक्षों विकल्प द्वारा हाइलाइट किए गए हैं "इंडेक्स छँटाई". कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि कक्ष संस्कृति परिणाम. प्रतिनिधि HSPC एक 384 अच्छी तरह से थाली में क्लोन () चढ़ाना के बाद 2 सप्ताह और (बी) चढ़ाना के बाद 4 सप्ताह. (सी) मध्यम प्रतिस्थापन के 2 सप्ताह के बाद एमएससी संस्कृति. स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: Karyotypes. () क्लोनल एचएसपीसी संस्कृति और (बी) एमएससी थोक नमूना. केरियोटाइप्स का निर्धारण पठन-गहराई विश्लेषण द्वारा किया जाता था। दोनों रेखांकन एक karyoआमतः सामान्य नमूना संकेत मिलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: संस्करण allele आवृत्तियों के हिस्टोग्राम. SNVFI के अंतिम फ़िल्टरिंग चरण से पहले क्लोन में भिन्न रूपों की विभिन्न आवृत्तियों का हिस्टोग्राम (VAF और 0.3). VAF पर एक चोटी - 0.5 इंगित करता है कि नमूना क्लोनल है. कम VAF के साथ subclonal उत्परिवर्तनS SNVFI (VAF और 0.3) के अंतिम फ़िल्टरिंग चरण के दौरान बाहर रखा गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एक HSPC नमूने में दैहिक उत्परिवर्तनों के प्रतिनिधि उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम विश्लेषण. चित्रित कुल स्पेक्ट्रम के लिए प्रत्येक trinucleotide परिवर्तन (जिसमें से मध्य आधार उत्परिवर्तित है) के सापेक्ष योगदान है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: आईजीवी16का उपयोग कर उत्परिवर्तनों के मैनुअल निरीक्षण | (ए) जब क्लोन में उपस्थित होते हैं तो उत्परिवर्तनों को सही माना जाता है न कि थोक नमूने में। () एक खराब प्रतिचित्रित क्षेत्र में उपस्थित होने पर उत्परिवर्तनों को गलत धनात्मक माना जाता है। (ग) जब जर्मलाइन नियंत्रण में उपस्थित होते हैं तो उत्परिवर्तनों को गलत धनात्मक माना जाता है। ऊर्ध्वाधर रेखा उत्परिवर्तन नामक की स्थिति को इंगित करती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: एक विकासात्मक वंश के पेड़ का निर्माण। चित्रित एक डेंड्रोग्राम है जो विकास के दौरान विभाजित विकास वंशों को दर्शाता है। डेन्ड्रोग्राम के तहत हीटमैप विभिन्न क्लोन में उत्परिवर्तनों की उपस्थिति को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत उत्परिवर्तनों कि व्यक्तिगत HSPCs में जीवन के दौरान जमा का पता लगाने के लिए और इन उत्परिवर्तन डेटा का उपयोग कर एक प्रारंभिक विकासवंशी पेड़ का निर्माण करने के लिए एक विधि है.

कई महत्वपूर्ण आवश्यकताओं को पूरा किया जाना चाहिए ताकि सफलतापूर्वक इन परख प्रदर्शन करने के लिए. सबसे पहले, नमूने की व्यवहार्यता सुनिश्चित की जानी चाहिए। नमूना की त्वरित हैंडलिंग प्रक्रिया की दक्षता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, विकास कारक शक्ति की हानि नकारात्मक HSPCs के क्लोनल विस्तार को प्रभावित करेगा. उच्च विकास कारक शक्ति सुनिश्चित करने के लिए, फ्रीज-थॉव चक्र से बचने और एकल-उपयोग एलिकोट्स तैयार करना महत्वपूर्ण है। तीसरा, WGS प्रदर्शन करने के बाद, उत्परिवर्तन बुला और छानने, यह क्लोनल संस्कृति की clonality मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है. संस्कृति की क्लोनता की पुष्टि करने के लिए, उत्परिवर्तनों के VAF एक karyopetically सामान्य नमूने में 0.5 के आसपास क्लस्टर चाहिए (चित्र 3). एक कम उत्परिवर्तन लोड के साथ कोशिकाओं में, इस तरह की गर्भनाल रक्त HSPCs के रूप में, यह कम उत्परिवर्तन संख्या के कारण clonality निर्धारित करने के लिए और अधिक कठिन है.

हमारे दृष्टिकोण WGS के लिए अनुमति देने के लिए एकल कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार पर निर्भर करता है. इसलिए, हमारा दृष्टिकोण क्लोनी विस्तृत करने के लिए प्रतिकृति क्षमता है जो कक्षों के लिए प्रतिबंधित है, जैसे HSPCs. हमारे हाथों में, सभी एकल-सॉर्ट किए गए कोशिकाओं के बारे में 5%-30% पर्याप्त रूप से विस्तार करने में सक्षम हैं। कम वृद्धि दर संभावित एक चयन पूर्वाग्रह में परिणाम कर सकते हैं. जैसा कि पहले चर्चा की, WGA का उपयोग करने वाले तरीके इस चयन पूर्वाग्रह को दूर कर सकते हैं क्योंकि यह तकनीक कोशिकाओं के विस्तार पर निर्भर नहीं करती है। हालांकि, WGA अपनी कमियों है, और क्लोनल प्रवर्धन सही allelic dropouts और जीनोम के साथ बराबर कवरेज के बिना पूरे जीनोम में उत्परिवर्तनों की संख्या का निर्धारण करने के लिए एकमात्र तरीका रहता है, विशेष रूप से कम सच somatic के साथ नमूनों में उत्परिवर्तन संख्या.

इस प्रकिया का उपयोग करके उत्पन्न किए गए डेटा का उपयोग हीमाटोपोइटिक प्रणाली के जातिजनों का निर्धारण करने के लिए किया जा सकता है, क्योंकि एकल कोशिकाओं में पाए गए उत्परिवर्तनों का उपयोग कोशिका वंशों को विभाजित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 6में दर्शाया गया है। आमतौर पर, एक या दो उत्परिवर्तनों एक स्वस्थ दाता1में प्रत्येक शाखा को परिभाषित कर सकते हैं. चूंकि वंशाधान के तुरंत बाद , इन पहली शाखाओं को परिभाषित करने वाले उत्परिवर्तन भी मेल-मिलाप वाले सामान्य नमूने में कम VAF के साथ उपस्थित होंगे जिसका उपयोग जर्मलाइन प्रकार1,18,19को छानने के लिए किया जाता था . इस मामले में, एमएससी जैसे गैर-हेमाटोपोइटिक कोशिकाओं का उपयोग पसंद किया जाता है क्योंकि हेमेटोपोएटिक प्रणाली से विकास के दौरान बहुत जल्दी अलग होने की उम्मीद की जाती है। चूंकि टी-कोशिकाएं हीमाटोपोएटिक मूल की हैं, इसलिए इन कोशिकाओं का उपयोग एक मेल सामान्य नमूने के रूप में germline वेरिएंट को फ़िल्टर करने के लिए किया जाता है इसलिए विकासवंशी पेड़ की जल्द से जल्द शाखाओं के निर्माण को भ्रमित कर सकता है। कुछ परिपक्व रक्त आबादी में शाखा-विशिष्ट उत्परिवर्तनों की अवतल उपस्थिति, जिसे लक्षित गहरी अनुक्रमण द्वारा मापा जा सकता है, यह संकेत देगा कि उस शाखा की संतति उस परिपक्व कोशिका प्रकार को जन्म दे सकती है। इसके अलावा, हमारे दृष्टिकोण विवो में mutagenic जोखिम के उत्परिवर्तन परिणामों का आकलन करने के लिए अनुमति देता है और अंत में यह ल्यूकेमिया विकास के लिए योगदान कर सकते हैं कि कैसे.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन के एक VIDI वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO) (no. 016.Vidi.171.023) के लिए आर वी बी के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.20 µm syringe filter Corning 431219
50 mL Syringe, Luer lock BD 613-3925
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647-50G
CD11c FITC BioLegend 301603 Clone 3.9
CD16 FITC BioLegend 302005 Clone 3G8
CD3 BV650 Biolegend 300467 Clone UCHT1
CD34 BV421 BioLegend 343609 561
CD38 PE BioLegend 303505 Clone HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5 BioLegend 304121 Clone HI100
CD49f PE/Cy7 BioLegend 313621 Clone GoH3
CD90 APC BioLegend 328113 Clone 5E10
Cell Strainer 5 mL tube Corning 352235
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover Greiner 781182
Cryogenic vial Corning 430487
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
DMEM/F12 ThermoFisher 61965059
EDTA Sigma-Aldrich E4884-500G
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 10500
GlutaMAX ThermoFisher 25030081
Human Flt3-Ligand, premium grade Miltenyi Biotech 130-096-479 Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) Stem Cell Technologies 78040.1 Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) Stem Cell Technologies 78050.1 Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human SCF, premium grade Miltenyi Biotech 130-096-695 Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human TPO, premium grade Miltenyi Biotech 130-095-752 Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Integrative Genomics Viewer 2.4 Broad Institute https://software.broadinstitute.org/software/igv/download
Iscove's Modified Eagle's Medium ThermoFisher 12440061
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC BioLegend 348701 Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Lymphoprep Stem Cell Technologies #07861 Used for Density gradient separation
PBS Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antibiotic formulation
QIAamp DNA Micro Kit Qiagen 56304
Qubit 2.0 fluorometer ThermoFisher Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32854
RNAse A Qiagen 19101
SH800S Cell Sorter Sony SH800S
StemSpan SFEM, 500 mL Stem Cell Technologies 9650
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA G-Biosciences 786-151
TrypLE Express ThermoFisher 12605-10

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