活细胞荧光显微镜研究细菌的亚细胞蛋白定位和细胞形态变化

Immunology and Infection

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Summary

本文提供了一个分步指南,以研究蛋白质亚细胞定位动力学,并使用高分辨率荧光显微镜监测葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的形态变化。

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Brzozowski, R. S., White, M. L., Eswara, P. J. Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria. J. Vis. Exp. (153), e59905, doi:10.3791/59905 (2019).

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Abstract

对影响细菌细胞分裂和细胞形状的因素的调查通常与高分辨率荧光显微镜一起进行,因为在总体水平上进行的观察可能无法真正反映单个细胞水平上发生的情况。活细胞延时显微镜使研究人员能够监测细胞分裂或细胞形态的变化,从而提供有关蛋白质亚细胞定位和基因表达时间的宝贵见解,从而有可能有助于回答重要的生物学问题。在这里,我们描述了使用高分辨率去卷积显微镜监测亚基利杆菌和金黄色葡萄球菌的形态变化的协议。本报告的目的是提供一个简单明了的协议,可以由有兴趣进行荧光显微镜实验的其他研究人员采用,以研究细菌和其他生物体的不同生物过程。

Introduction

最近显微镜技术1,2的进步,大大加强了细菌细胞生物学领域。在其他仪器中,能够进行延时荧光显微镜实验的显微镜仍然是一种宝贵的工具。研究者可以使用荧光蛋白实时监测各种生理事件,如绿色荧光蛋白(GFP)基转录和翻译报告器融合、荧光D-氨基酸(FDAA)3,或者使用其他污渍标记细胞壁、膜和DNA。因此,荧光显微镜在微生物细胞生物学家中仍然很受欢迎也就不足为奇了。除了简单地显示末端表型,提供有关观察到的表型如何产生的信息使用延时显微镜可以增加重大价值的发现,并可能提供线索,什么细胞过程是潜在的药物候选者的目标4

本文提供了使用全电动、倒置广域荧光显微镜进行高分辨率成像的协议(参见材料表)。这些方案可以适应其他荧光显微镜的需求,这些显微镜能够进行延时显微镜检查。虽然这里讨论的软件对应于材料表中所示的特定制造商提供的软件,但其他显微镜制造商通常提供的软件或免费提供的 ImageJ5具有用于分析显微镜数据的等效工具。对于时间推移不利于的条件,可以进行时间过程实验,如本文所述。此处描述的协议为研究两种不同细菌物种的树型变化提供了详细的指南:B. subtilisS. aureus。有关使用的菌株,请参阅表 1。

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Protocol

1. 一般增长条件

  1. 用抗生素(必要时)补充2 mL的适当生长介质,并结合要成像的菌株单一菌群。在摇动的培养箱中,在22°C中孵育这些种子培养物过夜。
    注:本文中使用的特定细菌生长条件在代表性结果部分下提供。
  2. 在125 mL瓶中稀释新鲜介质中的过夜培养物1:20,补充抗生素(如果需要)。
  3. 在摇动的培养箱中生长37°C的培养基,直到中对数阶段(OD600 = 0.5)。
    注:诱导剂或抑制剂可在适当的生长阶段直接添加到生长培养中。
  4. 如下一节所述,在所需的培养条件下收获细胞进行显微镜样品制备。

2. 样品制备

  1. 通过结合0.25克的分子生物学等级,低EEO,Agarose与25 mL的生长介质,并辅之以适当的抗生素(如果需要),用于延时显微镜或无菌水,制备1%的甘蔗。用微波炉加热混合物约30s,并将其倒入无菌的100 mm x 15 mm培养皿中,然后将其凝固。
  2. 根据细胞的需要和染色,对细胞培养进行5~50μL等分。在此阶段使用适当染料的染色细胞(例如,为实验添加荧光染料 FM4-64(膜染色)(图 1)。
    1. 将培养样品或染色样品的5μL等分移移至35毫米玻璃底培养盘的底部(微井直径为14毫米,未涂覆1.5号盖玻片;参见材料表)。
      注意:不要使用多L-莱辛涂层盖玻片,特别是用于延时显微镜,因为它们可能诱发不同的生长模式(我们已经观察到这一点与多D-莱辛;数据未显示)和/或影响蛋白质动力学6
    2. 为了尽量减少染料的使用,将3⁄4μL细胞悬浮液(在OD600 = 0.5时收获;大约2.7 x 107和3.4 x 107分别用于B.subtilis和S.aureus,每1mL培养基)。
    3. 将预切的Agarose板(直径为11毫米或任何所需尺寸,以重叠盖玻片的面积;使用无菌管或剃刀刀的开端切割)放在样品顶部,轻轻敲击,确保加玫瑰板平放在盖玻片上。
  3. 在成像之后(见下节),如果视野中的细胞数量不理想,则通过离心稀释或集中调整样品的细胞密度,并在必要时使用生长介质/缓冲液改变样品中细胞的比例。
    注:为了尽量减少培养基培养基产生的自荧光,可以在缓冲液中洗涤细胞(例如,在标准1x磷酸盐缓冲盐中),并在成像前在适当量的缓冲液中重新悬浮。在这一步中,较小的细胞或囊泡可能在离心后无法保留,因此会丢失。
  4. 使用移液器(±5 μL滴)向培养皿内的空间(盖玻片周围)加水,以防止甘蔗垫干燥,并帮助在图像采集过程中保持湿度,尤其是用于延时实验。
  5. 允许培养皿与孵化室内的温度平衡,孵化室是制造商提供的内置不透明隔间,显微镜为15-20分钟。
    注:打开加热元件,在成像前几个小时将孵育室设置为所需温度。这将确保硬件稳定到新的温度。对于长时间延时成像,在显微镜室内放置一个装有水的烧杯或烧瓶,远离工作区域,以保持湿度。

3. 成像

  1. 在实验当天,打开显微镜系统。单击桌面上的相应图标启动成像软件(参见材料表)。单击软件启动对话框上的"初始化显微镜"选项(带有显微镜的按钮)初始化显微镜。在初始化之前,使用显微镜进行粗调,确保目标完全降低。
    注: 初始化后,除了开始菜单之外,还应显示三个附加对话框:解析3D、数据收集和筛选器监视器。
  2. 在制造商提供的 100x 油浸物上放置 1.517(折射率)油(数字孔径 = 1.4,工作距离 = 0.12 mm;参见材料表)。
    注:对于进行成像时的温度,选择适当的浸入油非常重要。
  3. 将含有样品的玻璃底盘装入金属壳体(棺材),然后轻轻滑入舞台夹中。
  4. 使用粗调节旋钮提高目标,直到机油与盘的玻璃底部接触。使用眼片和精细调节旋钮使样品聚焦。一旦细胞处于对焦状态,通过将位于显微镜主体前部的选择开关向左移动,将旋钮从眼片转向相机模式。
  5. 使用成像软件开始实验。在Resolve3D窗口中,选择烧瓶显示的设计/运行实验图标。应出现一个名为"设计/运行实验"的新对话框。
    1. 使用设计(然后对设计/运行实验对话框)进行剖切选项卡设置 Z 堆栈数和样本厚度。
      注:在代表性结果部分的实验中,使用17个Z堆栈,以200nm间隔进行静止图像,在200nm间隔使用4个Z堆栈进行延时显微镜。
    2. 要测量样本中单元格的厚度,请使用解析3D对话框上的向上和向下箭头手动调整 Z 平面。将单元格失焦的位置标记为图像采集的上限和下限。在运行实验之前导入此信息。
    3. 为了帮助在延时成像期间最大限度地减少光毒性和光漂白,请减少 Z 堆栈的数量,并选择细胞的中平面进行图像采集。
  6. 使用设计为实验选择适当的筛选器集,然后在设计/运行实验对话框(TRITC: EX 542/27;EM 597/45;FITC/GFP: EX 475/28;EM 525/48;mCherry: EX 575/25;EM 632/60;Cy5: EX 632/22;EM 676/34)。
    1. 此外,选择用于收集 POL/DIC 信息的参考。通过在解析3D对话框上选择适当的选项,调整成像前选定的单个通道的传输百分比(光强度)和曝光持续时间。
      注: 在实验测试不考虑的测试视野中,这些设置用于识别所选参数是否获得有意义的荧光数据,而不会丢失弱信号或过度饱和。然后导入这些参数进行实验设置。
  7. 通过选择解析3D对话框上的"点"列表按钮打开点列表。应出现一个新的对话框,标题点列表。使用显微镜级控件查找适当的视场,并在点列表对话框中选择标记点选项,标记要在实验中使用的几个视场。
    注: 每次将显微镜重新聚焦在点列表中的点时,都必须选择替换点。这可以通过将显微镜聚焦在列表中的相应点上,然后选择替换点按钮来实现。重新聚焦时,不要触摸模拟粗/细调节旋钮,仅使用软件来调整焦点。
  8. 通过先选择设计,然后在设计/运行实验对话框上选择延时选项卡来设置延时参数。选择"延时"复选框。输入适当的延时参数,以延时图像/总时间。
  9. 通过首先选择设计,然后在设计/运行实验对话框上选项卡,从点列表中设置要成像的点。选择访问点列表选项,并输入要在文本框中以逗号或连字符分隔的点(如果是完整序列)。
  10. 在开始实验之前,请使用设计/运行对话框上的运行选项卡编辑文件名和文件位置。可以通过选择设置按钮、选择数据文件夹以及然后选择适当的文件夹或创建新文件夹来更改文件位置。通过在图像文件名文本框中输入新文件名来更改文件名。
  11. 通过选择开始实验对话框上的播放按钮开始实验。
    注:对于延时时间,使用 DIC 设置(以避免不必要的光漂白)持续检查整个实验中每个视场的焦点,并重新聚焦和更新点列表中的信息,因为单元格会随着时间的推移而离开焦点。

4. 图像处理

  1. 打开所需的原始 (R3D) 图像文件以生成图形。
    注: 可以使用映像软件的启动对话框上的数据文件夹按钮查找最近保存的文件。
  2. 运行去卷积程序,删除失焦荧光光7,8,以产生一个去向D3D图像文件。在启动对话框中选择流程选项卡,然后选择"去向"。将出现一个名为deonvolve的新对话框。
    1. 通过将相应的图像编号(位于每个图像文件的左上角)拖动到去卷积对话框上的输入来设置去卷积参数。在"去卷积"对话框中,选择更多选项按钮,并在处理后取消选择裁剪边框滚入复选框(否则图像不能叠加在相应的 DIC 文件上)。
    2. 单击"去卷积"对话框上的"执行它"按钮以去解原始图像文件。
      注: 可按软件制造商的指导手册指示,调整去卷积参数,以获得所需结果。
  3. 如有必要,在任何或所有波长(颜色)通道中执行手动背景噪声减法和亮度/对比度调整。为此,应选择去光图像文件上的对比度调整按钮。
  4. 首先选择D3D对话框顶部的文件选项,将图像另存为 TIFF 文件。然后选择"保存为 TIFF",标识并选择适当的 Z 堆栈(位于焦点内),选择或取消选择所需的筛选器集。
  5. 使用任何制造商提供的软件或免费可用的程序(如 ImageJ5)执行数据量化。
    1. 对于像元大小量化,单击相应 D3D 图像文件上的工具选项卡,然后选择测量距离选项。通过鼠标通过鼠标通过左键单击选择所需图像文件的起始点和终点来测量距离。
      注: 最好在单元格大小量化期间放大图像。
    2. 对于荧光信号量化,请使用相应 D3D 图像文件工具选项卡下方的数据检查器选项。
      注: 最好放大图像,在完成荧光信号量化时仅选择相关滤波器。
    3. 要量化荧光信号,绘制一个将柱/行选项设置为特定尺寸的框。选择具有要量化的信号的区域并记录该值。使用相同大小的框选择紧邻单元格外部的区域,测量背景信号。从从细胞内获得的荧光信号中记录的值中减去背景值。

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Representative Results

GpsB 表型
以前我们已经表明,Sa-GpsB是一种必需的蛋白质,因为使用反义RNA消耗GpsB会导致细胞解毒9。在这里,我们描述了如何使用本文中描述的延时显微镜协议来捕获各种细胞分裂表型的出现和蛋白质定位的变化。为此,S. aureus菌株 RB143 [SH1000 怀有 pEPSA5(空载体)] 和 GGS8 [SH1000 窝藏 pGG59(Pxyl-gpsB反义布猫) ] 之前报告的9,生长如下.菌株RB143和GGS8在2mL的试皮豆汤(TSB)中接种,在15 mL试管中补充5微克/mL氯霉素(氯),在22°C下孵育过夜,同时摇动。在125 mL烧瓶中稀释1:20在10 mL的新鲜TSB+氯中,在37°C下生长,摇动至中对数阶段(OD600 = 0.5)。诱导剂,1%木糖,被添加到培养基,以触发gpsB的反义RNA的表达,培养物又生长了3小时。 细胞随后被染色荧光染料FM4-64(膜染色),必要时,通过在显微镜盘上直接在5μL等分培养物上加入0.5μL的FM4-64,如协议所述。如图1和视频1所示,添加木糖诱导GGS8菌株导致"生病"细胞表型,如前9所述,而空载体控制(RB143)似乎类似于我们的对照-在没有诱导剂的情况下生长的细胞。

我们小组还报告说,S.aureus GpsB(Sa-GpsB)的过度生产破坏了B.subtilis9的细胞分裂。我们使用这种过度表达的表型作为示例来演示此处描述的协议。为此,使用了B.subtilis应变GG9(amyE::P超spank-gpsBSaspc;ftsAZ::ftsAZ-gfp_erm)9。荧光标记FtsZ的亚细胞定位,一种标记细胞分裂位点10,11的关键细胞分裂蛋白,用于监测细胞分裂状态。显微镜样本的制备情况如下。一个GG9的单个菌落在2mL Luria-Bertani(LB)介质中接种,并在22°C的孵化器摇床中孵育过夜。过夜培养物在10 mL的新鲜LB中为1:20,在37°C下生长,摇动至中对数阶段(OD600 = 0.5)。要成像的GG9细胞(5μL等量分)被放置在玻璃底部培养皿的底部,并覆盖着1%的甘蔗糖垫,用LB制成,辅以250μm(最终浓度)的二恶基β-D-1-硫拉球酸酯苷(IPTG),以诱导Sa-gpsB的表达(图2视频2)。延时显微镜和细胞长度定量执行,如协议部分所述。

对FtsZ的抑制
FtsZ是细胞分裂所必需的蛋白质,被认为是一个有吸引力的药物靶点,多个群体正在开发FtsZ抑制剂作为开发新抗生素的一种方式。FtsZ的定位模式或与之相关的蛋白质之一,如ZapA,可用作记者研究和/或识别新的抗菌化合物。我们使用此处提供的协议使用S. aureus RB197 [SH1000 预用 pRB42 (PCd-zapASa-gfp bla erm)]9B. subtilis PE92 (ftsAZ: :ftsAZ-gfp_erm13菌株来演示此方法。RB197和PE92菌株分别在TSB中生长(含有5微克/mL红霉素;和1.25μM CdCl2,诱导zapA-gfp的表达)和LB。在中对数阶段,在2μg/mL最终浓度下加入一种特征良好的FtSZ抑制剂PC19072314,并监测其对S.氨细胞和B.subtilis细胞的影响,在不同时间间隔使用显微镜(图3图4)。如协议部分所述,对S.aureus的细胞直径和B.subtilis的细胞长度进行了定量。

Figure 1
图1:显示病态表型的S.aureus细胞的高分辨率显微图。S. aureus菌株的荧光显微图,其中有一个空载体(左;RB143)或gpsBSa反义RNA的诱导副本(右;GGS8)在存在和不存在1%的木糖(诱导剂)。细胞沾有FM4-64膜污渍(在无菌水中溶解的库存),并使用TRITC滤芯进行成像。比例尺:1 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:显示B.subtilis细胞分裂抑制的代表性数据。A) 使用DIC/FITC通道以20分钟间隔采集的图像,以20分钟为120分钟采集的B.subtilis应变GG9的延时显微图。显示了 FtsZ-GFP(绿色)的荧光数据。在整个实验中,箭头跟随一个单元格。刻度条:1 μm. (B) 在所有时间点上对细胞长度进行量化。显示具有指示标准偏差 (n = 50) 的误差条的平均像元长度。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:S.aureus细胞分裂抑制的时间过程调查。A) 未经处理(顶部)或用FtsZ抑制剂(PC190723)处理的RB197菌株(顶部)或(底部)的中对数相细胞,在30分钟生长后,每10分钟采集一次生长培养物的等分,90分钟,并使用DIC和FITC滤波器进行成像。显示了来自 ZapA-GFP 的荧光。刻度条: 1 μm . (B) 显微镜数据的定量.显示平均单元格宽度,误差条指示标准偏差 (n = 50) 和显示正确 ZapA-GFP 定位(中单元和外围)的单元格百分比(n = 50)。使用抑制剂治疗的细胞的数据点以红色显示。具有绿色轮廓的形状对应于右侧的 Y 轴。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:B.subtilis中合成抑制剂细胞分裂抑制的调查。 B. subtilis菌株PE92在中对数阶段未经治疗或使用FtsZ抑制剂(PC190723)进行治疗,并监测随后的90分钟。显示了来自 FtsZ-GFP 的荧光。刻度条: 1 μm . (B) 显微镜数据的定量.显示平均电池长度,误差条指示标准偏差 (n = 50) 和显示正确中单元 FtsZ-GFP 定位的单元格百分比 (n = 50)。使用抑制剂治疗的细胞的数据点以红色显示。具有绿色轮廓的形状对应于右侧的 Y 轴。请点击此处查看此图的较大版本。

视频1:S.aureus细胞发育病态表型的延时显微镜。应变GGS8(gpsB反义)用1%的木糖处理。细胞被FM4-64膜染色,并使用协议中描述的TRITC通道以10分钟为间隔进行60分钟的成像。请点击此处下载此视频。

视频2:Sa-gpsB的过度表达导致B.subtilis细胞分裂的抑制。在 GG9 中显示 FtsZ-GFP 本地化中的丝丝和变化的延时视频。使用 DIC 和 FITC 通道以 20 分钟为间隔拍摄图像,间隔 120 分钟。请点击此处下载此视频。

物种 应变 基因 参考
S. 奥雷乌斯 RB143 SH1000 pEPSA5, Bla, 猫 Eswara等人,2018
S. 奥雷乌斯 GGS8 SH1000 pGG59 (pEPSA5 骨干) Pxyl-gpsB反义,bla, 猫 Eswara等人,2018
S. 奥雷乌斯 RB197 SH1000 pRB42 (pJB67 主干) PCd-zapASA-gfp, Bla, 猫 Eswara等人,2018
B. 子 GG9 amyE::P超斯潘克-gpsBSA spc;ftsAZ_ftsSAZ-gfp erm Eswara等人,2018
B. 子 PE92 ftsAZ::ftsAZ-gfp +erm 布尔佐佐夫斯基等人,2019

表1:使用的菌株。

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Discussion

显微镜一直是有关微生物的研究的支柱。鉴于其微米级细胞大小,单细胞水平研究传统上依赖于电子显微镜(EM)。虽然EM近年来已经成为一种非常强大的技术,但它除了有限的用户访问16之外,还有它自己的内在限制。荧光显微镜技术的改进和不同荧光探针(如FDAA3)的开发为微生物细胞生物学家提供了大量工具,用于研究活细胞中的各种细胞过程。研究人员还积极构建荧光工具来监测活细胞17、18的信号分子(如c-di-GMP等)的变化。此外,高分辨率延时荧光显微镜使研究人员能够监测变化,并研究相关的表型。

我们提供了详细的方案,以进行显微镜实验与高分辨率荧光显微镜(见材料表)。但是,协议中的步骤可以更改,以适应用户的需求和使用的显微镜。我们使用S. aureusB. subtilis作为模型生物体来展示如何监测各种细胞分裂表型、跟踪蛋白质定位的变化以及量化数据。此外,对于时间推移不利于的情况下,我们借助FtsZ抑制剂,展示如何设置时间课程实验。

荧光显微镜的固有局限性是衍射极限设定的分辨率,借助先进的超分辨率显微镜技术,可以在一定程度上克服。其他问题,如光毒性和光漂白,可以通过收集更少的Z堆栈或尽量减少暴露于激光的持续时间和/或频率来规避。其他特定于活细胞显微镜的指导材料有21。除了革兰氏阳性生物B.subtilis和S.aureus,利用这个设置,我们已经成功地成像了革兰氏阴性细菌大肠杆菌,酵母糖霉菌,和线虫卡埃诺哈布迪炎叶兰根。

除了此处描述的实验外,还可用于以高通量方式识别针对特定细胞过程的化合物。自动化量化过程的算法也可以合并为大型数据集22,23。研究不同的细菌物种以解决抗生素耐药性危机是十分必要的,需要进行更多的研究,以了解基本生物过程的机制,并确定新的治疗化合物。各种荧光显微镜技术已经获得了帮助研究人员应对这些挑战的力量和动力。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢我们的实验室成员对本文的评论。这项工作由南佛罗里达大学(PE)的启动赠款资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher BioReagents BP160-100 Molecular Biology Grade - Low EEO
DAPI Invitrogen D3571 Microscopy
FM4-64 Invitrogen T3166 Microscopy
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C Microscopy
IPTG Fisher BioReagents BP1755-10 Dioxane-free
Microscope GE DeltaVision Elite Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.
PC190723 MilliporeSigma 3445805MG FtsZ inhibitor
SoftWorx GE Manufacturer-supplied imaging software

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