विशिष्ट और कुशल प्रोटीन कमी प्राप्त करने के लिए ट्यूनिंग गिरावट

Immunology and Infection
 

Summary

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए प्रभावी ढंग से और विशेष रूप से खमीर Saccharomys cerevisiae में ब्याज की एक प्रोटीन deplete $-est AID प्रणाली का उपयोग कर.

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Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion. J. Vis. Exp. (149), e59874, doi:10.3791/59874 (2019).

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Abstract

संयंत्र auxin बाध्यकारी रिसेप्टर, TIR1, एक विशिष्ट auxin-inducable degron (AID) आकृति auxin की उपस्थिति में युक्त प्रोटीन पहचानता है, उन्हें गिरावट के लिए लक्षित. इस प्रणाली के कई गैर संयंत्र यूकैरियोट में शोषण किया है, इस तरह है कि एक लक्ष्य प्रोटीन, AID आकृति के साथ टैग, auxin इसके अलावा पर अपमानित किया है. TIR1 अभिव्यक्ति का स्तर महत्वपूर्ण है; अत्यधिक अभिव्यक्ति भी auxin की अनुपस्थिति में AID-टैग प्रोटीन की गिरावट की ओर जाता है, जबकि कम अभिव्यक्ति धीमी कमी की ओर जाता है. एक $-एस्ट्राडियोल-इंसुलेबल एड सिस्टम बनाया गया था, जिसमें एक $-एस्ट्राडियोल प्रेरक प्रवर्तक के नियंत्रण में TIR1 की अभिव्यक्ति थी। TIR1 का स्तर auxin इसके अलावा से पहले जेड-एस्ट्राडियोल के साथ ऊष्मायन के समय को बदलने से टूनाबल है। इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे तेजी से एक लक्ष्य प्रोटीन AID प्रणाली का उपयोग कर deplete करने के लिए. उपयुक्त जेड-एस्ट्राडियोल ऊष्मायन समय लक्ष्य प्रोटीन की बहुतायत पर निर्भर करता है। इसलिए, कुशल कमी भी auxin-स्वतंत्र कमी को कम करता है कि इष्टतम समय पर निर्भर करता है।

Introduction

सशर्त उत्परिवर्तनों, जैसे तापमान के प्रति संवेदनशील म्यूटेंट, आवश्यक प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं, जो अनुमत स्थिति के तहत सेल विकास की अनुमति देता है लेकिन गैर-अनुज्ञेय परिस्थितियों में कार्य की हानि का कारण बनता है। हालांकि, सेल चयापचय गंभीर रूप से दोष प्रेरित करने के लिए आवश्यक विकास की स्थिति में परिवर्तन से परेशान किया जा सकता है और यह भी बंद लक्ष्य प्रभाव पैदा कर सकते हैं. कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें ब्याज का प्रोटीन सशर्त अलग किया जाता है1 या इसकी अभिव्यक्तिको एकछोटे अणु के अलावा 2,3 नियंत्रित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल auxin और auxin-inducible degron (AID) प्रणाली का उपयोग करता है कुशलतापूर्वक एक लक्ष्य प्रोटीन deplete.

AID प्रणाली पौधों में अपनी मूल है, जहां एक auxin (इस प्रोटोकॉल indole-3-ऐसीटिक एसिड (IAA) में प्रयोग किया जाता है), TIR1 के साथ Aux/IAA प्रोटीन की बातचीत को उत्तेजित करता है, SCF U3 सबविक्विटिन लिगेज़ परिसर4के एक सदस्य . एससीएफ जटिल अन्योन्यक्रिया के कारण औक्स/आईएए परिवार प्रोटीनों का बहुविकरण होता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीसम5,6द्वारा उनकी गिरावट होती है।

इस प्रणाली को पहले खमीर Saccharomyces cerevisiae7में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था7 ,8 खमीर कोशिकाओं में Oriza sativa (osTIR) से TIR1 प्रोटीन व्यक्त करके, जहां यह अंतर्जात खमीर के साथ बातचीत करने में सक्षम है एससीएफ परिसर. ब्याज के प्रोटीन को निम्नीकरण के लिए लक्षित करने के लिए औक्स/आईएए प्रोटीन आईएए17 से एक आकृति के साथ टैग किया गया था। IAA17 के कार्यात्मक truncations बाद में विकसित किए गए थे, जैसे AID *8,9,10, जिसमें 43 एमिनो एसिड औक्सिन-संवेदी आकृति से युक्त है, जो कि अरबिडोप्सिस थालियाना आईएए17 से है, साथ ही सक्षम करने के लिए एक एपिटोप टैग के साथ डिटेक्शन.

प्रणाली शुरू में नवोदित खमीर7में उपयोग के लिए अनुकूलित,8 एक खमीर GAL प्रमोटर से osTIR1 प्रोटीन व्यक्त की. अभिव्यक्ति एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में Galactose के साथ विकास के माध्यम में स्थानांतरण की आवश्यकता है, जो दुर्भाग्य से, सेल चयापचय11के लिए व्यापक परिवर्तन के साथ एक diauxic बदलाव में परिणाम . दूसरी ओर, यह सूचित किया गया है कि यदि अभिव्यक्ति का स्तर अधिक है, तो एक्सिन/आईएए12 के अभाव में टीआईईआरसी1 की संघटना अभिव्यक्ति लक्ष्य प्रोटीन की अवक्रमण का कारण बन सकती है, जबकि कम TIR1 अभिव्यक्ति अक्षम कमी का कारण बनती है। एक उन्नत AID प्रणाली जिसका नाम है -est AID विकसित किया गया था जिसमें osTIR एक प्रेरक प्रमोटर है कि लक्ष्य प्रोटीन के अनुरूप करने के लिए टूनाबल है के नियंत्रण में है, सेल चयापचय पर कम से कम प्रभाव के साथ. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, एक कृत्रिम प्रतिलेखन कारक (एटीएफ) का निर्माण किया गया था जिसमें VP16 वायरल ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक को एक एस्ट्रोजन रिसेप्टर और चार n उंगलियों डीएनए बाइंडिंग डोमेन (DBD) से जुड़ा हुआ है। जब एस्टरिडॉल (एक एस्ट्रोजेन) मौजूद होता है, तो एटीएफ नाभिक में प्रवेश कर सकता है और अपने प्रमोटर ($4EVpr)13,12को बाध्य करके osTIR ट्रांसक्रिप्शन को प्रेरित कर सकता है।

osTIR अभिव्यक्ति आमतौर पर के बारे में पता लगाने योग्य है 20 मिनट के बाद $ estradiol12के अलावा . हालांकि, auxin के साथ टैग प्रोटीन के कुशल कमी को प्राप्त करने के लिए osTIR अभिव्यक्ति की इष्टतम अवधि, जबकि auxin इसके अलावा से पहले कमी से बचने, अनुभवजन्य प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. इस पूर्व इनक्यूबेशन के लिए एक अनुमानित समय Saccharomyces जीनोम डाटाबेस (SGD https://www.yeastgenome.org/) में बहुतायत मूल्यों से अनुमान लगाया जा सकता है. जैसा कि चित्र 1में देखा जा सकता है, प्रचुर मात्रा में प्रोटीन, डीसीपी1 (2880 से 4189 अणु/कोशिका) के लिए 40 मिनट पूर्व-एस्ट्राडियोल के साथ-साथ, जिसमें कोई औक्सिन-स्वतंत्र अवक्षय नहीं देखा गया है, की आवश्यकता होती है। बहुत कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन, Prp2 (172 से 211 अणुओं / कोशिका), दृढ़ता से पूर्व इनक्यूबेशन के केवल 20 मिनट के बाद समाप्त हो रहा है. यह दो अतिरिक्त पूर्व इनक्यूबेशन समय का परीक्षण करने के लिए सलाह दी जाती है, 10 से 20 मिनट पहले या इस प्रारंभिक अनुमानित समय के बाद (20 मिनट न्यूनतम समय है कि सिफारिश की है) है। इष्टतम पूर्व इनक्यूबेशन समय वह समय है जिस पर ऑक्सिन जोड़ने से पहले लक्ष्य प्रोटीन समाप्त नहीं हुआ है और एक बार auxin जोड़ा जाता है कमी स्वीकार्य है या प्रोटीन का स्तर न्यूनतम संभव दृष्टिकोण है। तो, चित्र 1खसे, Prp22 के लिए 30 मिनट पूर्व इनक्यूबेशन के साथ, स्तरों में ऑक्सिन इसके अलावा के बाद बहुत 10 मिनट की गिरावट नहीं आई है। पूर्व इनक्यूबेशन के 40 मिनट और आईएए के साथ 15 मिनट के साथ इसकी तुलना करना, जहां थोड़ा अतिरिक्त कमी है, 10 मिनट से अधिक समय तक औक्सिन के साथ इनक्यूबेटिंग में कोई लाभ नहीं है या 30 मिनट से अधिक समय तक पूर्व-इनक्यूबेटिंग, विशेष रूप से गैर-ऑक्सिन का सबूत है 40 मिनट पर निर्भर कमी. पूर्व इनक्यूबेशन के 40 मिनट के साथ Dcp1 के लिए (अंतिम बिंदु जिस पर प्रोटीन स्तर auxin इसके अलावा से पहले लगभग 100% है), auxin के साथ कमी के 15 से 20 मिनट स्वीकार्य है. कोशिका के चयापचय पर द्वितीयक प्रभावों को कम करने के लिए कम से कम समय को कम करने की सिफारिश की जातीहै.

यह आलेख दर्शाता है कि auxin जोड़ने से पहले कमी के बिना आईएए अतिरिक्त पर तेजी से लक्ष्य प्रोटीन कमी को प्राप्त करने के लिए osTIR अभिव्यक्ति के लिए $-estradiol ऊष्मायन के समय का अनुकूलन करके जेड-एस्ट एडीआई सिस्टम का उपयोग कैसे करें।

Protocol

नोट: ग्राफ़िकल सारांश के लिए चित्र 2 देखें.

1. तनाव तैयारी

  1. एक ura3-तनावका उपयोग करना, $-est AID प्रणाली (यानी, जीन encoding $-एस्ट्राडियोल उत्तरदायी प्रतिलेखन कारक (ATF) और osTIR) और AID * लक्ष्य प्रोटीन टैग (प्रक्रिया के सारांश के लिए चित्र 3 और तालिका 1 देखें) लागू करें।
    1. रूपांतरण15 या तो p$TRK (G418 प्रतिरोध मार्कर) या p$TRL(LEU2 मार्कर) प्लाज्मिड (पूर्व आनुवंशिक संसाधन केंद्र से उपलब्ध) ura3- खमीर तनाव में या एक टेम्पलेट के रूप में प्लाज्मिड का उपयोग करने के लिए जीनोमिक के लिए पीसीआर उत्पाद का उत्पादन एकीकरण.
    2. पीसीआर एटीएफ बढ़ाना (प्लाज्मिड मानचित्र पर चिह्नित $4EVATF) और osTIR प्लाज्मिड पी जेडटीआरके या पीजेडटीआरएल में से किसी से एक उच्च निष्ठा पॉलिमरेज का उपयोग कर रहा है। जीनोमिक क्षेत्र के लिए होमोलोजी के साथ 50 से 60 आधार 3' एक्सटेंशन के साथ प्राइमर का उपयोग करें, समजात पुनर्संयोजन16द्वारा एकीकरण को निर्देशित करने के लिए। दो घटकों के जीनोमिक एकीकरण के लिए या तो अलग से या एक साथ, प्राइमर और शर्तों के लिए तालिका 1 देखें।
      नोट: तनाव p$4EV-NTR1 घटक पहले से ही जीनोम में एकीकृत है (ईस्ट जेनेटिक रिसोर्स सेंटर, जापान से उपलब्ध).
    3. सुनिश्चित करें कि लक्ष्य प्रोटीन AID * Longtine प्रक्रिया17 का उपयोग कर टैग किया गया है (चित्र 3b और तालिका 1देखें).
    4. यदि AID* टैग वृद्धि को प्रभावित करता है और चरण 1.5 पर उपयोग के लिए वृद्धि दर की भविष्यवाणी करने के लिए मौजूद बिना तनाव पर एक वृद्धि विश्लेषण प्रदर्शन.

2. कमी के लिए सामान्य प्रक्रिया

  1. गणना करें कि सभी नमूनों को एकत्र करने के लिए कितनी संस्कृति की आवश्यकता है; उदाहरण के लिए, 0.8 के OD600 में संस्कृति के 10 एमएल प्रोटीन के लिए पर्याप्त है, आरएनए और डीएनए निष्कर्षण एक ही नमूने के लिए, तो 6 नमूनों के लिए, संस्कृति के कम से कम 60 एमएल की जरूरत है.
  2. एक रात संस्कृति से, OD600 0.1 से 0.2 में पर्याप्त नई संस्कृति की स्थापना की और 30 डिग्री सेल्सियस में विकसित करने के लिए छोड़ दें। ऐसे YPDA के रूप में एक अमीर माध्यम की सिफारिश की है, हालांकि अन्य विकास की स्थिति का इस्तेमाल किया जा सकता है:
    खमीर निकालें 10 ग्राम
    पेपटोन 20 ग्राम
    ग्लूकोज 20 ग्राम
    एडेनेन सल्फेट 40 मिलीग्राम
    एच2ओ को 1 एल

    नोट: ऑटोक्लेव या फिल्टर बाँझ; फिल्टर नसबंदी नमूना संग्रह में इस्तेमाल मेथनॉल में autoclaving वेग द्वारा उत्पादित पेप्टाइड / चीनी परिसरों के रूप में पसंद किया जाता है।
  3. नमूने प्राप्त करने के लिए तैयार करें.
    1. एक ट्यूब में मेथनॉल का इरादा नमूना मात्रा का 30 से 50% रखो. उदाहरण के लिए, यदि 10 एमएल का नमूना लिया जाना है, तो 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में 5 एमएल मेथनॉल डाल दें और ट्यूब को कसकर बंद कर दें। एक बार बंद हो जाने पर, ट्यूब को लेबल करें और ठंडा करने के लिए सूखी बर्फ या -80 डिग्री सेल्सियस पर डाल दें।
      चेतावनी: एक धूआं हुड में मेथनॉल का वितरण करें।
    2. नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण के लिए 1.5 एमएल ट्यूब लेबल और ठंडा करने के लिए बर्फ में जगह है।
    3. बर्फ पर पर्याप्त एच2ओ (प्रति नमूना कम से कम 1 एमएल) ठंडा करें।
  4. संस्कृति के विकास की उम्मीद है. नमूनों को इकट्ठा करने के लिए लक्ष्य OD लगभग 0.7 से 0.8 है, लेकिन पूर्व इनक्यूबेशन चरण (ऑस्टिरट को प्रेरित करने के लिए जेड-एस्ट्राडियोल के साथ ऊष्मायन), पहले शुरू करने की आवश्यकता है ताकि संस्कृति नमूने के समय तक लगभग सही ओडी तक पहुंच सके एकत्र.
    नोट: प्रयोग में उपयोग की जाने वाली स्थितियों में वृद्धि वक्र करने की सलाह दी जाती है ताकि इस प्रारंभिक ओड का अनुमान लगाया जा सके।
  5. एक बार पूर्व इनक्यूबेशन की शुरुआत के लिए लक्ष्य OD तक पहुँच गया है, एक नमूना ले (आमतौर पर 10 एमएल), ठंड मेथनॉल युक्त पूर्व तैयार ट्यूब में. मिश्रण और सूखी बर्फ में वापस जगह करने के लिए संक्षेप में उलटा.
    नोट: नमूना के बारे में 5 मिनट के बाद पानी की बर्फ के लिए ले जाया जा सकता है, अगर ऐसा करने के लिए सुविधाजनक.
  6. तुरंत $-एस्टरेडियोल, 1 डिग्री एल/एमएल संस्कृति (10 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता); नमूना इकट्ठा करने और जेड-एस्ट्राडियोल जोड़ने के बीच लिए गए समय को कम करने के लिए उपयोग के लिए तैयार पिपेट में जेड-एस्ट्राडियोल को पहले से मापा जाता है। तेजी से तेजी से घूमता द्वारा मिश्रण.
  7. पहले के रूप में संस्कृति को विकसित करने के लिए जारी रखें (चरण 2.2), इनक्यूबेट (यह इष्टतम समय के लिए जेड-एस्ट्राडियोल के साथ "पूर्व-इनक्यूबेशन" चरण है) (अनुकूल पूर्व-इनक्यूबेशन समय के निर्धारण के लिए चित्र 1देखें)।
  8. आईएए (ऑक्सिन) जोड़ने के लिए तैयार करें। कदम 2.10 के लिए आवश्यक IAA की मात्रा ले लो (यानी, 0.5 संस्कृति के एमएल प्रति आईएए के $L). यह चरण 2.20 तेजी से बनाता है।
  9. चरण 2.5 के रूप में एक नमूना ले लीजिए।
  10. 2ण्8 में तैयार किए गए अनुसार, संस्कृति के IAA 0.5 $L/एमएल को तत्काल 750 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता में जोड़ें। तेजी से तेजी से घूमता द्वारा मिश्रण.
  11. अपने प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार, कदम 2.5 के रूप में नमूने ले लीजिए। या तो एक नमूना, एक समय में जब यह उम्मीद है कि प्रोटीन मज़बूती से समाप्त हो जाएगा, या कमी के एक समय पाठ्यक्रम में कई नमूने. उदाहरण के लिए, 5 मिनट अंतराल समय के लिए सुविधाजनक हैं और प्रोटीन के स्तर की एक श्रृंखला प्रदान करते हैं. अनुकूलन रणनीति, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है, उपयुक्त समय का संकेत देगा।
  12. नमूनों को संसाधित करें.
    1. बर्फ पर नमूने प्लेस, अगर पहले से ही नहीं किया. सुनिश्चित करें कि कोई भी नमूने जमे हुए हैं; यदि वे है, धीरे हाथ में गर्म, लगातार उलटा तो तापमान स्थानीय स्तर पर वृद्धि नहीं करता है.
      नोट: यह सबसे अच्छा हाथ में किया जाता है के रूप में नमूना तापमान का मूल्यांकन किया जा सकता है, यह हमेशा ठंड महसूस करना चाहिए. बर्फ पर रखें. यह एक ठहराव बिंदु नहीं है - एक बार सभी नमूने तरल पदार्थ हैं, अगले चरण के लिए आगे बढ़ें।
    2. एक बार सभी नमूने एकत्र किया गया है और अब जमे हुए हैं, 2 मिनट के लिए 3,500 x ग्राम पर स्पिन (4 डिग्री सेल्सियस पर यदि संभव हो तो).
    3. मेथनॉल/मध्यम मिश्रण को डालो और बर्फ पर वापस रखें; चिंता मत करो अगर नहीं सभी तरल हटा दिया गया है.
    4. बर्फ ठंड एच2ओ (चरण 2.3.3 से) में सेल गोली को पुन: निलंबित करें और बर्फ पर 1.5 एमएल ट्यूब (चरण 2.3.2 में तैयार) में स्थानांतरित करें।
    5. संक्षेप में स्पिन करें (उदा., 10 s कुल समय) पर 15,000 x g कोशिकाओं को फिर से गोली, बर्फ पर वापस जगह है और तरल को दूर करने के लिए।
    6. आकांक्षा द्वारा एच2ओ को हटा दें। कोशिका छर्रों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस, या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  13. पश्चिमी दाग विश्लेषण18द्वारा प्रोटीन को किस स्तर तक समाप्त कर दिया गया है , इसकी जाँच कीजिये .
    नोट: पर्याप्त प्रोटीन19 और / या न्यूक्लिक एसिड सबसे प्रयोजनों के लिए एक सेल गोली से निकाला जा सकता है, हालांकि दुर्लभ आरएनए प्रजातियों अधिक नमूना मात्रा की आवश्यकता हो सकती है.

Representative Results

अवक्षय के प्रतिनिधि उदाहरण चित्र 1में प्रदर्शित किए जाते हैं। इस आंकड़े में प्रस्तुत तीन प्रयोगों प्रोटीन Prp2, Prp22 और Dcp1 की कमी के लिए अनुकूलन प्रयोग थे. कम बहुतायत, spliceosomal Prp2 और Prp22 प्रोटीन दोनों कम से कम 20% के बाद समाप्त 40 मिनट पूर्व के साथ incubation के साथ $-estradiol auxin के साथ 15 मिनट के बाद. लंबे समय से पूर्व ऊष्मायन समय तेजी से कमी का कारण बनते हैं, लेकिन ऑक्सिन इसके अलावा से पहले अवांछनीय प्रोटीन की कमी भी दिखाते हैं। इसकी तुलना में, अधिक प्रचुर मात्रा में Dcp1 केवल एक ही उपचार के साथ लगभग 30% करने के लिए समाप्त हो गया था, लेकिन पूर्व इनक्यूबेशन के 60 मिनट एक ही auxin उपचार के साथ 13% तक कमी के परिणामस्वरूप, कमी की लागत पर auxin जोड़ा जाता है. यह संभव है कि 50 मिनट पूर्व-एस्ट्राडियोल के साथ और 15 मिनट auxin के साथ एक कम समय बिंदु पर इसी तरह के परिणाम हासिल किया है और इसलिए अधिक इष्टतम होता है.

Figure 1
चित्र 1: Depletion दर $-एस्ट्राडियोल पूर्व इनक्यूबेशन की अवधि को मॉडुलन द्वारा ट्यून किया जा सकता है। लक्ष्य प्रोटीन के पश्चिमी दाग18: (एक और ) Prp22-AID *-6FLAG, (c और d) Prp2-AID*-6FLAG, और (ई और f) Dcp1-AID*-6HA, संस्कृतियों से पूर्व के साथ incubated के साथ $-estradiol (जेड-est) 20, 30, 40, या 60 मिनट auxin इसके अलावा12से पहले | प्रत्येक लेन में कुल प्रोटीन की समान मात्रा भरी हुई थी। Pgk1 एक दृश्य लोड िंग कंट्रोल के रूप में पाया जाता है, पैनल के अलावा, जहां Pgk1 और Dcp1 सह प्रवास. पैनल ों मेंप्रोटीन बैंडों का परिमाणन क्रमशः पैनल ख, घ, तथा में दर्शाया गया है। अवक्षय दर के माप के रूप में, प्रत्येक वक्र के रैखिक खंड (से 100% से 30% तक) के लिए ढलान (म) की गणना की गई थी। इष्टतम पूर्व इनक्यूबेशन समय वह समय है जिस पर प्रोटीन का स्तर अभी भी संयुक्त राष्ट्र-प्रेरित स्तर के करीब है (100%) और कमी के बाद की दर तेजी से है. Dcp1 (च) के लिए , पूर्व इनक्यूबेशन के 60 मिनट बहुत लंबा है, के रूप में प्रोटीन auxin के अभाव में नीचा शुरू कर दिया है, जबकि 20 मिनट बहुत कम है, के रूप में प्रोटीन appreciably इस समय पाठ्यक्रम में कमी नहीं है. 40 मिनट पूर्व इनक्यूबेशन के बाद, ऑक्सिन के साथ 15 मिनट का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि प्रोटीन लगभग 70% समाप्त हो जाता है और, हालांकि 20 मिनट आगे कमी में परिणाम होगा, यह भी माध्यमिक प्रभाव में परिणाम सकता है। त्रुटि पट्टियाँ दो जैविक प्रतिकृतियां के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्रत्येक प्रयोग के लिए, एक प्रतिनिधि धब्बा दिखाया गया है. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन9से लिया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ग्राफ़िकल सारांश. पूर्व इनक्यूबेशन शुरू करने के लिए समृद्ध माध्यम में और आवश्यक तापमान पर बढ़ रही पर्याप्त संस्कृति के लिए जेड-एस्ट्राडियोल जोड़ें। कमी शुरू करने के लिए आईएए (auxin) जोड़ने से पहले आवश्यक पूर्व इनक्यूबेशन समय के लिए विकास जारी रखें। पूर्व इनक्यूबेशन और कमी समय समाप्त होने वाले प्रोटीन पर निर्भर करता है, लेकिन पूर्व इनक्यूबेशन अक्सर 20-60 मिनट की सीमा में होता है और कमी का समय आमतौर पर 10 से 20 मिनट के क्रम में होता है। 10 एमएल नमूने पूर्व-इनक्यूबेशन और ड्यूरिन के प्रारंभ और अंत में लिए जाने चाहिए। छ कमी. इन नमूनों को तेजी से छर्रों और भंडारण से पहले ठंड मेथनॉल में तय कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: B-est प्रणाली के लिए तनाव पीढ़ी. (क) ए आईडी * प्रणाली के साथ खमीर तनाव उत्पन्न करने के लिए, या तो p$TRL (LEU2) या p$TRK (Kanamycin (G418) प्रतिरोध), प्लाज्मिड को तनाव में शामिल किया जाना चाहिए या, वैकल्पिक रूप से, एटीएफ और ऑस्टर को जीनोम में डाला जा सकता है 3'end प्राइमर से PCR द्वारा उत्पन्न एक टुकड़े का समजात पुनर्संयोजन (चित्र 3ख और तालिका 1देखें)। (ख) लक्ष्य प्रोटीन की सी-टर्मिनल टैगिंग पीसीआर प्रवर्धन द्वारा प्लाज्मिड पोरा3-एआईडी *-6FLAG (pURA3$AID*-6HA केवल टैग में भिन्न है और ठीक उसी तरह से इलाज किया जा सकता है), Longtine प्राइमर्स S3-F का उपयोग करके और लक्ष्य प्रोटीन के 3' अंत करने के लिए 3' एक्सटेंशन homologous के साथ S2-R. आगे प्राइमर विस्तार AID * टैग की शुरुआत के साथ फ्रेम में पिछले एमिनो एसिड codon शामिल करना चाहिए और बंद codon शामिल नहीं होना चाहिए. रिवर्स प्राइमर विस्तार कोडिंग क्षेत्र के डाउनस्ट्रीम क्षेत्र के लिए होना चाहिए। एक बार जीनोम में डाला, कोशिकाओं है कि URA3 मार्कर खो दिया है (मार्कर के दोनों सिरों पर पाया समान क्षेत्रों के बीच समजात पुनर्संयोजन द्वारा) 5-FOA के साथ विकास द्वारा चुना जा सकता है, कि काउंटर का चयन URA3 कोशिकाओं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

क. प्राइमर अनुक्रम
लक्ष्य स्थान प्राइमर नाम अनुक्रम टीएम (जेडसी)
पीजेडटीआरएल 516 एफ पीजेडटीआरएलजेडएफ --समविज्ञान का क्षेत्र--जीसीजीएजीएजीसीएसीटीसीजी 61.23
7897 आर पीजेडआरजेडआर सीजीसीसीसीसीटीसीटीसीटीजीसीएऔरएजेडए और एल टी; -क्षेत्र-लक्ष्य (आरसी)-gt; 61.30
पीजेडटीआरके 9154 एफ p[TRK]F -ल.; समविज्ञान क्षेत्र-एसीजीटीजीसीसीटीजीटीकैटटीजीसीटीसीसी 59.40
5897 आर पीजेडआरजेडआर सीजीसीसीसीसीटीसीटीसीटीजीसीएऔरएजेडए और एल टी; -क्षेत्र-लक्ष्य (आरसी)-gt; 61.30
pURA3-AID*-6FLAG या pURA3$AID*-6HA एफ एस 3-एफ --समविज्ञान का क्षेत्र--CGTACGCTGCAGGCGAC 59.21
आर S2-R ATCGATGAATTCGAGCTCG और lt;-क्षेत्र के homology (आरसी)-gt; 52.76
p]RTL/K को $-est AID सिस्टम को बढ़ाना है
PURA3-AID*-6FLAG/6HA लक्ष्य प्रोटीन टैग करने के लिए AID * और epitope टैग बढ़ाना करने के लिए (Lontine प्रक्रिया)
--समविज्ञान का क्षेत्र क्षेत्र जो कि क्षेत्र में सम्मिलित है, जहाँ सिस्टम डाला जाना है. अब इस क्षेत्र में और अधिक संभावना संशोधन सफल होने के लिए है; 50 - 100 ठिकानों की सिफारिश की है.
---भूविज्ञान का क्षेत्र (आरसी)-gt; क्षेत्र जो कि क्षेत्र में सम्मिलित है, जहाँ प्रणाली को सम्मिलित किया जाना है, रिवर्स पूरक का उपयोग करना याद रखें। जैसा कि ऊपर, अब इस क्षेत्र में बेहतर है.
टीएम (जेडसी) 50 m NaCl के साथ %GC विधि का उपयोग कर Tm
ख. पीसीआर मिक्स
घटक वॉल्यूम ($L)
टेम्पलेट (lt;10
एनईबी फशन एचएफ बफर (5x)* 100
फॉरवर्ड प्राइमर 100 $M 2.5
रिवर्स प्राइमर 100 डिग्री एम 2.5
dNTPs 10 एम एम प्रत्येक 10
एच2हे 500 करने के लिए
* एनईबी फसवण जीसी बफर (5x) भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन पसंद नहीं है
इस मिश्रण बनाओ, 50 डिग्री एल प्रत्येक मिश्रण के 10 ट्यूबों में विभाजित है और तालिका 1 ग के रूप में पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
पीसीआर की जाँच करें एक agarose जेल पर चलने के द्वारा काम किया है
एक ट्यूब और इथेनॉल वेग में सभी सफल प्रतिक्रियाओं का मिश्रण
पीसीआर द्वारा उत्पादित सभी सामग्री के साथ खमीर रूपांतरण
c. पीसीआर शर्तें
चरण अस्थायी (जेडसी) समय
प्रारंभिक विकृतीकरण 98 30 एस
25-35 साइकिल प्रकृति का वर्णन 98 10 एस
अनील 45-60 20 एस
एक्सटेंशन 72 30 s/kb
अंतिम एक्सटेंशन 72 10 मिनट
पकड़ 8
Lontine प्राइमर सेट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर Anneal (S3-F और S2-R) और p$TRL के लिए 60 डिग्री सेल्सियस /
Lontine PCR के लिए 3 मिनट के लिए और 3 मिनट के लिए विस्तृत p$TRL /

तालिका 1: प्राइमर दृश्यों, पीसीआर मिश्रण और पीसीआर शर्तों।

Discussion

एक अच्छी तरह से अनुकूलित प्रोटोकॉल लक्ष्य प्रोटीन के तेजी से और कुशल कमी का उत्पादन कर सकते हैं. इस कमी की पुन: उत्पादन क्षमता बढ़ जाती है के रूप में, के साथ अनुमानित पूर्व इनक्यूबेशन समय का निर्धारण महत्वपूर्ण है, लेकिन पूर्व इनक्यूबेशन समय में छोटे बदलाव सहन किया जा सकता है। दूसरी ओर, ध्यान auxin इसके अलावा के बाद समय के साथ लिया जाना चाहिए, के रूप में प्रोटीन का स्तर बहुत तेजी से गिरावट आती है.

इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि tuned कमी पूर्व-एस्ट्राडियोल और आईएए ऊष्मायन समय के साथ पूर्व इनक्यूबेशन समय के संयोजन के अलग-अलग संयोजन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि वांछित हो, तो पूर्व ऊष्मायन समय को कम करके लक्ष्य प्रोटीन धीरे-धीरे समाप्त हो सकता है।

जेड-एआईडी प्रणाली उन प्रणालियों पर कुछ लाभ प्रदान करती है जहां OsTIR को गठनके साथ व्यक्त किया जाता है। उदाहरण के लिए, यदि लक्ष्य प्रोटीन व्यवहार्यता के लिए आवश्यक है, osTIR के विनियमित अभिव्यक्ति लक्ष्य प्रोटीन के समय से पहले कमी से बचने कर सकते हैं. इसके अलावा, osTIR की अभिव्यक्ति लक्ष्य प्रोटीन की बहुतायत और गिरावट के लिए इसकी संवेदनशीलता के अनुरूप देखते जा सकते हैं, और कमी या तो तेजी से या धीमी हो सकती है। दो छोटे अणु प्रभावक, जेड-एस्ट्राडियोल और ऑक्सिन, यहाँ इस्तेमाल की जाने वाली परिस्थितियों के तहत खमीर चयापचय को परेशान न करें, rapamycin के विपरीत, लंगर-अवे सिस्टम1में उपयोग किया जाता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ प्रोटीन टैगिंग उनके कार्य को बाधित करती है, जो किसी भी लक्षित कमी प्रणाली के साथ एक समस्या है। जब कोई C-टर्मिनल टैग नहीं करता है, तो इस स्थिति में, N-टर्मिनल टैग काम कर सकते हैं। इसके अलावा, नहीं सभी प्रोटीन कुशलता से समाप्त हो जाएगा; उदाहरण के लिए, लक्ष्य प्रोटीन पर AID-टैग osTIR प्रोटीन के लिए दुर्गम हो सकता है. इसलिए, AID-टैगिंग के बाद, प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन विकास पर टैग के किसी भी प्रभाव के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, और निर्धारित करने के लिए कि क्या कमी प्रभावी है, इससे पहले कि जेड-एस्ट्राडियोल पूर्व इनक्यूबेशन और auxin उपचार के समय अनुकूलित कर रहे हैं.

यह AID * प्रणाली बहुत सरल है और किसी भी बाद प्रयोगात्मक प्रक्रिया है कि आगे की वृद्धि शामिल नहीं है के साथ संगत है, जैसे प्रोटीन, डीएनए या आरएनए विश्लेषण या माइक्रोस्कोपी. इसके अतिरिक्त, नवजात आरएनए20को शुद्ध करने के लिए थायोलेबलिंग के साथ संयोजित होने पर यह प्रणाली अच्छी तरह से कार्य करती है।

इस प्रणाली अन्यथा खमीर सेल के चयापचय को प्रभावित किए बिना एक प्रोटीन को कम करने का एक तेजी से, विशिष्ट, और reproduible साधन प्रदान करता है.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस कार्यक्रम की शुरुआत के लिए जेन रीड के लिए धन्यवाद, विकास के लिए बारबरा Terlouw, "उरा looper" निर्माण और कई उपयोगी विचार विमर्श के लिए सुज़ाना डे लुकास के लिए Vahid Aslanzadeh. इस काम को Consezo Nacional de Ciencia y Tecnologa, मेक्सिको (CONACYT) और एडिनबर्ग स्कूल ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज, IEM के लिए एक Wellcome पीएचडी छात्रवृत्ति से GIMO के लिए एक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था [105256] और Wellcome धन द्वारा [104648] JD Beggs के लिए . सेल जीव विज्ञान के लिए वेलकम सेंटर में काम वेलकम कोर फंडिंग [092076] द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine sulphate Formedium DOC0230
Agar Formedium AGA03
Β-estradiol Sigma Aldrich E2758-1G 10 mM solution in ethanol. Store at -20 °C
DMSO Alfa Aesar 42780 DMSO should be solid at 4 °C
Glucose Fisher Scientific G/0500/60
IAA 1H-Indole-3-acetic acid Across Orgainics 122150100 Auxin analogue. 1.5 M in DMSO. The solution will be a russet colour and darken as time goes on; a deep red solution should be discarded and a new one made. Store at -20 °C.
Methanol Fisher Scientific M/4000/PC17 CAUTION Toxic and flammable
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530
Peptone Formedium PEP03
SCSM single drop-out –ura Formedium DSCS101
Yeast Extract Formedium YEA03
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate Formedium CYN0410

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References

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