现场实验中估计富兰克林菌种花纹和奥里乌斯物种捕食者的取样

Environment
 

Summary

这里介绍的是一个协议,用于在田间实验中确定作物中多个日期的割裂和分钟海盗虫捕食者的数量。还说明了如何确定管理策略对漏洞的功效,并评估按分钟海盗错误进行掠夺的好处。

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Funderburk, J., Martini, X., Freeman, J., Strzyzewski, I., Traczyk, E., Skarlinsky, T., Adkins, S. Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments. J. Vis. Exp. (149), e59869, doi:10.3791/59869 (2019).

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Abstract

西部花纹,富兰克林西洋藻(佩尔甘德),是一种多噬菌种,已传播到世界各地。在控制其种群的尝试中广泛使用杀虫剂消除了天敌和竞争对手的花草品种,从而增加了其种群数量。与耐抗害虫种群、次生虫爆发和环境退化一起,形成了不可持续的状况。病虫害综合管理利用对害虫和天敌关系的了解,实施无害环境和可持续的战术。一分钟海盗虫是全世界最重要的捕食者。他们可以抑制并最终控制富兰克林菌种花纹。花样至少每周采集一次,才能了解捕食者-猎物的动态。这里展示的是水果蔬菜和伴生植物的花的样本,以估计单个树苗和分钟海盗虫物种的密度。具有代表性的数据说明了如何使用协议来确定管理策略随时间推后的有效性,以及如何评估按分钟盗版错误进行掠夺的好处。采样协议同样适用于其他植物物种宿主的thrip和分钟海盗虫的采样。

Introduction

西方花草,富兰克林西洋藻(Pergande),是第一批由于全球主义和农产品国际贸易而传播到全世界的害虫之一。经济损失直接来自喂养和排卵,间接地通过植物致病病毒的传播。入侵人口已经对大多数类别的杀虫剂产生了基本抗药性,而用杀虫剂控制种群的尝试只会通过消除重要的天敌和竞争对手物种而增加损害。这种控制方法破坏了管理方案的稳定,导致抗虫害种群、次生虫暴发和环境退化。

综合虫害管理方案是从对害虫和天敌关系以及管理策略对这些关系的影响的了解中发展起来的。长期以来,人们一直认为,快速殖民化和增长的人口特征超过了天敌调节机会主义的西方花丛的能力;也就是说,在它显示,从自然种群的奥里乌斯insidiosus(Say)的掠夺,不仅导致抑制西方花纹种群,而且下降种群走向灭绝2。此外,西方的花纹主要是花居,其中竞争花粉和其他花卉资源与本地多花花纹。

在美国东部的大部分地区,主要本土竞争对手是富兰克林·特里蒂奇(菲奇),而在佛罗里达州南部,主要竞争对手是富兰克林·比斯皮诺萨(摩根)3。西部花纹在佛罗里达受到来自捕食者和竞争对手花纹物种的强生物抵抗力;然而,它是受杀虫剂和其他战术干扰的栖息地中的主要物种,排除了竞争对手和天敌。因此,水果蔬菜成功综合病虫害防治方案的核心组成部分是增加掠夺和竞争3,4。这些程序是从捕食者-猎物动力学知识和各种策略的有效性,以管理血丝和增加生物抵抗力。这里,用于估计佛罗里达州水果蔬菜和伴生植物花中单个树苗和分钟海盗虫种的密度的方法被展示出来。这些数据用于确定管理策略的有效性,并评估按小海盗错误进行掠夺的好处。

设计花纹采样协议:背景信息

当西方花纹在20世纪80年代成为主要害虫时,有必要制定程序,在实地研究中准确、有效地、准确地确定个体刺虫的种类。这里描述的程序是从为理解花纹的生物学和管理而进行的许多研究中获得的知识发展起来的。这些研究的例子包括Funderburk等人2、汉森等人6、萨尔格罗·纳瓦斯等人7、萨瑟兰等人8、泰勒-朱利安等人9。在花中,富兰克林菌种和微小海盗虫的浓度是行为基础,而不是杀虫剂应用或取样伪影。对花卉中其他植物部分的种群估计通常足以了解捕食者和猎物对植物宿主的当地动态,并基于捕食者与猎物比率评估生物控制计划的好处。然而,为花卉开发的方法可以适应其他植物部件的取样。通常的样本单位是一朵或多朵花。达到所需精度水平所需的样本数量是样本单位中总体密度和花数的函数。

富兰克林的物种往往是花朵的聚合分布,种群通常集中在上部植物冠7的花朵。对于大多数研究,花是从植物的上半部分随机选择的。去除花丛的相对技术,包括液体清洗、机械脱流或干燥,是不准确和不精确的8。因此,使用直接计数、绝对估计技术。在Iength中,小生物是大约2毫米,显微镜通常是必要的,以准确确定物种。构成样品单元的花被放置在酒精含量为70%的瓶中。一旦采集样本,每个图的瓶将返回到实验室,以提取小虫和分钟海盗虫,并准确确定每个图的的性别、种类和阶段。实验包括复制的实地图,用于评估抑制thrip的治疗方法的疗效和被微小的海盗虫掠夺的好处。花样在植物宿主的开花期间至少每周采集一次。随机完整块实验设计有助于消除块之间的 thrip 和分钟盗版错误密度的实验误差差异。子图处理安排有助于减少影响thrips运动9的管理策略的图间效应。

花卉样品处理与分析:背景信息

在 20 世纪 90 年代之前,为分类学专家开发了鱼种的钥匙,这些专家使用多种安装介质之一,将用于识别的锥体放在显微镜幻灯片上。研究thrips生物学和管理的研究人员不是分类学专家,分类学专家没有参与研究。通常,这些研究样本中的分体被归为分类的属、家族、子阶或阶级。西方花纹传播后,有关丝虫生物学和管理的研究迅速扩散,研究人员认识到需要识别丝虫物种,并开发一个高效的样品处理系统。

在20世纪90年代中期涉及丝虫种群生物学的研究中,样本中的成人血丝被放置在显微镜幻灯片上,由分类学专家R.J.Beshear(例如Salguero Navas等人7)鉴定为物种。由于当时缺乏幼虫鉴定密钥,幼虫只被识别为属。滑轨安装成本高昂且费力,并开发了更高效的系统2。在随后的研究中,从含有70%酒精的培养皿中的花中提取样本中的丝虫,在立体镜下,在培养皿中确定雄性与雌性。我们的大部分研究都涉及富兰克林菌的物种。这些物种的成人被分离到立体镜下的物种,使用其在背表面的背纹差异,前体,头部和天线10,11,12。

在分体分类方面获得了额外的专业知识,以识别和识别样本中的其他鱼系和物种。全世界有许多奥里乌斯物种,它们是鱼类的重要食肉动物。两个物种,奥·因西迪奥斯和奥·普米利奥(冠军),在佛罗里达州13的大部分地区是共生的。这些物种的成年人被基底天线段、后腿的阴翼和翅膀上的楔形虫的颜色特征隔开。物种和性别在生物学和行为上有所不同;因此,通常单独分析每个数据。由于花朵中的纹组具有聚合分布模式,因此数据需要转换以稳定处理之间的方差。根据实验设计,使用适当的方差分析来比较处理方法,并分析每个单独日期和/或日期2、9 上汇集的数据的数据。当治疗差异因日期而异时,分析对单个日期的影响非常重要。每分钟海盗虫(成人和幼虫)总数(成人和幼虫)的比率用于评估生物控制的有效性与微小的海盗虫在佛罗里达州实地研究中抑制thrips种群的比例约一个捕食者每180次2,9。

Protocol

1. 实地实验,以确定紫外线反射覆盖物、高岭土和伴生植物对花纹及其小海盗虫捕食者的影响

  1. 在随机完整块实验设计中建立一个分块地块处理安排的现场实验,以覆盖类型作为整体地块处理,高岭土和没有高岭土作为子图处理,配套植物和没有配套植物作为子图处理(图1A,B)9,14。
    1. 番茄或胡椒的布局块,每个至少6米宽,72米长。
    2. 随机地躺在每个块整个地块的黑色和紫外线反射覆盖,每个整个地块由六个凸起的覆盖床组成,至少36米长。
    3. 每45厘米种植一排线性西红柿,或每30厘米种植两排线性辣椒,进入每个地块的四个内床。
  2. 高岭土治疗
    1. 随机将每个整个图分为高岭土的相等子图或无高岭土处理。
    2. 在被指定为接受高岭土治疗的子图中,以7.0公斤/公顷的速度,每周施用高岭土一次或两次。
  3. 配套植物
    1. 随机将每个子图划分为配套植物或伴侣植物处理的相等子图。
    2. 每30厘米或每30厘米种植两行线性的Bidens alba(L.),或每30厘米将一排Helianthus年金L.放入每个子子图处理与伴生植物的两个外层。

Figure 1
图1:实验现场研究实例。
(A) 随机完整的块设计,以评估伴生植物、覆盖物和高岭土对花纹和微小海盗虫的单独和交互效应。(B)拜登斯·阿尔巴(L.)被评价为一种与番茄为作物的配套植物。赫利安图斯·阿努斯L.评估为伴生植物物种,以胡椒为作物14。请点击此处查看此图的较大版本。

2. 花纹取样协议

  1. 在进行实验图之前,准备 50 mL 样品小瓶。
    1. 在每个小瓶的外侧和内侧放置贴有覆盖物、高岭土和配套植物处理、块号和样品日期的标签。
    2. 将每瓶 50 mL 酒精的 30 mL 含量为 70%。
    3. 将小瓶放入托盘中。
    4. 将托盘带到实验现场。
  2. 品尝花的叮当和分钟的海盗虫。
    1. 随机分配要在每个子图中取样的番茄或胡椒植物。
    2. 在上午中到下午之间取样。
    3. 从植物的上半部分取样。
    4. 拆下小瓶盖。使用锋利的剃须刀或剪刀,小心地从植物中取出花。快速将花放入适当的预标记小瓶中。将花推入小瓶的酒精中(图2)。更换盖子。
    5. 每个样品收集10朵花。确保每个小瓶都密封,然后摇动每个小瓶,以确保花在酒精内。
  3. 将装有样品的托盘送回实验室存放。为确保样品在加工前不会变质,请保持样品冷却和干燥。冷藏,如果可能的话,特别是对于未快速处理的样品。
  4. 在作物开花期间,至少每周重复每个子图的采样。

Figure 2
图 2:样品去除技术。
在番茄推拉实验9中,从子图中收集了10朵番茄花的样本。请点击此处查看此图的较大版本。

3. 实验室样品加工

  1. 从每个样本中的花中提取小虫和分钟海盗虫。
    1. 从冰箱和托盘中取出样品,而不会干扰内容物。
    2. 取下小瓶的盖子,用移液器小心地提取花上方多余的酒精。
    3. 重新密封小瓶,摇动,以清除花丛中的小虫和微小的海盗虫。
    4. 打开小瓶,将内容物倒入培养皿中。用70%的酒精冲洗小瓶内侧,并将内装物倒入培养皿中。确保小瓶中的所有小孔和分钟海盗虫都冲进培养皿中。
    5. 用钳子将每朵花倒掉,用70%的酒精冲洗,以确保所有的小虫和微小的盗版虫都被赶走。从培养皿中取出并丢弃花件(图3)。
    6. 将培养皿转移到具有 40x-150 倍放大倍率的立体镜平台。

Figure 3
图3:从花中提取小虫和小海盗虫。
10朵番茄花的样本倒入培养皿中进行处理,以确定丝虫和分钟海盗虫的数量。请点击此处查看此图的较大版本。

  1. 识别并计数样品中的花纹。
    1. 在每个网格中确定并计算每个花纹物种的成年雄性和雌性数量以及富兰克林菌种幼虫的数量。
    2. 识别在佛罗里达州的成年花纹物种基于在前名词,头部和第二天线段10,11,12的setaee。
    3. 将F.Bispinosa的成年人与F.tritici和F.ocidentalis的成年人分开,通过第二个天线段前背边缘上两个setae的额外粗壮(图4)。
    4. 将成人F. 欧西塔菌F. bispinosaF. tritici的成形 F.图 4.

Figure 4
图 4:用于识别 thrip 的形态字符示例。
(A,B,C)F 骨球:(A),箭头表示正心setae 对 IV;表示词 (B), 箭头表示长的副质位基泰;天线段 II (B) 的远端背膜。(D、E、F、G) .F. 比皮诺萨: 头 (D);词名 (E);天线段 II(F, G) 的远端背塞,箭头表示粗壮的 setae (F),粗壮 setae 的横向视图 (G)。(H,I,J)。F. 三提蒂: 头 (H);词名 (I);天线段 II (J) 的远端背膜。请点击此处查看此图的较大版本。

  1. 识别并计数佛罗里达州的小海盗虫样本。
    1. 在每个网格中识别和计数成年O.insidiosus和O.pumilio的数量和仙女奥里乌斯物种的数量13,15。
    2. 通过棕色基底天线段、有深色标记的阴云和深棕色的楔形虫,识别成年的O.insidiosus。
    3. 通过黄色基底天线段、黄色或稻草色女形片,以及浅稻草或浅棕色的楔形虫,识别成年 O. pumilio。
  2. 添加每个网格的数字,以确定每个花纹品种的成年雄性和雌性总数、富兰克林菌种幼虫数量、每个物种的成年分钟海盗虫的数量以及分钟海盗虫的数目在示例中。
  3. 从样本中选择具有代表性的花纹和分钟海盗虫成人凭证。按日期、工厂主机、位置和收集器进行标注。长期保存。
  4. 将数据从每个示例传输到电子表格,其中包括示例日期、处理和复制。
  5. 创建包含来自每个示例的数据的数据文件。包括实验地点、实验设计,以及用于建立和维护实验的每个文化实践的数量和日期。
  6. 使用适当的备份维护和管理数据文件,以便长期访问。

Representative Results

Tyler-Julian等人在研究中收集的数据可用于证明推动因子(即紫外线反射覆盖物和高岭土应用)和拉力因子(即配套植物西班牙针,B)的单独和综合影响。 .阿尔巴)关于番茄花中成年雄性与雌性的人口动态(图1A)。实验中的农业塑料覆盖处理用于形成高床塑料覆盖系统的床,这是佛罗里达州种植高价值蔬菜的生产系统的典型。害虫防治中紫外线反射覆盖物的机制是一种视觉威慑,它干扰了成年虫的宿主发现。高岭土在番茄植物上的应用也反射足够的紫外线来吓阻成年人。因此,在实验中采用了分割图随机完整块设计,以减少覆盖物和高岭土处理的紫外线反射特性对裂土运动产生的分图间干扰。处理(紫外线反射与常规黑色覆盖物)作为整个图,高岭土处理(每周两次高岭土应用与无高岭土)作为子图,并配套植物处理(配套植物与无伴)作为子子图。子图大小为6张床乘9米,每个子图的4个内床由一排线性番茄组成,植物间距为45厘米,每个子图共有80个植物。在子图的两个外部床中,每排西班牙针头被种植到两个外部床中,伴生植物的行内和行之间间隔为30厘米,每个子图共有128个配套植物。

在2011年番茄作物开花期间,每个子图共收集了10个番茄花的样本,每个子图的13个日期,并确定了每个样本中成年雄性、雌性F.ocitis的数量(图5)。使用随机完整块设计对覆盖物、高岭土和配套植物对每种性别的影响进行分析,以便使用混合模型对样本日期的数据进行分割绘图处理安排(参见 Tyler-Julian 等人)。9用于对方差和结果分析的完整描述)。地膜、高岭土和伴植植物的主要作用对雄性西花花(分别为0.01、0.001和0.001)有显著影响,而覆盖X高岭土、覆盖X伴植物、高岭土X的相互作用效果配套植物,和覆盖X高岭土X配套植物相互作用不显著(p > 0.05)。 这些结果表明,每种主要效应都减少了成年男性F.occientis的数量,并且每种策略的效果在相互结合时是累加的。

覆盖物的主要作用对女性F.奥西塔蒂斯(p <0.01),而高岭土和伴生植物的主要作用对女性F.奥西林(p > 0.05)没有显著。因此,紫外线反射覆盖物减少了番茄花中的雌性F.ocilinis,但高岭土和伴生植物没有。然而,覆盖X高岭土相互作用显著(p <0.05),表明紫外线反射覆盖物和高岭土的综合效应比单独使用哪种策略更能降低雌性F. 黑覆盖物上的番茄并没有减少雌性番茄的数量。覆盖X伴生植物、高岭土X配套植物和覆盖X高岭土X伴生植物对雌性F.occientis的相互作用的相互作用效果不显著(p > 0.05)。

Figure 5
图 5:在采样日期上分析数据的示例。
2011 年,在佛罗里达州加兹登县进行的推拉实验中,每 10 株番茄花 (SEM) 在覆盖、高岭土和配套植物处理中,对样本数据进行集中的 10 个番茄花 (SEM) 平均数。 这个数字已由泰勒-朱利安等人修改。

在2011年对男性和女性F.ocidentalis成人(分别为0.01和0.001)的实验中,覆盖X样本日期的相互作用显著。这表明,紫外线反射覆盖物减少了一些(但不是全部)样品日期上的花纹数量。因此,进行了额外的分析,以评估覆盖物对单个样本日期的影响。相互作用表明,紫外线反射覆盖物在季节早期有效减少花纹数量,但在季中或后期的单个样本日期上没有意义(图6)。

Figure 6
图6:整个图处理的人口动力学示例。
每10株番茄花(+ SEM)中,每个2011年样本日期的成年雄性、雌性F.ocidentalis的平均数量(+ SEM),用于在高岭土和配套植物中汇集的数据,对整个地块进行黑和紫外线反射覆盖物的处理在佛罗里达州加兹登县进行的推拉实验中的处理方法(*根据对单个样本日期的方差分析,指示显著性超过95%的显著性;d.f. = 1,2)。这个数字已由泰勒-朱利安等人9.请点击此处查看此图的较大版本。

高岭土X样本日期的相互作用在2011年对雄性或雌性F.如上文所示,对样本日期数据汇总的分析表明,高岭土对雌性F.奥西林数没有显著影响,而雄性F.奥西林数则显著减少。在样本日期数据集中分析中缺乏显著的高岭土X样本日期相互作用,这表明每个性别的结果在样本日期之间是一致的(图7)。

Figure 7
图7:子图处理的人口动力学示例。
在高岭土的子图处理中,每个 2011 年样本日期的成年雄性和雌性F. cidentalis每 10 个番茄花 (+ SEM) 的平均数量 (+ SEM) 在推拉中跨配套植物处理的数据汇集在佛罗里达州加兹登县进行的实验(*根据对单个样本日期的方差分析,指示显著性超过 95% 的显著性水平;d.f. = 1, 4)。这个数字已由泰勒-朱利安等人9.请点击此处查看此图的较大版本。

伴生植物X样本日期的相互作用在2011年显著为男性F.奥西塔蒂斯(p <0.05),但不适用于女性F.奥西塔蒂斯(p > 0.05)9 。为评估伴生植物对单个样本日期的影响而进行的分析表明,伴生植物在季末样品日期减少了成年F.occientis数量,但从未在早季或中季的样品日期上减少(图8)).

Figure 8
图8:子子图处理的人口动态示例。
在Gadsden进行的推拉实验中,每个2011年样本日期的成年雄性、雌性F.ocidentalis每10株番茄花(+ SEM)的平均数(+ SEM)在配套植物的子子图处理中,没有伴生植物佛罗里达州县(*根据对单个样本日期的方差分析,指示显著性超过 95% 显著性水平;d.f. = 1,8)。这个数字已由泰勒-朱利安等人9.请点击此处查看此图的较大版本。

在Tyler-Julian等人14号研究中从伴生植物的花朵中收集的数据可以用来证明微小的海盗虫和它在花中捕食之间的动态关系(图1B)。与Tyler-Julian等人9号研究一样,目标是确定推力因子(即紫外线反射覆盖物和高岭土应用)和拉力因子(即伴生植物)对种群的单独和综合影响。富兰克林菌种的动力学成年男性和女性在作物花。在Tyler-Julian等人14年的研究中,主要的花纹品种是伴生植物H.角质和胡椒作物中的F.bispinosa(超过99%的花丛)。 花儿迅速殖民向日葵和胡椒花,它们的数量在开花开始后不久就最多了(图9)。随着时间推移,随着小范围海盗虫数量的增加,盗虫的数量会减少。捕食者-猎物比率表明,捕食者有能力抑制以每40个鱼群的>1%的比例出现的鱼群几乎灭绝的鱼群。

Figure 9
图 9:评估掠夺的好处的示例。
2011 年和 2012 年在佛罗里达州棕榈滩县进行的实验中,每个Helianthus 年花头的平均数量 (+ SEM) 总鱼头(成人和幼虫)和总猎头spp.(成人和仙女)每个食肉动物在括号中显示的每个日期)。这个数字是根据泰勒-朱利安等人14号报告的数据改编的,并经牛津大学出版社批准。

Discussion

经过30多年的实地研究,为佛罗里达的农作物开发了具有所需精确度估计花纹种群密度的采样协议。研究是为了了解影响种群估计的花纹生物学的重要方面。例如,进行研究是为了了解采样16、场内样本位置16、个别植物的样本位置6、16、聚集模式对估计时间的影响。在花7,和花的颜色17。这些因素被认为影响人口估计;因此,决定在哪里,何时,以及如何在设计采样协议在未来的研究至关重要。

分钟海盗虫成人和仙女是高度嗜血的,和捕食者聚集与它的猎物在密度依赖的方式,通过选择相同的花也首选的thrips17。他们还利用猎物或被猎物破坏的植物的提示来定位鱼苗。成年人在花间快速移动,这种行为增强了他们在空间和时间18中追踪当地猎物种群的能力。因此,在估计微小海盗虫种群时,应在今后的研究中使用用于估计虫群的采样协议。分钟海盗虫是成人的有效捕食者和不同富兰克林菌种的幼虫花19。捕食者的数量相对于猎物总数提供了对分钟海盗虫抑制和控制花中混合的鱼群的能力的最佳估计。在分析未来研究中的数据时,应考虑这一点。

富兰克林菌种成人迅速殖民宿主作物一旦开花开始,和快速人口增长后,没有死亡从天敌2,18,19。在捕食者和向日葵等猎物的植物宿主上,在花开始后不久就,鱼群的数量最大,随着微小的海盗虫增加,种群数量就会减少(图9)。微小的海盗虫的数量仍然存在,即使小虫几乎灭绝。为了充分理解这种捕食者-猎物的动态关系,有必要在整个作物的开花期间经常取样。调查其他类型的战术的功效时也是如此,因为它们在某些日期可能有效,而其他策略则无效。在整个开花期间每周进行一次或两次采样,以评估泰勒-朱利安等人9、14年调查的推拉系统中多种战术的效果。

富兰克林是家族中第二大属,有大量文献描述20年的成年生活阶段。一种复杂的物种栖息花卉,是特定于不同的植物宿主物种和地理位置。因此,从初始采样的子集中专家鉴定带幻灯片的试样至关重要。然后,在任何特定的植物宿主和地理位置中,可以选择每个物种的成年人所特有的分类特征,以便在未来的研究中确定该物种,而无需进行将每个物种置于显微镜上的费力和昂贵的程序在复合显微镜下查看的幻灯片。它们只需在立体镜下查看和识别即可。(在某些异常情况下,分隔两个物种的形态特征非常类似,以至于它们无法在立体镜下分离。这里描述的佛罗里达州大多数作物中常见的花纹品种的方法,在处理实地研究中所需的大量样品时,应加以调整和使用,以确定管理策略的有效性,评估按小海盗错误掠夺的好处。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

支持由佛罗里达州农业和消费者服务部的专业作物块赠款号码01856和024049提供。其他支持来自美国农业部-ARS与佛罗里达大学58-6618-2-096和58-6618-4-035的合作协议。我们感谢以前的学生、博士后和合作者,他们以多种方式为我们的研究做出了贡献,以了解影响花纹种群动态的因素。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol Any source 70% ethanol or isopropyl
Centrifuge tube Fisher Scientific Co. 06-443-18 Flat cap and trayed
Forceps Fisher Scientific Co. 08-885 Medium point
Kaolin clay Novasource Surround WP 95% kaolin
Pasteur pipet Fisher Scientific Co. 13-678-6A 5 ¾ inch disposable
Petri dish Fisher Scientific Co. FB0875711A With grid
Probes/seekers Fisher Scientific Co. 08-995 6 inch bent end
Scalpel Fisher Scientific Co. 14-840-00 Excel international
Stereomicroscope Leica Microsystems M Series 40X and greater
UV-reflective mulch Intergro Metalized

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References

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