पूर्व Vivo Oculomotor स्लाइस संस्कृति भ्रूण GFP से-समय के लिए चूहे को व्यक्त करने के लिए Oculomotor तंत्रिका आउटग्रोथ के समय-लैप इमेजिंग

Neuroscience

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Summary

एक पूर्व विवो टुकड़ा परख oculomotor तंत्रिका वृद्धि वास्तविक समय में छवि की जा करने के लिए अनुमति देता है। स्लाइस e10.5 IslMN embedding द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं: agarose में GFP भ्रूण, एक vibratome पर टुकड़ा, और एक मंच शीर्ष इनक्यूबेटर में बढ़ रही है. एक्सॉन मार्गदर्शन रास्ते की भूमिका संस्कृति मीडिया के लिए inhibitors जोड़कर मूल्यांकन किया है.

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Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

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Abstract

सटीक आंख आंदोलनों दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन नेत्र मोटर प्रणाली के विकास, विशेष रूप से आणविक रास्ते एक्सॉन मार्गदर्शन को नियंत्रित करने, पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है. यह आंशिक रूप से पारंपरिक एक्सॉन मार्गदर्शन assays की तकनीकी सीमाओं के कारण है. Oculomotor तंत्रिका को प्रभावित करने वाले अतिरिक्त एक्सॉन मार्गदर्शन संकेतों की पहचान करने के लिए, वास्तविक समय में ओकुलोमोटर तंत्रिका की छवि के लिए एक पूर्व विवो स्लाइस परख के रूप में यह आंख की ओर बढ़ता विकसित किया गया था। E10.5 Isl MN-GFP भ्रूण उन्हें agarose में embedding द्वारा पूर्व vivo स्लाइस उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है, एक vibratome पर slicing, तो उन्हें एक माइक्रोस्कोप चरण में बढ़ रहा है-शीर्ष इनक्यूबेटर के साथ समय चूक photomicroscopy के लिए 24-72 ज नियंत्रण स्लाइस recapitulate नाभिक से कक्षा तक एक्सॉन के वृद्धि के विवो समय में। छोटे अणु inhibitors या रिकॉमबिनेंट प्रोटीन संस्कृति मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है विभिन्न एक्सॉन मार्गदर्शन रास्ते की भूमिका का आकलन. इस विधि के स्थानीय microenvironment जिसके माध्यम से axons पार, नहीं बढ़ axons axtomizing, और उनके प्रक्षेप पथ के साथ कई बिंदुओं पर axons का आकलन के अधिक बनाए रखने के फायदे हैं. यह भी axons के विशिष्ट सबसेट पर प्रभाव की पहचान कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, CXCR4 के निषेध का कारण बनता है axons अभी भी midbrain के भीतर ventrally के बजाय dorsally बढ़ने के लिए, लेकिन axons कि पहले से ही ventrally से बाहर निकल चुके हैं प्रभावित नहीं कर रहे हैं.

Introduction

नेत्र मोटर प्रणाली एक्सॉन मार्गदर्शन तंत्र की जांच के लिए एक सुरुचिपूर्ण प्रणाली प्रदान करता है. यह अपेक्षाकृत सीधी है, जिसमें छह अतिरिक्त मांसपेशियों (ईओएम) को आंतरिक रूप से तीन कपाल तंत्रिकाएं शामिल होती हैं, जो आंख को स्थानांतरित करती हैं, और लेवेटर पैल्पे सुपीरियरिस (एलपीएस) जो पलक को उठाता है। ऑकुलोमोटर तंत्रिका एलपीएस और चार ईओएम को आंतरिक रूप देती है - अवर तिरछा और मध्यस्थ, अवर, और बेहतर आयटस की मांसपेशियों। अन्य दो नसों, trochlear और abducens, प्रत्येक केवल एक मांसपेशी innervate, बेहतर तिरछा और पार्श्व rectus मांसपेशियों, क्रमशः. नेत्र आंदोलनों एक आसान readout प्रदान करते हैं, दिखा अगर innervation उचित था, याद आ रही है, या aberant. इसके अतिरिक्त, मानव नेत्र आंदोलन विकार है कि न्यूरॉन विकास या एक्सॉन मार्गदर्शन में घाटे से परिणाम होते हैं, सामूहिक रूप से जन्मजात कपाल disinnervation विकारों (CCDs)1कहा जाता है.

इन लाभों के बावजूद नेत्र मोटर प्रणाली का प्रयोग एक्सॉन मार्गदर्शन अध्ययन2,3,4,5,6,7,8में बहुत कम होता है. 9 , 10, तकनीकी कमियों के कारण. इन विट्रो एक्सॉन मार्गदर्शन परख में कई नुकसान11हैं . सह-संस्कृति परख, जिसमें न्यूरोनल एक्सप्लांटलक्ष्य ऊतक12 या ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं13के एक्सप्लांट के साथ सुसंस्कृत होते हैं, एक्सप्लांट और लक्ष्य ऊतक के बीच दोनों समरूपता और सटीक स्थिति पर निर्भर करते हैं। धारी assays14,15, जिसमें दो संकेतों बारी धारियों और axons एक पट्टी पर अधिमानी विकास के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं में निर्धारित कर रहे हैं, केवल संकेत मिलता है कि एक सब्सट्रेट दूसरे के लिए बेहतर है, नहीं है कि या तो आकर्षक है या प्रतिकर्षण, या शारीरिक रूप से प्रासंगिक. Microfluidics कक्षों सटीक रासायनिक ढाल फार्म कर सकते हैं, लेकिन तनाव कतरनी के लिए बढ़ axons विषय16,17,18, जो उनके विकास को प्रभावित कर सकते हैं. इसके अलावा, इन दृष्टिकोणों में से प्रत्येक में, explants या अलग कोशिकाओं का संग्रह की आवश्यकता है कि outgrowing axons axotomized हो और इस प्रकार इन assays वास्तव में axon पुनर्जनन की जांच, बजाय प्रारंभिक एक्सॉन वृद्धि. अंत में, इन इन इन विट्रो दृष्टिकोण microenvironment कि axons और उनके पाठ्यक्रम के विभिन्न बिंदुओं के साथ संकेतों को अपनी प्रतिक्रियाओं को प्रभावित दूर, और परंपरागत रूप से केवल अलगाव में एक क्यू परीक्षण. इन नुकसान को जटिल, नेत्र मोटर प्रणाली में प्रत्येक नाभिक के छोटे आकार विच्छेदन या तो explants या dissociated संस्कृतियों के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बनाता है. इसके अतिरिक्त, नेत्र मोटर न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृतियों आमतौर पर विषम हैं, महत्वपूर्ण सेल मौत है, और घनत्व पर निर्भर हैं, कई भ्रूण से कोशिकाओं के पूलिंग की आवश्यकता होती है (Ryosuki फ़ूजी, व्यक्तिगत संचार). vivo तरीकों में, तथापि, नॉकआउट माउस मॉडल सहित, स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए अनुचित हैं, समय और खर्च की आवश्यकता दी.

संस्कृति के लिए विकसित तरीके पूरे भ्रूण19 पलायन कोशिकाओं की लेबलिंग की अनुमति20 या विशिष्ट अणुओं की नाकाबंदी21, लेकिन पूरे भ्रूण संस्कृतियों रोलर बोतलों में ऊष्मायन की आवश्यकता होती है जो लेबल की वास्तविक समय इमेजिंग precludes संरचनाओं. सर्जिकल तकनीक है कि भ्रूण के हेरफेर की अनुमति है और फिर बाद में आगे के विकास या तो गर्भाशय में या माँ के पेट में (प्लेसेंटल कनेक्शन बनाए रखने)22 भी संभव है, लेकिन ये भी समय चूक की अनुमति नहीं है इमेजिंग.

इन विट्रो परख की बाधाओं को दूर करने और संकेतन रास्ते की तेजी से स्क्रीनिंग की अनुमति देने के लिए , एक पूर्व विवो भ्रूण ीय संस्कृति तकनीक विकसित की गई थी23, परिधीय तंत्रिका वृद्धि के लिए एक पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल से अनुकूलित24. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, विकासशील oculomotor तंत्रिका अपने पथ के साथ आसपास के संरचनाओं के कई की उपस्थिति में समय के साथ छवि की जा सकती है, EOM लक्ष्यों सहित. संस्कृति मीडिया के लिए छोटे अणु अवरोधकों, विकास कारकों, या मार्गदर्शन संकेतों को जोड़कर, हम एक्सॉन पथ के साथ कई बिंदुओं पर मार्गदर्शन क्षोभ का आकलन कर सकते हैं, संभावित विकास और मार्गदर्शन कारकों के अधिक तेजी से मूल्यांकन की अनुमति देता है।

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Protocol

सभी पशु यहाँ वर्णित काम को मंजूरी दे दी और बोस्टन बच्चों के अस्पताल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACU) प्रोटोकॉल के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया था.

1. समय पर संभोग

  1. जगह आईएसएल MN:GFP (Islet मोटर न्यूरॉन ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एमजीआई: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J स्टॉक No: 017952) पुरुष और मादा चूहों एक साथ रात भर. संभोग से पहले महिलाओं का वजन और रिकॉर्ड वजन।
    नोट: आईएसएल MN:GFP विशेष रूप से एक farnesylated GFP कि cytotoxic नहीं है के साथ मोटर न्यूरॉन्स लेबल, मोटर न्यूरॉन्स और उनके axons की कोशिका झिल्ली को localizes, और नसों के विकास के दौरान कल्पना की जा करने के लिए अनुमति देता है25. अन्य फ्लोरोसेंट लेबल लाइनों भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. सुबह में योनि प्लग के लिए जाँच करें. तारीख एक प्लग की पहचान की है E0.5 के रूप में नामित किया गया है.
  3. E10.5 पर वजन बढ़ाने और/या अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर गर्भावस्था की पुष्टि करें। गर्भवती बांधों में कम से कम 1 ग्राम भ्रूण E10.5 पर अल्ट्रासाउंड पर देखा जा सकता है प्राप्त किया जाना चाहिए.

2. टुकड़ा संस्कृति के लिए अभिकर्मकों और vibratome की तैयारी

  1. 500 एमएल टुकड़ा करने के बफर तैयार करें: के के बिना 5 एमएल HEPES और 5 एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन को हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के 500 एमएल में जोड़ें, बिना कै2+ और एमजी2+।  4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा।
    नोट: अतिरिक्त टुकड़ा करने बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और भविष्य टुकड़ा संस्कृति प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. संस्कृति मीडिया के 50 एमएल तैयार करें: एक बाँझ हुड में, एचबीएसएएस के 12.5 एमएल, भ्रूण बोवाइन सीरम के 12.5 एमएल, ग्लूकोज के 250 एमएल, एल-ग्लूटामाइन का 250 डिग्री एल, 125 एचईपी के 24.4 एमएल को फ्लोरोराइट डीएमईएम में जोड़ें। (अंतिम सांद्रता: 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% ग्लूकोज, 1 एमएम glutamine, और 2.5 m HEPES के साथ FlouroBright DMEM.).  एक बाँझ पानी स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए संस्कृति मीडिया गर्म.
    नोट: संस्कृति मीडिया अप करने के लिए 3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    1. एक बाँझ हुड में, एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति मीडिया के 1.5 एमएल जोड़ें.  प्रत्येक वेल में सेल कल्चर डालने( सामग्री कीतालिका) डालें।  एक बाँझ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  3. 4% कम पिघल तापमान agarose तैयार करें: बाँझ पीबीएस के 50 एमएल में कम पिघल तापमान agarose के 2 ग्राम भंग। पूरी तरह से भंग जब तक 30-60 के अंतराल में माइक्रोवेव. तरल रखने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
    नोट: अतिरिक्त agarose कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत किया जा सकता है और भविष्य टुकड़ा संस्कृति प्रयोगों के लिए पिघल.
  4. vibratome सेट करें: vibratome पर एक नया ब्लेड रखें. सेटिंग्स की जाँच करें: मोटाई 400-450 $m. पूर्व शांत vibratome चरण. बाहरी कक्ष में कुछ बर्फ रखें। स्लाइस जीने के लिए समर्पित एक कक्ष और मंच का उपयोग करें। अवशिष्ट fixative स्लाइस के लिए हानिकारक हो सकता है के रूप में निश्चित ऊतक के लिए एक ही vibratome कक्ष का उपयोग न करें.
  5. माइक्रोस्कोप चरण शीर्ष इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2 तैयारकरें।
  6. विच्छेदन के लिए तैयार: स्वच्छ शल्य चिकित्सा उपकरणों और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे। HBSS के साथ दो पेट्री व्यंजन भरें, बर्फ पर जगह है. एक 12 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट खोलें और नीचे का सामना करना पड़ के साथ बर्फ पर ढक्कन जगह है. एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट खोलें और सेल संस्कृति झिल्ली सम्मिलित करता है और प्रत्येक अच्छी तरह से 1.5 एमएल सेल संस्कृति मीडिया जगह है. एक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेट को पूर्व गर्म करें।

3. कटाई E10.5 भ्रूण और स्लाइस की तैयारी

नोट: इस बिंदु से सभी चरणों के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए. भ्रूण को हर समय बर्फ पर रखें।

  1. एक सीओ2 कक्ष में गर्भवती बांध (E10.5) की इच्छा। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं.
  2. 70% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे. कट कैंची के साथ पेट को खोलने के लिए, गर्भाशय को हटाने और बर्फ ठंड HBSS के साथ एक पेट्री डिश में जगह जल्दी से दूर खून धोने के लिए. एक दूसरे पेट्री डिश बर्फ ठंड HBSS से भरा करने के लिए धोया गर्भाशय ले जाएँ।
  3. विच्छेदन के दायरे के तहत, गर्भाशय सींग और व्यक्तिगत amniotic थैली से भ्रूण को हटा दें। भ्रूण को 12 अच्छी प्लेट के ढक्कन के नीचे रखें। बर्फ पर रखें.
  4. विच्छेदन क्षेत्र के तहत, प्रत्येक भ्रूण के आसपास के किसी भी तरल को हटाने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें।
    नोट: भ्रूण फिल्टर कागज के लिए रहना होगा अगर छुआ.
  5. अगारोस में भ्रूण ों को एम्बेड करें। इसे कवर करने के लिए प्रत्येक भ्रूण पर पिघला हुआ agarose डालो. बर्फ पर रखें. जैसे ही agarose कठोर है, प्रत्येक भ्रूण फ्लिप और दूसरी तरफ अतिरिक्त agarose डालना. बर्फ पर रखें.
  6. एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन गुंजाइश का उपयोग करना, प्रत्येक भ्रूण के आसपास agarose ट्रिम तो यह ठीक से उन्मुख हो जाएगा जब vibratome चरण से चिपके. ऑक्यूलोमोटर नाभिक और प्रारंभिक एक्सॉन वृद्धि फ्लोरोसेंट हैं। भ्रूण को संरेखित करें ताकि नाभिक, बढ़ते एक्सॉन, और आंख एक रेखा बनाते हैं, और इस रेखा के समानांतर एक उस्तरा ब्लेड कट के साथ agarose ट्रिम करें (भ्रूण के लिए पृष्ठीय, चित्र 1देखें)।
    नोट: यह पक्ष vibratome चरण से चिपके हो जाएगा (भ्रूण अपनी पीठ पर तैनात किया जाएगा, vibratome ब्लेड के लिए निकटतम सिर). नेत्रप्रेरक नाभिक और आंख के बीच की रेखा वाइब्रेटोम ब्लेड के समानांतर होनी चाहिए।
  7. बर्फ ठंडा टुकड़ा बफर के साथ vibratome कक्ष भरें. भ्रूण को वाइब्रटोम चरण में सुपरग्लू करें ताकि ब्लेड ऑकुलोमोटर नाभिक और आंखों के साथ समानांतर हो। एक बार superglue सूखा है, vibratome चरण डूब तो भ्रूण ब्लेड से दूर का सामना करना पड़ उन्मुख है.
  8. स्लाइस 400-450 $m स्लाइस.  एक बाँझ हस्तांतरण pipet के साथ प्रत्येक टुकड़ा ले लीजिए. ठंडे टुकड़ा करने वाले बफर में रखें।
  9. विच्छेदन क्षेत्र के तहत, oculomotor नाभिक और आंखों युक्त टुकड़ा का चयन करें. एक बाँझ हस्तांतरण पाइप का उपयोग करना, यह सेल संस्कृति पर जगह 6 अच्छी तरह से थाली में डालने. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर लौटाएं। वैकल्पिक रूप से, एक व्यक्ति टुकड़ा और एक और स्लाइस रखने है. टुकड़ा करने और इनक्यूबेटर में रखने के बीच के समय को कम करें।
    नोट: स्लाइस एक तरीका है कि अधिकतम फ्लोरोसेंट नाभिक और axons से उत्सर्जित में उन्मुख होना चाहिए इमेजिंग माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए निकटतम है. एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर, स्लाइस प्लेट के नीचे उद्देश्य के लिए निकटतम नाभिक और एक्सॉन के साथ झिल्ली पर रखा जाना चाहिए।
  10. vibratome चरण से अवशिष्ट agarose निकालें, मंच के लिए अगले भ्रूण superglue और कदम दोहराने 3.7-3.9 जब तक सभी भ्रूण कटा हुआ है और चढ़ाया गया है.
  11. एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र बनाने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया के लिए पसंद के अवरोधक या पुनः संयोजक अणु जोड़ें.  उचित विलायक में पतला.
    नोट: यदि DMSO का उपयोग कर, केवल ऊतक संस्कृति ग्रेड DMSO का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन-एल्किंग मोती टुकड़ा पर विशिष्ट स्थानों में रखा जा सकता है.
  12. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2 कक्ष में सूक्ष्मदर्शी पर रखें।  प्रत्येक टुकड़ा हर 30 मिनट (या अधिक बार अगर वांछित) के चरण इसके विपरीत और फ्लोरोसेंट तस्वीरें लेने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें। स्लाइस 48-72 एच के लिए बनाए रखा जा सकता है।

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Representative Results

सामान्य परिणाम: चित्र 1 प्रयोग का एक योजनाबद्ध प्रदान करता है. माउस में E9.5 के रूप में शुरू, पहले axons oculomotor नाभिक26से उभरने लगते हैं. E10.5 तक, एक फासीक्यूराटेड ऑकुलोमोटर तंत्रिका, जिसमें प्रारंभिक अग्रणी न्यूरॉन्स होते हैं, मेसेन्काइम में देखा जा सकता है। वहाँ E10.5 में भ्रूण के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता है (यहां तक कि एक ही कूड़े के भीतर) में कितनी दूर तंत्रिका कक्षा की ओर प्रगति की है, कुछ ही घंटों के विकास के मतभेद के कारण होने की संभावना. यूटेरो विकास में सामान्य के दौरान, पहले GFP सकारात्मक oculomotor axons अगले 18-24 एच (E11.5 द्वारा) पर कक्षा / स्लाइस संस्कृति में, इस समय recapitulated है (चित्र 2,वीडियो 1) . टुकड़ा बढ़ता है और फैलता है (सभी दिशाओं में) अप करने के लिए 72 ज, और axons आंख की ओर नाभिक से विस्तार देखा जा सकता है. हमने पाया है कि पहले 36-48 एच सबसे उपयोगी oculomotor एक्सॉन वृद्धि का आकलन करने के लिए. मोटर न्यूरॉन्स कभी कभी नाभिक के भीतर चलती देखा जा सकता है (नहीं दिखाया). कुछ स्लाइस में, अभिविन्यास के आधार पर, trochlear नाभिक भी मौजूद है. Trochlear axons टुकड़ा के भीतर बाद में विस्तार और अक्सर स्टाल, क्योंकि उनके सामान्य पाठ्यक्रम के लिए बाद में trochlear नाभिक से बाहर निकलें, dorsally और caudally मोड़ से पहले है, जो टुकड़ा से बाहर हो जाएगा. कभी कभी, trochlear axons oculomotor axons के साथ शामिल होने के लिए और आंख की ओर बारी लगता है, जो टुकड़ा की व्याख्या करने के लिए मुश्किल बनाता है, के रूप में उन axons oculomotor axons के मार्गदर्शन पर एक माध्यमिक प्रभाव हो सकता है.

एक महत्वपूर्ण एक्सॉन मार्गदर्शन मार्ग को बाधित करने का उदाहरण: CXCR4 संकेतन बाधा oculomotor axons के अधर विकास के बजाय पृष्ठीय कारण बनता है. हम AMD3100, CXCR428के एक पानी में घुलनशील छोटे अणु अवरोध करनेवाला, सीधे टुकड़ा संस्कृति तैयार है के रूप में के रूप में संस्कृति मीडिया के लिए सीधे जोड़कर oculomotor विकास पर संकेत CXCR4 की भूमिका का मूल्यांकन किया. इसके बाद ऑकुलोमोटर एक्सॉनकोन को ऑकुलोमोटर नाभिक डोर्सली से बाहर निकलते हुए और कक्षा से दूर बढ़ते हुए देखा जा सकता है ("पीछे") (चित्र2, वीडियो 2)। उन axons कि पहले से ही midbrain छोड़ दिया था और E10.5 पर कक्षा के मार्ग में थे उनके रास्ते पर जारी है. CXCR4 का निषेध भी टुकड़ा के समग्र विकास को प्रभावित करता है.

टुकड़ा के अभिविन्यास महत्वपूर्ण है. स्लाइस व्याख्या योग्य नहीं हैं अगर वे ठीक से उन्मुख नहीं हैं. अनुचित रूप से उन्मुख स्लाइसों के कुछ उदाहरण चित्र 3में दिखाए गए हैं। यदि भ्रूण अपनी ओर झुका हुआ है तो केवल एक ही नेत्रप्रेरक नाभिक टुकड़ा में है (चित्र3क)।  यदि एम्बेडेड भ्रूण अपनी पीठ की ओर बहुत दूर झुका हुआ है, तो आंखें स्लाइस में नहीं हैं, और इसके बजाय ऊपरी अंग और पश्च मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी स्लाइस में हो सकती है (चित्र 3)।  इस मामले में, oculomotor axons के सामान्य प्रक्षेप पथ मौजूद नहीं है, और वे बेतरतीब ढंग से विकसित करने के लिए करते हैं। संस्कृति झिल्ली पर टुकड़ा की नियुक्ति के दौरान, यह मुड़ा हो सकता है (चित्र 3ब्) .

सॉल्वैंट्स विषाक्त हो सकता है. जैविक सॉल्वैंट्स में अवरोधकया या विकास कारकों को भंग करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए। चित्र 4 एक स्लाइस का एक उदाहरण दिखाता है जो मीडिया में एथेनोल के योग के बाद मर गया। 118 $L मीडिया के 1.5 एमएल (अंतिम एकाग्रता 7.8%) में जोड़ा गया था, और इस उच्च एकाग्रता विषाक्त साबित कर दिया. इसे रोकने के लिए, विलायक संभव की न्यूनतम राशि में विलेय को भंग करें (विलेयता की सीमा तक)। जब भी संभव हो, पानी में भंग. यदि DMSO प्रयोग किया जाता है, सुनिश्चित करें कि यह बाँझ है, ऊतक संस्कृति ग्रेड DMSO.

Figure 1
चित्र 1 : Schematic. E10.5 IslMN-GFP भ्रूण (A:फोटो, बी: योजनाबद्ध) एक vibratome पर कटा हुआ है (400-450 डिग्री मोटी) ताकि वर्गों दोनों oculomotor नाभिक और कक्षा शामिल हैं. ए और बी में समानांतर डैश्ड रेखाएँ वाइब्राम कटौती के स्थान को दर्शाती हैं। ए शो में निचले डैश्ड लाइन जहां agarose छंटनी की जानी चाहिए और vibratome चरण से चिपके. (ग) खंडों को ऊतक-संस्कृति झिल्ली पर समतल रखा जाता है, जिससे पोषक तत्वों और गैसों के आदान-प्रदान की अनुमति होती है, और समय-चूक माइक्रोस्कोपी के लिए चरण-शीर्ष इनक्यूबेटर में रखा जाता है। इस स्तर पर, अवरोधक विकास मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है. () संस्कृति को 24-72 ज के लिए बनाए रखा जा सकता है, और ऑकुलोमोटर एक्सॉन को आंखों में बढ़ते देखा जा सकता है। Whitman, आदि से अनुमति के साथ अनुकूलित. अल. 201823| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : CXCR4 के निषेध CN3 misrouting का कारण बनता है. E10.5 Isl-GFP भ्रूण से स्लाइस संस्कृतियों 0, 12, 24, और संस्कृति में 36 एच पर छवि. शीर्ष पैनल से पता चलता है एक जंगली प्रकार नियंत्रण भ्रूण और CN3 (हरा) आंखों और शाखाओं की ओर बड़े पैमाने पर 36 एच के पाठ्यक्रम पर बढ़ता है. इसके अलावा वीडियो 1देखें | नीचे पैनल के साथ एक टुकड़ा से पता चलता है 1 g/mL AMD3100 (CXCR4 के लिए विशेष अवरोध करनेवाला) जोड़ा और axons oculomotor नाभिक dorsally बाहर निकलें. जो पहले से ही वेंटली से बाहर निकल चुके थे, वे आंखों की ओर जारी रहते हैं। इसके अलावा देखें वीडियो 2| डी: पृष्ठीय, वी: अधर, ई: आंख, एन: oculomotor नाभिक, SMN: रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स, तीर: oculomotor axons (सफेद: wildtype प्रक्षेपण, पीला: aberant अनुमानों). स्केल बार 200 डिग्री मी के बराबर होती है। इसके अलावा देखें वीडियो 1 और वीडियो 2|  अन्य उदाहरण दिखा एक समान आंकड़ा Whitman, आदि में प्रस्तुत किया गया था. अल. 201823| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : स्लाइस के अभिविन्यास महत्वपूर्ण है. प्रतिनिधि misoriented स्लाइस के प्रारंभिक चित्र (समय 0 ज).। एक टुकड़ा है जिसमें भ्रूण पक्ष को इस तरह से झुका हुआ था कि CN3 axons पेश axotomized थे दिखाता है. axons प्रोजेक्टिंग केवल टुकड़ा (तीर) के दाईं ओर मौजूद हैं।  बी एक टुकड़ा है जिसमें भ्रूण वापस झुका हुआ था तो CN3 नाभिक axons (तीर) प्रोजेक्टिंग के साथ द्विपक्षीय रूप से दिखाई दे रहे हैं, लेकिन आँखें टुकड़ा में मौजूद नहीं हैं दिखाता है. इसके बजाय रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स (SMN) और अंगों को मोटर न्यूरॉन अनुमानों देखा जा सकता है. सी एक टुकड़ा है कि झिल्ली पर नियुक्ति के दौरान तह से पता चलता है. इस तरह के यहाँ दिखाए गए उन लोगों के रूप में स्लाइस खारिज कर दिया जाना चाहिए. स्केल बार प्रत्येक पैनल में 500 डिग्री मीटर का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : सॉल्वैंट्स विषाक्त हो सकता है. E10.5 Isl-GFP भ्रूण से टुकड़ा संस्कृतियों के समय चूक इमेजिंग 0 और संस्कृति में 12 एच पर. कोई additives के साथ मीडिया में सुसंस्कृत एक टुकड़ा (ए-बी) आंख की ओर पेश CN3 axons के साथ 12 एच के लिए सामान्य रूप से बढ़ता है। इथेनॉल के एक उच्च एकाग्रता के साथ मीडिया में सुसंस्कृत एक टुकड़ा (7.8%) (C-D) सामान्य रूप से विकसित नहीं होता है। 12 बजे, CN3 बड़ा नहीं हुआ है और मुश्किल से दिखाई दे रहा है, और ऊतक बिखर शुरू कर दिया है. स्केल बार प्रत्येक पैनल में 500 डिग्री मीटर का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Video 1
वीडियो 1: टुकड़ा संस्कृति में CN3 वृद्धि. एक E10.5 Isl-GFP भ्रूण से एक नियंत्रण टुकड़ा संस्कृति के समय चूक इमेजिंग. संस्कृति में 18 एच से अधिक हर 30 मिनट लिया छवियाँ. CN3 (हरा) नाभिक (ऊपर) से आंखों की ओर बढ़ता है और शाखाओं शुरू होता है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 2
वीडियो 2: CXCR4 संकेतन के निषेध के साथ CN3 की Mistargeting. E10.5 Isl-GFP भ्रूण से टुकड़ा संस्कृतियों के समय चूक इमेजिंग संस्कृति में 48 एच से अधिक. जब 1 $g/mL AMD3100 (CXCR4 के लिए विशिष्ट अवरोध करनेवाला) सीधे मीडिया के लिए जोड़ा जाता है, CN3 axons कि परिधि में अभी तक नहीं कर रहे हैं बाहर निकलने oculomotor नाभिक dorsally (बाएं) के बजाय ventrally (दाएं). Whitman, आदि से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित. अल. 201823| कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

इस पूर्व vivo टुकड़ा संस्कृति प्रोटोकॉल पारंपरिक एक्सॉन मार्गदर्शन पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है23पर ासाकीय ताक पर . प्रत्येक कपाल मोटर नाभिक का आकार एक सीमित कारक नहीं है, और कोई मुश्किल विच्छेदन आवश्यक है. अंतर्जात सूक्ष्म पर्यावरण जिसके माध्यम से एक्सॉन यात्रा बनाए रखा है, एक संकेतन मार्ग के संशोधन की अनुमति है, जबकि अन्य संकेतन रास्ते को बनाए रखने. इसके अतिरिक्त, प्रभाव एक्सॉन प्रक्षेप पथ के साथ विभिन्न बिंदुओं पर मूल्यांकन किया जा सकता है. चूंकि एक्सॉन मार्गदर्शन के लिए कई संकेतों की आवश्यकता होती है, और संकेतों के संयोजन, पथ के साथ29, यह एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। अलग या explant संस्कृतियों के विपरीत, बढ़ते axons इस तैयारी में कटौती नहीं कर रहे हैं, तो प्रारंभिक एक्सॉन वृद्धि का मूल्यांकन किया जा सकता है, बजाय एक्सॉन पुनर्जनन. सबसे अन्य मार्गदर्शन assays में, एक्सॉन पुनर्जनन वास्तव में मूल्यांकन किया जा रहा है, बजाय प्रारंभिक एक्सॉन वृद्धि. एक्सोटोमी से बचना भी महत्वपूर्ण संभावित confounding कारकों से बचा जाता है क्योंकि न्यूरॉन्स क्षतिग्रस्त या तनाव के तहत नहीं कर रहे हैं.

दो सबसे महत्वपूर्ण कदम टुकड़ा करने और माँ की इच्छामृत्यु और इनक्यूबेटर में स्लाइस की नियुक्ति के बीच समय को कम करने के लिए भ्रूण के उन्मुखीकरण कर रहे हैं। भ्रूण हर समय बर्फ पर रखा जाना चाहिए। अभिविन्यास के लिए, हम कई अलग अलग ढालना की कोशिश की है, लेकिन इस उम्र में भ्रूण के बीच परिवर्तनशीलता की वजह से, हमने पाया है कि हाथ से अभिविन्यास, विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत फ्लोरोसेंट के आधार पर, सबसे प्रभावी है. हाथ से अभिविन्यास भ्रूण समय खिड़की है कि अध्ययन किया जा सकता है, लेकिन सीमा. E10.0 से पहले, टुकड़ा ठीक से उन्मुख चुनौतीपूर्ण है क्योंकि आंख को देखने के लिए मुश्किल है और बहुत कुछ CN3 axons देखा जा सकता है. इसका मतलब यह है कि हम जल्द से जल्द पायनियर एक्सॉन वृद्धि का अध्ययन करने के लिए इस विधि का उपयोग नहीं कर सकते हैं, क्योंकि हमें उन एक्सॉनको को टुकड़ा उन्मुख करने में सक्षम होने के लिए भाग के रास्ते को विकसित करने की अनुमति देने की आवश्यकता है।

oculomotor टुकड़ा संस्कृति की तैयारी के लिए कई सीमाएं हैं. यह टर्मिनल शाखा निर्णय के बजाय जल्दी और मध्यवर्ती मार्गदर्शन निर्णय का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयोगी है। E10.5 पर, EOMs केवल एक मांसपेशी anlage के रूप में मौजूद हैं. यहां तक कि बाद में समय अंक में, वर्तमान इमेजिंग प्रौद्योगिकी के साथ, व्यक्तिगत लक्ष्य EOMs टुकड़ा के भीतर प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है. इसलिए ऑक्यूलोमोटर एक्सॉन के विशिष्ट टर्मिनल शाखा निर्णयों का वर्तमान परिस्थितियों के साथ मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है। क्योंकि स्लाइस छिद्र ऊतक संस्कृति झिल्ली पर बड़े हो रहे हैं, झिल्ली से संस्कृति के बाद जुदाई मुश्किल है और अक्सर ऊतक क्षति का कारण बनता है, एंटीबॉडी धुंधला बनाने और अतिरिक्त इमेजिंग असफल के लिए remounting. हालांकि एक्सॉन में कटौती नहीं की जाती है, जिससे न्यूरोनल क्षति को कम किया जाता है, आसपास के ऊतकों में कटौती की जाती है और इसलिए क्षतिग्रस्त हो जाता है, जो संकेतन क्यू अभिव्यक्ति या रिलीज को प्रभावित कर सकता है। आदर्श समय खिड़की भी सीमित है. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, टुकड़ा के E10.0 अभिविन्यास से पहले मुश्किल है, और E11.5 के बाद, कई axons पहले से ही कक्षा तक पहुँच चुके हैं, इसलिए मध्यवर्ती मार्गदर्शन निर्णय पहले से ही किया गया है.

तैयारी मंच शीर्ष इनक्यूबेटर, स्वत: चरण, और समय चूक क्षमता के साथ एक माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है। उद्देश्यों और कैमरे के लिए कोई समाशोधन के साथ मोटी नमूनों की इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. एक ही विकास शंकु के स्तर पर संकल्प, के रूप में कुछ संस्कृति की तैयारी के साथ संभव है, वर्तमान इमेजिंग सेट अप के साथ संभव नहीं है. इमेजिंग पैरामीटर, हालांकि, संभावित रूप से उच्च संकल्प की अनुमति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, confocal या 2-photon माइक्रोस्कोपी के साथ, प्रत्येक टुकड़ा के एक छोटे से क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित (संभावित रूप से axons बढ़ने के रूप में टुकड़ा के रूप में समायोजन). वर्तमान epifluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग करना और हर 30 मिनट इमेजिंग, हम photobleaching नहीं देखा है; confocal माइक्रोस्कोपी और अधिक लगातार इमेजिंग इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन photobleaching एक संभावित समस्या बन जाएगा.

क्योंकि छोटे अणु inhibitors बंद लक्ष्य प्रभाव हो सकता है, समग्र विकास और टुकड़ा के स्वास्थ्य पर सहित, इस परख एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में सबसे उपयोगी है. परिणाम ों को अन्य विधियों, जैसे नॉकआउट माउस मॉडल द्वारा सत्यापित करने की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, CXCR4 अवरोध के साथ, वहाँ हल्के टुकड़ा के समग्र विकास में कमी आई है (चित्र 2देखें), CXCR4 के कई कार्यों के साथ संगत. तथापि, माउस मॉडलों में, स्लाइस में देखा गया एक्सॉन फीनोटाइप23को पुन: अभिगृहीत किया गया था।

इस प्रोटोकॉल अन्य कपाल तंत्रिका आबादी का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, हालांकि प्रत्येक के लिए, स्लाइस और समय के उचित अभिविन्यास अनुभवजन्य निर्धारित किया जाना होगा. इसके अतिरिक्त, विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबल के साथ चूहों का इस्तेमाल किया जा सकता है कि न्यूरॉन्स के विभिन्न सबसेट चिह्नित और /

टुकड़ा संस्कृति कई मायनों में हेरफेर किया जा सकता है. हम यहाँ एक छोटे अणु अवरोध कनेर के साथ रिसेप्टर संकेतन अवरुद्ध का एक उदाहरण दिखा. वैकल्पिक रूप से, एंटीबॉडी (या तो रिसेप्टर अवरुद्ध या रिसेप्टर सक्रिय) या रिकॉमबिनेंट प्रोटीन, जैसे एक्सॉन मार्गदर्शन संकेत या विकास कारक, मीडिया में जोड़ा जा सकता है. एक्सॉन मार्गदर्शन पर दिशात्मक प्रभाव के लिए मूल्यांकन करने के लिए, ligand-secreting मोती विशिष्ट स्थानों में टुकड़ा पर रखा जा सकता है. इन तरीकों में से किसी का उपयोग करना, कई अन्य एक्सॉन मार्गदर्शन रास्ते की पहचान की और नेत्र मोटर प्रणाली में अध्ययन किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

राष्ट्रीय नेत्र संस्थान [5K08EY027850], राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और विकास संस्थान [U54HD090255], हार्वर्ड-विजन नैदानिक वैज्ञानिक विकास कार्यक्रम [5K12EY016335], शूरवीरों टेम्पलर नेत्र फाउंडेशन [कैरियर स्टार्टर] द्वारा प्रदान की गई अनुदान अनुदान, और बच्चों के अस्पताल नेत्र विज्ञान फाउंडेशन [फैकल्टी डिस्कवरी पुरस्कार]. ईसीई एक हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के अन्वेषक है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors - Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

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References

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