Presynapse formation assay med Presynapse arrangör pärlor och "neuron Ball" kultur

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Presynapse formation är en dynamisk process inklusive ackumulering av synaptiska proteiner i rätt ordning. I denna metod, presynapse bildandet utlöses av pärlor konjugerat med en presynapse arrangör protein på axonal ark av "neuron Ball" kultur, så att ackumulering av synaptiska proteiner är lätt att analyseras under presynapse formation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Parvin, S., Takeda, R., Sasaki, Y. Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and “Neuron Ball” Culture. J. Vis. Exp. (150), e59893, doi:10.3791/59893 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Under neuronala utveckling, synapsen bildas är ett viktigt steg för att etablera neurala kretsar. För att bilda synapser måste Synaptic proteiner levereras i anslå beställer vid transport från cell förkroppsligar och/eller lokal översättning i omogna synapses. Emellertid, det är inte helt förstått hur synaptiska proteiner ackumuleras i synapser i rätt ordning. Här presenterar vi en ny metod för att analysera presynaptisk formation genom att använda kombinationen av neuron boll kultur med pärlor för att inducera presynapse formation. Neuron bollar som är neuronala cell aggregat ger axonala ark långt från cell kroppar och dendriter, så att svaga fluorescerande signaler av presynapser kan upptäckas genom att undvika överväldigande signaler av cell kroppar. Som pärlor för att utlösa presynapse formation, använder vi pärlor konjugerat med leucin-Rich REPEAT transmembranneuronal 2 (LRRTM2), en excitatoriska presynaptiska arrangör. Med denna metod, vi visade att vesikulär glutamat transporter 1 (vGlut1), ett synaptiskt vesikelprotein, ackumuleras i presynapser snabbare än Munc18-1, en aktiv zon protein. Munc18-1 ackumulerad översättning-beroende i presynapse även efter att ha avlägsnat cellen förkroppsligar. Detta fynd indikerar den Munc18-1 ackumulationen vid lokal översättning i axons, inte transport från cell förkroppsligar. Sammanfattningsvis, denna metod är lämplig för att analysera ackumulering av synaptiska proteiner i presynapser och källa av synaptiska proteiner. Som neuron boll kulturen är enkel och det är inte nödvändigt att använda särskilda apparater, denna metod kan tillämpas på andra experimentella plattformar.

Introduction

Synapsebildande är ett av kritiskt kliver under utveckling av neural går runt1,2,3. Bildandet av synapser som är specialiserade avdelningar består av pre-och post-synapser är en komplex och flerstegs process som inbegriper lämpligt erkännande av axoner och dendriter, bildandet av aktiv zon och postsynaptisk densitet, och korrekt anpassning av jonkanaler och signalsubstans receptorer1,2. I varje process, många typer av synaptiska proteiner ackumuleras till dessa specialiserade fack i rätt timing genom att transportera synaptiska proteiner från cell kroppar och/eller lokal översättning i avdelningarna. Dessa synaptiska proteiner är ansedda att vara ordnade i organiserat sätt för att bilda funktionella synapses. Dysfunktion av vissa synaptiska proteiner som involverar synapsen bildas resulterar i neurologiska sjukdomar4,5. Emellertid, det är fortfarande oklart hur synaptiska proteiner ackumuleras i rätt timing.

För att undersöka hur synaptiska proteiner ackumuleras i organiserat sätt, är det nödvändigt att undersöka ackumulering av synaptiska proteiner i kronologisk ordning. Vissa rapporter visade Live Imaging att observera synapsen bildas i dissocierad kultur av nervceller6,7. Emellertid, det är tidskrävande att hitta nervceller som bara startar synapsen bildas under mikroskopi. Att observera ackumulering av synaptiska proteiner effektivt, synapsen bildas måste starta vid den tidpunkt då forskare vill inducera bildandet. Den andra utmaningen är att skilja ackumulering av synaptiska proteiner på grund av transport från cell kroppar eller lokal översättning i synapser. För detta ändamål är översättnings nivån nödvändig för att mätas under det tillstånd som inte tillåter transport av synaptiska proteiner från cell kroppar.

Vi utvecklade nya presynapse formation assay med kombinationen av neuron Ball kultur med pärlor för att inducera presynapse formation8. Neuron Ball kultur är utvecklad för att undersöka axonal fenotyp, på grund av bildandet av axonala ark omgivande cell kroppar9,10. Vi använde magnetiska pärlor konjugerat med leucin-Rich REPEAT transmembranneuronal 2 (LRRTM2) som är en presynaptisk arrangör att framkalla excitatoriska presynapser (figur 1a)11,12,13. Genom att använda LRRTM2 pärlor, presynapse formation börjar vid den tidpunkt då pärlorna appliceras. Detta innebär att presynapse formation börjar i tusentals axoner av en neuron boll vid samma tider, vilket gör det möjligt att undersöka exakt tid kurs av ackumulering av synaptiska proteiner effektivt. Dessutom är neuron boll kultur lätt att blockera transport synaptiska proteiner från Soma genom att ta bort cell kroppar (figur 1b)8. Vi har redan bekräftat att axoner utan cell kroppar kan överleva och är friska minst 4 h efter avlägsnande av cell kroppar. Sålunda, detta protokoll är lämpligt att undersöka varifrån synaptiska proteiner härleds (cellkroppen eller Axon), och hur synaptiska proteiner ackumuleras i organiserat sätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De experiment som beskrivs i detta manuskript utfördes enligt de riktlinjer som beskrivs i den institutionella djuromsorg och användning kommittén för Yokohama City University.

1. beredning av neuron bollar som hängande Drop kultur (Days in vitro (DIV) 0-3)

Anmärkningar: de förfaranden som beskrivs här för beredning av neuron boll kultur är baserade på den metod som tidigare rapporterats av Sasaki gruppen med några ändringar9,10. Vi antog också flera procedurer från bankir metoden för dissocierad kultur14.

  1. Kontrollera följande innan dissektion startas
    1. Förbered alla nödvändiga lösningar och sterilisera dem genom autoklav/filtrering i förväg.
    2. Håll redo alla instrument och material som ska användas i varje steg i denna kortikala neuron kultur.
    3. Spraya och torka av laminärt luftflöde skåp, dissektion bord, scen plattan av stereomikroskop, sax och tång med 70% etanol.
  2. Euthanize musen vid applicering av CO2 och dissekera buken för att få E16 embryon.
  3. Ta bort hjärnorna från embryon försiktigt med hjälp av fina tips av tång och överföra dem till 60 mm cellkultur rätter som innehåller 4 mL HEPES buffrad saltlösning (HBSS).
    Anmärkning: dissektion medium HBSS innehåller 10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,09 mM na2HPO4, 1,1 mm KH2Po4, 5,6 mm D-glukos, och 5,64 μm fenolrött.
  4. Ta bort hårbotten, klippa luktbulben, separata cortices från varje cerebral halvklotet med hjälp av de fina spetsarna på tång under stereomikroskop, och överföra till en annan 60 mm rätter som innehåller färska HBSS. Använd minst 3-5 embryon för varje enskild neuron boll kultur.
  5. Skär cortices i små bitar med microdissekera våren sax i ett laminärt flöde cellkultur huva.
  6. Överför malet cortices till en 15 mL tub och trypsinize de malda cortices i 4 mL 0,125% trypsin i HBSS för 4,5 min i ett vattenbad vid 37 ° c.
    Obs: denna trypsinization tid är avgörande för effektiv neuron kultur som den ökande tiden (> 4,5 min) leder till mycket mer döda nervceller.
  7. Överför cell aggregaten till ett nytt 15 mL-rör som innehåller 10 mL HBSS med en steril överföringspipett och inkubera vid 37 ° c i 5 minuter. Upprepa detta steg en gång till.
  8. Överför cell aggregaten till en ny 15 mL tub innehållande 2 mL Neurobasal mediainnehåll ande GlutaMax, B27 supplement (NGB medium), 0,01% DNase I och 10% Horse serum.
  9. Triturate den trypsinized cortices genom att upprepade gånger Pipettera dem upp och ner (3-5 gånger) med hjälp av brand-polerad Fine glass Pasteur pipett.
    Anmärkning: diameter brand-polerad Fine glass Pasteur pipett är mycket viktigt som beskrivs i bankir metod papper14. Om pipetten är för smal för att passera cortices, Förbered pipetter med 2-3 olika storlekar och försök från större pipett.
  10. För att förbereda neuron bollar, ta ovanstående cellsuspension och justera CELLTÄTHETEN till 1 x 106 celler/ml med NGB medium.
  11. Odla kortikala nervceller som hängande droppar som innehåller 10 000 celler/droppe (1 droppe är 10 μL) inuti de övre locken på 10 cm kultur rätter.
  12. Tillsätt 7 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till den nedre delen av kulturen rätter, sedan hålla i en inkubator för 3 dagar vid 37 ° c med 5% CO2 under befuktade tillstånd att möjliggöra neuron boll bildning.

2. placering neuron bollar på PLL-belagda glas täckband och kultur underhåll (DIV 3-11)

Anmärkning: före beläggning av glas täckband med poly-L-lysin (PLL), tvätta täckglas med hjälp av tvättmedel är viktigt. Glas täckband är ibland inte så rena för neuronala kultur och enhetlig beläggning med PLL. Icke-enhetlig PLL beläggning kan resultera i ojämn axonal förlängning av neuron bollar.

  1. Blötlägg täckglasarna i 1/20 utspädd neutral icke-fosforhaltiga tvättmedel i keramiska rack för 1-3 övernattningar.
  2. Tvätta täckglas 8 gånger i ultrarent vatten, och sedan sterilisera i en ugn vid 200 ° c för 12 h.
    Anmärkning: alla steg härifrån måste göras i en laminär luftflöde cell Culture Hood.
  3. Överför bakade täckglas till 100-mm rätter. Efter tätning skålen med parafilm mellan ett lock och en botten skålen, bakade täckband kan hållas för långsiktig lagring.
  4. Valfritt Applicera paraffin prickar på täckglas. Prickarna gör plats för att förhindra neuron bollar lossas från täckglas under immunofärgning av direkt kontakt med neuron bollar till plast rätter. Smält paraffin i en lämplig flaska i ett varmt vattenbad vid ca 90 ° c. Doppa en Pasteur pipett i paraffin, sedan snabbt röra den för att göra tre fläckar nära kanten av en täckslip.
  5. Coat PLL (MW > 300 000) på paraffin-pärlstav glas täckblad i 60-mm rätter med PLL lösning (15 μg/mL i Borat buffert), och förvara dem i minst 1 h i en CO2 inkubator.
  6. Efter tvättning 4 gånger med PBS, överför PLL-belagda täckglas till en 4-brunn tallrik som innehåller 350 μL av NGB medium i varje brunn och cytosin β-D-arabinofuranoside hydroklorid (AraC, 3 μM) till media för att döda dividera celler.
  7. Behåll denna 4-bra tallrik som innehåller PLL-belagda täckband i CO2 inkubator åtminstone för 20 min för att säkerställa temperaturen på mediet nå 37 ° c innan du överför neuron bollar.
  8. Vid DIV 3 när "neuron bollar" bildas mycket väl, överföra dem till PLL-belagda täckglas inuti 4-brunnen plattan (5 neuron bollar/brunn) hålls i CO2 inkubator.
  9. Efter 48 h, ersätta neuron Ball Culture medium med färskt AraC-fri NGB medium. Använd en värmeplatta i ett laminärt luftflöde cellodling huva vars temperatur hålls klar vid 37 ° c omedelbart före detta förfarande.
    Obs: det är nödvändigt att utföra mediet förändras så snabbt som möjligt på en värmeplatta för att minska den tid som kulturerna är på utsidan av CO2 inkubator.
  10. Behåll denna neuron boll kultur i CO2 inkubator för upp till div 11.
    Obs: på DIV 11-12, neuron bollar utvidga neuriter upp till 1-2 mm används för experiment.

3. tillämpa LRRTM2 pärlor på neuron Ball kultur med eller utan cell kroppar (DIV 11-12)

Obs: före applicering av LRRTM2 pärlor på neuron boll kultur, det rekommenderas att ta bort cell kroppar. Därför, Förbered LRRTM2 pärlor först, ta sedan bort cell kropparna och senare tillämpa LRRTM2 pärlor till kulturen så tidigt som möjligt. Biotinylated LRRTM2 tillhandahålls av Nogi grupp (Yokohama City University) som konditionerat medium. De använder en uttrycks vektor inklusive biotin acceptorsekvens och biotin Ligase från E. coli BirA 15 , 16 om du vill bifoga biotin till LRRTM2 och uttrycks vektorn transfekterade till Expi293F celler som ingår i Expi293 Expression system. Vektorinformationen finns i kompletterande figur 1. Biotinylated LRRTM2-konjugerat konjugerat pärlor minskad bakgrund av immunofärgning kraftigt jämfört med LRRTM2-FC-konjugerat protein en pärlor som används för prototyp LRRTM2 system8.

  1. Beredning av en LRRTM2 pärlor
    1. För att avlägsna överskott biotin från konditionerat medium av Expi293F celler som uttrycker en LRRTM2, applicera 1,7 ml av det konditionerade mediet blandat med 0,8 ml PBS (totalt 2,5 ml) till PD-10 gelfiltrering kolumn. PD-10-kolonnen är pre-equilibrated med 25 ml ultrarent vatten och 25 ml PBS.
    2. Eluera med 3,5 mL PBS och samla in genomflödet som en LRRTM2 stock.
      Obs: denna LRRTM2 Stock kan dispenseras till alikvoter och lagras vid-80 ° c för långsiktig. Uttrycks nivåer av en LRRTM2 varierar ibland från parti till parti. Sålunda, ordentlig volym av LRRTM2 stock till konjugera till pärlor skulle bli beslutat till form presynapses nog på neuron balerna, när ny lott av LRRTM2 Stock är Använd på första tid.
    3. Ta 20 μL från suspensionen av streptavidin-belagda magnetiska partiklar (diameter: 4-5 μm) till ett microcentrifugerör. Immobilize pärlorna till en handgjorda apparat fäst med Neodymium permanentmagneter och tvätta tre gånger med 100 μL av PBS-MCBC i 1,5 mL microcentrifug rör.
      Anmärkning: PBS-MCBC innehåller PBS inklusive 5 mM MgCl2, 3 mm CaCl2, 0,1% BSA, och 0,1% komplett EDTA-fri.
    4. Efter avlägsnande helt PBS-MCBC från pärlorna, tillsätt förutbestämd volym LRRTM2 lager (vanligtvis 500-1000 μL, se anmärkning 3.1.2) till de tvättade pärlorna. Inkubera blandningen med hjälp av rotator vid 4 ° c för 1-2 h.
    5. Tvätta pärlorna två gånger med 100 μL PBS-MCBC, och senare med 100 μL NGB-medium.
    6. Omsuspendera LRRTM2-pärlorna i 50 μL NGB-medium för applicering på neuronbollkulturen.
    7. Använd samma procedurer för att förbereda kontroll pärlor (negativ kontroll) i en annan microcentrifug röret förutom att lägga biotinylated-LRRTM2 proteiner.
  2. Ta bort cell kroppar från neuron bollar på DIV 11-12 och tillämpa LRRTM2 pärlor
    1. Märk brunnarna på en 4-brunnsplåt som "cell kropp (+)" och "cell kropp (-)".
    2. Skär slutet av en gul spets vid 45 ° vinkel med ett rakblad som tidigare besprutas med 70% etanol under stereomikroskop (figur 1b).
    3. Sätt den gula spetsen änden på cellkroppen område av en neuron boll och ta bort cell kropparna genom sug (figur 1b).
    4. För att identifiera varje angivet tillstånd av experimentet, märk brunnarna igen som "LRRTM2 pärlor" och "kontroll pärlor".
    5. Applicera LRRTM2 och kontroll pärlor på neuron Ball kultur, och dränera till botten av plattorna för 1 min med ferrit magneter för att starta presynapse formation. Detta förfarande säkerställer att touchdown alla pärlor på samma gång. Speciellt, det skulle vara effektivt för kort tid inkubering (t. ex., 30 min och 1 h) med LRRTM2 pärlor synkront.
    6. För att utföra tid-kurs experiment, etikett varje separat brunn så 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h och 18 h och applicera LRRTM2 beads på den antyd tid intervallerna.
    7. Efter tillsats av LRRTM2 pärlor, inkubera neuron bollen kultur med pärlor för angiven tid (0 min till 18 h) för att bilda presynapser.

4. immunofärgning och mikroskopi

Anmärkning: Fix cellerna för 4 h via inkubering med LRRTM2 pärlor i experimentella förhållanden med och utan cell kroppar, som axonerna tenderar gradvis att dö i avsaknad av cell kroppar efter 4 h. I händelse av tidsförlopp med LRRTM2 pärlor, fixa cellerna vid angivet angiven tid.

  1. Fastställande och färgning nervceller i neuron boll kultur efter presynapse formation med LRRTM2 pärlor
    1. Ta bort NGB medium och fixa neuron bollar med 4% PFA i PBS (250 μL/brunn) för 20 min vid rumstemperatur, och sedan tvätta med 500 μL av PBS 4-gånger vardera 5 min.
    2. Tvätta de fasta cellerna med TBS (Tris-buffrad saltlösning: 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) och 150 mM NaCl) i mer än 5 min.
    3. Permeabilize cellerna/axonerna av neuron Ball kultur med TBS som innehåller 0,3% Triton X-100 för 5 min.
    4. Håll cellerna 1 h för blockering med blockeringsbuffert (0,1% Triton X-100 och 5% NGS (normal get serum) i TBS).
    5. Inkubera cellerna med primära antikroppar; anti-Rabbit-vGlut1 (vesikulär glutamat transporter 1 (1:4000)) och anti-Mouse-Munc18-1 (1:300) utspädd med antikropps spädningsmedel för övernattning vid 4 ° c.
    6. Tvätta täckglas 4 gånger med immunofluorescens (IF) buffert (0,1% Triton X-100 och 2% BSA i TBS) och inkubera i 30 min med fluorophore (Alexa Dye)-konjugerade 2nd antikroppar; anti-Mouse-IgG-Alexa 555 (1:500), anti-kanin-IgG-Alexa 488 (1:1000).
    7. Fläcken kärr av cell kroppar av nervceller för 5 min med 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 μg/mL) i PBS.
    8. Tvätta täckglasen tre gånger med PBS och montera sedan på glas rutschbanor med hjälp av monteringsmaterial som innehåller 167 mg/mL poly (vinyl) alkohol och 6 mg/mL N-propylgallat.
    9. Förvara glas rutschbanorna i kylskåp vid-20 ° c tills mikroskopi. Fluorescerande signaler från glas rutschbanorna är detekterbara i minst 1 år när bilderna förvaras vid-20 ° c.
  2. Ta bilder under fluorescensmikroskop
    1. Capture differential interferens kontrast och om bilder under en inverterad fluorescerande Mikroskop med en kyld CCD-kamera med 60X Oil Immersion lins. För bild förvärvs programvara, Använd ett program installerat Mikroskop system. Använd bild J som bildanalysprogram.
    2. Mät om intensitet i presynapser i Axon med följande formel; OM intensiteter av regionen av intresse på pärlor (ROI)-off pärlor region intensitet/axonal intensitet längs 20 μm från pärlor-bakgrundsintensitet. Denna ratio intensitet ger protein ackumuleringsindex (figur 4a). Utför mätningarna på de ursprungliga 16-bitarsbilderna med hjälp av bild J programvara.
    3. För att kvantifiera ackumuleringen nivån av särskilt protein i presynapse induceras med LRRTM2 pärlor, alltid välja området bort från 2-synfält eller mer bortsett från cellen kroppen med Mikroskop (60X).
      Obs: urvalet av område i neuron bollen för avbildning är avgörande eftersom täta axoner är nära cellen kroppen och periferin av neuron bollen kan ge enkel Axon.
    4. För noggrann mätning, Välj 5-olika axonala fält (liknande avstånd från cell kroppar)/Coverslip.
    5. Behåll identiska avbildnings förhållanden vid olika dagar och mellan experiment

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här visar vi representativa resultat av ackumulering av presynaptiska proteiner i LRRTM2-inducerad presynapser av axonala ark av neuron boll kultur. Som presynaptiska proteiner, analyserade vi excitatoriska Synaptic vesikler protein vGlut1 och Active Zone protein Munc18-1. Vi undersökte också tidsförlopp för ackumulering av vGlut1 och Munc18-1 i presynapser, och erhållna resultat visar källan till Munc18-1 i presynapser med axoner att ta bort cell kroppar och en proteinsyntes hämmare. Nyligen har vi undersökt en roll av bräcklig X mental utvecklingsstörning protein (fmrp) på ackumulering av Munc18-1 i presynapser8. Fmrp, som är en orsakande genprodukt av bräcklig X syndrome (FXS), är ett mRNA bindande protein för att undertrycka översättningen17,18,19. Vi undersökte också medverkan av FMRP i Munc18-1 ackumulering med FXS modell möss som är bristfällig i Fmr1 gen kodning fmrp.

Tillämpning av LRRTM2-pärlor i neuron boll kultur vid DIV11 inducerad ackumulering av Munc18-1 i presynapser av axoner av neuron bollar (figur 2A). Även i axoner som avlägsnas cell kroppar, ackumulering av Munc18-1 observerades under pärlorna liknande som axoner av neuron bollar med cell kroppar (figur 2b). I typiska fall, över 80% av pärlor efter 4 h-inkubation med neuron bollar kan inducera ackumulering av synaptiska proteiner i presynapser, bedömas genom färgning Munc18-1 och vGlut-1. Eftersom axoner är så trångt och överlappade nära cell kroppar (figur 2AA, ba), mer perifera regionen axonala ark mättes där axoner inte är så överlappade (figur 2AB, BB, t. ex., perifera området bort från 2-fält av beskådar eller mer frånsett cellen förkroppsligar med Mikroskop (60X)). När perifera regionen axonal ark analyserades av objektiv med hög förstoringsgrad (60X), vGlut1 och Munc18-1 samlats klart i presynapser av axoner under pärlorna (figur 3). Ibland, fluorescerande signaler av synaptiska vesikulär proteiner som vGlut1 är svåra att upptäcka i axonal region utanför pärlorna, eftersom dessa synaptiska vesikulär proteiner ackumuleras så mycket under pärlorna. När det gäller Munc18-1, kan fluorescerande signaler detekteras svagt i axonal region utanför pärlorna.

För att kvantifiera ackumuleringsnivå av synaptiska proteiner i presynapser inducerade av LRRTM2-pärlor, mättes fluorescerande intensiteter av axoner under pärlorna och utanför pärlorna, och sedan beräknas som "protein ackumulations index" (figur 4a, och beskrivs i avsnittet protokoll i detalj). Experiment med tidsförlopp visade att ackumulering av vGlut1 i presynapser ökade signifikant vid 30 min (figur 4b). Å andra sidan, Munc18-1 ackumulering började öka betydligt vid 2 h, och nå en platå på 4 h (figur 4c). Dessa data tyder på att det synaptiska vesikelproteinet vGlut1 ackumuleras i presynapser tidigare än det aktiva zon proteinet Munc18-1. Den Munc18-1 ackumulering i presynapser av Fmr1-Ko nervceller ökade 1,5 gånger mer än de i VILDTYP (WT) (figur 4c), vilket tyder på inblandning av fmrp i Munc18-1 ackumulering. Därefter, för att särskilja Munc18-1 ackumulering på grund av transport från cell kroppar eller lokal översättning i axoner, en effekt av proteinet syntes hämmare anisomycin undersöktes på ackumulering i närvaro eller frånvaro av cell kroppar (figur 4D) . Anisomycin undertryckte Munc18-1 ackumulering signifikant i axoner (figur 4D), vilket indikerar att ackumulationen är proteinsyntes-beroende. Ackumulering i presynapser av axoner utan cell kroppar var inte signifikant annorlunda än med cell kroppar (figur 4D). Dessa resultat tyder på att ackumulering av Munc18-1 i presynapser härleds mestadels från axoner, men inte transport av Munc18-1 från cell kroppar. Om ackumulering av synaptiska proteiner dämpas i presynapser av axoner genom att ta bort cell kroppar, det anses att denna minskning beror på transport från cell kroppar. Faktiskt, när vi undersökte ackumuleringen av den totala nysyntetiserade proteiner metaboliskt märkt av fluorescerande färg, ta bort cell kroppar minskat betydligt ansamling av totala nyligen syntetiserade proteiner, jämfört med presynapser av axoner med cell kroppar8. Även om Munc18-1 ackumulering i Fmr1-Ko ökade mer jämfört med WT, anisomycin undertryckt ackumulering i liknande nivå som WT och ta bort cell kroppar hade ingen effekt på ackumulering (figur 4D). Dessa resultat tyder på att FMRP är involverad i lokal översättning av Munc18-1 i axoner.

Representativa resultat som presenteras här visar att denna metod är lämplig för att undersöka hur synaptiska proteiner ackumuleras på ett organiserat sätt av tid kurs experiment, och att undersöka källan till synaptiska proteiner (transport från cell kroppar eller lokala Översättning i axoner) genom att ta bort cell kroppar.

Figure 1
Figur 1. System av presynapse bildandet och avlägsnande av cell kroppar från neuron bollen.
(A) presynapse formation assay med hjälp av en LRRTM2 konjugerat konjugerat pärlor att inducera presynapserna i axoner av neuron boll kultur beredd från E16 cortices. LRRTM2, en postsynaptisk protein, binder neurexin (NRXN) och fungera som en presynapse arrangör. Streptavidin pärlor konjugerat till en LRRTM2 extracellulära regioner (LRRTM2 pärlor) tillämpades vid DIV11-12 till neuron boll kultur för att inducera presynapser. Denna siffra har modifierats från tidigare publikation8. (B) den gula spetsen änden var skuren och placeras på cellkroppen området neuron boll kultur vid 45 ° vinkel. Cellen förkroppsligar togs bort av sugning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Munc18-1 ackumulering i presynapser i närvaro och frånvaro av cell kroppar av neuron bollen.
(A) efter 4 h INKUBERING med LRRTM2 pärlor, den aktiva zonen protein Munc18-1 ackumuleras vid de inducerade presynaptiska platserna i axoner (övre panelen; försöksplan, mitten; fas bild, lägre; OM bilder av Munc18-1 ackumulering). Bilder fångades som låg förstoring bilder med 10X objektiv och mellanliggande förstoring (1.5 X) för att se hela bilden består av en neuron boll, axoner och pärlor. Streckade rutor indikerar området för neuron bollen för exakt avbildning position pärlor. Skalstapel, 20 μm (vänster; ursprunglig bild), 10 μm (höger; förstorad bild). (B) Munc18-1 ackumulerade mycket väl även i avsaknad av cell kroppar vid inducerade presynaptiska platser i axoner. Detta resultat indikerar att axoner kan överleva och bilda presynapser även efter att ha avlägsnat cell kroppar i minst 4 h. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Ackumulering av vGlut1 och Munc18-1 i presynapser av axoner med och utan cell kroppar.
Den excitatoriska presynaptiska markören vGlut1 (grön) och Munc18-1 (röd) ackumuleras i presynapser 4 h efter tillsats av LRRTM2 pärlor. (Övre panelen; med cell kroppar, lägre; utan cell kroppar). Bilder fångades med 60X Oil Immersion lins för hög förstoring för att mäta fluorescerande intensitet. Streckad cirkel beskrivs placeringen av pärlor. Munc18-1 ackumulerade nästan liknande utsträckning i närvaro och frånvaro av cell kroppar i presynapser men vGlut1 ackumulering reduceras utan cell kroppar8. Skalstapel, 5 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Förfarande för om intensitet mätning och påverkan av cell kroppar avlägsnande och proteinsyntes inhibitor på Munc18-1 ackumulering i neuron bollar.
(A) diagrammet visade kvantifieringsmetoden för om intensitet vid en inducerad presynaptisk plats i Axon av neuron boll kultur. Skalbar, 5 μm. Detaljerna beskrivs i avsnittet protokoll. (B) tidsförlopp för vGlut1 ackumulering i presynapser induceras med LRRTM2 pärlor. Data som visas är medelvärdet ± SEM för n = 20. Tvåvägsanova med Tukey ' s multipeljämförelse test. * *p < 0,01. (C) tidsförlopp för Munc18-1 ackumulering i WT och Fmr1-Ko PRESYNAPSES under LRRTM2 pärlor. Data som visas är medelvärdet ± SEM för n = 20, Tvåvägsanova med Tukey ' s multipeljämförelse test. NS, inte signifikant; * *p < 0,01, skiljer mellan WT och Ko. (D) stapeldiagrammet visade Munc18-1 ackumuleringsnivå i presynapser av WT och Fmr1-Ko neuron bollar i närvaro eller frånvaro av 25 μm Anisomycin (aniso) med (CB +) eller utan (CB-) cell kroppar. Data som visas är medelvärdet ± SEM för n = 20. Tvåvägsanova med Tukey ' s multipeljämförelse test. * *p < 0,01, ns, inte signifikant. # indicerat p < 0,01, signifikant annorlunda med och utan anisomycin. Dessa siffror har ändrats från tidigare publikation8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1. Bicystronic Expression Vector för LRRTM2-ECR (extracellulära regionen) och BirA (biotin Ligase från E. coli ).
Mellan LRRTM2-ECR och BirA Coding sekvenser, det finns en intern ribosomal inträde webbplats (IRES) sekvens som gör det möjligt att co-Express båda proteiner från enstaka mRNA. hEF1-HTLV promotor driver uttryck den bicstronic mRNA, och båda proteinerna utsöndras av signalpeptidsekvenser efter översättning. LRRTM2-ECR kodning sekvens är ansluten till flera peptid tagg sekvenser (DYKDDDDK, TEV, MYC och hans taggar) och biotin acceptor sekvens (BAS). BirA är anslutet till DYKDDDDV-taggen. Utsöndras BirA biotinylates lysin av BAS sekvens av LRRRTM2-ECR att binda till streptavidine pärlor. Vänligen klicka här för att ladda ner figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi utvecklade ny metod för att undersöka presynapse formation stimuleras med LRRTM2-pärlor med hjälp av neuron boll kultur. För närvarande, de flesta av presynapse formation assay innehåller Poly-D-lysin (PDL)-belagda pärlor och dissocierade kultur/microfluidic kammare20,21,22. En av fördelarna med denna metod är LRRTM2-pärlor. Medan LRRTM2 interagerar med neurexin att bilda excitatoriska presynapser specifikt11,12,13, PDL-pärlor inducerar både excitatoriska och hämmande presynapser nonspecifikt20. I denna metod, andra presynapse arrangörer, vars medlemmar är över 10 proteiner3, är tillämpliga för att inducera presynapser genom att ändra extracellulära domänen av en protein beroende på experimentellt ändamål.

En annan fördel är neuron Ball Culture. I vissa fall, konventionell dissocierad kultur användes för att analysera presynapse formation20. Men dissocierad kultur är inte lämplig för att analysera låga nivåer av synaptiska proteiner inom presynapser, eftersom överväldigande signaler i cell kroppar och dendriter störa signaler i presynapser. I stället använder vissa grupper separerad kultur i mikroflödessystem kammare som är speciell apparat för kultur axoner och cell kroppar separat i 2 comprtments21,22. Med hjälp av mikroflödessystem kammare bildas axonal ark i axonal facket, och cell kroppar kan avlägsnas från cellkroppen fack, liknande neuron boll kultur. Men mikroflödessystem kammare är speciell apparat, och kräver vissa färdigheter för att upprätthålla konstant odlingstillstånd. Neuron Ball kultur är inte nödvändigt att använda speciella apparater, och är relativt lätt att introduceras som en ny experimentell metod. Eftersom kärnan i neuron boll kulturen är bara att placera neuronala cell aggregat (neuron bollar) till glasbotten skålen/kammare, kan det lätt kombineras med andra metoder. Till exempel, det anses att neuron boll kultur med LRRTM2-pärlor är tillämplig för hög innehåll screening för att mäta fluorescens av 10-20 pärlor område på samma gång.

Kritiskt steg i detta protokoll är beläggning med PLL. Om PLL beläggning inte är enhetlig, axoner av neuron bollar skulle inte förlänga enhetligt i alla riktningar. Detta stör effektiv analys av presynapse formation. Vi använder glas täckband och glas-botten rätter, dock är glas ibland inte så ren för neuronala kultur och enhetlig beläggning med PLL. I detta protokoll, till en början, glas täckband och glas-botten rätter blötläggas i neutrala icke-fosforhaltiga tvättmedel för 1-3 över natten, och sedan tvättas 8 gånger med ultrarent vatten. Vi använder PLL vars molekylvikt > 300 000 för att minska dess koncentration (15 μg/mL) för lägre oönskad bakgrund. Om den lägre molekylvikten för PLL (t. ex. 30000-70000) används, är högre koncentration (100 μg/ml) nödvändig för att förlänga axonerna.

Begränsning av denna metod är att neuron Ball kultur inte kan upprätthålla > DIV15-16. Axoner av neuron bollar är fragmenterad efter DIV15-16. Fragmenterade axoner producerar inte någon presynapse efter LRRTM2 pärlor ansökan. Sålunda, denna metod är inte tillämplig för att analysera mogna neuroner (> DIV21). Emellertid, i de flesta fall11,12,21,22, presynapse formation assay använder yngre nervceller som odlas tills DIV14. En annan begränsning är att axoner utan cell kroppar inte kan överleva över 4 timmar. Vi analyserade ackumulering av 5 synaptiska proteiner i presynapser hittills, ansamling av alla proteiner vi kollade nådde nästan platå inom 4 h (opublicerade observation). Det anses att synaptiska proteiner ackumuleras tillräckligt vid 4 h för att analysera var synaptiska proteiner härleds från (cellkroppen eller Axon).

Kombinationen av neuron Ball kultur med LRRTM2-pärlor är relativt enkel och flexibel att anpassa många experimentella plattformar. Vi har redan tillämpat denna metod för att mäta presynaptisk aktivitet med hjälp av AM1-43 Dye (opublicerad observation). Denna metod anses vara tillämplig för screening av hög genomströmning. Presynapse formation assay är möjligt att tillämpa hög innehåll screening genom färgning synaptiska proteiner i presynapser bildas under LRRTM2-pärlor. Denna metod skulle bidra till att hitta nya föreningar för att bota neurologiska sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds delvis av JSPS Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning (KAKENHI) (C) (nr 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Vi tackar Dr terukazu Nogi och MS Makiko neyazaki (Yokohama City University) för vänligt tillhandahållande en LRRTM2 protein. Vi tackar även Honami Uechi och Rie Ishii för teknisk assistans.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent DAKO S2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-545-152
mouse anti-Munc18-1 BD Biosciences 610336
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA) Nacalai Tesque 01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) Nunc 176740
Complete EDTA-free Roche 11873580001
cooled CCD camera Andor Technology iXON3
Coverslip Matsunami C015001 Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Nacalai Tesque 11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I) Wako pure chemicals 047-26771
Expi293 Expression System Thermo Fisher Scientific A14635
Horse serum Sigma-Aldrich H1270
image acquisition software Nikon NIS-element AR
Image analysis software NIH Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscope Nikon Eclipse Ti-E
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Neurobasal media Thermo Fisher Scientific #21103-049
Normal Goat Serum (NGS) Thermo Fisher Scientific #143-06561
N-propyl gallate Nacalai Tesque 29303-92
Paraformaldehyde (PFA) Nacalai Tesque 26126-25

Paraplast Plus
Sigma-Aldrich P3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) Nacalai Tesque 28359-54
poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
Prepacked Disposable PD-10 Columns GE healthcare 17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 Synaptic Systems 135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) Nacalai Tesque 41506-04
Streptavidin-coated magnetic particles Spherotech Inc SVM-40-10 diameter: 4-5 µm
TritonX-100 Nacalai Tesque 35501-15
Trypsin Nacalai Tesque 18172-94

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28, (1), 251-274 (2005).
  2. Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5, (5), 385-399 (2004).
  3. Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203, (1), 11-22 (2013).
  4. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455, (7215), 903-911 (2008).
  5. Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53, (8), 1441-1449 (2012).
  6. Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27, (1), 57-69 (2000).
  7. Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, (6), 1507-1520 (2004).
  8. Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. (2018).
  9. Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30, (28), 9349-9358 (2010).
  10. Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74, (3), 397-406 (2014).
  11. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61, (5), 734-749 (2009).
  12. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64, (6), 799-806 (2009).
  13. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64, (6), 791-798 (2009).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1, (5), 2406-2415 (2006).
  15. Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. (2017).
  16. Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286, (40), 35247-35256 (2011).
  17. Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60, (2), 201-214 (2008).
  18. Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16, (11), 1530-1536 (2013).
  19. Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16, (10), 595-605 (2015).
  20. Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29, (40), 12449-12466 (2009).
  21. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33, (13), 5584-5589 (2013).
  22. Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20, (13), 3085-3098 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics