人体血液的突变载荷和克隆成分的特征

Genetics
 

Summary

细胞体突变模式反映先前突变暴露,可以揭示发育系系关系。这里介绍的是一种对单个造血干细胞和祖细胞的体细胞突变进行编目和分析的方法。

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Huber, A. R., Manders, F., Oka, R., van Boxtel, R. Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood. J. Vis. Exp. (149), e59846, doi:10.3791/59846 (2019).

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Abstract

造血干细胞和祖细胞(HSPCs)在一生中逐渐积累DNA突变,这可能导致与年龄相关的疾病,如白血病。特征突变积累可以增进对年龄相关疾病病因的了解。这里介绍的是一种对单个HSPCs的体细胞突变进行编目的方法,该方法基于克隆原细胞培养的全基因组测序(WGS)。原始细胞中存在的突变由克隆培养中的所有细胞共享,而细胞分类后在体外获得的突变存在于细胞的一个子集中。因此,这种方法可以准确检测个体HSPCs基因组中存在的体细胞突变,这些突变在生命过程中积累。这些体细胞突变目录可以为活跃于造血组织的突变过程以及这些过程如何促进白细胞生成提供有价值的见解。此外,通过评估同一个体的多个HSPCs之间共享的体细胞突变,可以确定血型的克隆系关系和种群动态。由于这种方法依赖于单个细胞的体外扩张,该方法仅限于具有足够复制潜力的造血细胞。

Introduction

造血干细胞和祖细胞(HSPCs)暴露于内源或外源诱变源,有助于在寿命1期间逐渐积累DNA突变。HSPCs1的逐渐突变积累可导致与年龄相关的克隆血球(ARCH) 2、3,这是一种由携带白血病驱动突变的HSPCs驱动的非症状性疾病。最初,人们认为有ARCH的人有增加的风险白血病2,3。然而,最近的研究表明,在老年人4的ARCH发病率为95%,使得与恶性肿瘤的关联不那么明显,并引发了为什么一些患有ARCH的人最终是否患有恶性肿瘤的问题。然而,HSPCs的体细胞突变可能造成严重的健康风险,因为骨髓增生障碍和白血病的特点是存在特定的癌症驱动因素突变。

为了识别突变过程和研究血液克隆性,需要对单个HSPCs的突变积累进行特征化。突变过程在基因组中留下特征模式,即所谓的突变特征,可以在全基因组突变集合中识别和量化。例如,暴露于紫外线、烷基化剂和DNA修复途径的缺陷都与不同的突变特征6,7相关。此外,由于突变积累的随机性质,大多数(如果不是全部)获得突变在细胞之间是唯一的。如果突变在同一个体的多个细胞之间共享,则表明这些细胞共享一个共同的祖先8。因此,通过评估共享突变,可以确定细胞之间的谱系关系,并且可以分支构造发育谱系树。然而,由于健康组织的多克隆性质,在生理正常细胞中编目罕见的体细胞突变在技术上具有挑战性。

这里介绍的是一种准确识别和确定单个HSPCs基因组中体细胞突变的方法。这涉及到在体外HSPCs的分离和克隆扩张。这些克隆培养体反映了原始细胞的基因组成(即原始细胞中的突变将由培养基中的所有其他细胞共享)。这种方法使我们能够获得足够的DNA进行全基因组测序(WGS)。我们之前已经表明,在克隆培养过程中在体外积累的突变将由细胞的子集共享。这使得过滤所有体外突变,因为这些将存在于较小的部分读取相比,在体内获得突变9。以前的方法已经利用全基因组扩增(WGA)10从单个细胞中获得了足够的DNA。然而,WGA的主要缺点是其相对容易出错和不平衡的基因组扩增,这可能导致等位基因下降11。然而,由于这种方法依赖于单细胞的体外扩张,它仅限于具有足够复制潜力的血细胞,而WGA依赖方法则并非如此。早先对克隆培养物进行测序的努力依赖于使用进料层来确保单次HSPCs12的克隆扩增。然而,来自进料层的DNA可能会污染克隆培养物的DNA,混淆随后的突变调用和过滤。这里介绍的方法完全依赖于指定的介质来克隆地扩展单个HSPCs,因此避免了DNA污染问题。到目前为止,我们已经成功地将这种方法应用于人类骨髓、脐带血、冷冻骨髓和外周血。

Protocol

样品必须按照适当的道德规范获得,捐助者必须在程序之前给予知情同意。

1. 样品材料的制备

注:使用新获得的材料时,从步骤 1.1 开始。使用冷冻材料时,从步骤 1.2 开始。

  1. 准备新鲜骨髓、脐带血或外周血
    1. 按照制造商的说明(参见材料表),使用密度梯度分离从样品中分离单核部分,并使用血细胞计对单核细胞进行计数。隔离单核细胞后,继续步骤1.3。
    2. 可选:对全 384 孔板的 HSPCs 进行排序所需的推荐电池数为 1⁄2 x 107。如果在密度梯度离心过程中分离出更多的细胞,将细胞剩余储存在液氮中。
    3. 在 IMDM 的 500 μL 中重新悬浮细胞 = 每 1 x 107个细胞 10% FBS,并添加一滴一滴等于体积的 IMDM = 30% FBS + 20% DMSO,在 IMDM 的 1 mL 中实现 1 x 107细胞的悬浮量 + 20% FBS = 10% DMSO。
    4. 立即将单核细胞转移到1mL低温小瓶中,并在-80°C下冷冻细胞,在受控速率细胞冷冻容器中过夜。第二天将细胞转移到液氮储存中,经过进一步加工。
  2. 从骨髓、脐带血或外周血制备冷冻单核细胞
    1. 制备50 mL的细胞解冻培养基,含有45 mL的Iscove的改性鹰培养基(IMDM)和5 mL的胎儿牛血清(FBS),并在37°C水浴中加热。
    2. 从液氮储存中抽取含有样品的小瓶,将样品转移到干冰中,并在37°C的水浴中尽快解冻。
    3. 当样品几乎解冻时,用70%乙醇擦拭小瓶,并将其内容物转移到50 mL锥形管中。用1 mL的预加热IMDM + 10%FBS冲洗小瓶,以收集剩余的细胞,并在轻轻旋转管时将溶液滴滴(每滴5s)添加到解冻样品中。
    4. 在样品中加入额外的预加热 15 mL IMDM = 10% FBS 滴落,同时轻轻旋转管。
    5. 在350 x g下通过离心将细胞细胞进行5分钟的细胞。
    6. 除 ±3 mL 外,全部清除上清液。在剩余的上清液中重新悬浮细胞,在轻轻摇动管部的同时,加入20 mL的IMDM + 10%FBS滴滴。
    7. 取10μL的细胞悬浮液进行细胞计数。通过加入20μL的0.4%锥蓝色溶液稀释这些10μL,并使用血细胞计计算细胞。细胞数量在解冻时可减少,解冻后细胞损失高达50%。细胞活力应在70%至90%之间。
  3. 如果使用骨髓或脐带血细胞,请为MSC培养使用5 x 106单核细胞(步骤2.1)。如果使用外周血,请占用2⁄5 x 106细胞进行T细胞分离(步骤2.2)
  4. 剩余的细胞在350 x g下5分钟,在3 mL的FACS缓冲液中重新悬浮(0.05%BSA = 1 mM EDTA在PBS中)。
  5. 将 1 x 105细胞转移到装有 200 μL FACS 缓冲液的微管中,该缓冲液将作为流量细胞测定的负控制(步骤 3.8),并保持在冰上。

2. 细胞培养

注:为了获得体细胞获得突变的目录,需要过滤掉供体特定的生殖系变异。当从骨髓活检或脐带血开始时,中相位质细胞(MSCs)可用作匹配控制,以过滤生殖系变异。在这种情况下,请遵循第 2.1 节。当使用(动员的)外周血时,按照步骤2.2分离并使用T细胞作为匹配的控制样本来过滤生殖系变异(图1)。大容量T细胞群将与HSPC共享相同的血统关系。

  1. MSC 文化
    1. 制备50 mL的MSC介质,含有45 mL的DMEM/F12介质、10%FBS、500 μL的胰蛋白酶或胰蛋白酶替代品,以及500 μL的青霉素/链霉素溶液。
    2. 每孔MSC介质1.5 mL的板式约5×105个单核电池。将细胞置于37°C的加湿培养箱中,CO2为5%。
    3. 在24小时后更换培养基,然后每3天更换一次培养基,以确保所有造血细胞都洗掉。继续培养,直到汇合度为 100%。
    4. 如果 MSCs 是汇入的,则用 1 mL 的 PBS 洗涤细胞,并通过每孔添加 200 μL 的胰蛋白酶或胰蛋白酶替代品来收获 MSCs。在37°C下孵育细胞5分钟。加入800 μL的MSC培养基,上下移液细胞,使细胞从孔板上松开。
    5. 将MSC转移到微离心管中,在350 x g下通过离心5分钟对细胞进行颗粒。去除上清液并继续进行DNA分离,或将颗粒储存在-20°C,以便以后进行DNA分离(第4节)。
  2. T 细胞隔离
    注:如果使用(动员的)外周血,T细胞可以分离并用作生殖系控制。
    1. 在100μL的抗CD3染色溶液中重新悬浮细胞颗粒(在FACS缓冲液中稀释抗CD抗体1:100)。
    2. 通过添加 1 mL 的 FACS 缓冲液来洗涤细胞。在350 x g下通过离心将细胞压离5分钟,并在300μL的FACS缓冲液中重新悬浮。
    3. 在预填充 1 mL FBS 的 5 mL 聚苯乙烯管中,使用 FACS 分拣机分离至少 5 x 105 CD3+ 细胞。
    4. 在350 x g下使用离心5分钟,去除上清液,然后直接进行DNA分离(第4节),或将颗粒储存在-20°C,以进行DNA分离。

3. HSPC 隔离、排序和培养

  1. 在1⁄2 x 107单核电池下旋转5分钟,在350 x g下,在50μL的FACS缓冲液中重新悬浮(见步骤2.2.1)。将细胞转移到微离心管中。
    注:当对 >2 x 107细胞进行排序时,相应地增加抗体混合物和 FACS 缓冲体积。
  2. 根据表1所示的配方,准备50μL的2xHSC染色混合物。
抗体 音量 [L]
BV421-CD34 5
FITC-系线组合(CD3/14/19/20/56) 5
PE-CD38 2
APC- CD90 0.5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA 5
PE/Cy7- CD49f 1
FITC -CD16 1
FITC-CD11 5
FACS 缓冲区 25.5

表1:HSC排序组合。图中所示为一张表格,表明用于对HSCs进行排序的抗体的稀释。

  1. 将50μL的细胞溶液与制备的HSC染色混合物混合,在室温(RT)下孵育细胞15分钟,或在冰上孵育1小时,使抗体结合。
  2. 通过加入1mL的FACS缓冲液和颗粒,在350 x g下离心5分钟,洗涤细胞。
  3. 在 300 μL 的 FACS 缓冲液中重新悬浮细胞,并通过 35 μm 细胞滤网封顶的 5 mL 聚苯乙烯管过滤细胞悬浮液,以在荧光激活细胞分拣 (FACS) 之前去除细胞团块。
  4. 制备 25 mL 的 HSPC 培养基,包括 1x SFEM 介质,辅以 100 纳克/mL SCF、100 纳克/mL Flt3、50 纳克/mL TPO、10 纳克/mL IL-3、20 纳克/mL IL-6 和 100 纳克/mL 抗生素配方(见材料表)。
  5. 在每个孔中填充 384 孔细胞培养板,并填充 75 μL 的 HSPC 培养基。
    注:为了防止外井中介质蒸发,请向外井中填充 75 μL 的无菌水或 PBS,并且不要使用这些井进行细胞分拣。
  6. 对单个 HSPC 进行排序
    1. 根据未染色的控件(步骤 1.9)和染色样本中的 10,000 个单元格设置 HSPC 排序门。图 1中描述了设置门的代表性结果。通过围绕线性 FSC 高度与 FSC 面积分数绘制门来浇解单个单元。使用未染色的控制分数绘制血统-分数的门。为 CD34+细胞绘制门,并通过为 CD38- CD45RA-细胞设置特定门来进一步描述此子集的特征。
    2. 将 384 孔板加载到 FACS 机器上,然后对单个单元进行排序。
      注:如果适用于 FACS 计算机,请切换用于保留索引排序数据的选项,以便重新跟踪已排序的单元格。
  7. 栽培单独排序的 HSC
    1. 直接将384孔板转移到加湿的37°C培养箱,其中5%为CO2。
      注:为了防止在培养过程中蒸发,将 384 孔培养板(带盖)包裹在透明聚乙烯包装中。
    2. 将 384 孔板留在培养箱中 3⁄4 周,直到出现可见的克隆。克隆文化的代表性图像如图2所示。根据输入材料的条件,5%-30%的排序细胞将克隆展开。

4. 收获HSPC克隆

  1. 经过4周的培养,确定哪些井的汇合率在30%或更高。
  2. 预填充(对于每个克隆外生长)1.5 mL 微管,在 PBS 中具有 1 mL 的 1% BSA,并根据相应的井标记管。
  3. 在 PBS 中预湿移液器尖端,其中 1% BSA,以尽量减少粘附在移液器尖端的细胞数量。
  4. 用200μL移液器(设置在75μL)在井中猛烈地(至少5次)中移管介质,刮取井底以松开井中的细胞,并在与井对应的标记微管中收集细胞悬浮液。
  5. 在PBS中加入75μL的新鲜1%BSA,并在井中重复移液,以确保细胞的最大接受。
    注:克隆培养的细胞可以粘在井底。使用标准倒置光学显微镜检查油井,以确保是否收集了所有细胞。
  6. 如果所有具有 >30% 汇合的井都已收获,则将 384 孔板放回培养箱中。克隆培养物可以增殖长达5周。
  7. 在350 x g下将细胞悬架旋转5分钟。小颗粒应该是可见的。
  8. 小心地去除除约 5 μL 的上清液。细胞颗粒可在-20°C冷冻,并在DNA分离前储存数月。

5. DNA分离

  1. 根据制造商的说明,使用微尺度DNA分离试剂盒分离HSPC和MSC/T细胞DNA,并进行以下调整:
    1. 在第2节添加缓冲AL后,加入2μL的RNase A。在加入蛋白酶K之前孵育2分钟。
    2. 在56°C下孵育30分钟,而不是10分钟。
    3. 通过用低 EDTA (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA) 加载 50 μL TE 缓冲液来释放 DNA。为了获得最佳洗脱效果,在列上重新加载洗脱液并再次旋转。
  2. 使用每个克隆 2 μL 的 DNA 确定 DNA 浓度。脱氧核糖核酸(DNA)的产量通常在0.5~3纳克/μL之间变化。

6. 测序

  1. 执行Jager等人描述的DNA测序

7. 映射和躯体突变调用

  1. 将测序(FASTQ文件)的输出映射到参考基因组并调用突变,如 Jager 等人13中所述
  2. 使用复制编号分析工具(如 Control-FreeC14)检查序列克隆和批量数据中异常的岩核变化的数据。到目前为止,我们还没有报告任何HSPCs与核子异常。
  3. 生成黑名单,该黑名单由一组不匹配的正常样本组成,用于从自己的一组样本中筛选,如前13所述,或使用以下上传的黑名单:
  4. 使用 SNVFI 过滤单个核苷酸变异。
    1. 预设 SNVFI.config 文件,以便帮助器函数的所有路径都正确。
    2. 使用根据补充文件 1 (SNVFI.ini) 中看到的设置配置的 .ini 文件运行 SNVFI。为了排除体外诱导突变,我们筛选为VAF +0.39。
  5. 检查 SNVFI 的变型等位数分数 (VAF) 输出(图 4)。检查密度图的峰值是否接近 0.5,指示样本为克隆。
  6. 可选:要确定在筛选过程中覆盖的基因组部分,请确定沿生殖系的可调用区域,并使用来自 GATK 的 CallableLoci 进行控制(Genome 分析工具包):
    java-jar基因组分析TK.jar |
    -T 可调用Loci |
    -R 参考.fasta |
    -我读我.bam |
    -摘要表.txt |
    -o 可调用_状态.bed
  7. 可选:从 CallableLoci 输出检索可调用区域,并使用位于https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor.生成的床文件可用于进一步过滤 SNVFI 的输出,并检查第 9 节中的突变配置文件:
    可调用Loci_处理器.py dir_in dir_out示例_name bulk_name_s_示例1样本2样本3

8. Indel 呼叫

  1. 使用 GATK 选择变体选择原始变量.vcf 文件中的所有插入和删除(Indels):
    java -Xmx12G |
    -jar 基因组分析TK.jar |
    -T 选择变体 |
    -R 参考_基因组.fasta |
    -V 原始变量.vcf |
    -o 原始_INDLL.vcf |
    -选择类型 INDEL
  2. 使用 INDELFI 过滤原始_INDELS.vcf列表:
    perl INDELFI.pl -i 输入.vcf(从步骤 8.1) |
    -s 柱测试样本 |
    -c 柱控制样本

9. 突变型材检查

  1. 使用步骤 7.6(或步骤 7.9 中具有可选可调用位点分析)中生成的 .vcf 文件,使用 R 包突变模式15分析基因组突变配置文件、突变类型和特征分析:有关可以使用生成的 .vcf 文件(如 96 三核苷酸突变谱)生成的代表性输出,请参阅图5

10. 使用基础替代建造发育系谱树

  1. 要构造发育谱系树,检测克隆之间的共享突变。谱系树第一个分支中存在的突变也可以亚克隆地存在于大体积样品(MSCs/T细胞)中。以后的分支谱系将仅由 HSPC 克隆共享的突变定义。
  2. 要识别克隆子集中的突变,并分克隆地存在于批量中,请执行以下步骤。
  3. 为了筛选克隆之间共享的体细胞突变,在基于 Unix 的终端中运行filterSomatic.py脚本。该脚本可在https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic中找到。 在运行此脚本之前,请编辑 filterSomatic.ini 文件(请参阅补充文件 2)以设置路径并调整其他参数。
  4. 运行filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py -i 过滤器 Somatic.ini)
  5. 使用"确定"低VAF_bulk,筛选散装中亚克隆存在的突变。基于 Unix 的终端中的 R 脚本。该脚本可在https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts中找到。 这将为共享和唯一 SNV 生成单独的 .vcf 文件:
    Rscript 确定_低VAF_批量。R
    --vcf 路径/到/筛选器_somatic_output.vcf
    --批量批量_名称
    --示例名称示例名称
    --性别 [M]F#
    --出_迪尔_迪尔
  6. 通过重叠所有突变位置(SNVFI 输出的串联列 1 和 2),确定在散装样本中不存在的所有克隆之间共享的所有突变。
  7. 排除使用 IGV16进行手动检查在步骤 10.5 和 10.6 期间获得的误报。当突变不存在时,当突变存在于生殖系中或当存在于映射不良的区域时,突变被认为是错误的,参见图7。
    注:我们强烈建议使用目标或桑格测序独立地对所有共享位点进行序列排序。
  8. 使用步骤 10.1 和 10.2 期间获得的共享突变构建突变与序列克隆的二进制表,0 表示不存在突变,1 表示突变存在。
  9. 输出突变二进制表,如在热图中,以及指示使用 R 的细胞之间的谱系关系。热图指示每个细胞的突变状态。请参阅此函数的输出 (图 6)。
            
    克隆 <- 读取表("路径/到/二进制表")
            
    my_palette <- 色调调色板(c("#cccccc","#333333")(n = 2)
    col_中断 <- c (0,0.5,1)
            
    热图.2(克隆,不源函数(x)dist(x,方法= "二进制"),二进制的,
    赫鲁斯特芬函数(x)赫鲁斯特(x,方法 = 平均值),
    树形图 = "列",行 = F,
    col_my_palette,中断_col_中断,
    跟踪="无",密度.info="无")

Representative Results

实验程序
实验工作流如图1所示。根据输入材料的类型,必须遵循不同的步骤。图2中描述了脐带血细胞排序的流式细胞测定输出。首先,所有单细胞都通过松散地围绕这个种群绘制一个门来选择。然后,通过选择具有线性 FSC-H/FSC-A 比率的单元来隔离单一体,因为较低的 FSC-H/FSC-A 比率包括双元或单元块。未染色的控制样本用于定义系系的细胞分类门-, CD34+, CD38-, CD45RA-.此外,CD90和CD49f可用于区分祖细胞或自更新干细胞17(图2)。索引排序允许重新跟踪单个单元格,并且排序的单元格被描绘为棕色点。在细胞培养过程中,单个克隆可以以不同的速度扩展,有些克隆在3周内扩大,而其他克隆只完全扩展到培养的第五周。参见图3A,B了解代表性的菌落生长。在电镀后 11 天内,显示了一个几乎汇联的 MSC 散装培养物的代表性图片(图 3C)。

在测序和突变分析后检查质量
图中所示为 Control-FreeC14生成的拷贝号分析的示例输出,用于检查拷贝号更改(图 4)。在 SNVFI 运行期间,卡约蒂皮奇信息可以指示要排除哪些染色体(步骤 7.6)。由 SNVFI 创建的 VAF 图 (图 5) 是样本中变位等位频率的直方图。密度图中的峰值为 0.5 表示样本为克隆。为了更深入地了解突变背后的生物原因,可以使用R包突变模式15进行分析。此处描述的是一个典型分析,生成 96 三核苷酸图 (图 6)。除了对不同突变类型的量化外,还可以使用此工具进行特征提取。

构建发育谱系树
使用IGV验证在克隆之间共享或存在于生殖系对照中的克隆(和低VAF)中的突变。当样本中存在突变时,在生殖系中不处于高VAF水平时,突变被认为是正确的(图7A)。当IGV中不存在突变时,突变被认为是错误的,这可能发生在映射不良的区域内(图7B)。在其他情况下,SNVFI检测到的事件是漏掉的生殖系突变(图7C)。强烈建议在选定的克隆中通过目标重新测序对这些突变进行独立重新测序。 在检测克隆之间的共享体细胞突变后,生成二进制矩阵(步骤 10.8)。热图构建包含具有和无共享突变 A-M 的细胞。在此热图上方,指示发育谱系树(图8)。

Figure 1
图1:描述基于输入材料的实验过程的流程图。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:单元格排序策略。首先,对小型单核细胞进行门控。其次,单个单元格通过选择线性分数进行封闭。系骨负细胞是门控的。所有 CD34+ CD38- CD45-细胞均按单细胞排序。应注意棕色单元格的分数,这是选项"索引排序"突出显示的排序单元格。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:代表性细胞培养结果。代表性HSPC克隆在电镀后2周的384孔板 (A) 和电镀后 4 周 (B) 中。(C) 中位更换 2 周后 MSC 培养。刻度条 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:卡约类型。(A) 克隆 HSPC 培养和 (B) MSC 散装样品.通过读深度分析确定核类型。两个图形都指示一个卡约异常样本。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:变位角频率的直方图。在 SNVFI 的最后一个过滤步骤 (VAF >0.3) 之前克隆中变体的变位基因频率的直方图。VAF = 0.5 处的峰值表示样品为克隆。在 SNVFI (VAF >0.3) 的最后一个过滤步骤中,排除了 VAF 低克隆突变。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:HSPC样本中体细胞突变的代表性突变谱分析。描绘的是每个三核苷酸变化(其中中间基发生突变)对总光谱的相对贡献。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7:使用IGV16手动检查突变。(A) 突变在克隆中存在时,而不是存在于大体积样本中时,被认为是真实的.(B) 突变在映射不良区域时被视为误报。(C) 突变在生殖系控制中时被视为误报。垂直线指示被调用突变的位置。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图8:建设发育系谱树。所描绘的是一个树状图,指示发育系在发育过程中分裂。树突图下的热图指示不同克隆中存在突变。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

这里介绍的是一种检测单个HSPCs生命期间积累的突变,并使用这些突变数据构建早期发育谱系树的方法。

为了成功执行这些检测,必须满足几个关键要求。首先,必须确保样品的可行性。快速处理样品是确保程序效率的关键。其次,生长因子效力的丧失将对HSPCs的克隆扩张产生负面影响。为了确保高生长因子效力,避免冻融周期和准备一次性等分非常重要。第三,在进行WGS、突变调用和过滤后,验证克隆培养体的克隆性至关重要。为了确认培养体的克隆性,突变的VAF应聚集在一个典型正常样本中的0.5左右(图3)。在突变载荷低的细胞(如脐带血HSPC)中,由于突变数低,很难确定克隆性。

我们的方法依赖于单细胞的体外扩张,以允许WGS。因此,我们的方法仅限于具有克隆扩展的复制潜力的单元格,如 HSPC。在我们手中,大约5%-30%的单排序细胞能够充分膨胀。增长率降低可能导致选择偏差。如前所述,使用WGA的方法可以克服这种选择偏差,因为这种技术不依赖于细胞的扩展。然而,WGA有其自身的缺点,克隆扩增仍然是准确确定全基因组突变数量的唯一方法,没有同音位下降和基因组的相等覆盖,特别是在低真体样本中突变数。

使用这种方法生成的数据可用于确定造血系统的形态,因为在单个细胞中检测到的突变可用于解剖细胞谱系,如图6所示。通常,一个或两个突变可以定义健康捐赠者1中的每个分支。由于世系分支在受孕后早期,定义这些第一个分支的突变也将存在与匹配的正常样本的低VAF,用于过滤生殖系变异1,18,19。在这种情况下,使用非造血细胞(如 MSCs)是首选,因为它们在发育过程中应尽早与造血系统分离。由于T细胞是造血原源,因此使用这些细胞作为匹配的正常样本来过滤生殖系变异可能会混淆发育系谱树最早的分支结构。某些成熟血群中分支特异性突变的亚克隆存在,可以通过靶向深度测序进行测量,这表明该分支的后代可以产生该成熟细胞类型。此外,我们的方法允许评估体内诱变暴露的突变后果,并最终促进白血病的发展。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了荷兰科学研究组织(NWO)的VIDI赠款(第016.Vidi.171.023)对R.诉B案的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.20 µm syringe filter Corning 431219
50 mL Syringe, Luer lock BD 613-3925
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647-50G
CD11c FITC BioLegend 301603 Clone 3.9
CD16 FITC BioLegend 302005 Clone 3G8
CD3 BV650 Biolegend 300467 Clone UCHT1
CD34 BV421 BioLegend 343609 561
CD38 PE BioLegend 303505 Clone HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5 BioLegend 304121 Clone HI100
CD49f PE/Cy7 BioLegend 313621 Clone GoH3
CD90 APC BioLegend 328113 Clone 5E10
Cell Strainer 5 mL tube Corning 352235
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover Greiner 781182
Cryogenic vial Corning 430487
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
DMEM/F12 ThermoFisher 61965059
EDTA Sigma-Aldrich E4884-500G
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 10500
GlutaMAX ThermoFisher 25030081
Human Flt3-Ligand, premium grade Miltenyi Biotech 130-096-479 Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) Stem Cell Technologies 78040.1 Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) Stem Cell Technologies 78050.1 Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human SCF, premium grade Miltenyi Biotech 130-096-695 Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human TPO, premium grade Miltenyi Biotech 130-095-752 Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Integrative Genomics Viewer 2.4 Broad Institute https://software.broadinstitute.org/software/igv/download
Iscove's Modified Eagle's Medium ThermoFisher 12440061
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC BioLegend 348701 Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Lymphoprep Stem Cell Technologies #07861 Used for Density gradient separation
PBS Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antibiotic formulation
QIAamp DNA Micro Kit Qiagen 56304
Qubit 2.0 fluorometer ThermoFisher Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32854
RNAse A Qiagen 19101
SH800S Cell Sorter Sony SH800S
StemSpan SFEM, 500 mL Stem Cell Technologies 9650
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA G-Biosciences 786-151
TrypLE Express ThermoFisher 12605-10

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References

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