Ex vivo nervus Slice kultur fra embryonale GFP-uttrykker mus for time-lapse Imaging av nervus nerve utvekst

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En ex vivo Slice analysen lar nervus nerve utvekst å bli avbildet i sanntid. Sektorer genereres ved å bygge inn E 10.5 ISLMN: GFP embryo in agarose, kutting på en vibratome, og vokser i en scene-topp inkubator. Rollen til axon veilednings trasé vurderes ved å legge til hemmere i kultur mediene.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nøyaktige øyebevegelser er avgjørende for synet, men utviklingen av øye motorsystemet, spesielt de molekylære veiene som kontrollerer axon veiledning, har ikke blitt fullstendig belyst. Dette skyldes delvis tekniske begrensninger i tradisjonelle axon veilednings analyser. For å identifisere flere axon veiledning pekepinner påvirke nervus nerve, en ex vivo Slice analysen til bildet nervus nerve i sanntid som det vokser mot øyet ble utviklet. E 10.5 ISLMN-GFP embryo brukes til å generere ex vivo skiver ved å bygge dem inn i agarose, kutting på en vibratome, deretter vokser dem i et mikroskop stadium-topp inkubator med time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. kontroll skiver recapitulate i vivo timing av utvekst av axons fra kjernen til banen. Små molekyl hemmere eller rekombinant proteiner kan legges til kulturen Media for å vurdere hvilken rolle ulike axon veiledning trasé. Denne metoden har fordelene med å opprettholde mer av de lokale mikromiljøet gjennom hvilke axons Travers, ikke axotomizing den voksende axons, og vurdere axons på flere punkter langs deres bane. Det kan også identifisere effekter på bestemte delsett av axons. For eksempel, hemming av CXCR4 årsaker axons fortsatt innenfor mellomhjernen å vokse dorsalt stedet ventrally, men axons som allerede har gått ut ventrally er ikke berørt.

Introduction

Øye motorsystemet gir et elegant system for å undersøke axon veilednings mekanismer. Det er relativt ukomplisert, bestående av tre skallen nerver innervating seks ekstraokulære muskler (EOMs) som beveger øyet, og levator palpebrae superioris (LPS) som løfter øyelokket. Den nervus nerve innerverer LPS og fire EOMs-den underlegne skrå og midtre, dårligere, og overlegen Rectus muskler. De to andre nerver, den trochlear og abducens, hver eneste innervate en muskel, overlegen skrå og lateral Rectus muskel, henholdsvis. Eye bevegelser gir en enkel avlesning, viser om innervasjon var hensiktsmessig, mangler, eller avvikende. I tillegg er det menneskelige øyebevegelse lidelser som følge av underskudd i neuronal utvikling eller axon veiledning, kollektivt betegnet de medfødte skallen disinnervation lidelser (CCDDs)1.

Til tross for disse fordelene brukes øye motorsystemet sjelden i axon veilednings studier2,3,4,5,6,7,8, 9 andre priser , 10, på grunn av tekniske ulemper. I vitro axon veiledning analysene har mange ulemper11. Co-kultur analyser, der neuronal explants er kultivert sammen med explants av målet vev12 eller transfekterte celler13, avhengig av både symmetri av explant og presis posisjonering mellom explant og målet vev. Stripe analyser14,15, der to Stikkordene er fastsatt i vekslende striper og axons er vurdert for fortrinnsrett vekst på en stripe, bare tyder på at ett substrat er å foretrekke fremfor den andre, ikke at enten er attraktiv eller frastøtende, eller fysiologisk relevant. Materialer Chambers kan danne presise kjemiske graderinger, men underlagt økende axons å skjær stress16,17,18, noe som kan påvirke deres vekst. Videre, i hver av disse tilnærmingene, samle explants eller dissosiert celler krever at outgrowing axons være axotomized og dermed disse analysene faktisk undersøke axon regenerering, snarere enn første axon utvekst. Til slutt, disse in vitro tilnærminger fjerne mikromiljøet som påvirker axons og deres svar på stikkordene langs forskjellige steder av deres kurs, og tradisjonelt bare teste en kø i isolasjon. Compounding disse ulempene, gjør den lille størrelsen på hver kjerne i øye motorsystemet disseksjon teknisk utfordrende for enten explants eller dissosiert kulturer. I tillegg er primære kulturer av øye motor neurons vanligvis heterogene, har betydelig celle død, og er tetthet avhengig, krever pooling av celler fra flere embryo (Ryosuki FUJIKI, personlig kommunikasjon). In vivo metoder, men inkludert knockout musemodeller, er upassende å bruke for screening, gitt den tid og utgifter som kreves.

Metoder utviklet for å kultur hele embryo19 tillate merking av å migrere celler20 eller blokade av spesifikke molekyler21, men hele embryo kulturer krever inkubasjons i rulle flasker som utelukker sanntids Imaging av merket Strukturer. Kirurgiske teknikker som tillater manipulering av embryo og deretter påfølgende videre utvikling enten i livmoren eller i magen av moren (opprettholde placenta)22 er også mulig, men disse heller ikke tillate time-lapse Imaging.

For å overvinne hindringene for in vitro analyser og tillate rask screening av signalering trasé, en ex vivo embryonale skjær kultur teknikk ble utviklet23, tilpasset fra en tidligere publisert protokoll for perifer nerve utvekst24. Ved hjelp av denne protokollen, kan utvikle nervus nerve bli avbildet over tid i nærvær av mange av de omkringliggende strukturer langs banen, inkludert EOM mål. Ved å legge til små molekyl hemmere, vekstfaktorer, eller veiledning signaler til kulturen Media, kan vi vurdere veiledning forstyrrelser på flere punkter langs axon banen, slik at mer rask vurdering av potensiell vekst og veiledning faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeidet beskrevet her ble godkjent og utført i samsvar med Boston Children ' s Hospital institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) protokoller.

1. tidsbestemt siamesere

  1. Sted ISLMN: GFP (Islet motor Nevron grønt fluorescerende protein; MGI: J:132726; JAX TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J Stock no: 017952) mannlige og kvinnelige mus sammen over natten. Veie hunnene og registrere vekter før paring.
    Merk: ISLMN: GFP spesielt etiketter motor NEURONS med en farnesylated GFP som ikke er cytotoksisk, lokaliseres til cellemembranen av motor neurons og deres axons, og gjør at nervene skal kunne visualisere under utbygging25. Andre fluorescensmerkete merket linjer kan også brukes.
  2. Se etter vaginale plugger tidlig om morgenen. Datoen en plugg identifiseres, er angitt som E 0.5.
  3. Bekreft graviditet ved hjelp av vektøkning og/eller ultralyd ved E 10.5. Gravide dammer bør ha fått minst 1 g. embryo kan sees på ultralyd på E 10.5.

2. utarbeidelse av reagenser og vibratome for skjære kultur

  1. Klargjør 500 mL skjære buffer: tilsett 5 mL HEPES og 5 mL penicillin/Streptomycin til 500 mL av Hank ' s balanserte salt Solution (HBSS) uten ca2 + og mg2 +.  Chill til 4 ° c.
    Merk: ekstra buffer for kutting bør oppbevares ved 4 ° c og kan brukes til fremtidige kultur eksperimenter.
  2. Forbered 50 mL kultur medier: i en steril hette, tilsett 12,5 mL HBSS, 12,5 mL Foster storfe, 250 μL av glukose, 250 μL av L-glutamin, 125 μL av HEPES til 24,4 mL Fluorobright DMEM. (Slutt konsentrasjoner: FlouroBright DMEM med 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% glukose, 1 mM glutamin og 2,5 mM HEPES.).  Varm kultur mediene til 37 ° c i et sterilt vannbad.
    Merk: kultur medier kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 3 uker.
    1. I en steril hette, tilsett 1,5 mL kultur medier til hver brønn av en 6-brønn plate.  Legg til en cellekultur sett inn (tabell av materialer) til hver brønn.  Plasser i en steril 37 ° c og 5% CO2 inkubator.
  3. Klargjør 4% lav Smeltetemperatur agarose: løs opp 2 g lav Smeltetemperatur agarose i 50 mL sterilt PBS. Mikrobølgeovn i 30-60 s intervaller til helt oppløst. Plasser i et vannbad på 40 ° c for å holde væsken.
    Merk: ekstra agarose kan lagres ved romtemperatur (RT) og smeltet for fremtidige Slice kultur eksperimenter.
  4. Sett opp vibratome: Legg et nytt blad på vibratome. Sjekk innstillinger: tykkelse 400-450 μm. pre-chill den vibratome scenen. Plasser litt is i ytter kammeret. Bruk et kammer og scene dedikert til levende skiver. Ikke bruk samme vibratome kammer for fast vev som resterende bindemiddel kan være skadelig for skiver.
  5. Klargjør mikroskop etappen til 37 ° c og 5% CO2.
  6. Forbered disseksjon: Rengjør Kirurgiske instrumenter og spray med 70% etanol. Fyll to Petri retter med HBSS, sted på isen. Åpne en 12 brønn vev kultur plate og plasser lokket på isen med undersiden vendt opp. Åpne en 6 brønn vev kultur plate og sted cellekultur membran inserts og 1,5 mL cellekultur medier i hver brønn. Pre-Warm platen i en 37 ° c og 5% CO2 inkubator.

3. høsting E 10.5 embryo og forbereder skiver

Merk: alle trinn fra dette punktet bør gjøres så raskt som mulig. Hold embryo på isen til enhver tid.

  1. Euthanize den gravide demningen (E 10.5) i et CO2 kammer. Utfør cervical forvridning.
  2. Spray magen med 70% etanol. Skjær åpne magen med saks, fjerne livmoren og legg den i en Petri rett med iskald HBSS å raskt vaske bort blod. Flytt den vasket livmoren til en andre Petri fylt med rett iskald HBSS.
  3. Under en dissekere omfang, fjerne embryo fra livmor horn og individuelle fostervann SACs. Plasser embryo på undersiden av lokket på en 12 brønn plate. Fortsett isen.
  4. Bruk filter papir for å fjerne væske som omgir hvert embryo, under et dissekere omfang.
    Merk: embryo vil holde seg til filter papiret hvis de berøres.
  5. Bygg inn embryo i agarose. Hell smeltet agarose over hvert embryo å dekke det. Fortsett isen. Så snart agarose har herdet, flip hvert embryo og helle ekstra agarose på den andre siden. Fortsett isen.
  6. Ved hjelp av et fluorescerende dissekere omfang, trim agarose rundt hvert embryo så det vil bli orientert riktig når limt til vibratome scenen. Den nervus kjernen og tidlig axon utvekst er fluorescerende. Juster fosteret slik at kjernen, outgrowing axons og øye danner en linje, og trim agarose med et barberblad kuttet parallelt med denne linjen (rygg til fosteret, se figur 1a).
    Merk: Dette vil være den siden limt til vibratome scenen (det embryo vil bli plassert på ryggen, hodet nærmest vibratome bladet). En linje mellom nervus kjernen og øyet bør være parallell med vibratome bladet.
  7. Fyll vibratome kammer med iskaldt skive buffer. Superlim embryo til vibratome scenen slik at bladet vil være parallelt med nervus kjernen og øynene. Når superlim er tørr, Senk vibratome scenen slik at fosteret er orientert vendt bort fra bladet.
  8. Slice 400-450 μm skiver.  Samle hver skive med en steril overførings Pipet. Plasseres i kald skjære buffer.
  9. Under dissekere omfang velger du stykket som inneholder nervus kjerner og øyne. Ved hjelp av en steril overføring Pipet, plassere den på cellen kulturen setter inn i 6 brønn plate. Returner platen til 37 ° c inkubator. Alternativt har en person kutting og en annen plassere skiver. Minimer tiden mellom kutting og plassering i inkubator.
    Merk: skiver skal være orientert på en måte som den maksimale fluorescens som slippes ut fra kjerner og axons er nærmest bildet mikroskop objektiv. På en invertert mikroskop, bør skiver plasseres på membranen med kjerner og axons nærmest målet under platen.
  10. Fjern resterende agarose fra vibratome scenen, superlim neste embryo til scenen og gjenta trinn 3.7-3.9 til alle embryo har blitt skiver og belagt.
  11. Legg til inhibitor eller rekombinant molekyl valg til Media i hver brønn for å lage en dose-respons kurve.  Fortynne i passende løsemiddel.
    Merk: Hvis du bruker DMSO, bruk bare vev kultur grade DMSO. Alternativt kan protein-tent perler plasseres på bestemte steder på stykket.
  12. Plasser på mikroskopet i 37 ° c og 5% CO2 kammer.  Sett mikroskopet til å ta fase kontrast og fluorescerende fotografier av hver skive hver 30 min (eller oftere hvis ønskelig). Skiver kan opprettholdes for 48-72 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Normal resultater: figur 1 gir et skjematisk av eksperimentet. Starter så tidlig som E 9.5 i mus, den første axons begynner å dukke opp fra nervus kjernen26. Ved E 10.5, en fasciculated nervus nerve, som inneholder de tidlige pioner neurons, kan sees i mesenchyme. Det er betydelig variasjon mellom embryo på E 10.5 (selv innenfor samme kull) i hvor langt nerve har kommet mot banen, sannsynligvis på grunn av utviklingsmessige forskjeller på noen timer. Under normale i Utero utvikling, den første GFP-positive nervus axons nå bane/øye over de neste 18-24 h (av e 11.5), og deretter begynne forgrening til sine endelige mål27. I Slice kultur, er denne timingen sammenfattet (figur 2, video 1). Stykket vokser og utvides (i alle retninger) for opp til 72 h, og axons kan sees strekker seg fra kjernen mot øyet. Vi har funnet den første 36-48 h mest nyttig for å vurdere nervus axon utvekst. Motor neurons kan noen ganger bli sett beveger seg innenfor kjernen (ikke vist). I noen skiver, avhengig av orientering, trochlear kjernen er også til stede. Trochlear axons utvide sidelengs innenfor skive og ofte stall, fordi deres normale kurs er å gå ut av Trochlear kjernen sideveis, før du slår dorsalt og caudally, som ville være ute av stykket. Noen ganger, trochlear axons ser ut til å bli med nervus axons og slå mot øyet, noe som gjør stykket vanskelig å tolke, som de axons kan ha en sekundær effekt på veiledning av nervus axons.

Eksempel på å hemme en viktig axon veiledning Pathway: hemme CXCR4 signalering forårsaker rygg i stedet for ventrale vekst av nervus axons. Vi vurderte rollen til CXCR4 signalering på nervus utvikling ved å legge 1 μg/mL (1,26 μM) av AMD3100, en vannløselig liten molekyl hemmer av CXCR428, direkte til kultur mediene så snart Slice kulturen er forberedt. Den nervus axons kan da sees som avslutter nervus nucleus dorsalt og vokser vekk fra banen ("baklengs") (figur 2, video 2). De axons som allerede hadde forlatt mellomhjernen og var på vei til banen på E 10.5 fortsette på deres vei. Hemming av CXCR4 påvirker også den samlede veksten av stykket.

Orientering av stykket er avgjørende. Stykker interpretable ikke hvis de ikke er riktig orientert. Noen eksempler på feil orienterte sektorer vises i Figur 3. Hvis fosteret er vippet til siden, er bare én nervus kjernen i stykket (Figur 3A).  Hvis den innebygde embryo er vippet for langt mot ryggen, øynene er ikke i stykket, og i stedet den øvre lem og hindbrain eller ryggmargen kan være i stykket (Figur 3B).  I dette tilfellet er den normale banen til nervus axons ikke er til stede, og de har en tendens til å vokse tilfeldig. Under plassering av stykket på kultur membranen, kan det bli foldet (Figur 3C).

Løsemidler kan være giftige. Forsiktighet bør utvises ved oppløsning av hemmere eller vekstfaktorer i organiske løsemidler. Figur 4 viser et eksempel på en skive som døde etter tilsetning av etanol til Media. 118 μL ble tilsatt til 1,5 mL av Media (siste konsentrasjon 7,8%), og denne høye konsentrasjonen viste seg å være giftig. For å unngå dette, oppløse oppløsninger i minimum av løsemiddel mulig (til grensen av løselighet). Når det er mulig, oppløses i vann. Hvis DMSO brukes, sørge for at det er sterilt, vev kultur grade DMSO.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk. E 10.5 ISLMN-GFP embryo (A: bilde, B: skjematisk) er skiver på en vibratome (400-450 μm tykk) slik at delene omfatter både nervus kjernen og bane. Parallelle stiplede linjer i A og B betegner plasseringen av vibratome kutt. Den nedre stiplede linjen i A viser hvor agarose skal beskjæres og limes til vibratome scenen. (C) seksjoner er lagt flatt på en vev-kultur membran, slik at utveksling av næringsstoffer og gasser, og plassert i en scene-topp inkubator for time-lapse mikroskopi. På dette stadiet, kan hemmere legges til vekst Media. (D) kulturer kan opprettholdes for 24-72 h, og nervus axons kan sees vokser til øyet. Tilpasset med tillatelse fra Whitman, et. Al. 201823. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Hemming av CXCR4 forårsaker CN3 misrouting. Skjær kulturer fra E 10.5 ISL-GFP embryo avbildet på 0, 12, 24 og 36 h i kultur. Den øverste panelet viser en vill-type kontroll embryo og CN3 (grønn) vokser mot øynene og grener mye i løpet av 36 h. Se også video 1. Det nederste panelet viser en skive med 1 μg/mL AMD3100 (spesifikk inhibitor for CXCR4) lagt til og axons avslutte nervus nucleus dorsalt. De som allerede hadde gått ut ventrally fortsette mot øyet. Se også video 2. D: rygg, V: ventrale, E: øye, N: nervus kjerne, SMN: spinal motor neurons, piler: nervus axons (hvit: wildtype projeksjon, gul: avvikende anslag). Scale bar tilsvarer 200 μm. Se også video 1 og video 2.  En lignende figur som viser andre eksempler ble presentert i Whitman, et. Al. 201823. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Orientering av skiver er avgjørende. Initial bilder (tid 0 h) av representative misoriented skiver. A viser en skive der fosteret ble vippet til siden slik at prosjektering CN3 axons ble axotomized. Projisering av axons er bare til stede på høyre side av stykket (pilen).  B viser et stykke der fosteret ble vippet tilbake så CN3 kjerner med prosjektering axons (pil) er synlige bilateralt, men øynene er ikke til stede i stykket. I stedet spinal motor neurons (SMN) og motorisk Nevron anslag til lemmer kan sees. C viser en skive som brettes under plassering på membranen. Sektorer som de som vises her, bør forkastes. Skala linjer representerer 500 μm i hvert panel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Løsemidler kan være giftige. Time-lapse Imaging av Slice kulturer fra E 10.5 ISL-GFP embryo på 0 og 12 h i kultur. Et stykke kultivert i media uten tilsetningsstoffer (A-B) vokser normalt for 12 h med CN3 axons projiserer mot øyet. Et stykke kultivert i Media med en høy konsentrasjon av etanol (7,8%) (C-D) ikke vokser normalt. Ved 12 h, CN3 har ikke vokst og er knapt synlig, og vevet har begynt å oppløses. Skala linjer representerer 500 μm i hvert panel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video 1: CN3 utvekst i Slice kultur. Time-lapse Imaging av en kontroll Slice kultur fra et E 10.5 ISL-GFP embryo. Bilder tatt hver 30 min over 18 timer i kultur. CN3 (grønn) vokser fra kjernen (øverst) mot øynene og begynner forgrening. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 2
Video 2: Mistargeting av CN3 med hemming av CXCR4 signalering. Time-lapse Imaging av skive kulturer fra E 10.5 ISL-GFP embryo over 48 h i kultur. Når 1 μg/mL AMD3100 (spesifikk inhibitor for CXCR4) legges direkte til mediet, CN3 axons som ennå ikke er i periferien avslutte nervus nucleus dorsalt (venstre) i stedet for ventrally (høyre). Gjengitt med tillatelse fra Whitman, et. Al. 201823. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne ex vivo Slice kultur-protokollen gir betydelige fordeler i forhold til tradisjonelle axon veiledning analyser23. Størrelsen på hver skallen motor kjernen er ikke en begrensende faktor, og ingen vanskelig disseksjon er nødvendig. Den endogene mikromiljøet gjennom som axons reise opprettholdes, slik at modifisering av en signalering sti og samtidig opprettholde andre signalering trasé. I tillegg kan effekter vurderes på ulike punkter langs axon banen. Siden axon veiledning krever flere signaler, og kombinasjoner av signaler, langs stien29, gir dette en betydelig fordel. I motsetning til i dissosiert eller explant kulturer, vokser axons ikke er kuttet i dette preparatet, så innledende axon utvekst kan vurderes, snarere enn axon gjenfødelse. I de fleste andre retningslinjer analyser, axon regenerering er faktisk vurderes, snarere enn første axon utvekst. Unngå axotomy også unngår betydelige potensielle forvirrende faktorer fordi neurons ikke er skadet eller under stress.

De to mest kritiske skritt er orienteringen av embryo for kutting og minimere tiden mellom døds-av mor og plassering av skiver i inkubator. Embryo må holdes på isen til enhver tid. For orientering, har vi prøvd flere forskjellige former, men på grunn av variasjon mellom embryo i denne alderen, har vi funnet at orientering for hånd, basert på fluorescens under dissekere mikroskop, er mest effektive. Orientering for hånd begrenser den embryonale tid vinduet som kan bli studert, men. Tidligere enn E 10.0, orientere stykket riktig er utfordrende fordi øyet er vanskelig å se og svært få CN3 axons kan sees. Dette betyr imidlertid at vi ikke kan bruke denne metoden til å studere de tidligste pioner axon utvekst, som vi trenger for å tillate disse axons å vokse ut en del måte å kunne orientere stykket.

Det er flere begrensninger på nervus Slice kultur forberedelse. Det er mest nyttig for å studere tidlig og mellomliggende veiledning beslutninger, snarere enn Terminal forgrening beslutninger. På E 10.5, den EOMs er til stede bare som en muskel anlage. Selv ved senere tidspunkt, med den nåværende Imaging-teknologien, kan individuelle mål EOMs ikke skilles i stykket. Bestemte gren forgreninger avgjørelser av nervus axons derfor ikke kan vurderes med gjeldende forhold. Fordi skiver dyrkes på porøse vev kultur membraner, post-kultur separasjon fra membranen er vanskelig og ofte fører til vevsskade, noe som gjør antistoff farging og remounting for ytterligere bildebehandling mislykket. Selv om axons ikke er kuttet, og dermed minimere neuronal Kader, er de omkringliggende vev kuttet og derfor skadet, noe som kan påvirke signalering stikkordet eller slipp. Det ideelle tidsvinduet er også begrenset. Som nevnt ovenfor, tidligere enn E 10.0 orientering av stykket er vanskelig, og etter E 11.5, mange axons har allerede nådd banen, så mellomliggende veiledning beslutninger allerede er gjort.

Preparatet krever et mikroskop med scene-topp inkubator, automatisk Stadium, og tidsforløp evne. Målene og kameraet må være optimalisert for avbildning av tykke prøver uten avregning. Oppløsning på nivå med en enkelt vekst kjegle, som er mulig med noen kultur forberedelser, er ikke mulig med gjeldende Imaging oppsett. Det tenkelig parameterene kunne, imidlertid, muligens være omarbeidet å tillate høyere resolution, med konfokalmikroskopi eller 2-Foton mikroskopi, fokusere opp på en liten område av hver skive (muligheter innstillings-idet det skive idet axons avle). Ved hjelp av gjeldende epifluorescent mikroskop og bildebehandling hver 30 min, har vi ikke sett photobleaching; konfokalmikroskopi mikroskopi og hyppigere bildebehandling kan brukes, men photobleaching ville blitt et potensielt problem.

Fordi små molekyl hemmere kan ha off-Target effekter, blant annet på generelle vekst og helse av stykket, er denne analysen mest nyttig som en screening verktøyet. Resultatene må bekreftes av andre metoder, for eksempel knockout-mus modeller. For eksempel, med CXCR4 hemming, er det mild redusert total vekst av stykket (se figur 2), i samsvar med de mange funksjonene i CXCR4. I musemodeller, men den axon fenotype sett i stykket var sammenfattet23.

Denne protokollen kan bli endret for å studere andre skallen nerve populasjoner, men for hver, ville riktig orientering av skiver og timing må være empirisk bestemmes. I tillegg kan mus med ulike fluorescerende etiketter brukes som markerer ulike delsett av neurons og/eller som slår på til tidligere eller senere embryonale aldre.

Stykket kulturen kan manipuleres på flere måter. Vi viser her et eksempel på blokkering reseptor signalering med et lite molekyl inhibitor. Antistoffer (enten reseptor blokkering eller reseptor aktivering) eller rekombinant proteiner, som axon veilednings signaler eller vekstfaktorer, kan også legges til i mediene. For å evaluere for retningsbestemt effekter på axon veiledning, ligand-sekresjon perler kan plasseres på skive på bestemte steder. Ved hjelp av noen av disse metodene kan mange andre axon veilednings veier identifiseres og studert i øye motorsystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Finansiering gitt av National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child helse og utvikling [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical forsker Development program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [karriere starter Grant], og Children ' s Hospital Oftalmologi Foundation [fakultet Discovery Award]. ECE er en Howard Hughes Medical Institute etterforsker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors - Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
  2. Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25, (1), 29-41 (2000).
  3. Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25, (1), 43-56 (2000).
  4. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70, (8), 549-564 (2010).
  5. Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82, (2), 334-349 (2014).
  6. Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140, (1), 74-87 (2010).
  7. Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399, (1), 68-79 (2015).
  8. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
  9. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (42), 16540-16551 (2013).
  10. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (36), 14669-14674 (2012).
  11. Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (45), 17647-17655 (2013).
  12. Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105, (2), 379-387 (1977).
  13. Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177, (1), 123-129 (1998).
  14. Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101, (4), 909-913 (1987).
  15. Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81, (2), 283-287 (1990).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8, (2), 227-237 (2008).
  17. Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144, (1), 79-89 (2005).
  18. Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8, (1), 34-57 (2008).
  19. Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244, (1), 155-169 (2002).
  20. Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, (31), 10551-10562 (2010).
  21. Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
  22. Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
  23. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59, (12), 5201-5209 (2018).
  24. Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
  25. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, (4), 604-620 (2007).
  26. Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13, (1), 285-299 (1993).
  27. Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58, (4), 2388-2396 (2017).
  28. Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200, (3), 337-355 (2013).
  29. Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145, (10), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics