Ensayo de formación de presinapse utilizando cuentas organizadoras de presinapsiona y cultura de "Bola de neurona"

Neuroscience

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Summary

La formación de presinapsis es un proceso dinámico que incluye la acumulación de proteínas sinápticas en el orden correcto. En este método, la formación de presináptica se desencadena por perlas conjugadas con una proteína organizadora de la presinapsis en láminas axonales del cultivo de "bola de neurona", por lo que la acumulación de proteínas sinápticas es fácil de analizar durante la formación de la presinapsis.

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Parvin, S., Takeda, R., Sasaki, Y. Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and “Neuron Ball” Culture. J. Vis. Exp. (150), e59893, doi:10.3791/59893 (2019).

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Abstract

Durante el desarrollo neuronal, la formación de sinapsis es un paso importante para establecer circuitos neuronales. Para formar sinapsis, las proteínas sinápticas deben suministrarse en el orden adecuado mediante el transporte desde cuerpos celulares y/o la traducción local en sinapsis inmaduras. Sin embargo, no se entiende completamente cómo las proteínas sinápticas se acumulan en las sinapsis en el orden correcto. Aquí, presentamos un método novedoso para analizar la formación presináptica mediante el uso de la combinación de cultivo de bolas de neuronas con cuentas para inducir la formación de presinapsis. Las bolas neuronales que son agregados de células neuronales proporcionan hojas axonales lejos de los cuerpos celulares y dendritas, de modo que las señales fluorescentes débiles de las presinapciones pueden detectarse evitando señales abrumadoras de cuerpos celulares. Como perlas para desencadenar la formación de presinapsis, utilizamos cuentas conjugadas con la repetición de leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2), un organizador presináptico excitatorio. Usando este método, demostramos que el transportador de glutamato vesicular 1 (vGlut1), una proteína de vesícula sináptica, acumulada en presinapciones más rápido que Munc18-1, una proteína de zona activa. Munc18-1 acumuló la traducción dependiente en la presinapsis incluso después de eliminar los cuerpos celulares. Este hallazgo indica la acumulación munc18-1 por traducción local en axónes, no el transporte desde cuerpos celulares. En conclusión, este método es adecuado para analizar la acumulación de proteínas sinápticas en presinapis y fuente de proteínas sinápticas. Como el cultivo de bolas de neuronas es simple y no es necesario utilizar aparatos especiales, este método podría ser aplicable a otras plataformas experimentales.

Introduction

La formación de sinapsis es uno de los pasos críticos durante el desarrollo de los circuitos neuronales1,2,3. La formación de sinapsis especializadas compuestas por pre y post-sinapsis es un proceso complejo y multipaso que implica el reconocimiento adecuado de los axónes y dendritas, la formación de la zona activa y la densidad postsináptica, y la alineación adecuada de canales ióniónicos y receptores de neurotransmisores1,2. En cada proceso, muchos tipos de proteínas sinápticas se acumulan en estos compartimentos especializados en el momento adecuado mediante el transporte de proteínas sinápticas de los cuerpos celulares y / o por traducción local en los compartimentos. Estas proteínas sinápticas se consideran dispuestas de manera organizada para formar sinapsis funcionales. La disfunción de algunas proteínas sinápticas que implican la formación de sinapsis da como resultado enfermedades neurológicas4,5. Sin embargo, sigue sin estar claro cómo se acumulan las proteínas sinápticas en el momento adecuado.

Para investigar cómo se acumulan las proteínas sinápticas de forma organizada, es necesario examinar la acumulación de proteínas sinápticas en orden cronológico. Algunos informes demostraron imágenes en vivo para observar la formación de sinapsis en el cultivo disociado de las neuronas6,7. Sin embargo, es lento encontrar neuronas que simplemente comienzan la formación de sinapsis bajo microscopía. Para observar la acumulación de proteínas sinápticas eficientemente, la formación de sinapsis debe comenzar en el momento en que los investigadores quieren inducir la formación. El segundo desafío es distinguir la acumulación de proteínas sinápticas debido al transporte de los cuerpos celulares o la traducción local en sinapsis. Para ello, es necesario medir el nivel de traducción bajo la condición que no permite el transporte de proteínas sinápticas de los cuerpos celulares.

Desarrollamos un nuevo ensayo de formación de presinapsis utilizando la combinación de cultivo de bolas de neuronas con cuentas para inducir la formación de presinapsis8. El cultivo de la bola de neuronas se desarrolla para examinar el fenotipoaxonal, debido a la formación de láminas axonales que rodean los cuerpos celulares 9,10. Utilizamos cuentas magnéticas conjugadas con la reacción transmembrana neuronal 2 (LRRTM2) rica en leucina que es un organizador presináptico para inducir presinapciones excitatorias (Figura1A)11,12,13. Mediante el uso de las perlas LRRTM2, la formación de presinapsivas comienza en el momento en que se aplican las perlas. Esto significa que la formación de presinapsis comienza en miles de axónes de una bola de neurona al mismo tiempo, por lo que permite examinar el curso preciso del tiempo de acumulación de proteínas sinápticas de manera eficiente. Además, el cultivo de bolas de neuronas es fácil de bloquear las proteínas sinápticas de transporte del soma mediante la eliminación de cuerpos celulares (Figura 1B)8. Ya hemos confirmado que los axons sin cuerpos celulares pueden sobrevivir y están sanos al menos 4 h después de la eliminación de los cuerpos celulares. Por lo tanto, este protocolo es adecuado para investigar de dónde se derivan las proteínas sinápticas (cuerpo celular o axón), y cómo se acumulan las proteínas sinápticas de manera organizada.

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Protocol

Los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con las directrices descritas en el Comité Institucional de Cuidado y Uso De Animales de la Universidad de la Ciudad de Yokohama.

1. Preparación de bolas de neuronas como cultivo de gota colgante (Días in vitro (DIV) 0-3)

NOTA: Los procedimientos descritos aquí para la preparación del cultivo de bolas de neuronas se basan en el método previamente reportado por el grupo Sasaki con algunas modificaciones9,10. También adoptamos varios procedimientos del método banquero para la cultura disociada14.

  1. Confirmación de lo siguiente antes de iniciar la disección
    1. Preparar todas las soluciones necesarias y esterilizarlas por autoclave/filtración de antemano.
    2. Mantener listo todos los instrumentos y materiales para ser utilizado en cada paso de este cultivo de neurona cortical.
    3. Rocíe y limpie el gabinete de flujo de aire laminar, la mesa de disección, la placa de escenario del estereomicroscopio, las tijeras y los fórceps con 70% de etanol.
  2. Euthanizar el ratón tras la aplicación de CO2 y diseccionar el abdomen para obtener embriones E16.
  3. Retire los cerebros de los embriones cuidadosamente con la ayuda de puntas finas de fórceps y transfieralos a platos de cultivo celular de 60 mm que contengan 4 ml de solución de sal tamponada HEPES (HBSS).
    NOTA: El medio de disección HBSS contiene 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.09 mM Na2HPO4, 1.1 mM KH2PO4, 5.6 mM D-glucosa, y 5.64 mFenol rojo.
  4. Retire el cuero cabelludo, corte la bombilla olfativa, separe los cortices de cada hemisferio cerebral usando las puntas finas de fórceps bajo estereomicroscopio, y transfiera a otros platos de 60 mm que contengan HBSS fresco. Utilice al menos 3-5 embriones para cada cultivo de bola de neurona separada.
  5. Cortar los cortices en trozos pequeños con tijeras de resorte microdisselantes en una capucha de cultivo de celda de flujo laminar.
  6. Transfiera los cortices picados a un tubo de 15 ml y intente trippsinizar los cortices picados en 4 ml de trippsina al 0,125% en HBSS durante 4,5 min en un baño de agua a 37 oC.
    NOTA: Este tiempo de trippsinización es crítico para el cultivo eficiente de neuronas ya que el tiempo creciente (> 4.5 min) conduce a neuronas mucho más muertas.
  7. Transfiera los agregados de celda a un nuevo tubo de 15 ml que contenga 10 ml de HBSS mediante una pipeta de transferencia estéril e incubar a 37 oC durante 5 min. Repita este paso una vez más.
  8. Transfiera los agregados celulares a un nuevo tubo de 15 ml que contenga 2 ml de medios neurobasales que contengan GlutaMax, suplemento B27 (medio NGB), 0,01% DNase I y 10% de suero de caballo.
  9. Tritura rcíticos trippsinizados pipetándolos repetidamente hacia arriba y hacia abajo (3-5 veces) usando pipeta Pasteur de vidrio fino pulida al fuego.
    NOTA: El diámetro de la pipeta Pasteur de vidrio fino pulido al fuego es muy importante como se describe en el documento del método banquero14. Si la pipeta es demasiado estrecha para pasar cortices, prepare pipetas que posean 2-3 tamaños diferentes e intente con pipetas más grandes.
  10. Para preparar las bolas de neuronas, tome la suspensión celular anterior y ajuste la densidad celular a 1 x 106 células/ml usando un medio NGB.
  11. Cultivo de las neuronas corticales como gotas colgantes que contienen 10.000 células / gota (1 gota es 10 l) dentro de los párpados superiores de los platos de cultivo de 10 cm.
  12. Añadir 7 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) a la parte inferior de los platos de cultivo, luego mantener en una incubadora durante 3 días a 37 oC con 5% co2 en condiciones humidificadas para permitir la formación de bolas de neuronas.

2. Colocación de bolas de neuronas en cubiertas de vidrio recubiertas de PLL y mantenimiento de cultivo (DIV 3-11)

NOTA: Antes de la recubrimiento de los revestimientos de vidrio con poli-L-lisina (PLL), es importante lavar los cubresítos con detergente. Los cubreobjetos de vidrio a veces no son tan limpios para el cultivo neuronal y un recubrimiento uniforme con PLL. Recubrimiento PLL no uniforme puede resultar en una extensión axonal desigual de las bolas de neuronas.

  1. Remoje los cubreobjetos en 1/20 detergente neutro no fosforo diluido en estantes cerámicos durante 1-3 noches.
  2. Lavar los labios de las cubiertas 8 veces en agua ultrapura, y luego esterilizar en un horno a 200 oC durante 12 h.
    NOTA: Todos los pasos desde aquí deben realizarse en una campana de cultivo de celda de flujo de aire laminar.
  3. Transfiera los cubreobjetos horneados a platos de 100 mm. Después de sellar el plato por parafilm entre una tapa y un plato inferior, los cubreobjetos horneados se pueden mantener para su almacenamiento a largo plazo.
  4. (Opcional) Aplicar puntos de parafina en las cubiertas. Los puntos hacen espacio para evitar que las bolas de neuronas se desprenden de las cubiertas durante la inmunomancha ción mediante el contacto directo de las bolas de neuronas a los platos de plástico. Derretir la parafina en una botella adecuada en un baño de agua caliente a unos 90 oC. Sumerja una pipeta Pasteur en la parafina, luego tóquela rápidamente para hacer tres puntos cerca del borde de una cubierta.
  5. Recubrir PLL (MW > 300.000) sobre las cubiertas de vidrio con cuentas de parafina en platos de 60 mm utilizando la solución PLL (15 g/ml en tampón de borato) y guardarlos durante al menos 1 h en una incubadora de CO 2.
  6. Después de lavar 4 veces con PBS, transfiera los cubrejos recubiertos de PLL a una placa de 4 pocillos que contenga 350 ol de medio NGB en cada pocil y la citosina-D-arabinofuranoside clorhidrato (AraC, 3 m) a los medios para matar las células divisorias.
  7. Conservar esta placa de 4 pocillos que contiene los cubreobjetos recubiertos con PLL en la incubadora de CO2 al menos durante 20 minutos para garantizar la temperatura del medio de alcanzar los 37 oC antes de transferir las bolas de neuronas.
  8. En DIV 3 cuando las "bolas de neuronas" se forman muy bien, transferirlas a los cubredes recubiertos con PLL dentro de la placa de 4 pocillos (5 bolas de neuronas / bien) mantenido en la incubadora de CO 2.
  9. Después de 48 h, reemplace el medio de cultivo de la bola de neurona con un medio NGB fresco libre de AraC. Utilice una placa caliente en una campana de cultivo de células de flujo de aire laminar cuya temperatura se mantenga lista a 37 oC inmediatamente antes de este procedimiento.
    NOTA: Es necesario realizar el cambio medio lo más rápido posible en una placa caliente para reducir el tiempo que los cultivos están en el exterior de la incubadora de CO 2.
  10. Mantenga este cultivo de bolas de neuronas en la incubadora de CO2 para hasta DIV 11.
    NOTA: En DIV 11-12, las bolas de neuronas que extienden neurites de hasta 1-2 mm se utilizan para experimentos.

3. Aplicación de perlas LRRTM2 en el cultivo de bolas de neuronas con o sin cuerpos celulares (DIV 11-12)

NOTA: Antes de la aplicación de perlas LRRTM2 en el cultivo de bolas de neuronas, se recomienda eliminar los cuerpos celulares. Por lo tanto, prepare las perlas LRRTM2 al principio, luego retire los cuerpos celulares y luego aplique cuentas LRRTM2 al cultivo tan pronto como sea posible. Biotinylated LRRTM2 es proporcionado por el grupo de Nogi (Universidad de la Ciudad de Yokohama) como medio acondicionado. Utilizan un vector de expresión que incluye la secuencia del aceptador de biotina y la ligasa de biotina de E. coli (BirA) 15 , 16 para unir biotina a LRRTM2, y el vector de expresión se transinfecta a las células Expi293F incluidas en el Sistema de Expresión Expi293. La información vectorial está disponible en la Figura Suplementaria 1. Las perlas de estriptavidina biodilatadas lRRTM2 reducen en gran medida el fondo de inmunomancha en comparación con las perlas de proteína A conjugadas lRRTM2-Fc que se utilizan para el prototipo del sistema LRRTM28.

  1. Preparación de perlas biotiniadas LRRTM2
    1. Para eliminar el exceso de biotina del medio acondicionado de las células Expi293F que expresan LRRTM2 biotiniladas, aplique 1,7 ml del medio acondicionado mezclado con 0,8 ml de PBS (total 2,5 ml) a la columna de filtración de gel PD-10. La columna PD-10 está preequilibrada con 25 ml de agua ultrapura y 25 ml de PBS.
    2. Eluir con 3,5 mL de PBS y recoger el flujo a través como un stock LRRTM2.
      NOTA: Esta acción LRRTM2 se puede dispensar en alícuotas y almacenarse a -80 oC a largo plazo. Los niveles de expresión de LRRTM2 biotinilado a veces varían de un lote a uno. Por lo tanto, el volumen adecuado de lRRTM2 stock para conjugar con las cuentas debe determinarse para formar presinapciones suficientes en bolas de neuronas, cuando se utiliza un nuevo lote de lRRTM2 stock en la primera vez.
    3. Tomar 20 l desde la suspensión de partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina (diámetro: 4-5 m) a un tubo de microcentrífuga. Inmovilizar las perlas a un aparato hecho a mano unido con imanes permanentes de neodimio y lavar tres veces con 100 s de PBS-MCBC en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: PBS-MCBC contiene PBS incluyendo 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 0.1% BSA, y 0.1% libre de EDTA completo.
    4. Después de retirar completamente PBS-MCBC de las perlas, agregue el volumen predeterminado de lRRTM2 (normalmente 500-1.000 l, véase la Nota 3.1.2) a las cuentas lavadas. Incubar la mezcla utilizando un rotador a 4oC durante 1-2 h.
    5. Lave las perlas dos veces con 100 ml de PBS-MCBC, y más tarde con 100 oL de medio NGB.
    6. Resuspenda las perlas LRRTM2 en un medio de 50 oL para su aplicación en el cultivo de la bola de neuronas.
    7. Utilice los mismos procedimientos para preparar las perlas de control (control negativo) en otro tubo de microcentrífuga, excepto añadir proteínas biotinicadas-LRRTM2.
  2. Extracción de cuerpos celulares de las bolas de neuronas en DIV 11-12 y aplicación de cuentas LRRTM2
    1. Etiquetar los pocillos de una placa de 4 pocillos como "Cuerpo celular (+)" y "Cuerpo celular (-)".
    2. Corte el extremo de una punta amarilla en ángulo de 45o con una cuchilla de afeitar previamente rociada con 70% de etanol bajo estereomicroscopio (Figura1B).
    3. Coloque el extremo amarillo de la punta en el área del cuerpo celular de una bola de neurona y retire los cuerpos celulares por succión (Figura 1B).
    4. Para identificar cada condición especificada del experimento, etiquete los pozos de nuevo como "Perlas LRRTM2" y "Controlar perlas".
    5. Aplique el LRRTM2 y controle las perlas en el cultivo de la bola de neurona, y sumerja en la parte inferior de las placas durante 1 min usando imanes de ferrita para iniciar la formación de presinaptusis. Este procedimiento garantiza el touchdown de todas las cuentas al mismo tiempo. Especialmente, sería eficaz para la incubación de poco tiempo (por ejemplo, 30 min y 1 h) con perlas LRRTM2 sincrónicamente.
    6. Para realizar experimentos de curso de tiempo, etiquete cada uno de los valores separados de 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h y 18 h y aplique perlas LRRTM2 en los intervalos de tiempo indicados.
    7. Después de la adición de perlas LRRTM2, incubar el cultivo de la bola de neuronacon las cuentas durante un tiempo especificado (0 min a 18 h) para formar presinapciones.

4. Inmunomanchay y microscopía

NOTA: Fijar las células durante 4 h a través de la incubación con perlas LRRTM2 en las condiciones experimentales con y sin cuerpos celulares, ya que los axones tienden a morir gradualmente en ausencia de cuerpos celulares después de 4 h. En caso de curso de tiempo con perlas LRRTM2, fije las celdas en el tiempo especificado indicado.

  1. Fijación y tinción de neuronas en el cultivo de bolas de neuronas después de la formación de presinapsivas con perlas LRRTM2
    1. Retire el medio NGB y fije las bolas de neuronas con 4% de PFA en PBS (250 l/bien) durante 20 minutos a temperatura ambiente, y luego lave con 500 ol de PBS 4 veces cada 5 min.
    2. Lave las células fijas con TBS (salina tris tamponada: 50 mM Tris-HCl (pH 7.3) y 150 mM NaCl) durante más de 5 min.
    3. Permeabilizar las células / axónes del cultivo de bolas de neuronas con TBS que contiene 0.3% Triton X-100 durante 5 min.
    4. Conservar las células 1 h para bloquearlas con tampón de bloqueo (0,1% Triton X-100 y 5% NGS (suero normal de cabra) en TBS).
    5. Incubar las células con anticuerpos primarios; anticonejo-vGlut1 (transportador de glutamato vesicular 1 (1:4000)) y antiratón-Munc18-1 (1:300) diluido con diluyente de anticuerpos durante la noche a 4oC.
    6. Lavar los cubreobjetos 4 veces con tampón de inmunofluorescencia (IF) (0,1% Triton X-100 y 2% BSA en TBS) e incubar durante 30 minutos con fluoroforo (Alexa dye)-conjugado2 anticuerpos; anti-ratón-IgG-Alexa 555 (1:500), anti-conejo-IgG-Alexa 488 (1:1000).
    7. Manchar los núcleos de los cuerpos celulares de las neuronas durante 5 min con 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1 g/ml) en PBS.
    8. Lave los cubreobjetos tres veces con PBS y luego monte en diapositivas de vidrio utilizando medios de montaje que contengan 167 mg/ml de poli (vinilo) de alcohol y 6 mg/ml de n-propilo de gallato.
    9. Almacene los portaobjetos de vidrio en un refrigerador a -20 oC hasta que se microscopa. Las señales fluorescentes de las diapositivas de vidrio son detectables durante al menos 1 año cuando las diapositivas se almacenan a -20 oC.
  2. Toma de imágenes bajo microscopio de fluorescencia
    1. Capture el contraste de interferencia diferencial y las imágenes IF bajo un microscopio fluorescente invertido con una cámara CCD enfriada utilizando una lente de inmersión en aceite 60X. Para el software de adquisición de imágenes, utilice un sistema de microscopio instalado por software. Utilice la imagen J como software de análisis de imágenes.
    2. Mida la intensidad IF en presinapciones en axón usando la siguiente fórmula; IF intensidades de la Región de Interés en perlas (ROI) – Apagado de la intensidad de la región de perlas/Intensidad axonal a lo largo de 20 m de perlas – intensidad de fondo. Esta intensidad de la relación proporciona un índice de acumulación de proteínas (Figura4A). Realice las mediciones de las imágenes originales de 16 bits utilizando el software Image J.
    3. Para cuantificar el nivel de acumulación de proteína particular en presináptesis inducida con perlas LRRTM2, seleccione siempre el área lejos de 2 campos de visión o más aparte del cuerpo celular con microscopio (60X).
      NOTA: La selección del área en la bola de neuronas para la toma de imágenes es crucial, ya que los axons densos están cerca del cuerpo celular y la periferia de la bola de neurona puede proporcionar un solo axón.
    4. Para una medición precisa, elija un campo axonal de 5 diferentes (distancia similar a los cuerpos de celda)/coverslip.
    5. Mantenga condiciones de imagen idénticas en diferentes días y entre experimentos

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Representative Results

Aquí, mostramos resultados representativos de acumulación de proteínas presinápticas en presinapciones inducidas por LRRTM2 de hojas axonales del cultivo de bolas de neuronas. Como proteínas presinápticas, analizamos la proteína de vesícula sináptica excitatoria vGlut1 y la proteína de zona activa Munc18-1. También examinamos el curso de tiempo de acumulación de vGlut1 y Munc18-1 en presinapciones, y obtuvimos resultados que indican la fuente de Munc18-1 en presinapciones utilizando axones eliminando cuerpos celulares y un inhibidor de la síntesis de proteínas. Recientemente, hemos investigado un papel de la proteína de retardo mental X frágil (FMRP) en la acumulación de Munc18-1 en presinapciones8. FMRP, que es un producto genético causal del síndrome de X frágil (FXS), es una proteína de unión de ARNm para suprimir la traducción17,18,19. También examinamos la participación de FMRP en la acumulación Munc18-1 utilizando ratones modelo FXS que es deficiente en la codificación de genes Fmr1 FMRP.

Aplicación de LRRTM2-perlas en el cultivo de bolas de neuronas en DIV11 acumulación inducida de Munc18-1 en presinapciones de axones de bolas de neuronas (Figura 2A). Incluso en los axónicos que se eliminan cuerpos celulares, se observó acumulación de Munc18-1 bajo las cuentas similares como axones de bolas de neuronas con cuerpos celulares (Figura2B). En el caso típico, más del 80% de las perlas después de 4 h de incubación con bolas de neuronas pueden inducir la acumulación de proteínas sinápticas en presinapsis, juzgadas mediante la tinción Munc18-1 y vGlut-1. Debido a que los axons están tan llenos y se superponen cerca de cuerpos celulares (Figura2Aa,Ba), se midió más la región periférica de las láminas axonales donde los axones no están tan superpuestos (Figura2Ab, Bb, por ejemplo, área periférica lejos de 2 campos vista o más aparte del cuerpo celular con microscopio (60X)). Cuando la región periférica de la hoja axonal fue analizada por lente objetivo de alta aumento (60X), vGlut1 y Munc18-1 se acumularon claramente en presinapciones de axones bajo las cuentas (Figura 3). A veces, las señales fluorescentes de proteínas vesiculares sinápticas como vGlut1 son difíciles de detectar en la región axonal fuera de las cuentas, porque estas proteínas vesiculares sinápticas se acumulan mucho debajo de las cuentas. En el caso de Munc18-1, las señales fluorescentes se pueden detectar débilmente en la región axonal fuera de las cuentas.

Para cuantificar el nivel de acumulación de proteínas sinápticas en presinapciones inducidas por las perlas LRRTM2, se midieron las intensidades fluorescentes de los axones bajo las cuentas y fuera de las cuentas, y luego se calcularon como "índice de acumulación de proteínas" (Figura4A,y descrito en la sección de protocolo en detalle). Los experimentos del curso de tiempo demostraron que la acumulación de vGlut1 en presinapciones aumentó significativamente a 30 min (Figura4B). Por otro lado, la acumulación de Munc18-1 comenzó a aumentar significativamente a 2 h, y alcanzar una meseta a 4 h (Figura4C). Estos datos indican que la proteína de vesícula sináptica vGlut1 se acumula en presinapciones antes que la proteína de zona activa Munc18-1. La acumulación de Munc18-1 en presinapciones de neuronas Fmr1-KO aumentó 1,5 veces más que las de tipo salvaje (WT) (Figura4C),lo que indica la participación de FMRP en la acumulación de Munc18-1. A continuación, para distinguir la acumulación de Munc18-1 debido al transporte de cuerpos celulares o la traducción local en axónes, se examinó un efecto del inhibidor de la síntesis proteica anisomicina en la acumulación en presencia o ausencia de cuerpos celulares (Figura4D) . La anisomicina suprimió significativamente la acumulación de Munc18-1 en axón (Figura4D),lo que indica que la acumulación depende de la síntesis proteica. La acumulación en presinapciones de axónes sin cuerpos celulares no fue significativamente diferente a la de los cuerpos celulares (Figura4D). Estos resultados sugieren que la acumulación de Munc18-1 en presinapciones se derivan principalmente de axones, pero no el transporte de Munc18-1 de cuerpos celulares. Si la acumulación de proteínas sinápticas se suprime en presinapciones de axónicos mediante la eliminación de cuerpos celulares, se considera que esta disminución se debe al transporte de los cuerpos celulares. En realidad, cuando examinamos la acumulación de proteínas totales recién sintetizadas etiquetadas metabólicamente por tinte fluorescente, la eliminación de cuerpos celulares redujo significativamente la acumulación de proteínas totales recién sintetizadas, en comparación con las presinapciones de axón con cuerpos celulares8. Aunque la acumulación de Munc18-1 en Fmr1-KO aumentó más en comparación con WT, la anisomicina suprimió la acumulación en un nivel similar al WT y la eliminación de cuerpos celulares no tuvo ningún efecto en la acumulación (Figura4D). Estos resultados sugieren que el FMRP participa en la traducción local de Munc18-1 en axons.

Los resultados representativos presentados aquí demuestran que este método es adecuado para investigar cómo se acumulan las proteínas sinápticas de manera organizada por experimentos de curso de tiempo, y para examinar la fuente de proteínas sinápticas (transporte de cuerpos celulares o traslación en axónes) mediante la eliminación de cuerpos celulares.

Figure 1
Figura 1. Esquema de la formación de presinapsis y eliminación de cuerpos celulares de la bola de neuronas.
(A) Ensayo de formación de presinapsis utilizando cuentas de estreptavidina conjugadas lRRTM2 biotinuadas para inducir las presinapciones en axones del cultivo de bolas de neuronas preparadas a partir de cortices E16. LRRTM2, una proteína postsináptica, se une a la ninrexina (NRXN) y actúa como organizador de la presinapsis. Las perlas de estreptavidina conjugadas con regiones extracelulares LRRTM2 biotinicadas (perlas LRRTM2) se aplicaron en DIV11-12 al cultivo de bolas de neuronas para inducir presinapciones. Esta cifra ha sido modificada de la publicación anterior8. (B) El extremo amarillo de la punta fue cortado y colocado en el área del cuerpo celular del cultivo de la bola de neurona en un ángulo de 45o. Los cuerpos celulares fueron retirados por succión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Acumulación de Munc18-1 en presinapciones en presencia y ausencia de cuerpos celulares de bola de neurona.
(A) Después de 4 h de incubación con perlas LRRTM2, la proteína de zona activa Munc18-1 se acumuló en los sitios presinápticos inducidos en axones (panel superior; esquema experimental, imagen de fase media, inferior; SI imágenes de acumulación Munc18-1). Las imágenes se capturaron como imágenes de bajo aumento utilizando lente 10X y aumento intermedio (1.5X) para ver toda la imagen compuesta de una bola de neuronas, axones y cuentas. Los cuadrados discontinuos indican el área de la bola de neuronas para una posición precisa de las cuentas por imágenes. Barra de escala, 20 m (izquierda; imagen original), 10 m (derecha; imagen ampliada). (B) Munc18-1 se acumuló muy bien incluso en ausencia de cuerpos celulares en los sitios presinápticos inducidos en los axones. Este resultado indica que los axons pueden sobrevivir y formar presinaplasis incluso después de eliminar cuerpos celulares durante al menos 4 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Acumulación de vGlut1 y Munc18-1 en presinapciones de axones con y sin cuerpos celulares.
El marcador excitatorio vGlut1 (verde) y Munc18-1 (Rojo) acumulado en presinapciones 4 h después de la adición de perlas LRRTM2. (Panel superior; con cuerpos de celda, inferior; sin cuerpos de celda). Las imágenes se capturaron utilizando una lente de inmersión en aceite 60X para un alto aumento para medir la intensidad fluorescente. El círculo discontinuo delineó la posición de las cuentas. Munc18-1 acumuló una extensión casi similar en presencia y ausencia de cuerpos celulares enpresinapciones, pero la acumulación de vGlut1 se reduce sin cuerpos celulares 8. Barra de escala, 5 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Procedimiento de medición de intensidad IF y el impacto de la eliminación de cuerpos celulares e inhibidor de la síntesis de proteínas en munc18-1 acumulación en bolas de neuronas.
(A) El diagrama mostró el método de cuantificación de la intensidad IF en un sitio presináptico inducido en el axón del cultivo de la bola de neurona. Barra de escala, 5 m. Los detalles se describen en la sección de protocolo. (B) Curso de tiempo de acumulación de vGlut1 en presinapnaftas inducidas con perlas LRRTM2. Los datos mostrados son medios: SEM para n x 20. ANOVA bidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey. **p < 0.01. (C) Curso de tiempo de acumulación Munc18-1 en WT y Fmr1-KO presynapses bajo cuentas LRRTM2. Los datos mostrados son medios: SEM para n a 20, ANOVA bidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey. n.s., no significativo; **p < 0.01, significativamente diferente entre WT y KO. (D) El gráfico de barras mostró el nivel de acumulación de Munc18-1 en presinapciones de bolas de neuronas WT y Fmr1-KO en presencia o ausencia de anisomicina de 25 M (Aniso) con (CB+) o sin cuerpos celulares (CB-). Los datos mostrados son medios: SEM para n x 20. ANOVA bidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey. **p < 0.01, n.s., no significativo. • p < 0,01 indicado, significativamente diferente con y sin anisomicina. Estas cifras han sido modificadas con la publicación anterior8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1. Vector de expresión Bicystronic para LRRTM2-ECR (Región Extracelular) y BirA (biotina ligasa de E. coli).
Entre las secuencias de codificación LRRTM2-ECR y BirA, hay una secuencia de sitio de entrada ribosomal interna (IRES) que permite co-expresar ambas proteínas de un solo ARNm. el promotor hEF1-HTLV impulsa la expresión sobre el ARNm bicstrónico, y ambas proteínas son secretadas por secuencias de péptidos de señal después de la traducción. La secuencia de codificación LRRTM2-ECR se adjunta a varias secuencias de etiquetas de péptidos (DYKDDDDK, TEV, Myc y sus etiquetas) y Biotin Acceptor Sequence (BAS). BirA se adjunta a la etiqueta DYKDDDDV. Biotinylatos BirA secretados lisina de la secuencia BAS de LRRRTM2-ECR para unirse a las cuentas de estreptavidina. Haga clic aquí para descargar la figura.

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Discussion

Desarrollamos un método novedoso para examinar la formación de presinapnasa estimulada con LRRTM2-perlas utilizando el cultivo de bolas de neuronas. Actualmente, la mayor parte del ensayo de formación de presinapestos incluye cuentas recubiertas de poli-D-lisina (PDL) y cultivo disociado/cámara microfluídica20,21,22. Una de las ventajas de este método es LRRTM2-beads. Mientras que LRRTM2 interactúa con la neurexina para formar presinapciones excitatorias específicamente11,12,13, PERlas PDL induce presinaplas excitatorias e inhibitorias no específicamente20. En este método, otros organizadores de presinapnosa, cuyos miembros son más de 10 proteínas3, son aplicables para inducir presinapciones cambiando el dominio extracelular de la proteína biotinilada dependiendo del propósito experimental.

Otra ventaja es el cultivo de bolas de neuronas. En algunos casos, se utilizó un cultivo disociado convencional para analizar la formación de presinaptina20. Sin embargo, el cultivo disociado no es adecuado para analizar niveles bajos de proteínas sinápticas dentro de las presinapciones, porque las señales abrumadoras en los cuerpos celulares y las dendritas interfieren con las señales en las presinapciones. En su lugar, algunos grupos utilizan cultivo disociado en cámara microfluídica que es aparato especial para el cultivo de axones y cuerpos celulares por separado en 2 comprtments21,22. Usando una cámara microfluídica, la lámina axonal se forma en el compartimiento axonal, y los cuerpos celulares son capaces de ser retirados del compartimiento del cuerpo celular, similar al cultivo de la bola de neurona. Sin embargo, la cámara microfluídica es un aparato especial y requiere algunas habilidades para mantener una condición de cultivo constante. El cultivo de bolas de neuronas no es necesario para utilizar aparatos especiales, y es relativamente fácil de introducir como un nuevo método experimental. Debido a que la esencia del cultivo de la bola de neurona es sólo para colocar agregados de células neuronales (bolas de neuronas) en el plato de fondo de vidrio / cámara, se puede combinar fácilmente con otros métodos. Por ejemplo, se considera que el cultivo de bolas de neuronas con perlas LRRTM2 es aplicable para el cribado de alto contenido para medir la fluorescencia de 10-20 perlas de área al mismo tiempo.

El paso crítico de este protocolo es el recubrimiento con PLL. Si el recubrimiento PLL no es uniforme, los axons de las bolas de neuronas no se extenderían uniformemente en todas las direcciones. Esto perturba el análisis eficiente de la formación de presinapsis. Utilizamos tapas de vidrio y platos con fondo de vidrio, sin embargo, el vidrio a veces no es tan limpio para el cultivo neuronal y un recubrimiento uniforme con PLL. En este protocolo, al principio, los vasos de vidrio y los platos con fondo de vidrio se empapan en detergente neutro no fosforo durante la noche, y luego se lavan 8 veces con agua ultrapura. Utilizamos PLL cuyo peso molecular > 300.000 para reducir su concentración (15 g/ml) para un fondo indeseable más bajo. Si se utiliza un peso molecular menor de PLL(p. ej., 30.000-70.000), es necesaria una mayor concentración (100 g/ml) para extender los axons.

Limitación de este método es que el cultivo de bolas de neuronas no puede mantener > DIV15-16. Los axónes de las bolas de neuronas se fragmentan después de DIV15-16. Los axones fragmentados no producen ninguna presinapsis después de la aplicación de perlas LRRTM2. Por lo tanto, este método no es aplicable para analizar las neuronas maduras (> DIV21). Sin embargo, en la mayoría de los casos11,12,21,22, ensayo de formación de presinapsis utiliza neuronas más jóvenes que se cultivan hasta DIV14. Otra limitación es que los axons sin cuerpos celulares no pueden sobrevivir más de 4 h. Hemos analizado la acumulación de 5 proteínas sinápticas en presinapasias hasta el momento, la acumulación de todas las proteínas que comprobamos alcanzó casi la meseta dentro de 4 h (observación inédita). Se considera que las proteínas sinápticas se acumulan lo suficiente a las 4 h para analizar de dónde se derivan las proteínas sinápticas (cuerpo celular o axón).

La combinación del cultivo de bolas de neuronas con las perlas LRRTM2 es relativamente simple y flexible para adaptar muchas plataformas experimentales. Ya hemos aplicado este método para medir la actividad presináptica utilizando el tinte AM1-43 (observación inédita). Este método se considera aplicable para el cribado de alto rendimiento. El ensayo de formación de presinapsis es posible aplicar cribado de alto contenido mediante la tinción de proteínas sinápticas en presinapnaftas formados bajo LRRTM2-perlas. Este método contribuiría a encontrar nuevos compuestos para curar enfermedades neurológicas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo está respaldado en parte por JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (No 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Agradecemos al Dr. Terukazu Nogi y a la Sra. Makiko Neyazaki (Universidad de la Ciudad de Yokohama) por proporcionar amablemente proteína lRRTM2 biotinilada. También damos las gracias a Honami Uechi y Rie Ishii por su asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent DAKO S2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-545-152
mouse anti-Munc18-1 BD Biosciences 610336
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA) Nacalai Tesque 01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) Nunc 176740
Complete EDTA-free Roche 11873580001
cooled CCD camera Andor Technology iXON3
Coverslip Matsunami C015001 Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Nacalai Tesque 11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I) Wako pure chemicals 047-26771
Expi293 Expression System Thermo Fisher Scientific A14635
Horse serum Sigma-Aldrich H1270
image acquisition software Nikon NIS-element AR
Image analysis software NIH Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscope Nikon Eclipse Ti-E
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Neurobasal media Thermo Fisher Scientific #21103-049
Normal Goat Serum (NGS) Thermo Fisher Scientific #143-06561
N-propyl gallate Nacalai Tesque 29303-92
Paraformaldehyde (PFA) Nacalai Tesque 26126-25

Paraplast Plus
Sigma-Aldrich P3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) Nacalai Tesque 28359-54
poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
Prepacked Disposable PD-10 Columns GE healthcare 17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 Synaptic Systems 135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) Nacalai Tesque 41506-04
Streptavidin-coated magnetic particles Spherotech Inc SVM-40-10 diameter: 4-5 µm
TritonX-100 Nacalai Tesque 35501-15
Trypsin Nacalai Tesque 18172-94

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References

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