Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Un ensayo de rebanada ex vivo permite que el crecimiento del nervio oculomotor se intermiera en tiempo real. Los cortes se generan mediante la incrustación de embriones E10.5 IslMN:GFP en agarosa, cortando en un vibratome, y creciendo en una incubadora de etapa superior. El papel de las vías de orientación de axón se evalúa mediante la adición de inhibidores a los medios de cultivo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Los movimientos oculares precisos son cruciales para la visión, pero el desarrollo del sistema motor ocular, especialmente las vías moleculares que controlan la orientación de axón, no ha sido completamente aclarado. Esto se debe en parte a las limitaciones técnicas de los ensayos tradicionales de orientación de axón. Para identificar señales adicionales de guía de axón que influyen en el nervio oculomotor, se desarrolló un ensayo de rebanada ex vivo para imaginar el nervio oculomotor en tiempo real a medida que crece hacia el ojo. E10.5 Los embriones IslMN-GFP se utilizan para generar rodajas ex vivo incrustándolas en agarosa, cortando en un vibratomo, luego creándolas en una incubadora de microscopio con fotomicroscopía de lapso de tiempo para 24-72 h. Rebanadas de control recapituladas el momento in vivo del crecimiento de los axónes desde el núcleo hasta la órbita. Se pueden añadir inhibidores de moléculas pequeñas o proteínas recombinantes a los medios de cultivo para evaluar el papel de las diferentes vías de orientación de axón. Este método tiene las ventajas de mantener más del microambiente local a través del cual atraviesan los axones, no axotomizar los axons en crecimiento, y evaluar los axons en múltiples puntos a lo largo de su trayectoria. También puede identificar efectos en subconjuntos específicos de axones. Por ejemplo, la inhibición de CXCR4 hace que los axones todavía dentro del cerebro medio crezcan dorsalmente en lugar de ventralmente, pero los axones que ya han salido ventralmente no se ven afectados.

Introduction

El sistema de motor ocular proporciona un sistema elegante para investigar los mecanismos de orientación de axón. Es relativamente sencillo, que consiste en tres nervios craneales que inervian seis músculos extraoculares (EOM) que mueven el ojo, y el levator palpebrae superioris (LPS) que levanta el párpado. El nervio oculomotor incuba el LPS y cuatro EOM - el oblicuo inferior y los músculos medial, inferior, y superior recto. Los otros dos nervios, el trochlear y los abducens, cada uno de ellos sólo inervate un músculo, el músculo oblicuo superior y el músculo recto lateral, respectivamente. Los movimientos oculares proporcionan una lectura fácil, que muestra si la inervación era apropiada, faltaba o era aberrante. Además, hay trastornos del movimiento ocular humano que resultan de déficits en el desarrollo neuronal o guía de axón, colectivamente llamados los trastornos congénitos de disinnervación craneal (CCDD)1.

A pesar de estas ventajas, el sistema motor ocular rara vez se utiliza en los estudios de orientación de axón2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, debido a inconvenientes técnicos. Los ensayos de orientación axón in vitro tienen muchas desventajas11. Los ensayos de cocultivo, en los que los explantes neuronales se cultivan junto con explantas de tejido objetivo12 o células transfectóte13,dependen tanto de la simetría del explantar como del posicionamiento preciso entre el tejido explanteo y el tejido diana. Ensayos de rayas14,15, en los que se establecen dos señales en franjas alternas y los axones se evalúan para un crecimiento preferencial en una franja, sólo indican que un sustrato es preferible al otro, no que cualquiera de los dos sea atractivo repulsivo, o fisiológicamente relevante. Las cámaras de microfluidos pueden formar gradientes químicos precisos, pero sujeto a axones en crecimiento a tensión de cizallamiento16,17,18, que pueden afectar su crecimiento. Además, en cada uno de estos enfoques, la recolección de explantas o células disociadas requiere que los axons de crecimiento superior sean axotomizados y, por lo tanto, estos ensayos examinan realmente la regeneración de axón, en lugar del crecimiento inicial del axón. Por último, estos enfoques in vitro eliminan el microambiente que influye en los axones y sus respuestas a las señales a lo largo de diferentes puntos de su curso, y tradicionalmente sólo prueban una señal de forma aislada. Al componer estas desventajas, el pequeño tamaño de cada núcleo en el sistema motor ocular hace que la disección sea técnicamente difícil para explantas o cultivos disociados. Además, los cultivos primarios de las neuronas motoras oculares suelen ser heterogéneos, tienen muerte celular significativa y dependen de la densidad, lo que requiere la agrupación de células de múltiples embriones (Ryosuki Fujiki, comunicación personal). Los métodos in vivo, sin embargo, incluyendo modelos de ratón knockout, son inapropiados para su uso para la detección, dado el tiempo y los gastos requeridos.

Los métodos desarrollados para cultivar embriones enteros19 permiten el etiquetado de células migratorias20 o bloqueo de moléculas específicas21,pero los cultivos de embriones enteros requieren incubación en botellas de rodillos que impide la toma de imágenes en tiempo real de las etiquetas Estructuras. También son posibles las técnicas quirúrgicas que permiten la manipulación del embrión y luego el posterior desarrollo posterior, ya sea en el útero o en el abdomen de la madre (manteniendo la conexión placentaria)22, pero tampoco permiten lapso de tiempo Imagen.

Para superar los obstáculos de los ensayos in vitro y permitir un cribado rápido de las vías de señalización, se desarrolló una técnica de cultivo de rodajas embrionarias ex vivo23,adaptada de un protocolo previamente publicado para el crecimiento del nervio periférico24. Usando este protocolo, el nervio oculomotor en desarrollo se puede imaginar con el tiempo en presencia de muchas de las estructuras circundantes a lo largo de su trayectoria, incluyendo objetivos de la MOE. Mediante la adición de inhibidores de moléculas pequeñas, factores de crecimiento o señales de orientación a los medios de cultivo, podemos evaluar perturbaciones de orientación en múltiples puntos a lo largo de la trayectoria del axón, permitiendo una evaluación más rápida del crecimiento potencial y los factores de orientación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todo el trabajo de animales descrito aquí fue aprobado y realizado de conformidad con los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Boston Children's Hospital.

1. Apareras cronometradas

  1. Colocar ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Stock No: 017952) ratones machos y hembras juntos durante la noche. Pesar las hembras y registrar pesos antes del apareamiento.
    NOTA: ISLMN:GFP etiqueta específicamente las neuronas motoras con un GFP farnesylated que no es citotóxico, localiza a la membrana celular de las neuronas motoras y sus axones, y permite visualizar los nervios durante el desarrollo25. También se podrían utilizar otras líneas etiquetadas fluorescentes.
  2. Compruebe si hay tapones vaginales en la mañana temprano. La fecha en que se identifica un enchufe se designa como E0.5.
  3. Confirme el embarazo con aumento de peso y/o ultrasonido en E10.5. Las presas embarazadas deben haber ganado al menos 1 g. Los embriones se pueden ver en ultrasonido en E10.5.

2. Preparación de reactivos y vibratome para el cultivo de rodajas

  1. Preparar 500 ml de tampón de corte: añadir 5 ml de HEPES y 5 ml de penicilina/estreptomicina a 500 ml de la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hank sin Ca2+ y Mg2+.  Enfríe a 4 oC.
    NOTA: El búfer de corte adicional debe almacenarse a 4 oC y se puede utilizar para futuros experimentos de cultivo de sectores.
  2. Preparar 50 ml de medios de cultivo: En una campana estéril, añadir 12,5 ml de HBSS, 12,5 ml de suero bovino fetal, 250 ml de glucosa, 250 ml de L-glutamina, 125 ml de HEPES a 24,4 ml de Fluorobright DMEM. (Concentraciones finales: FlouroBright DMEM con 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% glucosa, 1 mM de glutamina y 2,5 mM HEPES.).  Calentar los medios de cultivo a 37 oC en un baño de agua estéril.
    NOTA: Los medios de cultivo se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 semanas.
    1. En una capucha estéril, agregue 1,5 ml de medios de cultivo a cada pocto de un plato de 6 pocillos.  Agregue una inserción de referencia cultural de celda (Tablade materiales)a cada poca.  Colocar en una incubadora estéril de 37oC y 5% de CO2.
  3. Preparar 4% de agarosa de baja temperatura de fusión: disolver 2 g de agarosa de baja temperatura de fusión en 50 ml de PBS estéril. Microondas en intervalos de 30-60 s hasta que se disuelvan por completo. Colocar en un baño de agua a 40 oC para mantener el líquido.
    NOTA: La agarosa adicional se puede almacenar a temperatura ambiente (RT) y derretirse para futuros experimentos de cultivo de rebanadas.
  4. Configurar vibratome: Coloque una nueva hoja en el vibratome. Compruebe los ajustes: espesor 400-450 m. Enfríe previamente la etapa del vibratomo. Coloca hielo en la cámara exterior. Utilice una cámara y un escenario dedicados a las rebanadas en vivo. No utilice la misma cámara de vibratome para el tejido fijo, ya que el fijador residual podría ser perjudicial para las rodajas.
  5. Preparar la incubadora superior de etapa del microscopioa 37 oC y 5% de CO 2.
  6. Prepararse para la disección: Limpie los instrumentos quirúrgicos y rocíe con 70% de etanol. Llene dos platos De Petri con HBSS, colóquelos en hielo. Abra una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos y coloque la tapa sobre hielo con la parte inferior hacia arriba. Abra una placa de cultivo de tejido de 6 pozos y coloque las inserciones de membrana de cultivo celular y los medios de cultivo celular de 1,5 ml en cada poca. Precalentar la placa en una incubadora de 37oC y 5% de CO2.

3. Cosecha de embriones E10.5 y preparación de rodajas

NOTA: Todos los pasos a partir de este punto deben realizarse lo más rápido posible. Mantenga los embriones en hielo en todo momento.

  1. Eutanasiar la presa embarazada (E10.5) en una cámara de CO2. Realizar luxación cervical.
  2. Rocíe el abdomen con 70% de etanol. Abra el abdomen con tijeras, retire el útero y colóquelo en un plato de Petri con HBSS helado para lavar rápidamente la sangre. Mueva el útero lavado a un segundo Petri lleno de HBSS helado.
  3. Bajo un alcance de disección, retire los embriones del cuerno uterino y los sacos amnióticos individuales. Coloque los embriones en la parte inferior de la tapa de una placa de 12 pocillos. Manténgase en hielo.
  4. Bajo un endoscopio, utilice papel filtrante para eliminar cualquier líquido que rodee a cada embrión.
    NOTA: Los embriones se pegarán al papel del filtro si se tocan.
  5. Incrustar embriones en agarosa. Verter agarosa derretida sobre cada embrión para cubrirlo. Manténgase en hielo. Tan pronto como la agarosa se haya endurecido, voltee cada embrión y vierta agarosa adicional en el otro lado. Manténgase en hielo.
  6. Usando un visor de diselación fluorescente, recorta la agarosa alrededor de cada embrión para que se oriente correctamente cuando se pegue a la etapa del vibratome. El núcleo oculomotor y el crecimiento temprano del axón son fluorescentes. Alinee el embrión de modo que el núcleo, los axons que crecen y el ojo formen una línea, y recorte la agarosa con una cuchilla de afeitar cortada paralela a esta línea (dorsal al embrión, véase la Figura 1A).
    NOTA: Este será el lado pegado a la etapa del vibratome (el embrión se colocará en su espalda, la cabeza más cercana a la hoja del vibratome). Una línea entre el núcleo oculomotor y el ojo debe ser paralela a la hoja vibratoria.
  7. Llene la cámara de vibratome con tampón de rodajas heladas. Superglue el embrión a la etapa vibratome para que la hoja sea paralela al núcleo oculomotor y los ojos. Una vez que el superpegamento está seco, sumerja la etapa del vibratome para que el embrión esté orientado hacia fuera de la hoja.
  8. Cortar 400-450 m de rodajas.  Recoja cada rebanada con un pipeta de transferencia estéril. Colocar en un búfer de corte en frío.
  9. Bajo el alcance de diselación, elija la rebanada que contiene los núcleos y los ojos oculomotores. Usando un pipeta de transferencia estéril, colóquelo en el inserto de cultivo celular en la placa de 6 pocillos. Vuelva a colocar la placa en la incubadora de 37oC. Alternativamente, pida a una persona que corte y otra colocando las rodajas. Minimice el tiempo entre el corte y la colocación en la incubadora.
    NOTA: Los cortes deben orientarse de manera que la fluorescencia máxima emitida por los núcleos y axones sea más cercana al objetivo del microscopio de imagen. En un microscopio invertido, las rodajas deben colocarse en la membrana con los núcleos y axónes más cercanos al objetivo debajo de la placa.
  10. Retire la agarosa residual de la etapa del vibratome, superencola el siguiente embrión hasta el escenario y repita los pasos 3.7-3.9 hasta que todos los embriones hayan sido cortados y chapados.
  11. Añadir inhibidor o molécula recombinante de elección a los medios en cada pozo para crear una curva dosis-respuesta.  Diluir en disolvente adecuado.
    NOTA: Si utiliza DMSO, utilice solo DMSO de grado de cultivo de tejido. Alternativamente, los granos de elusión de proteínas se pueden colocar en lugares específicos de la rebanada.
  12. Colocar sobre el microscopio en la cámara de 37oC y 5% de CO2.  Ajuste el microscopio para tomar fotografías fluorescentes y de contraste de fase de cada rebanada cada 30 minutos (o más a menudo si lo desea). Las rebanadas se pueden mantener durante 48-72 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultados normales: la figura 1 proporciona un esquema del experimento. A partir de e9.5 en ratón, los primeros axons comienzan a emerger del núcleo oculomotor26. Por E10.5, un nervio oculomotor fasciculado, que contiene las primeras neuronas pioneras, se puede ver en el mesenquima. Hay una variabilidad significativa entre los embriones en E10.5 (incluso dentro de la misma camada) en la distancia a la que el nervio ha progresado hacia la órbita, probablemente debido a diferencias de desarrollo de unas pocas horas. Durante el desarrollo normal en el útero, los primeros axónicos oculomotor es positivos de GFP alcanzan la órbita/ojo durante las siguientes 18-24 h (por E11.5), y luego comienzan a ramificarse a sus objetivos finales27. En la referencia cultural de sectores, este tiempo se recapitula (Figura2, Vídeo 1). La rebanada crece y se expande (en todas las direcciones) durante un máximo de 72 h, y se pueden ver axónes extendiéndose desde el núcleo hacia el ojo. Hemos encontrado las primeras 36-48 h más útiles para evaluar el crecimiento del axón oculomotor. Las neuronas motoras a veces se pueden ver moviéndose dentro del núcleo (no se muestra). En algunas rebanadas, dependiendo de la orientación, el núcleo esclero también está presente. Los axons terocleares se extienden lateralmente dentro de la rebanada y a menudo se estancan, porque su curso normal es salir del núcleo esclearar lateralmente, antes de girar dorsal y caudalmente, que estaría fuera de la rebanada. Ocasionalmente, los axons esquirleares parecen unirse con los axons oculomotor y girar hacia el ojo, lo que hace que la rebanada sea difícil de interpretar, ya que esos axons pueden tener un efecto secundario en la guía de los axones oculomotores.

Ejemplo de inhibición de una importante vía de guía de axón: Inhibición de la señalización CXCR4 causa crecimiento dorsal en lugar de ventral de axones oculomotores. Evaluamos el papel de la señalización CXCR4 en el desarrollo del oculomotor añadiendo 1 g/ml (1,26 m) de AMD3100, un inhibidor de molécula pequeña soluble en agua de CXCR428,directamente a los medios de cultivo tan pronto como se prepara el cultivo de la rebanada. Los axons oculomotor pueden ser vistos saliendo del núcleo oculomotor dorsalmente y creciendo lejos de la órbita ("hacia atrás") (Figura 2,Video 2). Esos axons que ya habían salido del cerebro medio y estaban en camino a la órbita en E10.5 continúan en su trayectoria. La inhibición de CXCR4 también afecta el crecimiento general de la rebanada.

La orientación de la rebanada es crucial. Los sectores no son interpretables si no están orientados correctamente. En la Figura 3se muestran algunos ejemplos de sectores orientados incorrectamente. Si el embrión está inclinado hacia su lado, sólo hay un núcleo oculomotor en la rebanada (Figura3A).  Si el embrión incrustado está inclinado demasiado hacia su espalda, los ojos no están en la rebanada, y en su lugar la extremidad superior y el cerebro posterior o la médula espinal pueden estar en la rebanada (Figura3B).  En este caso, la trayectoria normal de los axones oculomotores no está presente, y tienden a crecer al azar. Durante la colocación de la rebanada en la membrana de cultivo, se puede plegar (Figura3C).

Los disolventes pueden ser tóxicos. Se debe tener cuidado al disolver inhibidores o factores de crecimiento en disolventes orgánicos. La Figura 4 muestra un ejemplo de una rebanada que murió después de la adición de etanol a los medios. Se añadieron 118 l a 1,5 ml de medios (concentración final 7,8%), y esta alta concentración resultó tóxica. Para evitarlo, disolver los solutos en la cantidad mínima de disolvente posible (hasta el límite de solubilidad). Siempre que sea posible, disolver en agua. Si se utiliza DMSO, asegúrese de que sea estéril, grado de cultivo de tejido DMSO.

Figure 1
Figura 1 : Esquema. E10.5 Los embriones Isl MN-GFP (A: photo, B: schematic) se cortan en un vibratomo (400-450 m de espesor) para que las secciones incluyan tanto el núcleo oculomotor como la órbita. Las líneas discontinuas paralelas en A y B denotan la ubicación de los cortes de vibratome. La línea discontinua inferior en A muestra dónde se debe recortar la agarosa y pegarse a la etapa del vibratome. (C) Las secciones se colocan planas sobre una membrana de cultivo de tejido, lo que permite el intercambio de nutrientes y gases, y se colocan en una incubadora de etapa superior para la microscopía de lapso de tiempo. En esta etapa, los inhibidores se pueden añadir a los medios de crecimiento. (D) Los cultivos se pueden mantener durante 24-72 h, y los axons oculomotor se pueden ver creciendo a la vista. Adaptado con permiso de Whitman et. al. 201823. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : La inhibición de CXCR4 causa el desvío de CN3. Cultivos de corte de embriones E10.5 Isl-GFP imagee a 0, 12, 24 y 36 h en cultivo. El panel superior muestra un embrión de control de tipo salvaje y CN3 (verde) crece hacia los ojos y las ramas extensamente en el transcurso de 36 h. Consulte también El vídeo 1. El panel inferior muestra una rebanada con 1 g/ml AMD3100 (inhibidor específico para CXCR4) añadido y axones salen del núcleo oculomotor dorsalmente. Aquellos que ya habían salido ventralmente continúan hacia el ojo. Consulte también Vídeo 2. D: dorsal, V: ventral, E: ojo, N: núcleo oculomotor, SMN: neuronas motoras espinales, flechas: axones oculomotores (blanco: proyección de tipo salvaje, amarillo: proyecciones aberrantes). La barra de escala es igual a 200 m. Consulte también Video 1 y Video 2.  Una cifra similar que muestra otros ejemplos fue presentada en Whitman et. al. 201823. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : La orientación de las rodajas es crucial. Imágenes iniciales (tiempo 0 h) de sectores representativos desorientados. A muestra una rebanada en la que el embrión se inclinó hacia un lado de tal manera que los axónicos CN3 proyectados fueron axotomizados. Los axons de proyección solo están presentes en el lado derecho de la rebanada (flecha).  B muestra una rebanada en la que el embrión se inclinó hacia atrás para que los núcleos CN3 con axón es proyectando (flecha) sean visibles bilateralmente, pero los ojos no están presentes en la rebanada. En su lugar, se pueden ver las neuronas motoras espinales (SMN) y las proyecciones de neuronas motoras a las extremidades. C muestra una rebanada que se plegó durante la colocación en la membrana. Se deben descartar sectores como los que se muestran aquí. Las barras de escala representan 500 m en cada panel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Los disolventes pueden ser tóxicos. Imágenes de lapso de tiempo de cultivos de rebanadas de embriones E10.5 Isl-GFP a 0 y 12 h en cultivo. Una rebanada cultivada en medios sin aditivos (A-B) crece normalmente durante 12 h con axones CN3 que se proyectan hacia el ojo. Una rebanada cultivada en medios con una alta concentración de etanol (7,8%) (C-D) no crece normalmente. A 12 h, CN3 no ha crecido y es apenas visible, y el tejido ha comenzado a desintegrarse. Las barras de escala representan 500 m en cada panel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1
Vídeo 1: Crecimiento de CN3 en la cultura de las rebanadas. Imágenes de lapso de tiempo de un cultivo de rebanadas de control a partir de un embrión E10.5 Isl-GFP. Imágenes tomadas cada 30 minutos sobre 18 h en cultivo. CN3 (verde) crece desde el núcleo (arriba) hacia los ojos y comienza a ramificarse. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

Video 2
Vídeo 2: Error de segmentación de CN3 con inhibición de la señalización CXCR4. Imágenes de lapso de tiempo de cultivos de rebanadas de embriones E10.5 Isl-GFP a lo largo de 48 h en cultivo. Cuando se añade n.o 1 g/ml AMD3100 (inhibidor específico para CXCR4) directamente al medio, los axones CN3 que aún no están en la periferia salen del núcleo oculomotor dorsalmente (izquierda) en lugar de ventralmente (derecha). Reimpreso con permiso de Whitman et. al. 201823. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este protocolo de cultivo de rebanadas ex vivo proporciona ventajas significativas sobre los ensayos de orientación de axón tradicionales23. El tamaño de cada núcleo motor craneal no es un factor limitante, y no es necesaria una disección difícil. Se mantiene el microambiente endógeno a través del cual viajan los axones, permitiendo la modificación de una vía de señalización manteniendo otras vías de señalización. Además, los efectos se pueden evaluar en diferentes puntos a lo largo de la trayectoria del axón. Puesto que la guía de axón requiere múltiples señales, y combinaciones de señales, a lo largo de la trayectoria29,esto proporciona una ventaja significativa. A diferencia de los cultivos disociados o explantados, los axons en crecimiento no se cortan en esta preparación, por lo que se puede evaluar el crecimiento inicial del axón, en lugar de la regeneración de axón. En la mayoría de los otros ensayos de orientación, la regeneración de axón se está evaluando, en lugar del crecimiento inicial del axón. Evitar la axotomía también evita factores de confunción potenciales significativos porque las neuronas no están dañadas o bajo estrés.

Los dos pasos más críticos son la orientación de los embriones para cortar y minimizar el tiempo entre la eutanasia de la madre y la colocación de las rodajas en la incubadora. Los embriones deben mantenerse en hielo en todo momento. Para la orientación, hemos probado varios moldes diferentes, pero debido a la variabilidad entre embriones a esta edad, hemos encontrado que la orientación a mano, basada en la fluorescencia bajo el microscopio de disección, es más eficaz. Sin embargo, la orientación a mano limita la ventana de tiempo embrionaria que se puede estudiar. Antes de E10.0, orientar la rebanada correctamente es un reto porque el ojo es difícil de ver y se pueden ver muy pocos axons CN3. Esto significa, sin embargo, que no podemos utilizar este método para estudiar el crecimiento de axón pionero más temprano, ya que necesitamos permitir que esos axones crezcan en parte para poder orientar la rebanada.

Hay varias limitaciones en la preparación del cultivo de rodajas de oculomotor. Es más útil para estudiar las decisiones de orientación temprana e intermedia, en lugar de las decisiones de ramificación de terminales. En E10.5, las EOM están presentes sólo como un anlage muscular. Incluso en momentos posteriores, con la tecnología de imágenes actual, las eOM de destino individuales no se pueden distinguir dentro del sector. Por lo tanto, las decisiones específicas de ramificación terminal de los axons oculomotor no pueden evaluarse con las condiciones actuales. Debido a que las rodajas se cultivan en membranas de cultivo de tejido poroso, la separación post-cultivo de la membrana es difícil y a menudo causa daño tisular, haciendo que la tinción de anticuerpos y el remontaje para imágenes adicionales sin éxito. Aunque los axons no se cortan, minimizando así el daño neuronal, los tejidos circundantes se cortan y por lo tanto se dañan, lo que podría afectar la expresión o liberación de la señal de señalización. La ventana de tiempo ideal también es limitada. Como se señaló anteriormente, antes de la orientación E10.0 de la rebanada es difícil, y después de E11.5, muchos axons ya han llegado a la órbita, por lo que ya se han tomado decisiones de orientación intermedias.

La preparación requiere un microscopio con incubadora de etapa superior, etapa automática y capacidad de lapso de tiempo. Los objetivos y la cámara deben optimizarse para la toma de imágenes de muestras gruesas sin limpieza. La resolución a nivel de un solo cono de crecimiento, como es posible con algunas preparaciones de cultivo, no es posible con la configuración de imágenes actual. Sin embargo, los parámetros de imagen podrían adaptarse potencialmente para permitir una resolución más alta, con microscopía confocal o de 2 fotones, centrándose en un área pequeña de cada rebanada (potencialmente ajustando a medida que crecen los axones). Usando el microscopio epifluorescente actual y la toma de imágenes cada 30 minutos, no hemos visto fotoblanqueo; se podrían utilizar la microscopía confocal y las imágenes más frecuentes, pero el fotoblanqueo se convertiría en un problema potencial.

Debido a que los inhibidores de moléculas pequeñas pueden tener efectos fuera del objetivo, incluyendo el crecimiento general y la salud de la rebanada, este ensayo es más útil como una herramienta de detección. Los resultados deben verificarse mediante otros métodos, como los modelos de ratón knockout. Por ejemplo, con la inhibición de CXCR4, hay una disminución leve del crecimiento general de la rebanada (ver Figura2), consistente con las múltiples funciones de CXCR4. En los modelos de ratón, sin embargo, el fenotipo de axón visto en la rebanada fue recapitulado23.

Este protocolo podría ser modificado para estudiar otras poblaciones del nervio craneal, aunque para cada una, la orientación adecuada de las rodajas y el momento tendría que ser determinada empíricamente. Además, se podrían utilizar ratones con diferentes etiquetas fluorescentes que marquen diferentes subconjuntos de neuronas y/o que se enciendan a edades embrionarias anteriores o posteriores.

La referencia cultural de sectores se puede manipular de varias maneras. Aquí mostramos un ejemplo de bloqueo de la señalización del receptor con un inhibidor de molécula pequeña. Alternativamente, se podrían agregar anticuerpos (bloqueo de receptores o activación de receptores) o proteínas recombinantes, como señales de orientación de axón o factores de crecimiento, a los medios. Para evaluar los efectos direccionales en la guía de axón, se pueden colocar cordones de ligando y secretor en el sector en ubicaciones específicas. Utilizando cualquiera de estos métodos, muchas otras vías de orientación de axón pueden ser identificadas y estudiadas en el sistema motor ocular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Financiación proporcionada por el Instituto Nacional del Ojo [5K08EY027850], Instituto Nacional de Salud y Desarrollo Infantil [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant], y la Fundación de Oftalmología del Hospital Infantil [Faculty Discovery Award]. ECE es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors - Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
  2. Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25, (1), 29-41 (2000).
  3. Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25, (1), 43-56 (2000).
  4. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70, (8), 549-564 (2010).
  5. Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82, (2), 334-349 (2014).
  6. Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140, (1), 74-87 (2010).
  7. Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399, (1), 68-79 (2015).
  8. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
  9. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (42), 16540-16551 (2013).
  10. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (36), 14669-14674 (2012).
  11. Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (45), 17647-17655 (2013).
  12. Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105, (2), 379-387 (1977).
  13. Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177, (1), 123-129 (1998).
  14. Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101, (4), 909-913 (1987).
  15. Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81, (2), 283-287 (1990).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8, (2), 227-237 (2008).
  17. Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144, (1), 79-89 (2005).
  18. Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8, (1), 34-57 (2008).
  19. Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244, (1), 155-169 (2002).
  20. Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, (31), 10551-10562 (2010).
  21. Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
  22. Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
  23. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59, (12), 5201-5209 (2018).
  24. Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
  25. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, (4), 604-620 (2007).
  26. Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13, (1), 285-299 (1993).
  27. Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58, (4), 2388-2396 (2017).
  28. Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200, (3), 337-355 (2013).
  29. Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145, (10), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics