Isolering af spyt Epiteliale celler fra humane spytkirtler til in vitro-vækst som Salisfærer eller Monolayers

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi præsenterer en metode til isolering og dyrkning af primære menneskelige spytkirtel-afledte epiteliale celler. Disse celler udviser genekspressions mønstre i overensstemmelse med dem, der er af spyt epitelial oprindelse og kan dyrkes som salisfærer på kælder membran matricer afledt af Engelbreth-Holm-sværm tumorceller eller som monolag på behandlede kultur retter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Beucler, M. J., Miller, W. E. Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers. J. Vis. Exp. (149), e59868, doi:10.3791/59868 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spytkirtlerne er et sted af betydelig interesse for forskere, der er interesseret i flere aspekter af sygdomme hos mennesker. Et mål for forskere er at genoprette funktionen af kirtler beskadiget af stråling behandlinger eller på grund af patologier forbundet med Sjögrens syndrom. Et andet mål for forskere er at definere de mekanismer, hvormed vira replikere inden for glandulær væv, hvor de kan derefter få adgang til spyt væsker vigtigt for horisontal transmission. Disse mål fremhæver behovet for en robust og tilgængelig in vitro spytkirtel model, der kan udnyttes af forskere interesseret i ovennævnte samt relaterede forskningsområder. Her diskuterer vi en simpel protokol for at isolere epiteliale celler fra menneskelige spytkirtler og udbrede dem in vitro. Vores protokol kan optimeres yderligere for at imødekomme behovene i de enkelte undersøgelser. Kort sagt er spyt vævet mekanisk og enzymatisk adskilt for at isolere enkeltceller eller små klynger af celler. Udvælgelse til epiteliale celler sker ved plating på en kælder membran matrix i nærværelse af medier optimeret til at fremme epitel cellevækst. Disse resulterende kulturer kan opretholdes som tredimensionelle klynger, kaldet "salisfærer", eller dyrkes som en enkeltlags på behandlede plastik væv kultur retter. Denne protokol resulterer i en udvækst af en heterogene population af hovedsageligt epiteliale celler, der kan overføres til 5-8 passager (15-20 population doublings) før undergår cellulære senescens.

Introduction

I pattedyr spytkirtlerne er organiseret i 3 par store spytkirtler: den parotid, submandibulær, og sublinguale kirtler. Der findes også en række mindre kirtler placeret på tungen og spredt over hele mundhulen1. De vigtigste kirtler er ansvarlige for bulk volumen af spyt produceret2. Ud over at give antimikrobiel beskyttelse gennem udskillede faktorer, spyt er vigtigt i processen med at tygge og smøre fødevarer, som det passerer gennem spiserøret2. Som sådan, spytkirtel dysfunktion repræsenterer en medicinsk problem, hvor syge, der er i stand til at producere nok spyt er mere tilbøjelige til at udvikle maladies såsom dental kaviteter eller oral candidiasis3. Desuden, reduceret spyt resulterer i større problemer med at spise og fordøje fødevarer har en betydelig indvirkning på livskvalitet.

Spytkirtel dysfunktion findes primært hos patienter, der lider af Sjögrens syndrom, en autoimmunsygdom eller hos patienter med hoved-og nakke kræft, som har gennemgået strålebehandling3,4,5, 6. Beskadigede sekretoriske acini inden for kirtler som følge af autoimmunitet eller strålebehandling ikke undergår selvfornyelse, hvilket resulterer i en patient, der lever med uoprettelige skader6. Studiet af spytkirtler har også høstet opmærksomhed eller forskere interesseret i mekanismer af viral patogenese. Nogle patogener, såsom humant Cytomegalovirus (HCMV), vedholdende replikere inden for spytkirtlerne, som derefter giver mulighed for overførsel af spirende virus til en ny vært via spyt7,8. Således er der en uopfyldt behov for at udvikle robuste og reproducerbare in vitro-modeller af spytkirtel væv til at tackle og forstå en bred vifte af medicinske problemer.

Flere modeller af murine spytkirtel system har været brugt som udgangspunkt for at forstå og karakterisere de forskellige epiteliale celler, der danner spytkirtlerne9,10. Der findes indlysende og store forskelle mellem menneskelige og murine spytkirtler11. Især den menneskelige parotideale kirtel er større i forhold til submandibulær kirtel, mens musens submandibulære og parotideale er meget ens i størrelse1,2,11. Mens udødeliggjort menneskelige submandibulære cellelinjer findes, der er store bekymringer, at de udødeliggjort celler ikke præcist vedligeholde Fænotypen af det primære væv og sekundære bekymringer, at de udødelige celler ikke rent faktisk stammer fra spyt epitelet12. Af disse grunde er der en interesse og et behov for at studere primære spyt væv fra mennesker.

Her beskriver vi en protokol for at isolere primære epiteliale celler fra menneskelige spytkirtler til vævskultur. Vores protokol er baseret på værker af Pringle et al. og Tran et al. med ændringer, der generelt forenkler deres procedurer13,14. For det første, mens Tran et al. 's protokol kræver en lang femtimers inkubation for enzymatisk at fordøje spyt vævet, har vores modificerede protokol været vellykket med så lidt som en times inkubation, svarende til den i Pringle et al. For det andet bruger vi forskellige enzymer til vævs fordøjelse, især vi bruger ikke trypsin som bruges i den oprindelige Tran et al. protokol, men i stedet bruge en blanding af dispase og kollagenase. Vi foretrækker at undgå trypsin i de indledende fordøjelsestrin, da en nylig undersøgelse antydede, at den initiale fordøjelse af spyt vævet ved trypsin resulterer i nedsat cellelevedygtighed, muligvis ved tab af en sjælden stamcelle population15. Endelig kultur de salisfærer på overfladen af kælderen membran matrix (BMM) ved hjælp af en kommercielt tilgængelige medier oprindeligt formuleret til formering af bronkiale epitelceller. Vores protokol kan bruges til at isolere spyt celler fra parotid, submandibulær og sublinguale kirtler. Disse celler udtrykker spyt amylase og andre spyt specifikke gener, der indikerer, at de opretholder en fænotype svarende til spyt acinic epiteliale celler7. Vi har med succes genereret spyt kulturer fra > 50 primære humane vævsprøver ved hjælp af denne metode. Desuden kan de primære spyt celler nemt kryopreserveres til brug på et senere tidspunkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Disse protokoller og undersøgelser er blevet gennemgået og godkendt af den institutionelle revisions bestyrelse på University of Cincinnati (Federal-dækkende Assurance #00003152, IRB-protokol 2016-4183). Spyt vævet er almindeligt genbrugt i mange hoved og hals kirurgiske procedurer og er normalt ikke involveret af den maligne proces. Typisk, frisk redesignet spytkirtel væv anvendes inden for 2-4 h efter fjernelse fra patienten (figur 1a).

1. klargøring af reagens

  1. Bronkial epitelial cellevækst medium (BEGM)
    1. Tilføj komponenter fra det kit, der leveres af producenten (Se tabellen over materialer).
    2. Vask hvert rør én gang med base mediet for at sikre fuld overførsel af komponenter. Tilsæt derefter trækul strippet føtal kvægserum for at lave en endelig koncentration på 4% serum.
  2. Røde blodlegemer (RBC) lysis buffer
    1. For at gøre 10x lager, tilsættes 40,15 g af NH4Cl, 5,0 g NaHCO3, og 0,186 g ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og bringe op til en endelig volumen på 200 ml ved hjælp af DH2O. Derefter filtreres steriliserer og opbevares ved 4 °C.
    2. Fortyndes til en arbejds koncentration på 1x i steril dH2O før brug.
  3. Dissociations løsning
    1. Til en 100 mL flaske dispase opløsning (Se tabellen over materialer) tilsættes 0,15 g kollagenase type III. Efter at kollagenase er helt opløst, filtreres sterilisering af den nye opløsning og alikvot. Opbevares ved-20 °C.

2. vævs nedbrydning

  1. Ved hjælp af en 100 mm vævskultur plade, mekanisk hakker vævet i fine stykker ~ 1-2 mm i størrelse ved hjælp af autoklave-steriliseret dissekere saks og kirurgiske pincet (figur 1b,C). Bindevæv mellem stykker skal skæres for at sikre korrekt adskillelse og lethed i yderligere trin.
  2. Tilsæt 6 mL dispase/kollagenaseopløsning til det hakkede væv. Derefter inkubates ved 37 °C i ca. 30 min til 1 time.
  3. Væv ved pipettering med en 5 mL serologisk pipette 15-20 gange.
  4. Inkuber ved 37 °C i yderligere 30 min til 1 time.
  5. Gentag trin 2,3 og 2,4 to-tre gange mere, eller indtil vævet ligner en gylle og let kan passere gennem pipette åbningen (figur 1d).
    Bemærk: Startstørrelsen af vævsprøven og hvordan finheden af vævs hakning vil afgøre, hvor mange gange man skal gentage trin 2,3 og 2,4. Typisk, vi modtager væv ca 1 cm x 1 cm i størrelse. Derudover kan man overvåge vævs dissociation ved hjælp af en standard inverteret vævskultur mikroskop til at spore udviklingen af celle dissociation fra vævet. Små klynger af celler er ideelle til indledende udvækst af spyt celler som salisfærer.

3. belægning brønde med kælder membran matrix

Bemærk: kælder membran matrix (BMM) skal optøet natten over ved 4 °C dagen før den vil blive brugt. Når den er optøet, skal BMM konstant holdes på is eller ved 4 °C, da den hurtigt størkner (dvs. danner en gel) ved varmere temperaturer. Derudover skal der udvises forsigtighed, hvis prøverne er blevet kølet på is før plating på BMM, da kolde prøver vil "smelte" BMM og udsætte cellerne til plastik skålen.

  1. Afpipettér langsomt BMM (Se tabel over materialer) i hver brønd for at blive belagt. Jævnt og langsomt distribuere BMM over brønden.
    Bemærk: generelt bruger vi 500 μL pr. brønd af en seks-brønd plade, men denne volumen kan justeres til brug på andre varianter af plader som 12-Well eller 24-Well, eller som ønsket for tykkere eller tyndere hydrogels.
  2. De belagte plader inkubateres ved 37 °C i mindst 15 minutter før brug for at tillade BMM-tiden at størkne.

4. filtrering af ufordøjet væv, RBC lysis og celle plating

  1. Overfør vævs homogeni fra trin 2,5 til et 15 mL konisk rør. Vask pladen én gang med 6 mL Dulbecco's fosfat bufferet saltvand (DPBS) for at overføre de resterende celler.
  2. Filtrér homogenatet i et 50 mL konisk rør gennem en 70 μm nylon maske celle for at fjerne ufordøjet væv. Centrifugeres anspændte celler i 5 min. ved 500 x g.
  3. Fortyndet 10x RBC lyse buffer i steril dH2O for at gøre en 1x arbejdsopløsning.
  4. Aspirere supernatanten. Derefter resuspension celle pellet i 10 mL 1x RBC lysis buffer. Inkuber i 5 min ved 37 °C.
  5. Tilsæt 20-25 mL DPBS for at neutralisere RBC lysis-bufferen og minimere lyse af spyt celler. Centrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
    Bemærk: efter behandling med RBC lysis-buffer skal celle pellet være hvidt. Rød farve i pellet indikerer, at ikke alle RBC er blevet fuldt lysed. Gentag trin 4,4 til 4,5, hvis det er nødvendigt for fuldstændig lysis af alle RBC.
  6. Aspirere supernatanten. Resuspendér pellet i 1-2 mL BEGM pr. brønd, og Placer derefter resuspenderede celler på BMM-belagte brønde. Inkubere ved 37 °C.
  7. Når de er belagt på BMM, vil cellerne dannes i sfæriske strukturer eller "salisfærer" over en 2-3-dages periode. Celler kan vedligeholdes som saliskugler i ca. 5-7 dage, før BMM begynder at nedbrydes, så cellerne får adgang til og overholder plastik og vokser som en monolayer.

5. nedgravningen af salisfærerne og vedligeholdelsen på BMM

  1. Aspirér medier fra brønde, tilsæt derefter 1 mL dispase/collagenase opløsning til hver brønd og Inkuber ved 37 °C i ~ 15 min eller indtil BMM er for det meste opløst.
  2. Overfør cellerne til et 15 mL konisk rør og vask brønde en gang med DPBS for at få de resterende celler. Centrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
  3. Aspirere supernatanten. Resuspension af pellet i 2 mL trypsin derefter inkubere ved 37 °C i 15 min.
  4. Neutralisere trypsin ved hjælp af alle komplette medier, der indeholder 10% serum. Centrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
  5. Aspirere supernatanten. Resuspender cellerne i DPBS for at fjerne resterende medier, trypsin og serum. Centrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
  6. Aspirere supernatanten. Resuspension i BEGM og plade de resuspenderede celler på solidificeret BMM-coated kultur retter. Resuspenderede celler kan også være belagt direkte på cellekultur behandlede retter til spredning som en monolayer. For yderligere oplysninger om vækst af spyt celler som et monolayer, se punkt 6. Celler dyrket på BMM eller på plastik skal fodres med frisk BEGM hver 2 – 3 dage.
  7. Kultur cellerne i en befuret inkubator vedligeholdt ved 37 °C med 5% CO2.

6. nedgravningen af salisfærerne på behandlede plastvæv kultur retter

Bemærk: Hvis du vedligeholder celler som en enkeltlags på plastik, start på dette trin. Følgende protokol gælder for celler, der vokser i en 100 mm skål.

  1. Aspirere medierne. Vask en gang med DPBS for at fjerne resterende medier.
  2. Tilsæt 2 mL trypsin, og Inkuber derefter ved 37 °C i 15 min., eller indtil cellerne er helt løsrevet.
  3. At neutralisere trypsin med 4 mL af alle komplette medier, der indeholder 10% serum. Overfør cellerne til et 15 mL konisk rør.
  4. Pladen vaskes én gang med ca. 5 mL DPBS for at indsamle de resterende celler. Centrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
  5. Aspirere supernatanten. Resuspendér cellerne i 6-10 mL DPBS for at fjerne resterende medier.
  6. Centrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
  7. Aspirér supernatanten og resuspension i BEGM. Plade celler på behandlede plastvæv kultur retter. Feed med frisk BEGM hver 2-3 dage.
  8. Kultur cellerne i en befuret inkubator vedligeholdt ved 37 °C med 5% CO2.

7. Kryopreservation af celler

Bemærk: Kryopreservation af celler kan opnås fra en enkelt cellesuspension, der stammer fra enten salisphere eller enkeltlags dyrkede celler.

  1. Tæl cellerne på et hematocytometer for at beregne den samlede mængde af celler til stede.
  2. Centrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
  3. Aspirere supernatanten. Resuspendere pellet i BEGM med 10% dimethylsulfoxid (DMSO). Koncentrationen af cellerne skal være 2 x 106 celler/ml til 10 x 106 celler/ml.
  4. Aliquot celler til sterile kryogene opbevarings slanger. Placer rørene i en isoleret skum rack og Inkuber ved-80 °C natten over for langsomt at fryse cellerne.
  5. På den næste dag, Placer rør i flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
    Bemærk: cellerne skal hurtigt optøet ved 37 °C. Ved optøning skal cellerne pelleteres ved 500 x g , og de DMSO-holdige medier fjernes før plating.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To-tre dage efter plating celler fra fordøjet væv på BMM, vil cellerne let danne små klynger, der vil fortsætte med at ekspandere i størrelse op til 15-20 celler per klynge (figur 2a). Cellulære rester og fritliggende døde celler ses typisk og bør fjernes ved at aspirere og fylde med friske medier. Cellerne vil fortsætte med at formere sig som saliskugler i ca. 3-10 dage, eller så længe BMM-laget forbliver intakt. Lejlighedsvis, på grund af delvis opdeling af BMM, vil cellerne blive knyttet til den underliggende plast og begynde at formere sig som en monolayer. Salisfærer dyrket på BMM vil udvise variation i størrelse og strukturel kompleksitet. Saliskugler kan opretholdes ved at overføre dem til frisklavet BMM som beskrevet i protokollen. Inden for 2-3 dage efter at have passeret på frisk BMM, vil cellerne reformere i kugler. Spyt celler kan også lægges på cellekultur behandlet plastik og dyrkes som en enkeltlags, hvor de udviser morfologi i overensstemmelse med celler af epitelial oprindelse som vist i figur 2b. Mens salisphere celler dyrket på BMM som saliskugler er tilbøjelige til at opretholde en fænotype mere karakteristisk for spyt vævet, kan cellerne dyrket som en enkeltlags være fordelagtigt for nogle eksperimentelle protokoller. Mere omfattende karakterisering skal udføres for at bestemme, i hvilket omfang cellerne opretholder en spyt fænotype, når de dyrkes på en enkeltlags i forhold til celler dyrket som salisfærer.

Figure 1
Figur 1 : Indledende behandling af humane submandibulære kirtler til fremstilling af spyt sfæren. Excised spytkirtel væv ca. 1 cm i diameter (A) er mekanisk hakket i mindre stykker ved hjælp af skarp saks (B), indtil kirtel er adskilt i fordøjelig stykker på ca. 1-2 mm i størrelse (C). De glandulære stykker inkuberet derefter i dispase/collagenase opløsning til 30-90 min med periodisk passage gennem serologiske pipetter, indtil prøven er fordøjet til hovedsagelig enkeltceller eller små klumper af celler (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Primære menneskelige spyt celler kan dyrkes som kugler på kælderen membran matrix eller som en enkeltlags på behandlede cellekultur retter. Efter indledende fordøjelse af spyt vævet, er de Ford øjede kirtler belagt direkte på BMM og dyrkes i 3-10 dage. Celler fodres hver 2-3 dage for at give friske næringsstoffer. Når de primære spyt kugler udvikler sig, kan matricer fordøjes i dispase/kollagenase opløsning, trypsinized til at generere enkeltceller, og re-belagt på frisk BMM, hvor de reformere i kugler (A) eller belagt på cellekultur retter, hvor de let danne en brosten morfologi typisk for en epitelial enkeltlags (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spyt dysfunktion repræsenterer en bekymring for livskvaliteten for dem, der lider af Sjögrens syndrom samt dem, der gennemgår strålebehandling for kræft ved siden af spytkirtlerne3,4,5, 16. En foreslået terapi til behandling af disse patienter er at dyrke funktionelle spyt celler eller organoider in vitro, som derefter kan indsættes i beskadigede spytkirtel til at erstatte angrebne væv9. Desuden, spytkirtler er ofte et sted for persistens og transmission af humane patogener. For eksempel, menneskelige herpesvira såsom Human Cytomegalovirus (HCMV) er kendt for at inficere og bruge spytkirtlerne og spyt til at overføre virus til nye værter7,8,17. De molekylære mekanismer underliggende viral persistens i spytkirtel og bevægelse til spyt forbliver ukendt. Udviklingen af in vitro-spyt cellesystemer vil give et vigtigt model system til at udforske denne mekanistiske information.

Vi rapporterer her en robust protokol til generering af primære spyt "salisfærer", der kan dyrkes in vitro enten som klynger på BMM eller som monolag på plastik. Evnen til at kultur og udbrede primære menneskelige spytkirtel epiteliale celler repræsenterer en vigtig platform, hvor forskerne kan (1) potentielt udvikle substitutionsbehandlinger for patienter med spytkirtel mangler, for hvem ingen andre muligheder findes (2) bedre at forstå den grundlæggende fysiologi underliggende spytkirtel udvikling, spredning, sekretion, etc.; og (3) definere mekanismer, der anvendes af patogener til at replikere og sprede sig til nye værter.

Ved hjælp af disse spyt cellekulturer, vi har rapporteret, at HCMV kræver pentameric glykoprotein kompleks for primær infektion og også at virussen fortsætter i en længere periode, der minder om, hvad der sker med HCMV in vivo7. Desuden viste vores funktionelle undersøgelser, at spyt kulturen ikke indeholder kontaminerende fibroblaster som fibroblast Tropic, Lab tilpassede vira undlader at inficere og replikere i de primære spyt afledte celler7. Mens vi har brugt denne protokol til at generere celler til evaluering af HCMV replikation og spredes i et primært spyt system, denne protokol kunne let tilpasses til at generere spyt celler nyttige for den brede vifte af forskningsemner, der er nævnt ovenfor. Desuden kan denne protokol tilpasses behovene og budgettet for hver enkelt forsker. Selv om vi ikke har valideret andre betingelser selv, andre har rapporteret succes voksende spyt epiteliale celler under forskellige medie forhold. For eksempel, Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM): F12 blanding suppleret med epidermal vækstfaktor og fibroblast vækstfaktor-2 er blevet rapporteret til at fremme robust vækst af spyt celler18. Alternativt, Nam et al. Brug minimal essentielle medier suppleret med føtal kvægserum før overførsel af cellerne til en serum-fri version af en keratinocytproliferation vækstmedier og har rapporteret robust vækst af spyt celler på plast15. Det ser således ikke ud til, at spyt cellerne udviser et absolut krav til en bestemt medietype, men synes snarere at vokse og formere sig på en række kommercielt tilgængelige medietyper.

Ud over medie formulering, forskellige kælder membran formuleringer kunne evalueres for deres evner til at understøtte robust spyt epitelial cellevækst. Vækst af celler på kommercielt tilgængelige kælder membran-holdige matrixer let udbytte saliskugler og giver en enkel, omend dyrt dyrkning system7,19. Svarende til det, der er diskuteret ovenfor om valg af medier til cellevækst, forskere har rapporteret vækst og udvikling af salisfærer på en række forskellige matricer og hydrogel systemer. Hydrogels lavet af hyaluronsyre har den ekstra fordel i at skabe en ekstracellulær matrix tværbundet med ønskede kemiske bestanddele til at studere deres interaktioner og virkninger på celler. Ved hjælp af primære humane væv afledt spyt celler, Srinivasan et al. rapporterede succes i vækst og vedligeholdelse af en spyt stamcelle population i hyaluronsyre hydrogels; øget vækst i stamceller blev yderligere observeret, når silicagelrogeler blev indarbejdet med peptider afledt af kælderen membran proteiner såsom perlecan og Laminin20. Et andet system, der for nylig er udviklet af foraida et al. rapport ved hjælp af "elektro spinding" til at udvikle en af stillads lavet af poly (mælke-Co-glykolsyre) (plga). Plga silicagelrogeler med tilsat elastin fandtes for let at fremme udviklingen af et polariseret submandibulært cellesystem, som kan være nyttigt til at fastslå, hvordan celle polarisering påvirker spyt biologi og biokemi21.

I denne protokol, har vi præsenteret en enkel metode til isolering og vækst af primære spytkirtel-afledte epiteliale celler. Denne protokol resulterer i en hurtig udvækst af en epitelial cellepopulation, der kan opretholdes i gennemsnit for 5-8 passager. Det er afgørende at overvåge vævet under behandling med dispase/collagenase for at sikre passende fordøjelse som nævnt i protokollen. Ufuldstændig fordøjelse vil alvorligt mindske antallet af salisfærer, der overlever. Det er også vigtigt at overvåge kulturerne for den udvækst af fibroblaster, der har en aflang form og er meget forskellige fra de polygonal epitelceller, der typisk vokser i diskrete pletter eller klumper. Vi har brugt denne protokol til isolering af epiteliale celler fra mennesker og mus, men det forekommer sandsynligt, at det kunne tilpasses til brug sammen med andre pattedyr systemer. Desuden kan denne protokol yderligere ændres ved hjælp af yderligere rensningstrin baseret på celleoverflade markør ekspression og flow cytometri, der kan føre til dannelse af mere homogene Initial cellepopulationer. På samme måde kan denne protokol anvendes til at bestemme, hvordan forskellige medier eller matrix/hydrogels formulering føre til udvækst af specifikke celletyper, når først genererer de salisfærer. Som konklusion bør denne protokol fungere som en robust startplatform for isolation og vækst af primære spyt celler, som let kan tilpasses til en lang række forsøgsprotokoller og forskningsområder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer intet til at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke James P. Bridges for at give en betydelig vejledning om de metoder, der er involveret i dyrkning af primære celler. Matthew J. Beucler blev støttet af nationale institutter for sundhedsuddannelse Grant T32-ES007250. Dette arbejde blev også støttet af nationale institutter for sundhedstilskud R01-AI121028 og R21-DE026267 tildelt William E. Miller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm culture dishes Thermo Scientific 172931
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339651
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media Lonza CC-3171 Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh Fisher 22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum Gibco 12676-029
Collagenase type III Worthington LS004182 Store at 4 °C.
Cryogenic Tube Fisher 5000-0020
Dispase Cell Applications 07923 Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors Fisher 08-940
Dulbecco phosphate buffered saline Corning 55-031-PC
General Chemicals Sigma
PathClear Basement membrane extract Cultrex 3432-005-01 Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes Falcon 353046
Surgical forceps Fisher 22-079-742
Trypsin-EDTA solution Corning 25-052-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
  2. Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).
  3. Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
  4. Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
  5. Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. (2018).
  6. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
  7. Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. (2018).
  8. Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
  9. Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
  10. Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
  11. Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. (2018).
  12. Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
  13. Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
  14. Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (2011).
  15. Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
  16. Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
  17. Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
  18. Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
  19. Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
  20. Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
  21. Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics