Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence

Cancer Research

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Summary

La caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) est un sujet populaire dans la recherche translationnelle. Ce protocole décrit un test semi-automatique d'immunofluorescence (IF) pour la caractérisation de PD-L1 et l'énumération des CTC dans les échantillons patients de cancer de poumon de non-petite cellule (NSCLC).

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Garcia, J., Barthelemy, D., Geiguer, F., Ballandier, J., Li, K. W., Aurel, J. P., Le Breton, F., Rodriguez-Lafrasse, C., Manship, B., Couraud, S., Payen, L. Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (150), e59873, doi:10.3791/59873 (2019).

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Abstract

Les cellules tumorales circulantes (CTC) dérivées de la tumeur primaire sont jetées dans la circulation sanguine ou le système lymphatique. Ces cellules rares (1 à 10 cellules par ml de sang) justifient un mauvais pronostic et sont corrélées avec une survie globale plus courte dans plusieurs cancers (p. ex. le sein, la prostate et le cancer colorectal). À l'heure actuelle, le système de capture à base de perles magnétiques anti-EpCAM est le test de référence approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l'énumération des CCT dans la circulation sanguine. Ce test est basé sur l'utilisation de perles magnétiques recouvertes de marqueurs anti-EpCAM, qui ciblent spécifiquement les cellules cancéreuses épithéliales. De nombreuses études ont montré qu'EpCAM n'est pas le marqueur optimal pour la détection de la CCT. En effet, les CTC sont une sous-population hétérogène de cellules cancéreuses et sont capables de subir une transition épithéliale à mésenchymale (EMT) associée à la prolifération métastatique et à l'invasion. Ces CTC sont capables de réduire l'expression du marqueur épithélial de surface cellulaire EpCAM, tout en augmentant les marqueurs mésenchymal tels que la vimentine. Pour surmonter cet obstacle technique, d'autres méthodes d'isolement fondées sur les propriétés physiques des CCT ont été mises au point. Les technologies microfluidiques permettent une approche sans étiquette de l'enrichissement de la CCT à partir d'échantillons de sang entier. La technologie microfluidique spirale utilise les forces de traînée inertielles et Dean avec un flux continu dans les canaux incurvés générés dans une puce microfluidique spirale. Les cellules sont séparées en fonction des différences de taille et de plasticité entre les cellules sanguines normales et les cellules tumorales. Ce protocole détaille les différentes étapes pour caractériser l'expression programmée de la ligand de la mort 1 (PD-L1) des CTC, combinant un dispositif microfluidique en spirale avec l'ensemble de marqueurs d'immunofluorescence personnalisable (IF).

Introduction

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques à l'antigène tumoral jouent un rôle crucial dans la réponse aux cancers par le biais d'un processus connu sous le nom de « surveillance immunitaire » du cancer. Leurs fonctions antitumorales sont renforcées par des anticorps de blocus de point de contrôle immunitaire tels que les inhibiteurs cTLA-4 et les inhibiteurs De PD-1/PD-L1. Dans le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC), les thérapies anti-PD-1/PD-L1 ont comme conséquence des taux de réponse s'étendant de 0%-17% dans les patients présentant des tumeurs PD-L1-négatives et 36%-100% dans ceux exprimant PD-L1. Les réponses robustes au blocus de PD-1/PD-L1 observées dans le mélanome et NSCLC sont montrées par l'évidence du taux global amélioré de réponse (RR), des avantages cliniques durables, et de la survie sans progression (PFS). À l'heure actuelle, les traitements anti-PD1 sont la norme de soins dans le traitement de deuxième intention avec le nivolumab indépendamment de l'expression PD-L1 et avec le pembrolizumab chez les patients exprimant PD-L1 -1%. Dans le traitement de première ligne, la norme de soins est le pembrolizumab seul chez les patients atteints de NSCLC exprimant PD-L1 50% et peut être potentiellement améliorée avec la chimiothérapie (platin et médicament doublet selon le sous-type histologique)1,2.

Cependant, une telle approche à lagestion patiente est discutable 3, puisque l'expression de PD-L1 dans les cellules de tumeur par immunohistochemistry (IHC) n'est probablement pas le biomarqueur de compagnon le plus idéal. D'autres tels que la charge de mutation de tumeur4 (TMB), l'instabilité de microsatellite (MSI), et/ou le microbiote sont probablement intéressants dans ce arrangement seul ou en combinaison. NSCLC sont connus pour être des tumeurs hétérogènes, soit spatialement (d'un site de tumeur à un autre) ou temporellement (du diagnostic à la répétition). Les patients atteints de NSCLC sont généralement fragiles, et les biopsies invasives itératives de tissu peuvent être un problème. En effet, le taux de rebiopsie à la première progression varie de 46% à 84% selon les séries, et la re-biopsie réussie (c'est-à-dire avec une analyse histologique et moléculaire complète) varie de 33% à 75%. Cela signifie que 25%-67% des patients ne peuvent pas recevoir une analyse complète de re-biopsie au cours de la première progression5,6,7,8.

L'avènement des « biopsies liquides » a ainsi suscité un enthousiasme considérable dans ce contexte particulier, car il permet une réévaluation cruciale des altérations moléculaires lors de la progression de la maladie en examinant l'ADN libre circulant (aDNc) dérivé de la circulation cellules tumorales (CTC). Ces cellules vivantes sont libérées de la tumeur dans la circulation sanguine, où elles circulent librement. Bien qu'elle ne soit pas couramment utilisée, l'analyse des CCT semble très prometteuse dans le cas de la caractérisation moléculaire et phénotypique, du pronostic et de l'importance prédictive dans le cancer du poumon (via DNAseq, RNAseq, miRNA et analyse des protéines). En effet, les CTC abritent probablement des caractéristiques phénotypiques de la maladie active plutôt que les marqueurs initiaux (détectés sur les biopsies tissulaires au moment du diagnostic). En outre, les CTC détournent le problème de l'hétérogénéité spatiale du tissu tumoral, qui peut être un problème crucial dans de petites biopsies. Par conséquent, l'expression de PD-L1 sur des CTC peut potentiellement jeter la lumière sur les écarts dérivés de son utilisation comme biomarqueur prédictif utilisant le tissu de tumeur.

Récemment, l'expression PD-L1 a été testée dans les CCT de NSCLC. Presque tous les patients examinés9 étaient Positifs de PD-L1, compliquant l'interprétation du résultat et de son utilisation clinique. Dans l'ensemble, des CTC positifs au PD-L1 ont été détectés dans 69,4 % des échantillons provenant d'une moyenne de 4,5 cellules/mL10. Après l'initiation de la radiothérapie, la proportion de CTC PD-L1-positifs a augmenté de manière significative, indiquant la régulation vers le haut de l'expression de PD-L1 en réponse au rayonnement11. Par conséquent, l'analyse de CTC de PD-L1 peut être employée pour surveiller des changements dynamiques de la tumeur et de la réponse immunitaire, qui peuvent refléter la réponse à la chimiothérapie, à la radiothérapie, et aux traitements probables d'immunothérapie (IT).

À ce jour, l'isolement des CCT et la caractérisation de la DPc-L1 s'appuient sur diverses méthodes telles que lacapture de perles magnétiques à base de perles magnétiques anti-EpCAM, l'analyse basée sans enrichissement et la taille 12,13 essais de capture de la CCT. Cependant, les CTC n'ont été détectés que chez 45 à 65 % des patients atteints de NSCLC métastatique, ce qui limite leur capacité de fournir des renseignements à plus de la moitié des patients atteints de NSCLC métastatique. De plus, le nombre de CCT était faible dans la plupart de ces études en utilisant l'approche fondée sur la taille10. En outre, cette méthode a conduit à des divergences telles que la détection de cellules CD45(-)/DAPI(MD) avec des « modèles cytomorphologiques de malignité » dans la circulation sanguine de donneurs en bonne santé. Ces préoccupations soulignent la nécessité d'une méthode très sensible de collecte de la CCT associée au phénotypage immunitaire des cellules CD45(-) atypiques provenant de sang entier sain à l'aide de biomarqueurs du cancer supplémentaires (c.-à-d. TTF1, Vimentin, EpCAM et CD44) dans le NSCLC.

Par conséquent, nous avons évalué un dispositif microfluidique en spirale qui utilise des forces de traînée inertielles et dedoyen pour séparer les cellules en fonction de la taille et de la plasticité à l'intermédiaire d'une puce microfluidique. La formation des flux de vortex Dean présents dans la puce microfluidique donne lieu à de plus grandes CTC situées le long de la paroi intérieure et à de plus petites cellules immunitaires le long de la paroi extérieure de la puce. Le processus d'enrichissement est complété par le siphonnage des cellules plus grandes dans la prise de collecte comme la fraction de la CCT enrichie. Cette méthode est particulièrement sensible et spécifique (détection d'environ 1 CTC/mL de sang entier)14 et peut être associée à des analyses personnalisées d'immunofluorescence (IF). Ces outils permettront de mettre en place un seuil positif pour l'interprétation clinique. Un flux de travail est ainsi décrit qui permet aux biologistes d'isoler et d'immunophénotype CTC avec un taux élevé de récupération et de spécificité. Le protocole décrit l'utilisation optimale de l'appareil microfluidique en spirale pour recueillir les CTC, les tests IF optimisés qui peuvent être personnalisés selon le type de cancer, et l'utilisation de logiciels libres open-source pour mesurer et analyser les images cellulaires pour effectuer un semi-automatique numération des cellules en fonction de la coloration fluorescente. En outre, le multiplexage au microscope peut être effectué en fonction du nombre de filtres fluorescents/marqueurs disponibles.

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Protocol

Des échantillons ont été prélevés de façon prospective dans le cadre de la cohorte CIRCAN (CIRculating CANcer) basée au CHU de Lyon après le consentement écrit du patient. Cette étude a été intégrée à la cohorte CIRCAN-ALL. L'étude CIRCAN-ALL a été reconnue comme non interventionnelle par le RPC Sud-Est IV daté du 04/11/2015 en vertu de la référence L15-188. Une version modifiée a été reconnue comme non interventionnelle le 20/09/2016 en vertu de la référence L16-160. L'étude CIRCAN-ALL a été déclarée au correspondant informatique et liberté des Hospices Civils de Lyon le 01/12/2015, sous la référence 15-131. La collecte de sang a été exécutée quand les médecins ont observé la première indication de progression de tumeur.

REMARQUE: Utiliser tous les réactifs et les matériaux décrits dans le Tableau des matériaux avec les conditions d'entreposage respectives pour la préparation pré-analytique de l'échantillon et l'analyse de l'immunofluorescence. Le remplacement des réactifs et/ou la modification des conditions de stockage pourrait entraîner des performances d'évaluation sous-optimales.

1. Décontamination de l'appareil microfluidique spiralé

REMARQUE: La décontamination de l'appareil microfluidique en spirale est une exigence pour éliminer tous les antécédents d'immunofluorescence générés par la contamination bactérienne, explorer la cytomorphologie des CTC et être en mesure de les différencier des cellules immunitaires normales. Le protocole est optimisé pour les échantillons de sang prélevés dans les tubes K2EDTA dans les 6 h après l'échantillonnage du sang et enrichi à l'aide de l'appareil microfluidique spirale dans des conditions propres. L'utilisation de cet analyse pour d'autres types d'échantillons (autres fluides biologiques) peut nécessiter une optimisation supplémentaire. Ce protocole de décontamination doit être fait une fois par semaine.

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparation du tampon diluant
      1. Stériliser 20 mL de réactif additif diluant à l'aide d'un filtre à seringues de 0,22 m et ajouter directement à 1 L de 1x tampon de phosphate de qualité saline (PBS) de qualité ultra-pure (Tableau des matériaux).
    2. Stérilisation des réactifs et de la paille d'entrée
      1. Stériliser le tampon de lyse RBC et le tampon de résuspension (RSB; Tableau des matériaux) à l'aide d'un filtre à seringues de 0,22 m et d'un stock dans un nouveau tube conique en polypropylène de 50 ml pour chaque solution.
      2. Stériliser la paille d'entrée en couve à température ambiante (RT) pendant 1 h dans le réactif de nettoyage tout usage (Table des matériaux). Transférer la paille à l'agent nettoyant à base d'eau de Javel (Table of Materials) et couver à RT pendant 1 h.
      3. Rincer la paille d'entrée deux fois avec du PBS stérile pendant 1 h chacun et entreposer la paille d'entrée stérilisée dans un sac chirurgicalement stérile (Table des Matériaux).
  2. Décontamination du dispositif microfluidique en spirale
    1. Désinfection à l'aide du réactif nettoyant tout usage
      1. Déconnectez le bouchon de bouteille diluant du port diluant de l'appareil microfluidique en spirale en dévissant la vis brune. Sous un coffret de sécurité microbiologique, transférer jusqu'à 250 ml de réactif de nettoyage tout usage (Tableaudes matériaux)dans une nouvelle bouteille vide.
      2. Visser le bouchon de bouteille diluant et la paille à la bouteille de 250 ml de réactif de nettoyage tout usage sous une armoire de sécurité microbiologique. Fixez cette bouteille au port diluant de l'appareil microfluidique en spirale en vissant la vis brune.
      3. Transférer jusqu'à 100 ml d'eau de Javel (1 % de concentration finale; Tableau des matériaux) au conteneur de déchets fourni dans le kit de course (Figure 1A).
      4. Chargez une nouvelle paille d'entrée stérile sur le dispositif microfluidique en spirale (Table of Materials) dans le port d'entrée. Chargez un nouveau tube de centrifugeuse de 50 ml dans le port d'entrée. Chargez un nouveau tube centrifugeur de 50 mL dans le port de sortie.
      5. Procédez à l'apaisement de l'appareil microfluidique en spirale en cliquant sur Prime sur le dispositif microfluidique en spirale (3 min). Retirez le tube d'entrée une fois le premier terminé.
      6. Transférer jusqu'à 15 ml de réactif de nettoyage tout usage dans un nouveau tube de centrifugeuse de 50 ml avec une pipette sérologique sous une armoire de sécurité microbiologique et attacher le tube au port d'entrée du dispositif microfluidique en spirale.
      7. Avant de commencer la course, vérifiez que la solution est exempte de bulles excessives. Si des bulles sont présentes, retirez-les par aspiration lente avec une pipette.
      8. Chargez une puce microfluidique de décontamination dans le dispositif microfluidique en spirale. Exécutez un programme 3 sur l'appareil microfluidique en spirale en cliquant sur Run et en sélectionnant le programme 3 (31 min).
        REMARQUE : Le programme 3 du dispositif microfluidique en spirale permet un enrichissement rapide des CCT en 31 min.
      9. Continuez avec l'étape de nettoyage du dispositif microfluidique en spirale en utilisant le volume restant du réactif de nettoyage tout usage dans le tube d'entrée.
      10. Jetez le tube d'entrée après l'étape de nettoyage est terminée, laissant derrière la paille d'entrée.
    2. Décontamination à l'aide de l'agent nettoyant à base d'eau de Javel
      1. Déconnectez le bouchon de bouteille de réactif de nettoyage tout usage du port diluant de l'appareil microfluidique en spirale en dévissant la vis brune. Sous un coffret de sécurité microbiologique, transférer jusqu'à 250 ml d'agent nettoyant à base d'eau de Javel (tableaudes matériaux)dans une nouvelle bouteille vide (Figure 1A).
      2. Vissez le bouchon de bouteille de réactif de nettoyage tout usage et la paille à la bouteille contenant l'agent de nettoyage bleach-basé sous une armoire de sécurité microbiologique. Fixez cette bouteille au port diluant de l'appareil microfluidique en spirale en vissant la vis brune.
      3. Transférer jusqu'à 15 ml d'agent nettoyant à base d'eau de Javel dans un nouveau tube d'entrée de 50 ml à l'aide d'une pipette sérologique sous une armoire de sécurité microbiologique. Chargez la position d'entrée du tube de centrifugeuse de 50 ml. Chargez un tube vide en position de sortie.
      4. Avant de traiter la course, vérifiez que l'échantillon est exempt de bulles excessives et, le cas échéant, retirez les bulles en les aspirant lentement avec une pipette.
      5. Exécuter le programme 3 en cliquant sur Run et en sélectionnant le programme 3 (31 min). Après la course, passez directement à l'étape de nettoyage en utilisant le volume restant d'agent nettoyant à base d'eau de Javel dans le tube d'entrée.
      6. Jeter les tubes d'entrée et de sortie.
    3. Rincer le dispositif microfluidique en spirale.
      1. Déconnectez le bouchon de bouteille à base d'agent nettoyant à base d'eau de Javel du port diluant de l'appareil microfluidique en spirale en dévissant la vis brune. Sous une armoire de sécurité microbiologique, transférer la paille de la bouteille contenant l'agent nettoyant à base d'eau de Javel à la nouvelle bouteille contenant le tampon diluant. Visser la bouteille à l'appareil microfluidique spirale.
      2. Transférer jusqu'à 15 ml d'eau stérilisée (Tabledes matériaux)dans un nouveau tube d'entrée de centrifugeuse de 50 ml à l'aide d'une pipette sérologique sous un coffret de sécurité microbiologique. Chargez la position d'entrée du tube de centrifugeuse de 50 ml. Chargez un tube vide en position de sortie.
      3. Avant de traiter la course, vérifiez que l'échantillon est exempt de bulles excessives et, le cas échéant, retirez les bulles en les aspirant lentement avec une pipette.
      4. Exécuter le programme 3 en cliquant sur Run et en sélectionnant le programme 3 (31 min). Après la course, passez directement à l'étape de nettoyage en utilisant le volume restant d'eau stérilisée dans le tube d'entrée.
      5. Jeter les tubes d'entrée et de sortie.

2. Entretien pour garder le dispositif microfluidique spiralé sans bactéries

REMARQUE: L'entretien de routine doit être effectué à la fin de la journée lors de la dernière étape de nettoyage.

  1. Transférer jusqu'à 7 ml d'agent nettoyant à base d'eau de Javel dans le nouveau tube de centrifugeuse de 50 ml à l'aide d'une pipette sérologique sous une armoire de sécurité microbiologique. Visser le tube de nettoyage à base d'eau de Javel dans le port d'entrée de l'appareil microfluidique spirale.
  2. Avant de traiter l'exécution propre, vérifiez que l'échantillon d'entrée est exempt de bulles excessives et, le cas échéant, retirez les bulles en les aspirant lentement avec une pipette.
  3. Exécutez le nettoyage sur l'appareil microfluidique en spirale.

3. Enrichissement pré-analytique de la CCT à partir d'échantillons de sang de patients

  1. Recueillir 7,5 ml de sang dans le tube K2EDTA et garder sous une légère agitation pour éviter la sédimentation cellulaire et la coagulation. Processus dans les 6 h.
    REMARQUE: Si le sang est recueilli dans un tube de collecte d'ADN sans cellules contenant un agent de conservation, entreposez-le à 4 oC jusqu'au traitement. Assurez-vous que l'échantillon de sang, tampon de lyse RBC et tampon RBS sont à RT avant de procéder à l'étape d'enrichissement.
  2. Transférer jusqu'à 7,5 ml de sang entier dans un nouveau tube d'entrée de centrifugeuse de 50 ml à l'aide d'une pipette sérologique sous une armoire de sécurité microbiologique.
  3. Centrifugeuse à 1 600 x g pendant 10 min à RT. Recueillir la fraction plasmatique avec une pipette sans déranger le pelage chamois. Remplacez la fraction plasmatique en ajoutant directement un volume équivalent de PBS jusqu'à 7,5 ml.
  4. Ajouter délicatement le tampon de lyse RBC (Tableaudes matériaux)à l'échantillon de sang à un volume final de 30 ml (pour un tube K2EDTA) ou 37,5 ml (pour un tube de collecte de sang d'ADN sans cellules). Invertis doucement le tube de collecte de sang 10x et incuber pendant 10 min à RT.
    REMARQUE: L'échantillon de sang devient rouge foncé pendant la lyse RBC. Si aucun changement (du rouge foncé et opaque) n'est observé après 10 min, inverser doucement le tube 3x et laisser reposer pendant un autre maximum de 5 min. Ne laissez pas l'échantillon dans le tampon de lyse RBC pendant plus de 15 minutes, car il peut compromettre la qualité de l'échantillon et les performances d'analyse.
  5. Centrifugelée l'échantillon de sang lysé à 500 x g pendant 10 min à RT, avec des freins centrifugeurs sur (ou la vitesse de décélération la plus élevée). Utilisez une pipette Pasteur ou une pipette sérologique pour retirer délicatement le supernatant jusqu'à ce que le volume atteigne la marque de 4-5 ml. Ensuite, utilisez des pointes de micropipette filtrées pour enlever le supernatant restant.
  6. À l'aide d'une micropipette P1000 à la pointe filtrée, ajouter 1,0 ml de RSB à la paroi du tube d'entrée du tube de centrifugeur de 50 ml. Pour éviter d'introduire des bulles dans le mélange, resuspendre la pastille cellulaire en faisant doucement monter et descendre jusqu'à ce que l'échantillon soit homogène.
  7. Ajouter 3 ml de RSB supplémentaires à la paroi du tube d'entrée du tube de centrifugeuse de 50 ml (volume total de 4 ml). Évitez d'introduire des bulles dans le mélange. Mélanger délicatement la suspension cellulaire en faisant doucement monter et descendre.
    REMARQUE: Dans le cas peu probable où le tuyauterie ordinaire est incapable de décomposer les amas cellulaires (définis en étant visibles ou en bloquant la pointe de la pipette), filtrez l'échantillon à travers une passoire cellulaire de 40 m pour enlever les amas. Ajouter 150 L de RSB à l'échantillon pour compenser la perte de volume du filtrage. Notez que cette méthode doit être utilisée avec parcimoniellement et seulement lorsque de gros amas sont observés.
  8. Avant de passer à l'étape d'enrichissement, vérifiez que l'échantillon est exempt de bulles excessives et, le cas échéant, retirez les bulles et prenez soin de ne pas jeter tout échantillon. Si de minuscules bulles sont présentes, leur élimination n'est pas nécessaire.
  9. Traiter l'échantillon sur l'appareil microfluidique en spirale.

4. Enrichissement des CTC du sang entier du patient avec le dispositif microfluidique de spirale

  1. Chargez une nouvelle puce microfluidique spirale. Chargez deux tubes de centrifugeuse vides de 50 mL dans les ports d'entrée et de sortie.
  2. Exécutez un prime en cliquant sur Prime sur l'appareil microfluidique en spirale (3 min). Retirez les tubes d'entrée et de sortie et chargez l'échantillon à traiter dans le port d'entrée.
  3. Chargez un tube conique clair de 15 ml dans le port de sortie pour recueillir les CTC enrichis. Exécuter le programme 3 en cliquant sur Run et en sélectionnant le programme 3 (31 min).
  4. Décharger le tube de sortie et la centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min (accélération : 9 ; décélération : 5). Avec une pipette sérologique de 5 ml, retirez l'arrêt de supernatant à la marque de 2 ml sur le tube conique de 15 ml. À l'occasion d'une micropipette, retirer l'arrêt du supernatant à 100 oL sur le tube conique de 15 ml. Traiter l'échantillon enrichi directement pour la coloration immunofluorescence.

5. Staining immunofluorescence

  1. Énumérer sur une glissière chambrée avec une grille de type hémocytomètre le nombre de cellules par mL. Diluer l'échantillon enrichi avec une solution anticontraignante de 0,2 % (Tableau des matériaux) à une concentration atteignant 100 000 cellules/100 L par cytospin.
  2. Humidifiez le contour de la chambre d'échantillon à l'aide de coton (Tableaudes matériaux) avec une solution anticontraignante de 50 l à 0,2 %. Placer un lacet en verre en polylysine dans la chambre d'échantillon et fermer.
  3. Enrober une pointe d'une solution anticontraignante de 0,2 % en faisant monter et descendre 3 fois. Resuspendre l'échantillon enrichi et transférer la solution cellulaire dans la chambre de l'échantillon. Centrifugeuse avec centrifugeuse dédiée (Table des Matériaux) à 400 tr/min pour 4 min (accélération basse).
  4. Placez un isolateur de silicium autour de la zone de dépôt. Laisser sécher le verre-glisser sous une armoire de sécurité microbiologique pendant 2 min.
  5. Préparer la solution de fixation en diluant 1 ml de 16% de paraformaldéhyde (PFA) avec 3 ml de PBS stérile. Ajouter 100 L de solution de fixation (4 % de PFA) par échantillon et incuber à RT pendant 10 min. Enlevez la solution de fixation et effectuez trois lavages avec 200 L de PBS et incubez à RT chacun pendant 2 min.
    MISE EN GARDE: Utilisez pfA sous un coffret de sécurité chimique pour prévenir l'inhalation.
  6. Préparer la solution de saturation en diluant le sérum bovin fœtal (FBS) à 5%, le récepteur Fc (FcR) bloquant le réactif à 5%, et l'albumine de sérum bovin (BSA) à 1% en PBS stérile (Tableaudes Matériaux). Ajouter 100 L de solution de saturation par échantillon et incuber pendant 30 min à RT. Supprimer la solution de saturation.
  7. Ajouter 100 l de solution d'anticorps par échantillon (anticorps CD45 1/20; Anticorps PanCK 1/500; Anticorps PD-L1 1/200; Solution de saturation Qsp 100 l) (Tableau des Matériaux). Placer la glissière en verre en polylysine dans un plat Petri de 100 mm x 15 mm. Humidifiez un papier absorbant avec 2 ml d'eau stérile et fermez le plat Petri avec le couvercle. Placer à 4 oC pendant la nuit et protéger de la lumière.
  8. Retirer le mélange d'anticorps et effectuer 3 lavages avec 200 L de PBS incuber chaque lavage pendant 2 min. Laisser sécher l'échantillon pendant 5 min et le protéger de la lumière. Placez 10 l de solution de montage (Tableaudes matériaux) dans la zone de dépôt et recouvrez-la d'un bordereau de microscope sans faire de bulle. Scellez la couverture avec du vernis à ongles.

6. Acquisition d'images immunofluorescentes avec microscope fluorescent droit et logiciel associé

  1. Utilisez un microscope fluorescent droit avec une plate-forme motorisée X/Y. Utilisez un objectif 20x pour prendre des images de tiff 8 bits RGB dans quatre canaux correspondant à la teinture d'ADN (4',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), le colorant PanCK (isothiocyanate de fluorescéine [FITC]), le colorant PD-L1 (CY3) et le colorant CD45 (CY5). Allumez la lampe au mercure 15 min avant utilisation et adaptez le microscope et le logiciel associé à la pousse semi-automatisée.
  2. Placez le toboggan en verre sur la plate-forme.
  3. Dans le menu d'acquisition, définissez les quatre canaux et configurez le temps d'exposition (DAPI : 15 ms, FITC [PanCK] : 500 ms ; CY3 [PD-L1] : 800 ms; CY5 [CD45] : 1 000 ms). Définir les tuiles à la scan. Cliquez sur Tuiles. Dans l'expérience avancée, définir la zone à scanner.
  4. Ajuster la mise au point sur l'écran. Cliquez sur Démarrer l'expérience.
  5. Exporttisez les fichiers TIF de chaque canal et nommez spécifiquement le fichier d'image avec cette information : Sample-NumberofTilesRegion-dye-NumberOfSubtiles.tif (p. ex., Sample1-TR1-c1m01). Nom colorant comme suit: le canal DAPI est c1, le canal FITC est c2, le canal CY3 est c3, et le canal CY5 est c4.

7. Analyse d'images immunofluorescentes avec logiciel d'analyse d'images

  1. Téléchargez et installez le logiciel d'analyse d'images gratuit à partir du site Web du Broad Institute. Accepter tous les défauts pendant l'installation. Ouvrez le logiciel d'analyse d'images et cliquez sur Fichier Pipeline à partir du fichier . Analyse 4channels-CTC.cppipe.
    REMARQUE: Le pipeline convertit les images couleur RGB en échelle grise, supprime les artefacts en lissant les images avec un filtre médian, identifie les noyaux et le cytoplasme, quantifie les intensités de fluorescence de chaque canal, et les exporte dans un fichier Excel.
  2. Déposez les fichiers dans la liste de fichiers. Mettre à jour les métadonnées pour regrouper les fichiers par tuiles.
    REMARQUE: Toutes les instructions pour regrouper les images sont spécifiées dans le logiciel. Les fichiers nominaux sont apparus dans le module NamesAndTypes et les fichiers sont regroupés en fonction du nombre de la tuile et du canal par échantillon.
  3. Cliquez sur Afficher les paramètres de sortie et spécifier une sortie par défaut correcte. Cliquez sur Analyser les images. Ouvrez le fichier de feuille de calcul correspondant aux paramètres d'intensité de mesure.

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Representative Results

La première condition préalable était d'obtenir des collections non contaminées (sans agent infectieux) de CTC pour la culture tissulaire et d'éviter les antécédents de FI générés. Le protocole de décontamination a permis le nettoyage de tous les tuyaux et pompes, et il a abouti à la collecte des CTC avec un bon taux de récupération sans contamination bactérienne. Les échantillons enrichis ont été comparés sans et avec le flux de travail de protocole de décontamination du dispositif microfluidique en spirale. Pour valider le protocole de décontamination, la lignée cellulaire A549 a été utilisée en l'absence de sang entier et enrichie directement à l'aide du dispositif microfluidique en spirale. Sans le protocole de décontamination optimisé, une forte contamination bactérienne a été observée dans la culture tissulaire de la lignée cellulaire A549 enrichie après seulement 24 h, ce qui a causé la mort et des changements cytomorphologiques dans les cellules eucaryotes (Figure 1B).

En revanche, après le protocole de nettoyage, les cellules Vivantes A549 ont été obtenues en cultivant en culture 2D après 10 h de culture tissulaire et d'enlèvement des médias et dans des conditions 3D (figure 1B), ainsi que des échantillons de patients (Figure 1C). Les CCT potentiels sont identifiés avec une croix rouge (figure 1C).

La figure 2 récapitule le flux de travail complet pour le phénotypage d'immunofluorescence des CTC enrichis du sang entier. Il est composé de quatre étapes principales : l'échantillonnage du sang entier, l'enrichissement de la CCT, l'immunofluorescence (IF) et l'analyse d'images à l'aide d'un logiciel. Auparavant, le taux de récupération de l'appareil microfluidique spirale a été abordé14. À l'aide d'imitant les CCT fluorescents (MCTC), ce taux de rétablissement a été établi à 1,3 CTC/mL de sang entier14.

Les travaux actuels étaient axés sur la mise en place des conditions optimales pour l'analyse de la SIC et de la visualisation en aval (figure2). Tout d'abord, pour tester la spécificité de l'anticorps PD-L1, deux lignées cellulaires ont été utilisées : (1) PC3 ligne cellulaire à forte positive-PD-L1 et (2) ligne cellulaire SW620 faible ment positif-PD-L1. Les cellules ont ensuite été enrichies avec le dispositif microfluidique en spirale et analysées par IF. Toutes les cellules ont été tachées avec le marqueur anti-PanCK de tumeur, marqueur anti-CD45 de globule blanc, anti-PD-L1 (utile dans le cancer de poumon), et DAPI (colorant nucléaire). Les globules blancs ont été identifiés comme positifs pour Le DAPI et le CD45, tandis que les cellules cancéreuses ont été identifiées comme positives pour Le DAPI et le PanCK et négatives pour le CD45. La ligne cellulaire à haute teneur en PD-L1-positive de PC3 a été positivement souillée pour PD-L1, alors qu'une expression inférieure de PD-L1 a été détectée dans la ligne de cellules basse-PD-L1-négative de SW620.

Ensuite, on a comparé ce qui suit : l'(e) liquide IF, la coloration (ii) des CTC directement déposées sur des lames recouvertes de polylysine, et (iii) la coloration des CTC après cytospin sur des lames recouvertes de polylysine. Il a été clairement observé que le taux de recouvrement des CCT dépendait du type de protocole utilisé (figure 3A). Dans l'astodonte de la coloration du liquide, le taux de récupération n'était que de 10 % pour le nombre de MCTC à pointes était le plus bas. Ce faible taux de rétablissement présente un problème pour la plupart des patients atteints de NSCLC métastatique, car il limite considérablement la capacité de ces tests d'isoler les quelques CTC et de fournir des informations phénotypiques. Les deuxième et troisième sections décrites (dépôt direct du CCTM ou de la CCT sur des glissières recouvertes de polylysine sans et avec de la cytopsine) avaient systématiquement des taux de récupération supérieurs à 60 % (figure3A).

Figure 3 B montre des images représentatives de ces tests IF à l'aide d'échantillons de sang entier s'appuyant sur le même patient, soit en utilisant le test de coloration du liquide IF ou à la coloration IF sur des diapositives recouvertes de polylysine avec du cytospin. L'énumération des noyaux était clairement différente entre les deux essais (figure 3B). La coloration nucléaire DAPI a fourni l'énumération des cellules totales dans l'échantillon, et la coloration de biomarqueur a permis de mettre en évidence le vert les cellules PanCK-positives, orange dans les cellules PD-L1-positives, et rouge dans les cellules blanches résiduelles CD45 (figure3 B).

Ensuite, pour différencier cytologiquement les globules blancs des cellules tumorales, la forme du noyau doit être visualisée, car elle est caractéristique du type cellulaire. Figure 3 C démontre les contours des noyaux qui sont flous et la morphologie qui est inhabituel en l'absence de l'étape cytospin. Le protocole optimisé comprenait donc la cytospinning de CTC enrichis sur des lames recouvertes de polylysine suivie s'il s'agissait d'une fixation au paraformaldéhyde (PFA) de 4 %, pour préserver les lames avant la coloration IF. Ce protocole optimisé avait des taux de récupération similaires à ceux du dépôt de mCTC directement sur des lames recouvertes de polylysine (figure 3A),même lorsque très peu de cellules ont été ajoutées. Étant donné que cette étape supplémentaire permet la préservation de la morphologie nucléaire (figure 3C),les granulocytes ont été identifiés avec leurs noyaux multilobés, ainsi que des cellules tumorales (étiquetées avec une croix rouge dans le noyau) avec leur anomalies, modèles de malignité, et plus grande taille comparée aux globules blancs.

Après optimisation du protocole de FI, une preuve-de-concept a été conduite utilisant le sang entier des patients métastatiques. Des échantillons ont été prélevés de façon prospective dans le cadre de la cohorte de routine du CIRCAN basée au CHU de Lyon. La collecte de sang a été habituellement exécutée quand les médecins ont observé la première indication de progression de tumeur. Tous les cas de tumeur ont été histologiquement ou cytologiquement confirmés sur des spécimens de biopsie de FFPE pendant le diagnostic initial. En l'espèce, les analyses des CCT à la progression ont été effectuées par des chercheurs qui n'avaient pas accès aux données cliniques ou n'en avaient pas connaissance antérieurement. Des considérations pré-analytiques détaillées ont déjà été publiées15.

Dans la figure 4, le tableau 1et le tableau 2, différents résultats sont présentés à partir d'échantillons de patients. Le profil CD45(MD), PanCK(-), PD-L1(-) représente les cellules immunitaires. Le nombre résiduel de globules blancs s'est avéré fortement variable et dépendant de l'échantillon de sang entier. La fourchette dans cette petite cohorte pilote était de 648 à 11 000 cellules Blanches CD45 (figure5A). Par conséquent, immédiatement après l'enrichissement de la CCT, un recensement des cellules recueillies a été inclus pour ajuster la densité cellulaire sur la zone de cytospin à une densité de 100 000 cellules/cytospin (voir la section 6). Cela a permis la performance de plusieurs cytospins par patient et l'optimisation de l'observation microscopique pour l'énumération manuelle et l'utilisation du pipeline logiciel d'analyse d'image.

Dans la figure 4A-C, le tableau 1et le tableau 2, des cas typiques sont rapportés dans lesquels le nombre résiduel de globules blancs était très différent :

(i) Le premier profil est le CD45(-), PanCK(MD) et le PD-L1(MD) présenté à la figure 4A . Souvent, la taille des cellules est supérieure à 13 m de diamètre et la morphologie du noyau est irrégulière, ce qui représente un modèle cytomorphologique de malignité. Cette population est probablement composée de la CCT.
(ii) Le deuxième profil est le CD45(-), PanCK(-), et PD-L1(). Comme nous l'avons déjà signalé, tous les CCT n'expriment pas le biomarqueur PanCK (figure4A).
(iii) Le troisième profil est le CD45(-), PanCK(MD) et Le PD-L1(-). Comme nous l'avons déjà signalé, tous les CCT n'expriment pas le biomarqueur PD-L1.
(iv) Le quatrième profil est le CD45, PanCK et PD-L1(MD) présenté à la figure 4B. Il représente les cellules immunitaires activées atypiques dans le sang entier du patient. Cette population a été décrite dans plusieurs publications16,17,18 et représente environ 5% du total des cellules après l'enrichissement. La présence de cette population peut augmenter le taux de CTC faux positifs dans un échantillon si l'intensité du signal CD45 est trop faible et que la morphologie du noyau n'est pas bien conservée. Ceci souligne fortement la nécessité d'effectuer la coloration de biomarqueur tumoral complémentaire, telle que Vimentin et/ou Epcam dans cet analyse d'immunofluorescence.
(v) Enfin, le dernier profil comprend les cellules non étiquetées CD45(-), PanCK(-), et PD-L1(-), mises en évidence à la figure 4C. Le noyau de cette population montre souvent des modèles cytomorphologiques de malignité, et la taille est de plus de 13 m de diamètre. Le pourcentage de ces cellules dans les échantillons est très variable selon le sang entier du patient. Ceci accentue la nécessité d'employer les biomarqueurs tumoraux complémentaires pour confirmer le modèle tumoral de cette sous-population de cellules.

Dans le tableau 1 et le tableau 2, le nombre cellulaire de 16 échantillons a été rapporté chez des patients atteints de NSCLC métastatiques avancés. Les cellules ont été classées selon l'expression des biomarqueurs. Une grande variabilité a été observée dans les sous-populations obtenues. Comme déjà rapporté dans des études indépendantes, les profils CD45(-), PanCK(MD) et PD-L1(MD) ont été trouvés dans la plupart des échantillons. Néanmoins, comme la population de la CCT est très hétérogène, les échantillons de patients contenaient également des sous-populations de CD45(-), PanCK(-), et PD-L1(MD), les sous-populations CD45(-), PanCK(MD), et PD-L1(-) et les cellules non étiquetées CD45(-), PanCK(-), et PD-L1(-) sous-populations. Le niveau des globules blancs résiduels était très variable parmi les échantillons analysés.

Pour faciliter l'énumération cellulaire, un pipeline pilote a été mis en place à l'aide du logiciel d'analyse d'images pour une analyse automatisée des images d'immunofluorescence. Le flux de travail est décrit à la figure 5. Dans ce cas, il est important d'acquérir des images d'immunofluorescence de haute qualité en termes de contraste et d'intensité de fluorescence. Selon la capacité de calcul par grappe du matériel, le pipeline d'analyse d'image peut être appliqué à l'image fusionnée complète du cytospin ou à une zone représentative du cytospin.

Ici, à partir du microscope, un balayage semi-automatisé de la zone cytospin (X/Y; la mise au point Z n'est pas incluse) a généré 150-200 images fusionnées. Ces images peuvent être fusionnées et analysées directement à l'aide du pipeline d'analyse d'images. Néanmoins, cette procédure consomme des ressources en grappes de temps et de calcul, ce qui constitue une limitation importante de son utilisation courante dans les laboratoires. Par conséquent, sur la base de l'expérience antérieure dans le domaine de l'hématologie cellulaire, il a été décidé d'analyser les zones représentatives de chaque échantillon après avoir vérifié au microscope que la distribution des cellules était homogène sur toute la zone du cytospin. Ensuite, 25% de la surface totale du cytospin (environ 40 tuiles) a été numérisée avec le microscope à fleurescence pour générer 40 x 4 images indépendantes. Le fichier fusionné a été divisé par canaux, et les fichiers d'images ont été générés automatiquement avec le logiciel de microscope (voir la section 7; Figure 5 A). Ces fichiers ont été importés dans un pipeline d'analyse d'images pour analyse selon les paramètres décrits (voir la section 8; Figure 5 A).

Dans la figure 5B, nous avons identifié manuellement une image représentative affichant quatre CCT [CD45(-), PanCK(MD) et PD-L1(MD)] parmi 77 cellules immunitaires [CD45), PanCK(-), et PD-L1(-)]. Figure 5 B illustre comment le logiciel d'analyse d'image a identifié et énuméré le nombre de cellules en fonction de la coloration DAPI. Il illustre également la façon dont le logiciel d'analyse d'images a compté les objets secondaires. Enfin, des intensités de fluorescence pour chaque canal fluorescent ont été signalées pour tous les objets rapportés dans les images.

L'arrière-plan a été calculé et représenté par les cellules négatives présentes dans l'échantillon. Par exemple, les cellules immunitaires non activées ont une faible intensité de fluorescence et ont permis de mesurer l'arrière-plan de la coloration PanCK et PD-L1. Le signal fluorescent a été jugé positif si l'intensité de fluorescence a dépassé de deux fois celle de l'arrière-plan (d'après l'analyse de quatre échantillons de patients indépendants). En ce qui concerne la coloration CD45, comme le niveau d'expression de CD45 est très variable dans les sous-populations de globules blancs, le seuil de positivité a été fixé aussi bas que possible. Il a été basé sur l'analyse d'images de 10 sang entier sain taché avec l'anticorps CD45. L'analyse pilote (n o 4) a montré une concordance entre le recensement manuel et l'énumération des logiciels d'analyse d'images (tableau 2). Chaque cellule sur le cytospin est identifiée par un logiciel d'analyse d'images et permet aux biologistes de suivre la cellule et de confirmer manuellement les résultats, si nécessaire.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu du flux de travail pour la décontamination des dispositif microfluidique en spirale instrument. (A) Trois étapes majeures incluses dans le processus de décontamination (voir protocole), illustrant la localisation des entrées et des extrants de l'instrument. (B) Images représentatives de l'enrichissement de la lignée cellulaire A549 avant et après la décontamination de l'instrument. L'impact de la présence d'un agent infectieux sur la viabilité et la morphologie des cellules collectées est démontré. En présence de bactéries, la morphologie cellulaire et la viabilité ont été modifiées. Barre d'échelle de 20 m. (C) Culture cellulaire 3D d'échantillons enrichis de patients atteints de cancer du poumon, de la prostate et du sein. La croix rouge correspond à des cellules atypiques. Barre d'échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Aperçu du flux de travail de l'analyse d'immunofluorescence de l'échantillonnage de sang entier à l'analyse des images de fluorescence. Les principales étapes sont indiquées comme suit : collecte de sang pour le sang entier, collecte de CTC avec dispositif microfluidique en spirale, analyse d'immunofluorescence, et logiciel d'analyse d'image. Le choix du biomarqueur a été motivé par une meilleure identification des différentes populations de cellules observables sur la glissière cytospin (CD45 pour les cellules immunitaires, PanCK et PD-L1 pour les cellules cancéreuses du poumon). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Taux de récupération de trois protocoles de coloration indépendants. (A) Comparaison du taux de récupération des mCTC s'ilsèrent des taches liquides, de la coloration directe des cellules déposées sur des lames recouvertes de polylysine et de la coloration cellulaire après cytospin sur des lames recouvertes de polylysine. (B) Images représentatives d'échantillons de patients traités par protocole SI liquide et protocole d'immunostaining direct avec le cytospinstep. Les cellules ont été tachées avec CD45 anticorps monoclonaux (clone HI30) Alexa Fluor 647; Anticorps monoclonal PanCK (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488; 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Barre d'échelle de 20 m. (C) Images représentatives de la coloration DAPI de l'enrichissement cellulaire avec et sans l'étape cytospin. La morphologie et la taille des noyaux ont été montrées utilisant la coloration de DAPI. La croix rouge met en évidence les cellules présentant des anomalies dans le noyau dans l'image de droite. Dans l'image de gauche, l'image est floue, puisque les cellules ne sont pas au même niveau (x-, y-, et z-axes). Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Identification des profils cellulaires. (A) Images représentatives de patients présentant différents profils de la CCT. Les canaux de fluorescence sont présentés séparément. Les images fusionnées sont affichées sur la gauche. Ils sont tachés d'anticorps monoclonaux CD45 (clone HI30) Alexa Fluor 647; Anticorps monoclonal PanCK (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488; PDL-1 anticorps monoclonal (clone 29E2A3) phycoerythrin; 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI); flèches pointent vers des cellules atypiques. (B) Images représentatives de l'immunostaining de deux échantillons de patients avec des profils atypiques de globules blancs. Les cellules ont été tachées avec CD45 anticorps monoclonaux (clone HI30) Alexa Fluor 647; Anticorps monoclonal PanCK (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488; PDL-1 anticorps monoclonal (clone 29E2A3) phycoerythrin; 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). L'image met en évidence la présence de cellules immunitaires tachées de CD45( MD), PanCK et PD-L1( ). (C) L'image met en évidence la présence de cellules non étiquetées (CD45(-), PanCK(-), et PD-L1(-). Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Aperçu de l'analyse des images fluorescentes. (A) Les principales étapes sont décrites : la numérisation de microscopie, le fractionnement du canal en fonction de la fluorescence et l'importation de fichiers dans un logiciel d'analyse d'images. (B) Description des trois étapes différentes pour le flux de travail du logiciel d'analyse d'image. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Table 1
Tableau 1 : Recensement manuel de l'enrichissement cellulaire du patient. Recensement des cellules à partir de la coloration DAPI. Recensement d'autres objets basés sur la coloration FITC, PE et CY5.

Table 2
Tableau 2 : Logiciel d'analyse d'images énumération de l'enrichissement cellulaire du patient . Recensement des cellules à partir de la coloration DAPI. Recensement d'autres objets basés sur la coloration FITC, PE et CY5. Comparaison du comptage manuel et de l'énumération des logiciels d'analyse d'images.

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Discussion

Deux points majeurs ont été soulevés dans la présente étude, le premier en ce qui concerne la performance du flux de travail pour son transfert à des applications cliniques, et le second concernant la diminution de la subjectivité pour l'analyse des images de fluorescence obtenues.

Un flux de travail performant et optimisé pour l'énumération de la CCT a d'abord été déterminé à l'aide d'un analyse FI personnalisable après enrichissement cellulaire par l'intermédiaire d'un système microfluidique sans étiquette de la CCT (dispositif microfluidique en spirale). À l'aide de ce flux de travail, une étude pilote a confirmé que tous les échantillons de patients métastatiques de NSCLC contenaient des cellules atypiques, qui étaient toutes CD45(-). Ils peuvent également être étiquetés avec des biomarqueurs PanCK et/ou PD-L1; cependant, ils peuvent également être complètement négatifs pour tous les biomarqueurs testés [CD45(-), PanCK(-), et PD-L1(-) comme observé dans l'échantillon S19 (tableau 2)]. Cela souligne fortement la nécessité de biomarqueurs supplémentaires pour les sous-populations de phénotypage de la CCT. Par conséquent, il a été proposé d'ajouter des biomarqueurs épithélial-mésenchymal tels que l'EpCAM, la Vimentine et la N-Cadherin; marqueurs de cellules souches cancéreuses, y compris CD44 et CD133; et des marqueurs tumoraux spécifiques, y compris TTF1 pour l'adénocarcinome pulmonaire.

Dans l'étude pilote, la gamme de cellules atypiques était [40; '400] de 3,5 ml de sang entier. Pour 80% des échantillons de patient, le nombre atypique de cellules était au-dessus de 50. En effet, dans cytologique19,20,21 échantillons d'Endo Bronchial Ultra Sonic Guide Trans Bronchial Needle Aspiration ou CT-guided trans-thoraciques, L'analyse PD-L1 convient à la plupart des échantillons, mais un le seuil de 100 cellules tumorales est généralement admis pour produire une interprétation statistique et clinique de la valeur. Cependant, dans le cas particulier des CTC de sang, il devrait noter que la question de l'hétérogénéité spatiale de tumeur est contournée par contraste aux petits échantillons sur place de tumeur.

Le deuxième point était d'éviter l'impact du gestionnaire sur l'analyse des images d'immunofluorescence. Un logiciel d'analyse d'images fluorescentes a ainsi été mis en place pour normaliser le recensement cellulaire et fournir des données statistiques pour ces échantillons. Ce processus automatisé a mis en évidence la nécessité de clusters de calcul puissants pour l'analyse de toutes les cellules contenues dans le même échantillon. En outre, la qualité de la coloration IF doit être dans le même plan (pour éviter l'utilisation de systèmes confocal), et la densité des cellules sur le cytospin doit être calibré pour permettre au logiciel d'analyse d'image de reconnaître toutes les cellules séparément sur la diapositive. Enfin, les résultats n'ont pas été validés en ce qui concerne les résultats cliniques d'une cohorte de patients, mais ce point devrait être abordé dans une autre étude spécialisée.

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Disclosures

Jean-Philippe Aurel et Kathryn Weiqi Li sont des employés de la société Biolidics qui produit des instruments utilisés dans cet article. Les autres auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche d'AstraZeneca (Londres, Royaume-Uni), Biolidics (Singapour) et la Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, France). Les auteurs remercient les entreprises AstraZeneca et Biolidics pour leur soutien financier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) Ozyme BLE 422801 Storage conditions: +4 °C
BD Facs Clean – 5 L BD Biosciences 340345 Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL Biolidics CBB-F016012 Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% Sigma A8412 Storage conditions: +4 °C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 BioLegend BLE304020 Storage conditions: +4 °C
CellProfiler Software Broad Institute Image Analysis Software
Centrifuge device Hettich 4706 Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL Corning 430-829 Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL Biolidics CBB-F001004-25 Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System Biolidics CBB-F011002 Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L Beckman Coulter 8448222 All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S Biolidics CBB-FR001002 Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4 ThermoFisher A78300003 Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL Biolidics CBB-F016009 Storage conditions: +4 °C
EZ Cytofunnels ThermoFisher A78710003 Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent Miltenyi Biotec 130-059-901 Storage conditions: +4 °C
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10270-106 Storage conditions: +4 °C
Fluoromount Sigma F4680 Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone - 50 mg Bristol-Myers-Squibb 90129TB29 Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C
FX1 Input Straw with lock cap Biolidics CBB-F013005 Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide Dutscher 50126 Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 ThermoFisher 53-9003-80 Storage conditions: +4 °C
Paraformaldehyde 16% ThermoFisher 11490570 Fixation solution. Storage conditions: +4 °C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin BioLegend BLE329706 Storage conditions: +4 °C
Petri Dish Dutscher 632180 Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) Ozyme BE17-512F Storage conditions: +4 °C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L 1st Base Laboratory BUF-2040-1X1L Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10% Gibco 24040-032 Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides ThermoFisher J2800AMNZ Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL Falcon 352098 Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL G Biosciences 786-649 Storage conditions: +4 °C
RBC Lysis Buffer – 250 mL G Biosciences 786-650 Storage conditions: +4 °C
Resuspension Buffer (RSB) Biolidics CBB-F016003 Storage conditions: +4 °C
Shandon Cytopsin4 centrifuge ThermoFisher A78300003 Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator Grace bio-Labs 664270 Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL 1st Base Laboratory CUS-4100-100ml Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 Zeiss Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag SPS Laboratoires 98ULT01240 Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile BD Biosciences 300296 Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile ClearLine 51732 Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software Zeiss Microscope associated software

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