Presynapse formasjon analysen bruke Presynapse Organizer perler og "Nevron ball" kultur

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Presynapse formasjon er en dynamisk prosess inkludert akkumulering av Synaptic proteiner i riktig rekkefølge. I denne metoden, presynapse formasjon utløses av perler bøyd med en presynapse arrangør protein på axonal ark av "Nevron ball" kultur, slik at opphopning av Synaptic proteiner er lett å bli analysert under presynapse formasjon.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Parvin, S., Takeda, R., Sasaki, Y. Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and “Neuron Ball” Culture. J. Vis. Exp. (150), e59893, doi:10.3791/59893 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Under neuronal utvikling, er synapse formasjon et viktig skritt for å etablere nevrale kretser. For å danne synapser, må Synaptic proteiner leveres i riktig rekkefølge ved transport fra celle organer og/eller lokal oversettelse i umodne synapser. Det er imidlertid ikke fullt ut forstått hvordan Synaptic proteiner akkumuleres i synapser i riktig rekkefølge. Her presenterer vi en ny metode for å analysere presynaptiske nerve formasjon ved hjelp av kombinasjonen av Nevron ball kultur med perler å indusere presynapse formasjon. Nevron baller som er neuronal celle aggregater gir axonal ark langt fra celle organer og dendrites, slik at svake fluorescerende signaler av presynapses kan oppdages ved å unngå overveldende signaler av celle organer. Som perler å utløse presynapse formasjon, bruker vi perler bøyd med leucine-rik gjenta transmembrane neuronal 2 (LRRTM2), en eksitatoriske presynaptiske nerve arrangør. Ved hjelp av denne metoden viste vi at flytande glutamat transporter 1 (vGlut1), en Synaptic vesicle protein, akkumulert i presynapses raskere enn Munc18-1, et aktivt sone protein. Munc18-1 akkumulert oversettelse-sortert i presynapse selv etter fjerning av celle organer. Dette funnet indikerer Munc18-1 akkumulering av lokal oversettelse i axons, ikke transport fra celle organer. Som konklusjon, denne metoden er egnet til å analysere opphopning av Synaptic proteiner i presynapses og kilde til Synaptic proteiner. Som Nevron ball kulturen er enkel og det er ikke nødvendig å bruke spesielle apparater, kan denne metoden være gjeldende for andre eksperimentelle plattformer.

Introduction

Synapse formasjon er en av kritiske skritt under utviklingen av Neural kretser1,2,3. Dannelse av synapser som er spesialiserte rom sammensatt av pre-og post-synapser er en kompleks og flertrinnsprosess som involverer hensiktsmessig anerkjennelse av axons og dendrites, dannelse av aktiv sone og postsynaptic tetthet, og riktig justering av ion-kanaler og signal-reseptorer1,2. I hver prosess, mange typer Synaptic proteiner akkumuleres til disse spesialiserte rom i riktig timing ved å transportere Synaptic proteiner fra celle organer og/eller av lokal oversettelse i avdelingene. Disse Synaptic proteinene anses å være arrangert på organisert måte for å danne funksjonelle synapser. Dysfunksjon av noen Synaptic proteiner som involverer synapse formasjon resulterer i nevrologiske sykdommer4,5. Men det er fortsatt uklart hvordan Synaptic proteiner akkumuleres i riktig timing.

For å undersøke hvordan Synaptic proteiner akkumuleres på organisert måte, er det nødvendig å undersøke akkumulering av Synaptic proteiner i kronologisk rekkefølge. Noen rapporter demonstrerte Live Imaging å observere synapse formasjon i dissosiert kultur av neurons6,7. Det er imidlertid tidkrevende å finne neurons som bare begynner synapse formasjon under mikroskopi. For å observere akkumulering av Synaptic proteiner effektivt, må synapse formasjon starte på den tiden da forskerne ønsker å indusere dannelsen. Den andre utfordringen er å skille akkumulering av Synaptic proteiner på grunn av transport fra celle organer eller lokal oversettelse i synapser. For dette formålet, er oversettelse nivå nødvendig for å bli målt under forutsetning som ikke tillater transport av Synaptic proteiner fra celle organer.

Vi utviklet romanen presynapse formasjon analysen ved hjelp av kombinasjon av Nevron ball kultur med perler å indusere presynapse formasjon8. Nevron ball kultur er utviklet for å undersøke axonal fenotype, på grunn av dannelsen av axonal ark rundt celle organer9,10. Vi brukte magnetiske perler bøyd med leucine-rik gjenta transmembrane neuronal 2 (LRRTM2) som er en presynaptiske nerve arrangør for å indusere eksitatoriske presynapses (figur 1a)11,12,13. Ved å bruke LRRTM2 perler, presynapse formasjon starter på den tiden da perlene påføres. Dette betyr at presynapse formasjon starter i tusenvis av axons av en Nevron ball på samme tid, og dermed gjør det mulig å undersøke presis tid løpet av opphopning av Synaptic proteiner effektivt. I tillegg er Nevron ball kultur lett å blokkere transport Synaptic proteiner fra Soma ved å fjerne celle organer (figur 1B)8. Vi har allerede bekreftet at axons uten celle organer kan overleve og er friske minst 4 h etter fjerning av celle organer. Dermed er denne protokollen egnet til å undersøke hvor Synaptic proteiner er avledet (celle kroppen eller axon), og hvordan Synaptic proteiner akkumuleres på organisert måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentene beskrevet i dette manuskriptet ble utført i henhold til retningslinjene skissert i den institusjonelle Animal Care og use Committee of the Yokohama City University.

1. utarbeidelse av Nevron baller som henger drop kultur (Days in vitro (DIV) 0-3)

Merk: prosedyrene som er beskrevet her for utarbeidelse av Nevron ball kultur er basert på metoden tidligere rapportert av Sasaki gruppe med noen modifikasjoner9,10. Vi har også vedtatt flere prosedyrer fra banker metoden for dissosiert kultur14.

  1. Bekrefte følgende før du starter disseksjon
    1. Forbered alle nødvendige løsninger og sterilisere dem ved autoklav/filtrering på forhånd.
    2. Hold klar alle instrumenter og materialer som skal brukes i hvert trinn i denne kortikale Nevron kulturen.
    3. Spray og tørk av laminær luft strømnings kabinett, disseksjon bord, scene plate av stereomikroskopet, saks og tang med 70% etanol.
  2. Euthanize musa på anvendelse av CO2 og analysere magen for å få E16 embryo.
  3. Fjern hjernen fra embryo nøye ved hjelp av fine tips av tang og overføre dem til 60 mm cellekultur retter som inneholder 4 mL HEPES bufret salt Solution (HBSS).
    Merk: disseksjon medium HBSS inneholder 10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,09 mM na2HPO4, 1,1 mm KH2PO4, 5,6 mm D-glukose og 5,64 μM fenol-rød.
  4. Fjern hodebunnen, kutt olfactory pære, separate barken fra hver cerebral halvkule ved hjelp av fine tips av pinsett under stereomikroskopet, og overføre til en annen 60 mm retter som inneholder ferske HBSS. Bruk minst 3-5 embryo for hver separate Nevron ball kultur.
  5. Skjær barken i små biter med microdissecting våren saks i en laminær strømningscelle kultur hette.
  6. Overfør hakket barken til et 15 mL rør og trypsinize hakket barken i 4 mL 0,125% Trypsin i HBSS for 4,5 min i et vannbad ved 37 ° c.
    Merk: denne trypsinization tid er avgjørende for effektiv Nevron kultur som den økende tiden (> 4,5 min) fører til mye mer død neurons.
  7. Overfør celle aggregater til et nytt 15 mL rør som inneholder 10 mL HBSS av en steril overførings pipette, og ruge ved 37 ° c i 5 min. Gjenta dette trinnet én gang til.
  8. Overfør celle aggregater til en ny 15 mL rør inneholdende 2 mL Neurobasal medier som inneholder GlutaMax, B27 supplement (NGB medium), 0,01% DNase I og 10% heste serum.
  9. Triturate den trypsinized barken ved gjentatte ganger pipettering dem opp og ned (3-5 ganger) ved hjelp av brann-polert fint glass Pasteur pipette.
    Merk: diameter på brann-polert fint glass Pasteur pipette er svært viktig som beskrevet i banker metoden papir14. Hvis pipette er for smal til å passere barken, klargjør du Pipetter som har 2-3 forskjellige størrelser, og prøv fra større pipette.
  10. For å forberede Nevron baller, ta over celle suspensjonen og justere celle tettheten til 1 x 106 celler/ml ved hjelp av Ngb medium.
  11. Kultur kortikale neurons som hengende dråper som inneholder 10 000 celler/dråpe (1 dråpe er 10 μL) inne i øvre lokk av 10 cm kultur retter.
  12. Tilsett 7 mL fosfat bufret saltvann (PBS) til den nederste delen av kulturen retter, deretter holde i en inkubator for 3 dager ved 37 ° c med 5% CO2 under fuktet tilstand for å muliggjøre Nevron ball formasjon.

2. plassere Nevron baller på PLL-belagt glass coverslips og kultur vedlikehold (DIV 3-11)

Merk: før belegg av glass coverslips med Poly-L-lysin (PLL), er det viktig å vaske coverslips ved hjelp av vaskemiddel. Glass coverslips er noen ganger ikke så rent for neuronal kultur og ensartet belegg med PLL. Non-uniform PLL belegg kan resultere i ujevn axonal forlengelse av Nevron baller.

  1. Sug coverslips i 1/20 fortynnet, nøytralt, ikke-fosfor vaskemiddel i keramiske stativer for 1-3 overnattinger.
  2. Vask coverslips 8 ganger i ultrarent vann, og deretter steriliseres i en ovn ved 200 ° c i 12 timer.
    Merk: alle trinnene herfra må gjøres i en laminær luft strømningscelle kultur hette.
  3. Overfør bakt coverslips til 100-mm retter. Etter tetting av parabolen ved parafilm mellom et lokk og en bunn parabol, kan bakt coverslips holdes for langtidslagring.
  4. Valgfritt Påfør para fin prikker på coverslips. Prikkene gjøre plass til å hindre Nevron baller løsne fra coverslips under immunostaining ved direkte kontakt med Nevron baller til plast retter. Smelt parafin i en passende flaske i et varmt vannbad på ca 90 ° c. Dyppe en Pasteur pipette i parafin, deretter raskt berøre den for å gjøre tre plasser nær kanten av en dekkglass.
  5. Coat PLL (MW > 300 000) på parafin-beaded glass coverslips i 60-mm retter ved hjelp av PLL-løsning (15 μg/mL i borate buffer), og holde dem i minst 1 time i en CO2 inkubator.
  6. Etter vask 4 ganger med PBS, overføre PLL-belagt coverslips til en 4-brønn plate som inneholder 350 μL av NGB medium i hver brønn og cytosin β-D-arabinofuranoside hydrochloride (AraC, 3 μM) til media for å drepe dele celler.
  7. Oppbevar denne 4-brønn plate som inneholder PLL-belagt coverslips i CO2 inkubator minst for 20 min for å sikre temperaturen på mediet nå 37 ° c før overføring Nevron baller.
  8. På DIV 3 når "Nevron baller" er dannet veldig bra, overføre dem til PLL-belagt coverslips inne i 4-brønn plate (5 Nevron baller/brønn) holdt i CO2 inkubator.
  9. Etter 48 h, erstatte Nevron ball kulturen medium med frisk AraC-Free NGB medium. Bruk en kokeplate i en laminær luft strømningscelle kultur hette der temperaturen holdes klar ved 37 ° c umiddelbart før denne prosedyren.
    Merk: det er nødvendig å utføre mediet skiftende så raskt som mulig på en varm plate for å redusere tiden at kulturene er på utsiden av CO2 inkubator.
  10. Hold denne Nevron ballen kultur i CO2 inkubator for opp til div 11.
    Merk: på DIV 11-12, Nevron baller strekker neurites opp til 1-2 mm brukes for eksperimenter.

3. Bruk LRRTM2 perler på Nevron ball kultur med eller uten celle organer (DIV 11-12)

Merk: før påføring av LRRTM2 perler på Nevron ball kultur, anbefales det å fjerne celle organer. Derfor forberede LRRTM2 perler først, og deretter fjerne celle organer og senere gjelder LRRTM2 perler til kultur så tidlig som mulig. Biotinylated LRRTM2 er levert av Nogi ' s gruppe (Yokohama City University) som betinget medium. De bruker et uttrykk vektor inkludert biotin Acceptor sekvens og biotin ligase fra E. coli BirA 15 priser og , 16 for å feste BIOTIN til LRRTM2, og uttrykket vektoren er transfekterte til Expi293F celler som er inkludert i Expi293 Expression system. Vektoren informasjonen er tilgjengelig i supplerende figur 1. Biotinylated LRRTM2-bøyd streptavidin perler redusert bakgrunn av immunostaining sterkt sammenlignet med LRRTM2-FC-bøyd protein A perler som brukes til prototype LRRTM2 system8.

  1. Utarbeidelse av biotinylated LRRTM2 perler
    1. For å fjerne overflødig biotin fra betinget medium Expi293F celler uttrykker biotinylated LRRTM2, gjelder 1,7 mL av betinget medium blandet med 0,8 mL PBS (totalt 2,5 mL) til PD-10 gel filtrering kolonne. PD-10-kolonnen er pre-equilibrated med 25 mL ultrarent vann og 25 mL PBS.
    2. Eluere med 3,5 mL PBS og samle gjennomstrømning som en LRRTM2 lager.
      Merk: denne LRRTM2 lager kan føres ut til alikvoter og oppbevares ved-80 ° c for lang sikt. Expression nivåer av biotinylated LRRTM2 noen ganger varierer fra mye til mye. Dermed riktig volum av LRRTM2 lager å bøye til perlene bør fastsettes for å danne presynapses nok på Nevron baller, når nye mye LRRTM2 lager brukes til første gang.
    3. Ta 20 μL fra suspensjonen av streptavidin-belagte magnetiske partikler (diameter: 4-5 μm) til et mikrosentrifugen rør. Nakkens perlene til et håndlaget apparat festet med faste magneter og vask tre ganger med 100 μL av PBS-MCBC i 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
      Merk: PBS-MCBC inneholder PBS inkludert 5 mM MgCl2, 3 mm CaCl2, 0,1% BSA og 0,1% fullført EDTA-fri.
    4. Etter å ha fjernet helt PBS-MCBC fra perlene, tilsett forhåndsbestemt volum av LRRTM2 lager (vanligvis 500-1000 μL, se Note 3.1.2) til de vasket perlene. Ruge blandingen ved hjelp av Rotator ved 4 ° c for 1-2 h.
    5. Vask perlene to ganger med 100 μL av PBS-MCBC, og senere med 100 μL av NGB medium.
    6. Resuspend LRRTM2 perler i 50 μL av NGB medium for påføring på Nevron ball kulturen.
    7. Bruk samme prosedyrer for å forberede kontroll perlene (negativ kontroll) i en annen mikrosentrifugen tube bortsett fra å legge biotinylated-LRRTM2 proteiner.
  2. Fjerne celle organer fra Nevron baller på DIV 11-12 og anvende LRRTM2 perler
    1. Merk brønnene til en 4-brønn plate som celle tekst (+) og celle tekst (-).
    2. Skjær avslutningen av en gul tupp ved 45 ° vinkel med et barberblad tidligere sprayet med 70% etanol under stereomikroskopet (figur 1B).
    3. Sett den gule tuppen enden på cellen kroppen av en Nevron ball og fjerne celle organer ved sug (figur 1B).
    4. For å identifisere hver spesifiserte tilstand av eksperimentet, etikett brønnene igjen som "LRRTM2 perler" og "kontroll perler".
    5. Påfør LRRTM2 og kontroll perler på Nevron ball kultur, og senk til bunnen av platene for 1 min ved hjelp Ferrite magneter til å starte presynapse formasjon. Denne prosedyren sørger for å touchdown alle perler på samme tid. Spesielt ville det være effektivt for kort tid inkubasjons (f. eks 30 min og 1 h) med LRRTM2 perler synkront.
    6. For å utføre tids kurs eksperimenter, må du merke hver enkelt brønn som 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h og 18 timer og bruke LRRTM2-perler ved de angitte tidsintervallene.
    7. Etter tilsetning av LRRTM2 perler, ruge den Nevron ballen kultur med perlene for angitt tid (0 min til 18 t) for å danne presynapses.

4. Immunostaining og mikroskopi

Merk: Fix cellene for 4 h via inkubasjons med LRRTM2 perler i de eksperimentelle forhold med og uten celle organer, som axons tendens gradvis til å dø i fravær av celle organer etter 4 h. I tilfelle av tid kurs med LRRTM2 perler, fikse cellene på angitt angitt tid.

  1. Festing og farging neurons i Nevron ball kultur etter presynapse dannelse med LRRTM2 perler
    1. Fjern NGB medium og fikse Nevron baller med 4% PFA i PBS (250 μL/brønn) i 20 min ved romtemperatur, og deretter vaske med 500 μL av PBS 4-ganger hver 5 min.
    2. Vask de faste cellene med TBS (Tris-bufret saltvann: 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) og 150 mM NaCl) i mer enn 5 minutter.
    3. Permeabilize cellene/axons av Nevron ball kultur med TBS inneholder 0,3% Triton X-100 i 5 min.
    4. Hold cellene 1 h for blokkering med blokkering buffer (0,1% Triton X-100 og 5% NGS (normal geit serum) i TBS).
    5. Ruge cellene med primære antistoffer; anti-Rabbit-vGlut1 (flytande glutamat transporter 1 (1:4000)) og anti-Mouse-Munc18-1 (1:300) fortynnet med antistoff fortynningsmiddel for overnatting ved 4 ° c.
    6. Vask coverslips 4 ganger med immunofluorescence (IF) buffer (0,1% Triton X-100 og 2% BSA i TBS) og ruge i 30 min med fluoroforen (Alexa Dye)-bøyd 2dre antistoffer; anti-mus-IgG-Alexa 555 (1:500), anti-kanin-IgG-Alexa 488 (1:1000).
    7. Stain kjerner av cellen organer neurons for 5 min med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 μg/mL) i PBS.
    8. Vask coverslips tre ganger med PBS og deretter montere på glass lysbilder ved hjelp av monterings medier som inneholder 167 mg/mL Poly (vinyl) alkohol og 6 mg/mL N-propyl gallate.
    9. Oppbevar glass lysbildene i et kjøleskap ved-20 ° c til mikroskopi. Fluorescerende signaler på glass lysbildene kan oppdages i minst 1 år når lysbildene oppbevares ved-20 ° c.
  2. Ta bilder under fluorescens mikroskop
    1. Fang differensial forstyrrelser kontrast og IF bilder under en invertert fluorescerende mikroskop med et avkjølt CCD kamera med 60X olje nedsenking linse. For bildeoppkjøp programvare, bruk en programvare installert mikroskop system. Bruk image J som bildeanalyse programvare.
    2. Mål hvis-intensiteten i presynapses i axon ved hjelp av følgende formel; IF-intensitet av region av interesse på perler (ROI)-av perler region intensitet/axonal intensitet langs 20 μm fra perler-bakgrunn intensitet. Dette forholdet intensitet gir protein akkumulering indeks (figur 4a). Oppnå målene på originale 16-bits bilder ved hjelp av image J programvare.
    3. For å kvantifisere akkumulering nivået av bestemt protein i presynapse indusert med LRRTM2 perler, alltid velge området bort fra 2-synsfelt eller mer bortsett fra cellen kroppen med mikroskop (60X).
      Merk: valget av området i Nevron ball for Imaging er avgjørende som tette axons er nær cellen kroppen og periferien av Nevron ballen kan gi enkelt axon.
    4. For nøyaktig måling, Velg 5-forskjellige axonal felt (tilsvarende avstand fra celle organer)/coverslip.
    5. Behold identiske bildeforhold på forskjellige dager og mellom eksperimenter

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her viser vi representative resultater av akkumulering av presynaptiske nerve proteiner i LRRTM2-indusert presynapses av axonal ark av Nevron ball kultur. Som presynaptiske nerve proteiner, analyserte vi eksitatoriske Synaptic vesicle protein vGlut1 og den aktive sonen protein Munc18-1. Vi har også undersøkt tid løpet av akkumulering av vGlut1 og Munc18-1 i presynapses, og oppnådde resultater som indikerer kilden til Munc18-1 i presynapses bruker axons fjerne celle organer og en protein syntese inhibitor. Nylig har vi undersøkt en rolle skjøre X mental retardasjon protein (FMRP) på akkumulering av Munc18-1 i presynapses8. FMRP, som er en utløsende gen produkt av skjøre X syndrom (FXS), er en mRNA bindende protein å undertrykke oversettelse17,18,19. Vi undersøkte også involvering av FMRP i Munc18-1 akkumulering ved hjelp av FXS modell mus som er mangelfull i Fmr1 gen Encoding FMRP.

Anvendelse av LRRTM2-perler inn i Nevron ball kultur på DIV11 indusert opphopning av Munc18-1 i presynapses av axons av Nevron baller (figur 2a). Selv i axons som er fjernet celle organer, akkumulering av Munc18-1 ble observert under perlene lignende som axons av Nevron baller med celle organer (figur 2b). I typisk tilfelle, over 80% av perlene etter 4 h-inkubasjons med Nevron baller kan indusere opphopning av Synaptic proteiner i presynapses, bedømt av farging Munc18-1 og vGlut-1. Fordi axons er så overfylt og overlappende nær celle organer (figur 2AA, ba), mer perifere regionen axonal ark ble målt der axons ikke er så overlappet (figur 2AB, bb, eg, perifere området bort fra 2-feltet av visning eller mer bortsett fra celle kroppen med mikroskop (60X)). Når perifere regionen axonal arket ble analysert av høy forstørrelse objektiv linse (60X), vGlut1 og Munc18-1 akkumulert klart i presynapses av axons under perlene (Figur 3). Noen ganger, fluorescerende signaler av Synaptic flytande proteiner som vGlut1 er vanskelig å bli oppdaget i axonal regionen utenfor perlene, fordi disse Synaptic flytande proteiner akkumuleres så mye under perlene. I tilfelle av Munc18-1, kan fluorescerende signaler oppdages svakt i axonal region utenfor perlene.

Å kvantifisere akkumulering nivå av Synaptic proteiner i presynapses indusert av LRRTM2-perler, fluorescerende intensitet av axons under perlene og utenfor perlene ble målt, og deretter beregnet som "protein akkumulering index" (figur 4a, og beskrevet i protokoll seksjonen i detalj). Tids kurs eksperimenter viste at akkumulering av vGlut1 i presynapses økte betraktelig på 30 minutter (figur 4b). På den annen side, Munc18-1 akkumulering begynte å øke betraktelig ved 2 t, og nå et platå på 4 h (figur 4c). Disse dataene tyder på at Synaptic vesicle protein vGlut1 akkumuleres i presynapses tidligere enn den aktive sonen protein Munc18-1. Munc18-1 akkumulering i presynapses av Fmr1-ko neurons økte 1,5 ganger mer enn i vill type (WT) (figur 4c), noe som indikerer involvering av FMRP i Munc18-1 akkumulering. Deretter, for å skille Munc18-1 akkumulering på grunn av transport fra celle organer eller lokal oversettelse i axons, en effekt av proteinsyntese hemmer anisomycin ble undersøkt på akkumulering i nærvær eller fravær av celle organer (figur 4d) . Anisomycin undertrykt Munc18-1 akkumulering betydelig i axons (figur 4d), som indikerer at akkumulering er proteinsyntese-avhengig. Akkumulering i presynapses av axons uten celle organer var ikke signifikant annerledes enn med celle organer (figur 4d). Disse resultatene tyder på at akkumulering av Munc18-1 i presynapses er avledet hovedsakelig fra axons, men ikke transport av Munc18-1 fra celle organer. Hvis akkumulering av Synaptic proteiner undertrykkes i presynapses av axons ved å fjerne celle organer, anses det at denne reduksjonen skyldes transport fra celle organer. Egentlig, når vi undersøkte akkumulering av total nylig syntetisert proteiner metabolically merket av fluorescerende fargestoff, fjerne celle organer redusert betydelig akkumulering av totalt nylig syntetisert proteiner, sammenlignet med presynapses av axons med celle organer8. Selv om Munc18-1-opphopning i Fmr1-ko økte mer SAMMENLIGNET med WT, hadde anisomycin undertrykt akkumulering på tilsvarende nivå til WT og fjerning av celle organer hadde ingen effekt på akkumulering (figur 4d). Disse resultatene tyder på at FMRP er involvert i lokal oversettelse av Munc18-1 i axons.

Representative resultater som presenteres her viser at denne metoden er egnet til å undersøke hvordan Synaptic proteiner akkumuleres i organisert måte av tid kurs eksperimenter, og for å undersøke kilden til Synaptic proteiner (transport fra celle organer eller lokale oversettelse i axons) ved å fjerne celle organer.

Figure 1
Figur 1. Ordningen med presynapse dannelse og fjerning av celle organer fra Nevron ball.
(A) Presynapse formasjon analysen bruker biotinylated LRRTM2 bøyd streptavidin perler å indusere presynapses i axons av Nevron ball kultur tilberedt fra E16 barken. LRRTM2, en postsynaptic protein, binder neurexin (NRXN) og fungere som en presynapse arrangør. Streptavidin perler bøyd til biotinylated LRRTM2 ekstracellulære regioner (LRRTM2 perler) ble brukt på DIV11-12 til Nevron ball kultur for å indusere presynapses. Dette tallet er endret fra forrige publikasjon8. (B) den gule spissen ble kuttet og plassert på cellen kroppen område av Nevron ball kultur på 45 ° vinkel. Celle organene ble fjernet ved sug. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Munc18-1 akkumulering i presynapses i nærvær og fravær av celle organer av Nevron ball.
(A) etter 4 h INKUBASJONS med LRRTM2 perler, den aktive sonen protein Munc18-1 akkumulert ved indusert presynaptiske nerve steder i axons (Upper panel; eksperimentell ordningen, midten; fase bilde, lavere; IF bilder av Munc18-1 akkumulering). Bilder ble tatt som lav forstørrelse bilder ved hjelp av 10X objektiv og middels forstørrelse (1.5 X) for å se hele bildet består av en Nevron ball, axons, og perler. Stiplede firkanter indikere området av Nevron ballen for nøyaktig Imaging posisjon perler. Skalerings søyle, 20 μm (venstre; original bilde), 10 μm (høyre; forstørret bilde). (B) Munc18-1 akkumulert svært godt selv i fravær av celle organer ved indusert presynaptiske nerve områder i axons. Dette resultatet indikerer at axons kan overleve og danne presynapses selv etter fjerning av celle organer i minst 4 h. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Akkumulering av vGlut1 og Munc18-1 i presynapses av axons med og uten celle organer.
Den eksitatoriske presynaptiske nerve markør vGlut1 (grønn) og Munc18-1 (rød) akkumulert i presynapses 4 h etter tilsetning av LRRTM2 perler. (Øvre panel, med celle organer, lavere; uten celle organer). Bilder ble tatt med 60X olje nedsenking linse for høy forstørrelse å måle fluorescerende intensitet. Stiplet sirkel skissert posisjonen til perler. Munc18-1 akkumulert nesten tilsvarende grad i nærvær og fravær av celle organer i presynapses men vGlut1 akkumulering er redusert uten celle organer8. Scale bar, 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Prosedyre av IF intensitet måling og virkningen av celle organer fjerning og protein syntese inhibitor på Munc18-1 akkumulering i Nevron baller.
(A) diagram viste kvantifisering metoden for If intensitet på en indusert-presynaptiske nerve sted i axon av Nevron ball kultur. Skala bar, 5 μm. Detaljene er beskrevet i protokollen delen. (B) tid løpet av vGlut1 akkumulering i presynapses indusert med LRRTM2 perler. Data som vises er gjennomsnittlig ± SEM for n = 20. Toveis ANOVA med Tukey flere sammenlignings test. * *p < 0,01. (C) tid løpet av Munc18-1 AKKUMULERING i WT og Fmr1-ko presynapses under LRRTM2 perler. Data som vises er gjennomsnittlig ± SEM for n = 20, toveis ANOVA med Tukey ' s Multiple sammenligning test. n.s., ikke signifikant; * *p < 0,01, signifikant forskjellig mellom WT og ko. (D) søylediagram viste Munc18-1 akkumulering nivå i PRESYNAPSES av WT og Fmr1-ko Nevron baller i nærvær eller fravær av 25 μM anisomycin (ANISO) med (CB +) eller uten (CB-) celle organer. Data som vises er gjennomsnittlig ± SEM for n = 20. Toveis ANOVA med Tukey flere sammenlignings test. * *p < 0,01, n.s., ikke signifikant. # indikert p < 0,01, signifikant forskjellig med og uten anisomycin. Disse tallene er endret fra forrige publikasjon8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1. Bicystronic uttrykk vektor for LRRTM2-ECR (ekstracellulære region) og BirA (biotin ligase fra E. coli ).
Mellom LRRTM2-ECR og BirA koding sekvenser, er det en intern ribosomal Entry site (IRES) sekvens som gjør det mulig å co-uttrykke både proteiner fra enkelt mRNA. hEF1-HTLV promoter kjører expresson bicstronic mRNA, og begge proteinene skilles ut med signal peptid sekvenser etter oversettelse. LRRTM2-ECR koding sekvensen er knyttet til flere peptid tag sekvenser (DYKDDDDK, TEV, myC og hans koder) og biotin Acceptor Sequence (BAS). BirA er knyttet til DYKDDDDV-koden. Utskilles BirA biotinylates lysin av BAS-sekvensen av LRRRTM2-ECR å binde til streptavidine perler. Vennligst klikk her for å laste ned figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi utviklet romanen metode for å undersøke presynapse formasjon stimulert med LRRTM2-perler bruker Nevron ball kultur. Tiden, de fleste av presynapse formasjon analysen inkluderer Poly-D-lysin (PDL)-belagte perler og dissosiert kultur/mikrovæskebasert kammer20,21,22. En av fordelene med denne metoden er LRRTM2-perler. Mens LRRTM2 samhandler med neurexin å danne eksitatoriske presynapses spesifikt11,12,13, PDL-perler induserer både eksitatoriske og hemmende presynapses nonspecifically20. I denne metoden, andre presynapse arrangører, hvis medlemmer er over 10 proteiner3, gjelder for å indusere presynapses ved å endre ekstracellulære domene biotinylated protein avhengig av eksperimentell formål.

En annen fordel er Nevron ball kultur. I noen tilfeller ble konvensjonell dissosiert kultur brukt til å analysere presynapse formasjon20. Imidlertid er dissosiert kultur ikke egnet til å analysere lave nivåer av Synaptic proteiner innen presynapses, fordi overveldende signaler i celle organer og dendrites forstyrrer signalene i presynapses. I stedet bruker noen grupper dissosiert kultur i mikrovæskebasert kammer som er spesielle apparater til kultur axons og celle organer separat i 2 comprtments21,22. Ved hjelp av mikrovæskebasert kammer, axonal arket er dannet i axonal kupé, og celle organer er i stand til å bli fjernet fra cellen kroppen kupé, ligner på Nevron ball kultur. Men mikrovæskebasert kammer er spesielle apparater, og krever noen ferdigheter for å opprettholde konstant kultur tilstand. Nevron ball kultur er ikke nødvendig å bruke spesielle apparater, og er relativt lett å bli introdusert som en ny eksperimentell metode. Fordi essensen av Nevron ball kultur er bare å plassere neuronal celle aggregater (Nevron baller) til glass-bunn parabol/kammer, kan det være lett kombineres med andre metoder. For eksempel er det vurdert at Nevron ball kultur bruker LRRTM2-perler er aktuelt for høyt innhold screening for å måle fluorescens av 10-20 perler området på samme tid.

Kritisk trinn i denne protokollen er belegg med PLL. Hvis PLL belegget ikke er uniform, axons av Nevron baller ikke ville forlenge jevnt i alle retninger. Dette forstyrrer effektiv analyse av presynapse formasjon. Vi bruker glass coverslips og glass-bunn retter, men glass er noen ganger ikke så rent for neuronal kultur og ensartet belegg med PLL. I denne protokollen, først, glass coverslips og glass-Bottom retter er dynket i nøytral ikke-fosfor vaskemiddel for 1-3 over natten, og deretter vasket 8 ganger med ultrarent vann. Vi bruker PLL hvis molekylvekt > 300 000 for å redusere konsentrasjonen (15 μg/mL) for lavere uønsket bakgrunn. Hvis lavere molekylvekt av PLL (f.eks. 30000-70000) brukes, er høyere konsentrasjon (100 μg/ml) nødvendig for å forlenge axons.

Begrensning av denne metoden er at Nevron ball kultur ikke kan opprettholde > DIV15-16. Axons av Nevron baller er fragmentert etter DIV15-16. Fragmenterte axons produserer ikke noen presynapse etter LRRTM2 perler søknad. Således, denne metoden er ikke anvendelig å analysere modne neurons (> DIV21). Men i de fleste tilfeller11,12,21,22, presynapse formasjon analysen bruker yngre neurons som er kultivert inntil DIV14. En annen begrensning er at axons uten celle organer ikke kan overleve over 4 timer. Vi analyserte akkumulering av 5 Synaptic proteiner i presynapses så langt, akkumulering av alle proteiner Vi sjekket nådde nesten platå innen 4 timer (upublisert observasjon). Det anses at Synaptic proteiner akkumuleres nok til 4 h til å analysere hvor Synaptic proteiner er avledet fra (celle kroppen eller axon).

Kombinasjon av Nevron ball kultur med LRRTM2-perler er relativt enkel og fleksibel til å tilpasse mange eksperimentelle plattformer. Vi har allerede brukt denne metoden for å måle presynaptiske nerve aktivitet ved hjelp AM1-43 fargestoff (upublisert observasjon). Denne metoden anses å være gjeldende for screening med høy gjennomstrømming. Presynapse formasjon analysen er mulig å bruke høyt innhold screening av farging Synaptic proteiner i presynapses dannet under LRRTM2-perler. Denne metoden vil bidra til å finne nye forbindelser å kurere nevrologiske sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes delvis av JSP Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (nr. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Vi takker Dr. Terukazu Nogi og MS Hyunmin Neyazaki (Yokohama City University) for vennlig gi biotinylated LRRTM2 protein. Vi takker også Honami Uechi og Rite Ishii for teknisk assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent DAKO S2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-545-152
mouse anti-Munc18-1 BD Biosciences 610336
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA) Nacalai Tesque 01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) Nunc 176740
Complete EDTA-free Roche 11873580001
cooled CCD camera Andor Technology iXON3
Coverslip Matsunami C015001 Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Nacalai Tesque 11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I) Wako pure chemicals 047-26771
Expi293 Expression System Thermo Fisher Scientific A14635
Horse serum Sigma-Aldrich H1270
image acquisition software Nikon NIS-element AR
Image analysis software NIH Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscope Nikon Eclipse Ti-E
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Neurobasal media Thermo Fisher Scientific #21103-049
Normal Goat Serum (NGS) Thermo Fisher Scientific #143-06561
N-propyl gallate Nacalai Tesque 29303-92
Paraformaldehyde (PFA) Nacalai Tesque 26126-25

Paraplast Plus
Sigma-Aldrich P3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) Nacalai Tesque 28359-54
poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
Prepacked Disposable PD-10 Columns GE healthcare 17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 Synaptic Systems 135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) Nacalai Tesque 41506-04
Streptavidin-coated magnetic particles Spherotech Inc SVM-40-10 diameter: 4-5 µm
TritonX-100 Nacalai Tesque 35501-15
Trypsin Nacalai Tesque 18172-94

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28, (1), 251-274 (2005).
  2. Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5, (5), 385-399 (2004).
  3. Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203, (1), 11-22 (2013).
  4. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455, (7215), 903-911 (2008).
  5. Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53, (8), 1441-1449 (2012).
  6. Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27, (1), 57-69 (2000).
  7. Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, (6), 1507-1520 (2004).
  8. Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. (2018).
  9. Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30, (28), 9349-9358 (2010).
  10. Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74, (3), 397-406 (2014).
  11. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61, (5), 734-749 (2009).
  12. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64, (6), 799-806 (2009).
  13. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64, (6), 791-798 (2009).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1, (5), 2406-2415 (2006).
  15. Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. (2017).
  16. Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286, (40), 35247-35256 (2011).
  17. Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60, (2), 201-214 (2008).
  18. Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16, (11), 1530-1536 (2013).
  19. Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16, (10), 595-605 (2015).
  20. Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29, (40), 12449-12466 (2009).
  21. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33, (13), 5584-5589 (2013).
  22. Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20, (13), 3085-3098 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics