인간의 혈액의 돌연변이 하중과 클론 구성 특성화

Genetics
 

Summary

세포에 있는 체세포 돌연변이 패턴은 이전 돌연변이 노출을 반영하고 발달 혈통 관계를 밝힐 수 있습니다. 여기에 제시된 개별 조혈 줄기 및 전구 세포에서 체세포 돌연변이를 분류하고 분석하는 방법론이 제시된다.

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Huber, A. R., Manders, F., Oka, R., van Boxtel, R. Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood. J. Vis. Exp. (149), e59846, doi:10.3791/59846 (2019).

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Abstract

조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)는 백혈병과 같은 연령 관련 질병에 기여할 수 있는 수명 도중 DNA 돌연변이를 점차적으로 축적합니다. 돌연변이 축적을 특성화하면 연령과 관련된 질병의 병인에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 클론 1차 세포 배양의 전체 게놈 시퀀싱(WGS)에 기초한 개별 HSPC에서 체세포 돌연변이를 분류하는 방법이다. 본래 세포에 존재하는 돌연변이는 클로날 배양내의 모든 세포에 의해 공유되는 반면, 세포 선별 후 시험관 내에서 획득된 돌연변이는 세포의 하위 집합에 존재한다. 따라서,이 방법은 수명 동안 축적 개별 HSPC의 게놈에 존재하는 체세포 돌연변이의 정확한 검출을 할 수 있습니다. 체세포 돌연변이의 이 카탈로그는 조혈 조직에서 활성화된 돌연변이 프로세스에 귀중한 통찰력을 제공하고 이 프로세스가 백혈구 발생에 어떻게 기여하는지 제공할 수 있습니다. 추가적으로, 동일 개별의 다중 HSPC 사이에서 공유되는 체세포 돌연변이를 평가해서, 혈액 인구의 클론 계보 관계 및 인구 역학은 결정될 수 있습니다. 이 접근법은 단일 세포의 시험관 내 확장에 의존하기 때문에, 방법은 충분한 복제 잠재력을 가진 조혈 세포로 제한된다.

Introduction

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 노출은 내인성 또는 외적 돌연변이 원원에 수명 동안 DNA에 있는 돌연변이의 점진적인축적에 기여합니다 1. HSPC1에서 점진적인 돌연변이 축적은 백혈병-드라이버 돌연변이를 운반하는 HSPC에 의해 구동되는 비증상 상태인 연령과 관련된 클론 조혈(ARCH)2,3을초래할 수 있다. 처음에, ARCH를 가진 개별이 백혈병을 위한 증가한리스크가 있다는 것을 생각되었습니다 2,3. 그러나, 최근 연구는 노인 개인에 있는 ARCH의95%의 부각을 보여주었습니다 4, 악성종양과의 협회를 보다 적게 명확히 하고 ARCH를 가진 몇몇 개별이 결국 악성을 개발하지 않는 이유의 질문을 제기하. 그럼에도 불구하고, HSPC에 있는 체세포 돌연변이는 골수이형성 장애 및 백혈병이 특정 암 드라이버 돌연변이의 존재를 특징으로 하기 때문에, 심각한 건강 위험을 초래할 수 있습니다.

돌연변이 과정을 확인하고 혈액 clonality를 공부하기 위하여는, 개별 HSPC에 있는 돌연변이 축적은 특성화될 필요가 있습니다. 돌연변이 과정은 게놈에 있는 특성 패턴을 남겨, 돌연변이 의 게놈 전체 집합에서 확인되고 정량화될 수 있는 소위 돌연변이 서명5. 예를 들어, UV 광에 노출, 알킬화제, DNA 복구 경로의 결함은 각각 다른돌연변이 시그니처 6,7과연관되어 있다. 또한, 돌연변이 축적의 스토상 특성으로 인해, 후천성 돌연변이의 대부분(전부는 아님)은 세포 들 사이에서 유일하다. 돌연변이가 동일한 개별의 다중 세포 사이에서 공유되는 경우에, 이세포가 일반적인 조상 8을 공유한다는 것을 표시합니다. 따라서, 공유 돌연변이를 평가함으로써, 세포와 발달 혈통 트리 사이에 계보 관계는 가지별로 생성될 수 있다. 그러나, 생리적으로 정상 세포에 있는 희소한 체세포 돌연변이를 분류하는 것은 건강한 조직의 polyclonal 특성 때문에 기술적으로 도전적입니다.

여기에 제시된 것은 개별 HSPC의 게놈에서 체세포 돌연변이를 정확하게 식별하고 결정하는 방법이다. 이것은 시험관에서 HSPC의 격리 그리고 클론 확장을 관련시킵니다. 이러한 클론 배양은 본래 세포의 유전적 구성을 반영한다(즉, 본래 세포의 돌연변이는 배양내의 다른 모든 세포에 의해 공유될 것이다). 이 접근은 우리가 전체 게놈 순서 (WGS)를 위한 충분한 DNA를 장악하는 것을 허용합니다. 우리는 이전에 클론 배양 도중 시험관내에서 축적된 돌연변이가 세포의 부분집합에 의해 공유될 것이라는 점을 보여주었습니다. 이는 생체외 에서 획득한 돌연변이 9에 비해 더 작은 판독분획에 존재할 것이기 때문에모든 시험관내 돌연변이의 필터링을 가능하게 한다. 이전 방법은 전체 게놈 증폭(WGA)10을사용하여 WGS에 대한 단일 세포로부터 충분한 DNA를 얻었다. 그러나, WGA의 주요 단점은 게놈의 상대적으로 오류가 발생하기 쉽고 불균형한 증폭이며, 이는알레일 탈락(11)을 초래할 수 있다. 그럼에도 불구 하 고, 이 접근 은 단일 세포의 생체 외 확장에 의존, 그것은 충분 한 복제 잠재력을 가진 혈액 세포에 제한, WGA 의존적인 방법에 대 한 경우. 클론 문화권 시퀀싱을 위한 이전의 노력은 단일 HSPC12의클론 증폭을 보장하기 위해 피더 레이어를 사용하는 데 의존해 온 것입니다. 그러나, 피더 층에서 DNA는 잠재적으로 클론 배양의 DNA를 오염시킬 수 있고, 후속 돌연변이 호출 및 필터링을 혼동할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 단독으로 단일 HSPC를 복제하기 위해 지정된 배지에만 의존하므로 DNA 오염 문제를 방지합니다. 지금까지 우리는 인간의 골수, 제대혈, 유능하게 얼어 붙은 골수 및 말초 혈액에이 방법을 성공적으로 적용했습니다.

Protocol

샘플은 적절한 윤리 프로토콜에 따라 얻어야 하며, 기증자는 절차 전에 정보에 입각한 동의를 얻어야 합니다.

1. 견본 재료의 준비

참고: 갓 얻은 재료로 작업할 때는 1.1단계로 시작합니다. 냉동 재질로 작업할 때는 1.2단계로 시작합니다.

  1. 신선한 골수, 제대혈 또는 말초 혈액 준비
    1. 제조업체의 지침(재료 참조)을 따라 밀도 구배 분리를 사용하여 샘플에서 단핵 분획을 분리하고 혈세포계를 사용하여 단핵 전지를 계산합니다. 단핵 세포를 분리한 후, 1.3단계를 계속한다.
    2. 선택 사항: HSPC의 전체 384 웰 플레이트를 정렬하는 데 필요한 권장셀 수는 1-2 x 10 7입니다. 밀도 구배 원심분리 중에 더 많은 세포가 분리되면 액체 질소에 세포의 잉여를 저장합니다.
    3. IMDM 500 μL + 1 x 107 셀당 10% FBS로 셀을 다시 중단하고, IMDM + 30% FBS + 20% DMSO의 동일한 부피를 드롭 바이 드롭-드롭-드롭-드롭-바이-드롭-드롭-바이-드롭-투-드롭-바이-드롭-바이-드롭-투-드롭-바이-드롭-드롭-드롭-투-드롭-투-드롭-투-드롭-바이-드롭-드롭-드롭-드롭-바이-드롭-드롭-바이-드롭-바이-드롭-투-드롭-에 의해 1 x 107 IMDM의 1 mL에 셀 1 x 10 7 셀의 현탁을 달성 하기 위해 + 20% FBS + 10% DMSO.
    4. 단핵 세포를 1 mL 극저온 바이알로 즉시 옮기고 밤새 조절된 속도 의 세포 동결 용기에서 -80°C에서 세포를 동결시. 추가 처리 시 다음날 세포를 액체 질소 저장소로 옮김을 옮김.
  2. 골수, 제대혈 또는 말초 혈액에서 냉동 단핵 세포 준비
    1. 이스코브의 수정 된 독수리의 매체 (IMDM)의 45 mL와 태아 소 혈청 (FBS)의 5 mL를 포함하는 세포 해동 매체의 50 mL를 준비하고 37 °C 수조에서 따뜻하게하십시오.
    2. 액체 질소 저장에서 샘플을 포함하는 바이알을 가지고, 드라이 아이스에 샘플을 전송하고, 37 ° C 수조에서 가능한 한 빨리 해동.
    3. 시료가 거의 해동되면 70% 에탄올로 바이알을 닦고 내용물 50mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 한다. 미리 온난한 IMDM + 10% FBS로 바이알을 헹구어 남은 세포를 수집하고, 튜브를 부드럽게 소용돌이치면서 해동된 샘플에 이 용액을 드롭와이즈(한 방울당 5초)를 추가합니다.
    4. 미리 데운 15 mL의 IMDM + 10% FBS를 시료에 떨어뜨리면서 튜브를 부드럽게 소용돌이시도록 추가합니다.
    5. 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
    6. 상급물의 ±3 mL을 제외한 모든 것을 제거합니다. 나머지 상층부에서 세포를 다시 일시 중단하고 튜브를 부드럽게 흔들면서 IMDM + 10 % FBS 한 방울씩 20 mL를 추가하여 희석하십시오.
    7. 세포 계수를 위해 셀 현탁액의 10 μL을 가져 가라. 0.4% 트라이판 블루 용액의 20 μL을 추가하여 이러한 10 μL을 희석하고 혈세포계를 사용하여 세포를 계산하였다. 해동 시 세포 수가 감소할 수 있으며 해동 후 최대 50%의 세포 손실이 있습니다. 세포 생존력은 70%에서 90% 사이여야 합니다.
  3. 골수 또는 탯줄 혈액 세포로 작업하는 경우, MSC 배양을 위해 5 x 106 단핵 세포를 차지합니다 (단계 2.1). 말초 혈액으로 작업하는 경우, T 세포 격리를 위한 2-5 x 106 세포를 취합니다 (단계 2.2)
  4. 펠릿 잔류 세포는 350 x g에서 5분 간 FACS 완충액의 3 mL에서 재중단한다(0.05% BSA + PBS에서 1 mMEDA).
  5. 1 x 105 세포를 FACS 버퍼의 200 μL로 채워진 마이크로 튜브로 옮기고, 이는 유세포 분석 (단계 3.8)에 대한 음성 대조군역할을하고 얼음을 유지합니다.

2. 세포 배양

참고: 체세포적으로 취득한 돌연변이의 카탈로그를 장악하기 위하여는, 기증자 특정 생식선 변이를 여과될 필요가 있습니다. 골수 생검 또는 탯줄 혈액으로 시작할 때, 중간엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 생식선 변이를 위해 필터링하는 일치하는 대조군으로 사용될 수 있습니다. 이 경우 섹션 2.1을 따르십시오. (동원된) 말초 혈액을 사용하는 경우 2.2단계를 따라 T 세포를 분리하고 일치하는 대조군 샘플로서 사용하여 생식선 변이를 위해 필터링한다(도 1). 대량 T 세포 모집단은 HSPC와 동일한 계보 관계를 공유합니다.

  1. MSC 문화
    1. DMEM/F12 배지 45 mL, FBS 10% FBS, 트립신 또는 트립신 대체액 500 μL, 페니실린/스트렙토마이신 용액 500 μL을 함유한 MSC 배지 50 mL을 준비합니다.
    2. 잘 당 MSC 배지의 1.5 mL에서 약 5 x 105 단핵 세포를 플레이트. 세포를 5% CO2로 37°C에서 가습 된 인큐베이터에 놓습니다.
    3. 24 시간 후에 배지를 교체하고, 이어서 모든 조혈 세포가 씻어 내도록 3 일마다 배지를 교체하십시오. 합류가 100%가 될 때까지 배양을 계속합니다.
    4. 자미칼이 동립하는 경우, PBS의 1 mL로 세포를 세척하고 잘 당 트립신 또는 트립신 대안의 200 μL을 추가하여 자미 통을 수확. 37°C에서 5분 동안 세포를 배양한다. 800 μL의 MSC 배지를 추가하고 세포를 위아래로 피펫하여 웰 플레이트에서 세포를 느슨하게 합니다.
    5. 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 마이크로 원심 분리 튜브및 펠릿에 중후로 옮기십시오. 상층부를 제거하고 DNA 분리를 계속하거나 펠릿을 -20°C에서 저장하여 나중에 DNA 분리를 합니다(섹션 4).
  2. T 셀 분리
    참고: (동원된) 말초 혈액을 사용하는 경우, T 세포는 분리되고 생식선 대조군으로 사용될 수 있다.
    1. 항 CD3 염색 용액의 100 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다 (FACS 완충액에서 항 CD 항체의 1:100 희석).
    2. FACS 버퍼 1 mL를 추가하여 세포를 세척합니다. 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 펠렛하고 FACS 완충액의 300 μL에서 다시 중단한다.
    3. FBS 1 mL로 미리 채워진 5 mL 폴리스티렌 튜브에서 FACS 선별기를 사용하여 적어도 5 x 105 CD3+ 세포를 분리합니다.
    4. 펠렛 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리를 사용하여 분류 된 세포를 상류를 제거하고 DNA 격리 (섹션 4)로 직접 계속하거나 나중에 DNA 격리를 위해 -20 °C에서 펠릿을 저장합니다.

3. HSPC 격리, 분류 및 문화

  1. 350 x g에서 5분 동안 1-2 x 107 단핵 세포에서 스핀다운하고 FACS 버퍼의 50 μL에서 다시 일시 중단합니다(단계 2.2.1 참조). 세포를 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김으로 옮김.
    참고: >2 x 107 세포로 분류할 때, 그에 따라 항체 혼합 및 FACS 완충량을 증가시다.
  2. 1에 나타난 레시피에 따라 2x HSC 염색 믹스 50 μL을 준비한다.
항 체 볼륨 [μL]
BV421-CD34 5개
FITC-리니지 믹스 (CD3/14/19/20/56) 5개
PE-CD38 2개
APC- CD90 0.5
퍼CP/Cy5.5 - CD45RA 5개
PE/Cy7- CD49f 1개
FITC -CD16 1개
FITC-CD11 5개
FACS 버퍼 25.5

표 1: HSC 정렬 믹스. 도시된 것은 HSC를 분류하는 데 사용되는 항체의 희석을 나타내는 표이다.

  1. 50 μL의 세포 용액을 준비된 HSC 염색 혼합물과 혼합하고 실온(RT)에서 15분 동안 또는 항체가 결합할 수 있도록 얼음에 1시간 동안 세포를 배양한다.
  2. 350 x g에서5 분 동안 원심 분리하여 FACS 버퍼 및 펠릿 1 mL을 추가하여 세포를 씻는다.
  3. FACS 버퍼의 300 μL에서 세포를 다시 중단하고 형광 활성화 세포 선별 (FACS) 전에 세포 덩어리를 제거하기 위해 35 μm 세포 스트레이너 캡 5 mL 폴리스티렌 튜브를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다.
  4. 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6, 및 100 ng/mL 항생제 제제로 보충된 1x SFEM 배지로 구성된 HSPC 배양 배지 25 mL을 준비합니다(재료 참조).
  5. 384개의 웰 셀 배양플레이트를 각각 75 μL의 HSPC 배양 배지로 채웁니다.
    참고: 외부 우물에서 매질의 증발을 방지하기 위해, 멸균 수 또는 PBS의 75 μL로 외부 우물을 채우고, 세포 선별을 위해 이러한 우물을 사용하지 마십시오.
  6. 단일 HSPC 정렬
    1. 염색되지 않은 대조군(1.9단계) 및 염색된 샘플로부터 10,000개의 셀을 기반으로 HSPC 선별에 대한 게이트를 설정합니다. 게이트 설정에 대한 대표적인 결과는 그림1에 표시됩니다. 게이트 단일 셀은 선형 FSC 높이 대 FSC 영역 분율 주위에 게이트를 그립니다. 스테인드되지 않은 제어 분수를 사용하여 계보에 대한 게이트를 그립니다. CD34+ 셀에 대한 게이트를 그리고 CD38-CD45RA-셀에 대한 특정 게이트를 설정하여 이러한 서브세트를 더욱 특성화한다.
    2. FACS 기계에 384 웰 플레이트를 로드하고 단일 셀을 정렬합니다.
      참고: FACS-머신에 해당하는 경우 정렬된 셀을 다시 추적할 수 있도록 인덱스 정렬 데이터를 유지하는 옵션을 전환합니다.
  7. 선별된 HSC 배양
    1. 384웰 플레이트를 5% CO2로 가습된 37°C 인큐베이터로 직접 이송한다.
      참고: 배양 시 증발을 방지하기 위해 384 웰 배양 플레이트(뚜껑)를 투명 폴리에틸렌 랩으로 감쌉니다.
    2. 눈에 보이는 클론이 나타날 때까지 384 웰 플레이트를 인큐베이터에 3-4주 동안 보관합니다. 클론 문화의 대표적인 이미지는 그림 2에도시되어 있습니다. 입력 물질의 상태에 따라 정렬 된 세포의 5 %-30 %가 복제로 확장됩니다.

4. HSPC 클론 수확

  1. 배양 4 주 후, 어떤 우물이 30 % 이상의 합액을 가지고 있는지 결정하십시오.
  2. 사전 채우기 (각 클론 아웃성장에 대해) 1.5 mL 마이크로튜브와 1 mL의 1% BSA를 PBS에 표시하고 해당 웰에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다.
  3. PBS에서 1% BSA로 파이펫 팁을 미리 적시면 파이펫 팁에 달라붙는 셀 수를 최소화합니다.
  4. 200 μL 파이펫(75 μL에서 설정)으로 웰(75 μL)으로 매질을 위/아래로 파이펫하고 웰의 바닥을 긁어 내고, 웰에 해당하는 표지된 마이크로튜브에서 세포 현탁액을 수집한다.
  5. PBS에서 신선한 1% BSA의 75 μL을 가지고 세포의 최대 섭취를 보장하기 위해 우물에서 파이펫팅을 반복합니다.
    참고: 클로론 배양 세포는 우물의 바닥에 충실 할 수 있습니다. 표준 반전 광 현미경을 사용하여 우물을 검사하여 모든 세포가 수집되었는지 확인합니다.
  6. >30% 컨플루통이 있는 모든 우물을 수확한 경우, 384웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다. 클론 문화는 최대 5주 동안 증식할 수 있습니다.
  7. 350 x g에서 5 분 동안 셀 서스펜션을 스핀 다운하십시오. 작은 펠릿이 표시되어야합니다.
  8. 약 5 μL의 상류를 제외한 모든 것을 조심스럽게 제거하십시오. 세포 펠릿은 -20°C에서 동결되고 DNA 분리 전에 수개월 동안 보관될 수 있다.

5. DNA 격리

  1. 다음과 같은 조정을 통해 제조업체의 지시에 따라 미세 스케일 DNA 절연 키트를 사용하여 HSPC 및 MSC/T 세포 DNA를 분리합니다.
    1. 섹션 2 동안 버퍼 AL을 첨가한 후 RNase A 2 μL을 첨가합니다. 단백질성 K를 첨가하기 전에 2 분 동안 배양하십시오.
    2. 10분 대신 56°C에서 30분 동안 배양합니다.
    3. 낮은 EDTA (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA)로 TE 버퍼의 50 μL로 컬럼을 적재하여 DNA를 용해시다. 최적의 용출을 위해 열에서 용출을 다시 로드하고 다시 회전합니다.
  2. 클론당 2 μL을 측정하는 DNA를 사용하여 DNA 농도를 결정합니다. DNA 수율은 전형적으로 0.5-3 ng/μL 사이에서 변화합니다.

6. 시퀀싱

  1. Jager et al.13에 의해 설명된 대로 DNA 염기서열 분석 수행

7. 매핑 및 체세포 돌연변이 호출

  1. 시퀀싱(FASTQ 파일)의 출력을 참조 게놈에 매핑하고 Jager et al.13에 설명된 대로 돌연변이를 호출합니다.
  2. Control-FreeC14와같은 복사 번호 분석 도구를 사용하여 순차적 복제 및 벌크 데이터의 비정상적인 카요티픽 변경 에 대한 데이터를 검사합니다. 지금까지, 우리는 karyotypic 비수와 어떤 HSPC를보고하지 않았습니다.
  3. 앞에서 설명한대로자체 샘플 집합에서 필터링목적으로 비교할 수 없는 일반 샘플 패널로 구성된 블랙리스트를 생성하거나 업로드된 블랙리스트를 사용합니다.
  4. SNVFI 를 사용하여 단일 뉴클레오티드 변이를 필터링하십시오.https://github.com/ToolsVanBox/SNVFI>;
    1. 도우미 함수에 대한 모든 경로가 올바른지 미리 설정된 SNVFI.config 파일입니다.
    2. 보충 파일 1 (SNVFI.ini)에서 볼 수있는 설정에 따라 구성된 .ini 파일로 SNVFI를 실행합니다. 시험관 내 유도 돌연변이를 제외하기 위해 VAF≥0.3 9에 대해 필터링합니다.
  5. SNVFI의 변형 알레일 분획(VAF)출력을 확인합니다(그림 4). 밀도 플롯의 피크가 0.5에 가까스인지 확인하여 샘플이 복제임을 나타냅니다.
  6. 선택 사항: 필터링 중에 다루어지는 게놈 부분을 확인하려면 GATK(게놈 분석 도구 키트)의 CallableLoci를 사용하여 생식선을 따라 호출 가능한 영역을 결정하고 제어합니다.
    자바 - 항아리 게놈 분석TK.jar \
    -T 캘러블로치 \
    -R 레퍼런스.fasta \
    - 나는 myreads.bam \
    -요약 표.txt \
    -o 콜러블_스테이터스.베드
  7. 선택 사항: CallableLoci 출력에서 호출 가능한 영역을 검색하고 https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor 있는 파이썬 스크립트 CallableLoci_processor.py를 사용하여 샘플과 대량 간의 쌍별 교차를 수행합니다. . 생성된 침대 파일은 SNVFI의 출력을 추가로 필터링하고 섹션 9의 돌연변이 프로파일을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
    CallableLoci_processor.py dir_in dir_out 샘플_name bulk_name -샘플1 샘플2 샘플3

8. 인델 콜링

  1. GATK SelectVariants를 사용하여 raw_variants.vcf 파일에서 모든 삽입 및 삭제(Indels)를 선택합니다.
    자바 - Xmx12G \
    -항아리 게놈분석TK.jar \
    -T 선택변형 \
    -R 레퍼런스_게놈.fasta \
    -V raw_variants.vcf \
    -o raw_INDELs.vcf \
    - 선택 유형 인델
  2. INDELFI를 사용하여 raw_INDELS.vcf 목록을 필터링하십시오.https://github.com/ToolsVanBox/INDELFI>:
    펄 INDELFI.pl -i input.vcf (단계 8.1에서) \
    -s 열 테스트 샘플 \
    -c 컬럼 제어 샘플

9. 돌연변이 프로파일 검사

  1. 7.6단계(또는 선택적 호출 가능한 loci 분석)의 SNVFI 출력의 결과 .vcf 파일을 사용하여 R 패키지 돌연변이 패턴15:를 사용하여 게놈 돌연변이 프로필, 돌연변이 유형 및 시그니처 분석을 분석합니다. 96-삼뉴클레오티드 돌연변이 스펙트럼과 같은 생성된 .vcf 파일로 생성될 수 있는 대표적인 출력의 경우 그림5를 참조하십시오.

10. 기본 대체를 이용한 개발 계보 트리 구축

  1. 개발 계보 트리를 구성하려면 클론 간에 공유 돌연변이를 검색합니다. 계보 트리의 첫 번째 분기에 존재하는 돌연변이는 또한 벌크 샘플 (MSCs / T 세포)에 subclonally 존재 할 수 있습니다. 나중에 분기 계보는 HSPC 클론에 의해서만 공유되는 돌연변이에 의해 정의될 것입니다.
  2. 클론의 서브집합에 존재하고 서브클로나에 존재하는 돌연변이를 확인하려면 다음 단계를 수행한다.
  3. 클론 간에 공유되는 체세포 돌연변이를 필터링하려면 Unix 기반 터미널에서 filterSomatic.py 스크립트를 실행합니다. 스크립트는 https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. 이 스크립트를 실행하기 전에 filterSomatic.ini 파일(보충 파일 2참조)을 편집하여 경로를 설정하고 다른 매개 변수를 조정합니다.
  4. filterSomatic.py 실행(파이썬3 filterSomatic.py -i filterSomatic.ini).
  5. Determine_lowVAF_bulk를 사용하여 대문자로 존재하는 돌연변이에 대한 필터링입니다. 유닉스 기반 터미널의 R 스크립트입니다. 스크립트는 https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. 이렇게 하면 공유 및 고유 SNV에 대해 별도의 .vcf 파일이 생성됩니다.
    Rscript 결정_lowVAF_벌크. R
    --vcf 경로/받는 것/필터_somatic_output.vcf
    --대량 벌크_이름
    --sample_name 샘플 이름
    -성별 [M| F]
    --out_dir 아웃_디르
  6. 모든 돌연변이 위치(SNVFI 출력의 컬럼 1 및 2를 연결)를 겹쳐서 벌크 샘플에 존재하지 않는 클론 간에 공유되는 모든 돌연변이를 결정합니다.
  7. IGV 16을 사용하여 수동 검사를 통해 10.5 단계 및10.6 단계에서 얻은 거짓 긍정을 제외합니다. 돌연변이는 존재하지 않을 때, 돌연변이가 생식선에 존재할 때 또는 제대로 매핑되지 않은 지역에 존재하는 경우 거짓으로 간주됩니다, 그림7을 참조하십시오.
    참고: 표적 또는 sanger 시퀀싱을 사용하여 모든 공유 로시를 독립적으로 재시퀀싱하는 것이 좋습니다.
  8. 10.1 단계 및 10.2 단계 동안 수득된 공유 돌연변이를 사용하여 돌연변이가 존재하지 않는다는 것을 나타내는 0과 돌연변이의 존재를 나타내는 0과 함께 돌연변이의 이진 테이블을 구축합니다.
  9. R을 사용하여 세포 간의 계보 관계를 나타내는 덴드로그램과 함께 히트맵에서와 같이 돌연변이 이진 테이블을 출력합니다. 히트맵은 각 셀에 대한 돌연변이 상태를 나타냅니다. 이 함수의 출력을참조하십시오(그림 6).
            
    클론 <- read.table("경로/에/바이너리 테이블")
            
    my_팔레트 & - 색상램팔레트(c("#cccccc", "#333333")(n = 2)
    콜브레이크 &- c (0,0.5,1)
            
    히트맵.2(클론, distfun=function(x) dist(x, 방법 = '바이너리'),
    hclustfun=함수(x) hclust(x, 방법 = 평균),
    덴드로그램 = "열", Rowv = F,
    콜=my_팔레트, 브레이크=콜_브레이크,
    추적="없음", density.info="없음")

Representative Results

실험 절차
실험 워크플로는 그림1에 설명되어 있습니다. 입력 재료의 유형에 따라 다른 단계를 따라야 합니다. 2에서 코드 혈 세포 정렬의 유동 세포 측정 출력이 도시되어 있다. 첫째, 모든 단핵 세포는 느슨하게이 인구 주위에 게이트를 그려선택됩니다. 그런 다음, 싱글트는 더 낮은 FSC-H/FSC-A 비율이 더블트 또는 셀 덩어리를 포함하기 때문에 선형 FSC-H/FSC-A 비율을 가진 셀을 선택하여 단리된다. 스테인드되지 않은 제어 샘플은 계보에 대한 셀 정렬 게이트를 정의하는 데 사용됩니다- ,CD34+, CD38-, CD45RA-. 부가적으로, CD90 및 CD49f는 선조 세포 또는 자가 갱신 줄기세포(17)를 구별하기 위해 사용될 수 있다(도 2). 인덱스 정렬을 사용하면 개별 셀을 다시 추적할 수 있으며 정렬된 셀은 갈색 점으로 표시됩니다. 세포 배양 도중, 개별 클론은 다른 속도로 확장할 수 있습니다, 몇몇 클론은 3 주 안에 확장하는 상태에서, 그밖 클론은 배양의 다섯 번째 주까지만 완전히 확장되는 동안. 대표적인 식민지 의 성장은 그림 3A, B를 참조하십시오. 대표적인 사진은 도금 후 11일 에서 거의 동급MSC벌크 배양에 대한 도시(도 3C).

시퀀싱 및 돌연변이 분석 후 품질 확인
도시된 것은 Control-FreeC14에 의해 생성된 복사 수 분석의 예출력으로, 복사수 변경을 확인한다(도 4). Karyotypic 정보는 SNVFI 실행 중에 제외할 염색체를 나타낼 수 있습니다(단계 7.6). SNVFI에 의해 생성된 VAF 플롯(그림 5)은 샘플에서 변이체 알레르 주파수의 히스토그램이다. 밀도 플롯의 피크가 0.5이면 샘플이 복제임을 나타냅니다. 돌연변이 의 뒤에 근본적인 생물학 원인에 있는 추가 통찰력을 얻기 위하여는, 이들은 R 포장 돌연변이 패턴15를사용하여 분석될 수 있습니다. 여기서 도시된 96-삼뉴클레오티드 플롯을생성하는 전형적인 분석(도 6). 다른 돌연변이 유형의 정량화 외에도 이 도구를 사용하여 시그니처 추출을 수행할 수도 있습니다.

개발 계보 트리 구축
클론 사이에 공유되거나 클론 (및 낮은 VAF에서)에 존재하는 돌연변이는 IGV를 사용하여 검증됩니다. 돌연변이는 생식선에서 높은 VAF 수준이 아닌 시료에 존재할때 사실로 간주된다(도 7A). 돌연변이는 IGV에 존재하지 않을 때 거짓으로 간주되며, 이는제대로 매핑되지 않은 영역에서 발생할 수 있다(그림 7B). 다른 경우에, SNVFI에 의해 검출된 사건은 세균선돌연변이를 놓친다(도 7C). 표적 재염기에 의한 돌연변이의 독립적인 재염기는 선택된 클론에서 이러한 돌연변이에 대해 적극 권장된다.  클론 들 간의 공유 체세포 돌연변이의 검출 후, 이진 매트릭스가 생성된다 (단계 10.8). 히트맵은 공유 돌연변이 A-M의 유무에 관계없이 세포를 포함하는 구성됩니다. 이 히트맵 위에 는 발달 혈통트리가 표시됩니다(그림 8).

Figure 1
그림 1: 입력 재료를 기반으로 한 실험 절차를 묘사하는 순서도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 셀 정렬 전략. 첫째, 게이팅은 작은 단핵 세포에서 수행됩니다. 둘째, 단일 셀은 선형 분획의 선택에 의해 게이트됩니다. 계보 음세포가 게이트됩니다. 모든 CD34+ CD38- CD45- 셀은 단일 셀 정렬됩니다. 갈색의 셀 의 분율은 "인덱스 정렬"옵션으로 강조 표시된 정렬 된 셀입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 대표적인 세포 배양 결과. 대표적인 HSPC 클론은 도금 후 2주 후(A) 384웰 플레이트에서 도금 후 4주 후에 클론한다. (C) MSC 배양 후 2 주 간의 중간 교체. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 카요타입. (A) 클론 HSPC 배양 및 (B) MSC 대량 샘플. 핵종은 읽기 심도 분석에 의해 결정되었다. 두 그래프 모두 karyo전형 정상 샘플을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 변이체 말기 주파수의 히스토그램. SNVFI (VAF >0.3)의 마지막 필터링 단계 전에 복제본에서 변이체의 변이체의 히스토그램. VAF = 0.5의 피크는 샘플이 복제임을 나타냅니다. 낮은 VAF를 가진 subclonal 돌연변이는 SNVFI의 마지막 필터링 단계 도중 제외됩니다 (VAF >0.3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: HSPC 샘플에서 체세포 돌연변이의 대표적인 돌연변이 스펙트럼 분석. 묘사된 것은 전체 스펙트럼에 대한 각 삼중뉴클레오티드 변화(중간 염기가 돌연변이되는)의 상대적 기여이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: IGV16을사용한 돌연변이의 수동 검사. (A) 돌연변이는 대량 샘플이 아닌 복제본에 존재할 때 true로 간주됩니다. (B) 돌연변이는 제대로 매핑되지 않은 영역에 존재할 때 거짓 긍정으로 간주됩니다. (C) 돌연변이는 생식선 대조군에서 존재할 때 거짓 양성으로 간주된다. 수직 선은 호출된 돌연변이의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 개발 계보 트리의 건설. 묘사된 것은 개발 중에 분리되는 발달 혈통을 나타내는 덴드로그램입니다. 덴드로그램 아래의 히트맵은 다른 클론에 돌연변이가 있음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

여기에 제시된 것은 개별 HSPC에서 수명 동안 축적된 돌연변이를 검출하고 이러한 돌연변이 데이터를 사용하여 초기 발달 혈통 트리를 구성하는 방법이다.

이러한 검정을 성공적으로 수행하기 위해서는 몇 가지 중요한 요구 사항을 충족해야 합니다. 첫째, 샘플의 생존가능성을 보장해야 합니다. 시료의 신속한 처리는 절차의 효율성을 보장하는 열쇠입니다. 둘째, 성장 인자 효능의 손실은 HSPC의 클론 확장에 부정적인 영향을 미칩니다. 높은 성장 인자 효능을 보장 하기 위해, 동결 해동 주기를 방지 하 고 일회용 aliquots를 준비 하는 것이 중요 하다. 셋째, WGS, 돌연변이 호출 및 필터링을 수행 한 후, 클론 배양의 복제성을 확인하는 것이 중요합니다. 배양의 복제를 확인하기 위해, 돌연변이의 VAF는 카요전형 정상 샘플에서 0.5의주위에 클러스터되어야 한다(그림 3). 코드 혈액 HSPC와 같은 낮은 돌연변이 부하를 가진 세포에서는 낮은 돌연변이 수로 인해 복제를 결정하는 것이 더 어렵습니다.

우리의 접근은 WGS를 허용하기 위하여 단 하나 세포의 시험관 내 확장에 의존합니다. 따라서, 우리의 접근은 HSPC와 같은 복제 잠재력이 있는 세포로 제한됩니다. 우리의 손에, 모든 단일 정렬 된 세포의 약 5%-30%는 적당히 확장할 수 있습니다. 증가된 증가율은 잠재적으로 선택 편향을 초래할 수 있습니다. 앞서 설명한 바와 같이, WGA를 사용하는 방법은 이 기술이 세포의 확장에 의존하지 않기 때문에 이러한 선택 편향을 극복할 수 있다. 그러나 WGA는 그 자체의 단점을 가지고 있으며, 클론 증폭은 특히 낮은 진정한 체세포가있는 샘플에서 유전체 탈락및 동등한 범위없이 전체 게놈의 돌연변이 수를 정확하게 결정하는 유일한 방법입니다. 돌연변이 번호.

이 접근법을 사용하여 생성된 데이터는 단일 세포에서 검출된 돌연변이가 6에 도시된 바와 같이 세포 계수를 해부하는데 사용될 수 있기 때문에 조혈 시스템의 생리를 결정하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 하나 또는 2개의 돌연변이는건강한 기증자 1에 있는 각 가지를 정의할 수 있습니다. 임신 후 일찍 계보 가점 이기 때문에, 이들 제1 분기를 정의하는 돌연변이는 또한 생식선 변이체 1,18,19를필터링하는 데 사용된 일치하는 정상 샘플에서 낮은 VAF로 존재할 것이다. 이 경우, MCS와 같은 비조혈세포의 사용은 조혈시스템에서 개발 중에 매우 일찍 분리될 것으로 예상되기 때문에 바람직하다. T 세포는 조혈 기원의, 생식선 변이체를 필터링하기 위하여 일치하는 정상 견본으로 이 세포의 사용은 그러므로 발달 혈통 트리의 초기 분기의 건축을 혼동할 수 있었습니다. 표적으로 한 깊은 순서에 의해 측정될 수 있는 특정 성숙한 혈액 인구에 있는 분지 특정 돌연변이의 subclonal 존재는, 그 가지의 자손은 그 성숙한 세포 모형을 초래할 수 있다는 것을 표시할 것입니다. 추가적으로, 우리의 접근은 생체내에서 돌연변이 노출의 돌연변이 결과를 평가하고 궁극적으로 이것이 백혈병 발달에 기여할 수 있는 방법을 허용합니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 연구는 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)의 VIDI 보조금에 의해 지원되었다 (No. 016.Vidi.171.023) R. v. B..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.20 µm syringe filter Corning 431219
50 mL Syringe, Luer lock BD 613-3925
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647-50G
CD11c FITC BioLegend 301603 Clone 3.9
CD16 FITC BioLegend 302005 Clone 3G8
CD3 BV650 Biolegend 300467 Clone UCHT1
CD34 BV421 BioLegend 343609 561
CD38 PE BioLegend 303505 Clone HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5 BioLegend 304121 Clone HI100
CD49f PE/Cy7 BioLegend 313621 Clone GoH3
CD90 APC BioLegend 328113 Clone 5E10
Cell Strainer 5 mL tube Corning 352235
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover Greiner 781182
Cryogenic vial Corning 430487
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
DMEM/F12 ThermoFisher 61965059
EDTA Sigma-Aldrich E4884-500G
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 10500
GlutaMAX ThermoFisher 25030081
Human Flt3-Ligand, premium grade Miltenyi Biotech 130-096-479 Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) Stem Cell Technologies 78040.1 Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) Stem Cell Technologies 78050.1 Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human SCF, premium grade Miltenyi Biotech 130-096-695 Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human TPO, premium grade Miltenyi Biotech 130-095-752 Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Integrative Genomics Viewer 2.4 Broad Institute https://software.broadinstitute.org/software/igv/download
Iscove's Modified Eagle's Medium ThermoFisher 12440061
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC BioLegend 348701 Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Lymphoprep Stem Cell Technologies #07861 Used for Density gradient separation
PBS Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antibiotic formulation
QIAamp DNA Micro Kit Qiagen 56304
Qubit 2.0 fluorometer ThermoFisher Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32854
RNAse A Qiagen 19101
SH800S Cell Sorter Sony SH800S
StemSpan SFEM, 500 mL Stem Cell Technologies 9650
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA G-Biosciences 786-151
TrypLE Express ThermoFisher 12605-10

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