Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo

Neuroscience

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Summary

Un présagéex-invivo permet d'imaginer l'excroissance du nerf oculomoteur en temps réel. Les tranches sont générées par l'intégration d'embryons E10.5 IslMN:GFP dans l'agarose, en coupant sur un vibratome et en grandissant dans un incubateur de toit de scène. Le rôle des voies de guidage d'axone est évalué en ajoutant des inhibiteurs aux médias de culture.

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Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

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Abstract

Les mouvements précis des yeux sont cruciaux pour la vision, mais le développement du système moteur oculaire, en particulier les voies moléculaires contrôlant le guidage des axones, n'a pas été entièrement élucidé. Cela est dû en partie aux limitations techniques des essais traditionnels de guidage d'axone. Pour identifier les indices additionnels de guidage d'axone influençant le nerf oculomoteur, un assay de tranche ex vivo pour imager le nerf oculomoteur en temps réel pendant qu'il se développe vers l'oeil a été développé. E10.5 Les embryons Isl MN-GFP sont utilisés pour générer des tranches ex vivo en les incorporant dans l'agarose, en les coupant sur un vibratome, puis en les cultivant dans un incubateur au microscope avec photomicroscopie en accéléré de 24 à 72 h. Les tranches de contrôle récapitulent le moment in vivo de la croissance des axones du noyau à l'orbite. Des inhibiteurs de petites molécules ou des protéines recombinantes peuvent être ajoutés au support culturel pour évaluer le rôle de différentes voies de guidage des axones. Cette méthode a l'avantage de maintenir une plus grande partie du microenvironnement local par lequel les axones traversent, et non pas d'axotomiser les axones en croissance, et d'évaluer les axones à plusieurs points le long de leur trajectoire. Il peut également identifier des effets sur des sous-ensembles spécifiques d'axones. Par exemple, l'inhibition du CXCR4 provoque une croissance dorale des axones dans le cerveau moyen plutôt que ventrale, mais les axones qui sont déjà sortis ventrales ne sont pas affectés.

Introduction

Le système moteur oculaire fournit un système élégant pour étudier les mécanismes de guidage des axones. Il est relativement simple, composé de trois nerfs crâniens intériorisant six muscles extraoculaires (EOM) qui déplacent l'œil, et le levator palpebrae superioris (LPS) qui soulève la paupière. Le nerf oculomoteur intémine les LPS et quatre EOM - les muscles inférieurs obliques et les muscles rectus médiaux, inférieurs et supérieurs. Les deux autres nerfs, le trochlear et les abducens, chacun seulement innervate un muscle, le muscle supérieur oblique et latéral de rectus, respectivement. Les mouvements des yeux fournissent une lecture facile, montrant si l'innervation était appropriée, manquante ou aberrante. En outre, il y a des désordres humains de mouvement d'oeil qui résultent des déficits dans le développement neuronal ou le guidage d'axone, collectivement appelé les désordres crâniens congénitaux de disinnervation (CCDDs)1.

Malgré ces avantages, le système moteur oculaire est rarement utilisé dans les études de guidage d'axone2,3,4,5,6,7,8, 9 (en) , 10, en raison d'inconvénients techniques. Les tests de guidage d'axone in vitro ont beaucoup d'inconvénients11. Les essais de co-culture, dans lesquels les explants neuronaux sont cultivés ensemble avec des explants de tissu cible12 ou des cellules transfectées13,dépendent à la fois de la symétrie de l'explantation et du positionnement précis entre l'explante et le tissu cible. Les essais à rayures14,15, dans lesquels deux indices sont posés en rayures alternées et les axones sont évalués pour une croissance préférentielle sur une bande, indiquent seulement qu'un substrat est préférable à l'autre, non pas que l'un ou l'autre est attrayant répugnant, ou physiologiquement pertinent. Les chambres microfluidiques peuvent former des gradients chimiques précis, mais les axones de plus en plus de sujet pour cisailler le stress16,17,18, qui peuvent affecter leur croissance. En outre, dans chacune de ces approches, la collecte d'explants ou de cellules dissociées exige que les axones de croissance soient axotomisés et donc ces essais examinent réellement la régénération d'axone, plutôt que la croissance initiale d'axone. Enfin, ces approches in vitro éliminent le microenvironnement qui influence les axones et leurs réponses aux indices le long de différents points de leur cours, et traditionnellement seulement tester un signal dans l'isolement. En plus de ces inconvénients, la petite taille de chaque noyau dans le système moteur oculaire rend la dissection techniquement difficile pour les explantations ou les cultures dissociées. En outre, les cultures primaires des neurones moteurs oculaires sont habituellement hétérogènes, ont la mort cellulaire significative, et sont dépendantes de densité, exigeant la mise en commun des cellules des embryons multiples (Ryosuki Fujiki, communication personnelle). Les méthodes in vivo, cependant, y compris les modèles de souris knock-out, sont inappropriés à utiliser pour le dépistage, compte tenu du temps et des dépenses requises.

Les méthodes développées pour la culture d'embryons entiers19 permettent l'étiquetage des cellules migratrices20 ou le blocus de molécules spécifiques21, mais les cultures d'embryons entiers nécessitent l'incubation dans des bouteilles à rouleaux, ce qui empêche l'imagerie en temps réel de l'étiquetage Structures. Les techniques chirurgicales qui permettent la manipulation de l'embryon, puis le développement ultérieur soit dans l'utérus ou dans l'abdomen de la mère (maintien de la connexion placentaire)22 sont également possibles, mais ceux-ci ne permettent pas non plus time-lapse Imagerie.

Pour surmonter les obstacles des essais in vitro et permettre un dépistage rapide des voies de signalisation, une technique de culture de tranches embryonnaires ex vivo a été développée23, adaptée d'un protocole précédemment publié pour la croissance nerveuse périphérique24. Grâce à ce protocole, le nerf oculomoteur en développement peut être représenté au fil du temps en présence de nombreuses structures environnantes le long de sa trajectoire, y compris les cibles de l'OME. En ajoutant des inhibiteurs de petites molécules, des facteurs de croissance ou des indices de guidage aux médias de culture, nous pouvons évaluer les perturbations de guidage à plusieurs points le long de la trajectoire d'axone, permettant une évaluation plus rapide des facteurs de croissance et d'orientation potentiels.

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Protocol

Tous les travaux sur les animaux décrits ici ont été approuvés et exécutés conformément aux protocoles du Boston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Accouplements chronométrés

  1. Placez ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg (Isl-EGFP)1Slp/J Stock No: 017952) souris mâles et femelles ensemble pendant la nuit. Peser les femelles et enregistrer les poids avant l'accouplement.
    REMARQUE: ISLMN:GFP étiquette spécifiquement les neurones moteurs avec un GFP farnésilé qui n'est pas cytotoxique, localise à la membrane cellulaire des neurones moteurs et de leurs axones, et permet aux nerfs d'être visualisés pendant le développement25. D'autres lignes étiquetées fluorescentes pourraient également être utilisées.
  2. Vérifiez s'il y a des prises vaginales tôt le matin. La date à laquelle une prise est identifiée est désignée comme E0.5.
  3. Confirmer la grossesse en utilisant un gain de poids et/ou une échographie à E10.5. Les barrages enceintes auraient dû gagner au moins 1 g. Les embryons peuvent être vus à l'échographie à E10.5.

2. Préparation des réactifs et du vibratome pour la culture des tranches

  1. Préparer 500 ml de tampon de tranchage : ajouter 5 ml de HEPES et 5 ml de pénicilline/streptomycine à 500 ml de solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) sans Ca2 et Mg2.  Réfrigérer jusqu'à 4 oC.
    REMARQUE : Le tampon de coupe supplémentaire doit être stocké à 4 oC et peut être utilisé pour de futures expériences de culture de tranches.
  2. Préparer 50 ml de supports culturels : Dans une hotte stérile, ajouter 12,5 mL de HBSS, 12,5 ml de sérum bovin fœtal, 250 l de glucose, 250 l de L-glutamine, 125 oL de HEPES à 24,4 ml de Fluorobright DMEM. (Concentrations finales: FlouroBright DMEM avec 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% glucose, 1 mM glutamine, et 2.5 mM HEPES.).  Réchauffer les supports culturels à 37 oC dans un bain d'eau stérile.
    REMARQUE : Les supports culturels peuvent être stockés à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à 3 semaines.
    1. Dans une hotte stérile, ajouter 1,5 ml de support culturel à chaque puits d'une assiette de 6 puits.  Ajouter un insert de culture cellulaire (Table des Matériaux) à chaque puits.  Placer dans un incubateur stérile de 37 oC et 5 % de CO 2.
  3. Préparer 4 % d'agarose à basse température : dissoudre 2 g d'agarose à basse température dans 50 ml de PBS stérile. Micro-ondes à intervalles de 30-60 s jusqu'à dissolution complète. Placer dans un bain d'eau de 40 oC pour garder le liquide.
    REMARQUE : L'agarose supplémentaire peut être stockée à température ambiante (RT) et fondue pour de futures expériences de culture de tranches.
  4. Configurer le vibratome : Placez une nouvelle lame sur le vibratome. Vérifier les réglages : épaisseur de 400 à 450 m. Pré-réfrigérer le stade vibratome. Placez un peu de glace dans la chambre extérieure. Utilisez une chambre et une scène dédiées aux tranches vivantes. N'utilisez pas la même chambre vibratome pour les tissus fixes que le fixatif résiduel pourrait être dommageable pour les tranches.
  5. Préparer l'incubateur de l'étape du microscopeà 37 oC et 5 % de CO 2.
  6. Préparez-vous à la dissection : Nettoyez les instruments chirurgicaux et vaporisez-les avec 70 % d'éthanol. Remplir deux plats Petri avec HBSS, placer sur la glace. Ouvrez une plaque de culture de 12 puits et placez le couvercle sur la glace avec le dessous vers le haut. Ouvrez une plaque de culture de tissu de 6 puits et placez des inserts de membrane de culture cellulaire et des médias de culture cellulaire de 1,5 ml dans chaque puits. Préchauffer la plaque dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.

3. Récolte d'embryons E10.5 et préparation de tranches

REMARQUE : Toutes les étapes à partir de ce point doivent être faites aussi rapidement que possible. Gardez les embryons sur la glace en tout temps.

  1. Euthanasier le barrage enceinte (E10.5) dans une chambre CO 2. Effectuer la dislocation cervicale.
  2. Vaporiser l'abdomen avec 70% d'éthanol. Couper l'abdomen avec des ciseaux, enlever l'utérus et le placer dans un plat Petri avec hbSS froid glacé pour laver rapidement le sang. Déplacer l'utérus lavé à un deuxième Petri rempli de glace de vaisselle froide HBSS.
  3. Sous une portée de dissection, retirez les embryons de la corne utérine et des sacs amniotiques individuels. Placer les embryons sur le dessous du couvercle d'une plaque de 12 puits. Restez sur la glace.
  4. Sous une portée de dissection, utilisez du papier filtre pour enlever tout liquide entourant chaque embryon.
    REMARQUE : Les embryons colleront au papier filtre s'ils sont touchés.
  5. Intégrer des embryons dans l'agarose. Verser l'agarose fondue sur chaque embryon pour le couvrir. Restez sur la glace. Dès que l'agarose s'est durcie, retournez chaque embryon et versez de l'agarose supplémentaire de l'autre côté. Restez sur la glace.
  6. À l'aide d'une lunette de dissection fluorescente, taillez l'agarose autour de chaque embryon afin qu'il soit orienté correctement lorsqu'il est collé au stade du vibratome. Le noyau oculomoteur et la croissance précoce de l'axone sont fluorescents. Alignez l'embryon de sorte que le noyau, les axones en croissance et les yeux forment une ligne, et taillez l'agarose avec une lame de rasoir coupée parallèlement à cette ligne (dorsal à l'embryon, voir Figure 1A).
    REMARQUE: Ce sera le côté collé au stade vibratome (l'embryon sera positionné sur son dos, la tête la plus proche de la lame vibratome). Une ligne entre le noyau oculomoteur et l'œil doit être parallèle à la lame de vibratome.
  7. Remplir la chambre vibratome d'un tampon de tranches glacées. Superglue l'embryon au stade vibratome de sorte que la lame sera parallèle avec le noyau oculomoteur et les yeux. Une fois que la superglue est sèche, immerger le stade vibratome de sorte que l'embryon est orienté vers l'extérieur de la lame.
  8. Trancher 400-450 tranches de m.  Recueillir chaque tranche avec un tuyau de transfert stérile. Placer dans un tampon de coupe à froid.
  9. Sous la portée de dissection, choisissez la tranche contenant les noyaux et les yeux oculomoteurs. À l'aide d'un tuyau de transfert stérile, placez-le sur l'insert de culture cellulaire dans la plaque de 6 puits. Remettre la plaque dans l'incubateur de 37 oC. Alternativement, demandez à une personne de trancher et une autre de placer les tranches. Minimisez le temps entre le découpage et le placement dans l'incubateur.
    REMARQUE : Les tranches doivent être orientées de manière à ce que la fluorescence maximale émise par les noyaux et les axones soit la plus proche de l'objectif du microscope d'imagerie. Sur un microscope inversé, les tranches doivent être placées sur la membrane avec les noyaux et les axones les plus proches de l'objectif sous la plaque.
  10. Retirez l'agarose résiduelle du stade du vibratome, supergluelez l'embryon suivant à l'étape et répétez les étapes 3.7-3.9 jusqu'à ce que tous les embryons aient été tranchés et plaqués.
  11. Ajouter l'inhibiteur ou la molécule recombinante de choix aux médias dans chaque puits pour créer une courbe dose-réponse.  Diluer dans un solvant approprié.
    REMARQUE : Si vous utilisez le DMSO, n'utilisez que le DMSO de qualité de culture tissulaire. Alternativement, les perles éliantes de protéines peuvent être placées dans des endroits spécifiques sur la tranche.
  12. Placer sur le microscope dans la chambre CO2 de 37 oC et 5 %.  Définir le microscope pour prendre le contraste de phase et les photographies fluorescentes de chaque tranche toutes les 30 min (ou plus souvent si désiré). Les tranches peuvent être maintenues pendant 48-72 h.

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Representative Results

Résultats normaux : La figure 1 fournit un schéma de l'expérience. Commençant dès E9.5 dans la souris, les premiers axones commencent à émerger du noyau oculomoteur26. Par E10.5, un nerf oculomoteur fasculé, qui contient les premiers neurones pionniers, peut être vu dans le mésenchyme. Il existe une variabilité significative entre les embryons à E10.5 (même dans la même portée) dans la mesure dans laquelle le nerf a progressé vers l'orbite, probablement en raison de différences de développement de quelques heures. Pendant le développement in utero normal, les premiers axones oculomoteurs GFP-positifs atteignent l'orbite/oeil au cours de la prochaine 18-24 h (par E11.5), puis commencent à se ramifier à leurs cibles finales27. Dans la culture des tranches, ce timing est récapitulé (Figure 2,Vidéo 1). La tranche pousse et se dilate (dans toutes les directions) jusqu'à 72 h, et on peut voir des axones s'étendant du noyau vers l'œil. Nous avons trouvé le premier 36-48 h le plus utile pour évaluer la croissance d'axone oculomoteur. Les neurones moteurs peuvent parfois être vus se déplaçant dans le noyau (non montré). Dans certaines tranches, selon l'orientation, le noyau trochléaire est également présent. Les axones trochléaires s'étendent latéralement à l'intérieur de la tranche et calent souvent, parce que leur cours normal est de sortir du noyau trochléaire latéralement, avant de tourner doraïquement et caudally, qui serait hors de la tranche. De temps en temps, les axones trochléaires semblent se joindre aux axones oculomoteurs et se tourner vers l'œil, ce qui rend la tranche difficile à interpréter, car ces axones peuvent avoir un effet secondaire sur le guidage des axones oculomoteurs.

Exemple d'inhibition d'une voie de guidage d'axone importante : Inhiber la signalisation CXCR4 provoque la croissance dorsale plutôt que ventrale des axones oculomoteurs. Nous avons évalué le rôle de la signalisation CXCR4 sur le développement oculomoteur en ajoutant 1 g/mL (1,26 M) d'AMD3100, un inhibiteur de petite molécule soluble dans l'eau du CXCR428, directement aux médias de culture dès que la culture de la tranche est préparée. Les axones oculomoteurs peuvent alors être vus sortant du noyau oculomoteur dorasiquement et s'éloignant de l'orbite (" à l'envers ") (Figure 2, Vidéo 2). Les axones qui avaient déjà quitté le cerveau moyen et étaient en route vers l'orbite à E10.5 continuent sur leur chemin. L'inhibition du CXCR4 affecte également la croissance globale de la tranche.

L'orientation de la tranche est cruciale. Les tranches ne sont pas interprétables si elles ne sont pas orientées correctement. Quelques exemples de tranches mal orientées sont présentés à la figure 3. Si l'embryon est incliné sur le côté, un seul noyau oculomoteur se trouve dans la tranche (Figure 3A).  Si l'embryon incorporé est incliné trop loin vers son dos, les yeux ne sont pas dans la tranche, et au lieu de cela le membre supérieur et le cerveau arrière ou la moelle épinière peuvent être dans la tranche (Figure 3B).  Dans ce cas, la trajectoire normale des axones oculomoteurs n'est pas présente, et ils ont tendance à se développer au hasard. Pendant le placement de la tranche sur la membrane de culture, elle peut se plier (Figure 3C).

Les solvants peuvent être toxiques. Il faut faire attention lors de la dissolution d'inhibiteurs ou de facteurs de croissance dans les solvants organiques. La figure 4 montre un exemple de tranche qui est morte après l'ajout d'éthanol dans les médias. 118 L ont été ajoutés à 1,5 ml de support (concentration finale de 7,8 %), et cette forte concentration s'est avérée toxique. Pour éviter cela, dissoudre les solutés dans la quantité minimale de solvant possible (à la limite de la solubilité). Dans la mesure du possible, dissoudre dans l'eau. Si le DMSO est utilisé, assurez-vous qu'il est stérile, la culture tissulaire de qualité DMSO.

Figure 1
Figure 1 : Schématique. E10.5 Les embryons IslMN-GFP (A: photo, B: schématique) sont tranchés sur un vibratome (400-450 m d'épaisseur) de sorte que les sections comprennent à la fois le noyau oculomoteur et l'orbite. Des lignes pointillées parallèles en A et B indiquent l'emplacement des coupes vibratome. La ligne pointillée inférieure en A montre où l'agarose doit être taillée et collée à la scène vibratome. (C) Les sections sont posées à plat sur une membrane de culture tissulaire, permettant l'échange de nutriments et de gaz, et placées dans un incubateur de pointe pour la microscopie en accéléré. À ce stade, des inhibiteurs peuvent être ajoutés aux supports de croissance. (D) Les cultures peuvent être maintenues pendant 24-72 h, et les axones oculomoteurs peuvent être vus de plus en plus à l'œil. Adapté avec la permission de Whitman, et. al. 201823. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : L'inhibition du CXCR4 provoque une mauvaise routage du CN3. Trancher les cultures des embryons E10.5 Isl-GFP représentés à 0, 12, 24 et 36 h en culture. Le panneau supérieur montre un embryon témoin de type sauvage et le CN3 (vert) pousse vers les yeux et les branches en profondeur au cours de 36 h. Voir aussi la vidéo 1. Le panneau inférieur montre une tranche avec 1 'g/mL AMD3100 (inhibiteur spécifique pour CXCR4) ajouté et les axones quittent le noyau oculomoteur dorsally. Ceux qui étaient déjà sortis ventralement continuer vers l'œil. Voir aussi la vidéo 2. D: dorsal, V: ventral, E: eye, N: oculomotor nucleus, SMN: spinal motor neurons, arrows: oculomotor axones (white: wildtype projection, yellow: aberrant projections). La barre d'échelle équivaut à 200 m. Voir aussi la vidéo 1 et la vidéo 2.  Un chiffre similaire montrant d'autres exemples a été présenté dans Whitman, et. al. 201823. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : L'orientation des tranches est cruciale. Images initiales (temps 0 h) de tranches représentatives mal orientées. A montre une tranche dans laquelle l'embryon a été incliné sur le côté de telle sorte que la projection des axones CN3 ont été axotomisés. Les axones projetants ne sont présents que sur le côté droit de la tranche (flèche).  B montre une tranche dans laquelle l'embryon a été incliné vers l'arrière de sorte que les noyaux CN3 avec des axones projetants (flèche) sont visibles bilatéralement, mais les yeux ne sont pas présents dans la tranche. Au lieu de cela les neurones moteurs spinaux (SMN) et les projections de neurones moteurs aux membres peuvent être vus. C montre une tranche qui s'est pliée pendant le placement sur la membrane. Les tranches telles que celles présentées ici doivent être jetées. Les barres d'échelle représentent 500 m dans chaque panneau. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Les solvants peuvent être toxiques. Imagerie en accéléré des cultures de tranches des embryons E10.5 Isl-GFP à 0 et 12 h en culture. Une tranche cultivée dans les médias sans additifs (A-B) pousse normalement pendant 12 h avec des axones CN3 se projetant vers l'œil. Une tranche cultivée dans les médias avec une forte concentration d'éthanol (7,8 %) (C-D) ne se développe pas normalement. À 12 h, le CN3 n'a pas grandi et est à peine visible, et le tissu a commencé à se désintégrer. Les barres d'échelle représentent 500 m dans chaque panneau. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Video 1
Vidéo 1 : Excroissance cN3 dans la culture des tranches. Imagerie en accéléré d'une culture de tranche témoin à partir d'un embryon E10.5 Isl-GFP. Images prises toutes les 30 min sur 18 h en culture. CN3 (vert) pousse du noyau (en haut) vers les yeux et commence à se ramifier. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Video 2
Vidéo 2 : Ciblage erroné du CN3 avec inhibition de la signalisation CXCR4. Imagerie en accéléré des cultures de tranches d'embryons E10.5 Isl-GFP de plus de 48 h en culture. Lorsqu'un AMD3100 (inhibiteur spécifique pour CXCR4) est ajouté directement au support, les axones CN3 qui ne sont pas encore dans la périphérie sortent du noyau oculomoteur doraillard (à gauche) plutôt que ventralement (à droite). Réimprimé avec la permission de Whitman, et. al. 201823. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

Ce protocole de culture de tranche ex vivo fournit des avantages significatifs au-dessus des essais traditionnels de guidage d'axone23. La taille de chaque noyau moteur crânien n'est pas un facteur limitant, et aucune dissection difficile n'est nécessaire. Le microenvironnement endogène à travers lequel les axones voyagent est maintenu, permettant la modification d'une voie de signalisation tout en maintenant d'autres voies de signalisation. En outre, les effets peuvent être évalués à différents points le long de la trajectoire de l'axone. Depuis le guidage axone nécessite de multiples indices, et des combinaisons de repères, le long du chemin29, cela fournit un avantage significatif. Contrairement aux cultures dissociées ou explantées, les axones en croissance ne sont pas coupés dans cette préparation, de sorte que la croissance initiale de l'axone peut être évaluée, plutôt que la régénération des axones. Dans la plupart des autres essais de guidage, la régénération des axones est en fait évaluée, plutôt que la croissance initiale de l'axone. Éviter l'axotomie évite également les facteurs de confusion potentiels importants parce que les neurones ne sont pas endommagés ou sous l'effort.

Les deux étapes les plus critiques sont l'orientation des embryons pour trancher et minimiser le temps entre l'euthanasie de la mère et le placement des tranches dans l'incubateur. Les embryons doivent être conservés sur la glace en tout temps. Pour l'orientation, nous avons essayé plusieurs moules différents, mais en raison de la variabilité entre les embryons à cet âge, nous avons constaté que l'orientation à la main, basée sur la fluorescence sous le microscope disséquer, est la plus efficace. L'orientation à la main limite la fenêtre de temps embryonnaire qui peut être étudiée, cependant. Plus tôt que E10.0, il est difficile d'orienter correctement la tranche parce que l'œil est difficile à voir et que très peu d'axones CN3 peuvent être vus. Cela signifie, cependant, que nous ne pouvons pas utiliser cette méthode pour étudier la plus ancienne excroissance d'axone pionnier, car nous devons permettre à ces axones de se développer à mi-chemin pour être en mesure d'orienter la tranche.

Il y a plusieurs limitations à la préparation de culture de tranche d'oculomotor. Il est plus utile pour étudier les décisions d'orientation précoces et intermédiaires, plutôt que pour les décisions de branchement terminale. À E10.5, les EOM ne sont présents qu'en tant qu'anlage musculaire. Même à des moments ultérieurs, avec la technologie d'imagerie actuelle, les EMO cibles individuelles ne peuvent pas être distinguées dans la tranche. Les décisions spécifiques de branchement terminale des axones oculomoteurs ne peuvent donc pas être évaluées avec les conditions actuelles. Puisque les tranches sont cultivées sur les membranes poreuses de culture de tissu, la séparation post-culture de la membrane est difficile et cause souvent des dommages de tissu, faisant la coloration d'anticorps et remontant pour l'imagerie additionnelle infructueuse. Bien que les axones ne soient pas coupés, minimisant ainsi les dommages neuronaux, les tissus environnants sont coupés et donc endommagés, ce qui pourrait affecter l'expression ou la libération du signal. La fenêtre de temps idéale est également limitée. Comme indiqué ci-dessus, plus tôt que l'orientation E10.0 de la tranche est difficile, et après E11.5, de nombreux axones ont déjà atteint l'orbite, de sorte que les décisions de guidage intermédiaire ont déjà été prises.

La préparation nécessite un microscope avec incubateur de pointe, stade automatique, et la capacité time-lapse. Les objectifs et la caméra doivent être optimisés pour l'imagerie de spécimens épais sans compensation. La résolution au niveau d'un cône de croissance unique, comme c'est possible avec certaines préparations de culture, n'est pas possible avec la configuration actuelle d'imagerie. Les paramètres d'imagerie pourraient toutefois être adaptés pour permettre une résolution plus élevée, avec microscopie confocale ou à 2 photons, en se concentrant sur une petite zone de chaque tranche (potentiellement ajustant au fur et à mesure que les axones grandissent). À l'aide du microscope épifluorescent actuel et de l'imagerie toutes les 30 min, nous n'avons pas vu de photoblanchiment; la microscopie confocale et l'imagerie plus fréquente pourraient être employées, mais le photoblanchiment deviendrait un problème potentiel.

Étant donné que les inhibiteurs de petites molécules peuvent avoir des effets hors cible, y compris sur la croissance globale et la santé de la tranche, cet analyse est plus utile comme outil de dépistage. Les résultats doivent être vérifiés par d'autres méthodes, telles que les modèles de souris knock-out. Par exemple, avec l'inhibition cXCR4, il y a une légère diminution de la croissance globale de la tranche (voir la figure 2), compatible avec les multiples fonctions de CXCR4. Dans les modèles de souris, cependant, le phénotype d'axone vu dans la tranche a été récapitulé23.

Ce protocole pourrait être modifié pour étudier d'autres populations de nerfs crâniens, bien que pour chacun, l'orientation appropriée des tranches et le moment devraient être déterminés empiriquement. En outre, des souris avec différentes étiquettes fluorescentes pourraient être employées qui marquent différents sous-ensembles des neurones et/ou qui s'allument à des âges embryonnaires plus tôt ou plus tard.

La culture de tranche peut être manipulée de plusieurs manières. Nous montrons ici un exemple de signalisation des récepteurs de blocage avec un inhibiteur de petite molécule. Alternativement, des anticorps (bloquant ou activant les récepteurs) ou des protéines recombinantes, telles que des indices de guidage d'axone ou des facteurs de croissance, pourraient être ajoutés aux médias. Pour évaluer les effets directionnels sur le guidage des axones, des perles de sécrétion de ligand peuvent être placées sur la tranche à des endroits précis. En utilisant l'une de ces méthodes, de nombreuses autres voies de guidage des axones peuvent être identifiées et étudiées dans le système moteur oculaire.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Financement fourni par le National Eye Institute [5K08EY027850], le National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Le Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], la Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant], et la Children's Hospital Ophthalmology Foundation [Prix de découverte de la Faculté]. ECE est un chercheur de l'Institut médical Howard Hughes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors - Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

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References

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