Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Målet med denne protokol er at vise, hvordan man bruger Lattice Light-Sheet Mikroskopi til firedimensionelt visualisere overflade receptor dynamik i levende celler. Her vises T-cellereceptorer på CD4+ primære T-celler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e59914, doi:10.3791/59914 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Signalning og funktion af en celle er dikteret af de dynamiske strukturer og interaktioner af dens overflade receptorer. For virkelig at forstå strukturen-funktion forholdet mellem disse receptorer in situ, vi nødt til at visualisere og spore dem på levende celle overflade med nok spatiotemporal opløsning. Her viser vi, hvordan man bruger nyligt udviklede Lattice Light-Sheet Mikroskopi (LLSM) til billede T-celle receptorer (THRs) fire-dimensionelt (4D, rum og tid) på levende celle membran. T celler er en af de vigtigste effektor celler i adaptive immunsystem, og her brugte vi T celler som et eksempel for at vise, at signalering og funktion af disse celler er drevet af dynamikken og samspillet mellem THR'er. LLSM giver mulighed for 4D-billeddannelse med hidtil uset spatiotemporal opløsning. Denne mikroskopi teknik kan derfor generelt anvendes på en bred vifte af overflade eller intracellulære molekyler af forskellige celler i biologi.

Introduction

Den præcise dynamik molekyler handel og sprede på de tre-dimensionelle celle overflade i realtid har været en gåde at løse. Mikroskopi har altid været en balance mellem hastighed, følsomhed og opløsning; hvis en eller to er maksimeret, minimeres den tredje. Derfor, på grund af den lille størrelse og enorme hastighed, hvormed overfladen receptorer flytte, sporing deres dynamik har været en stor teknologisk udfordring for området cellebiologi. For eksempel er mange undersøgelser blevet udført ved hjælp af total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi1,2,3, som har høj tidsmæssig opløsning, men kan kun billedet en meget tynd skive af T-cellemembranen (~ 100 nm), og derfor savner begivenheder sker længere væk i cellen. Disse TIRF billeder viser også kun en to-dimensionel del af cellen. Derimod kan superopløsningsteknikker, såsom stokastiske optiske rekonstruktionsmikroskopi (STORM)4, fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM)5og stimuleret emissionsnedbrydelsesmikroskopi (STED)6, overvinde Abbe diffraktionsgrænsen for lys. Disse teknikker har høj rumlig opløsning (~ 20 nm opløsning)4,5,6,7, men de ofte tager mange minutter at erhverve en fuld to-dimensionelle (2D) eller tre-dimensionelle (3D) billede, og derfor den tidsmæssige opløsning er tabt. Desuden kan teknikker som STORM og PALM, der er afhængige af blinkende signaler, have unøjagtigheder ioptællingen af 8,9. Elektronmikroskopi har langt den højeste opløsning (op til 50 pm opløsning)10; det kan endda udføres tredimensionelt med fokuseret ionstråle scanning elektron mikroskopi (FIB-SEM), hvilket resulterer i op til 3 nm XY og 500 nm Z opløsning11. Enhver form for elektronmikroskopi kræver imidlertid barske prøveforberedelse og kan kun udføres med faste celler eller væv, hvilket eliminerer muligheden for billeddannelse levende prøver over tid.

Teknikker til at opnå den høje spatiotemporal opløsning, der kræves for at identificere dynamikken i overflade og intracellulære molekyler i levende celler i deres sande fysiologiske 3D natur er først for nylig udviklet. En af disse teknikker er Lattice Light-Sheet Mikroskopi (LLSM)12, som udnytter en struktureret lysplade til drastisk lavere fotoblegning. Udviklet i 2014 af Nobelprismodtageren Eric Betzig, den høje aksiale opløsning, lav fotoblegning og baggrundsstøj, og evne til samtidig at billedet hundredvis af fly pr synsfelt gøre LLS mikroskoper overlegen i forhold til widefield, TIRF og konfokale mikroskoper12,13,14,15,16,17,18,19. Denne fire-dimensionelle (x, y, z og tid) billeddannelse teknik, mens der stadig diffraktion begrænset (~ 200 nm XYZ opløsning), har utrolige tidsmæssige opløsning (vi har opnået en frame rate på omkring 100 fps, hvilket resulterer i en 3D rekonstrueret cellebillede med 0,85 sekunder per ramme) for 3D rumlig erhvervelse.

LLSM kan generelt bruges til at spore real-time dynamik af alle molekyler i enhver celle på enkelt-molekyle og encellede niveau, især dem i stærkt motile celler såsom immunceller. For eksempel viser vi her, hvordan man bruger LLSM til at visualisere T-celle receptor (TCR) dynamik. T celler er effektor celler i adaptive immunsystem. TCR'er er ansvarlige for at genkende peptid-MHC (pMHC) ligands vises på overfladen af antigen-præsentere celler (APC), som bestemmer udvælgelse, udvikling, differentiering, skæbne, og funktion af en T-celle. Denne anerkendelse sker på grænsefladen mellem T-celler og APC'er, hvilket resulterer i lokaliseret receptorklyngedannelse for at danne det, der kaldes den immunologiske synaps. Selv om det er kendt, at TCR'er ved den immunologiske synaps er afgørende for T-celle effektor funktion, stadig ukendt er de underliggende mekanismer i realtid TCR menneskehandel til synapsen. LLSM har tilladt os at visualisere i realtid dynamikken i TCR'er før og efter menneskehandel til synapsen med den resulterende pMHC-TCR interaktion(Figur 1). LLSM kan derfor bruges til at løse aktuelle spørgsmål om de tcrs formative dynamik og give indsigt til at forstå, hvordan en celle skelner mellem selv- og udenlandske antigener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

5C. C7 TCR-transgene RAG2 knockout mus i B10. En baggrund blev brugt i denne undersøgelse i henhold til en protokol godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee fra University of Chicago.

1. Høst og aktivér T-celler

BEMÆRK: Denne del af protokollen er baseret på tidligere protokoller. Se citater for yderligere detaljer20,21.

  1. Euthanize en 10-12 uger gammel 5C. C7 transgene mus af begge køn (~ 20-25 g) i henhold til den godkendte IACUC protokol (dvs. CO2 kammer efterfulgt af cervikal dislokation).
  2. Spray mus slagtekrop grundigt med 70% ethanol til at suge ned pelsen og bringe ind i en BSL-2 sikkerhedsskab.
  3. Drej musen på sin højre side og lave et lille snit i kroppen hulrum med kirurgisk saks. Fjern milten ved hjælp af kirurgiske pincet. Skær bindevæv væk efter behov med kirurgisk saks.
  4. Læg milten i en 70 μm-pore mesh celle si og mos med bagsiden af en 1 ml sprøjte stemplet. Vask gennem sien grundigt med komplet RPMI (RPMI med 10% føtal kvægserum [FBS], 2 mM L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin, 50 μM 2-mercaptoethanol).
  5. Centrifugeret enkeltcelleaffjedringen af milticytter ved 300 x g i 5 min. Kassér supernatantet.
    BEMÆRK: Pellet på dette punkt vil være rød.
  6. Suspension af milten i 5 ml RBC lysisbuffer igen. Inkubere i 5 min, derefter slukke med 5 ml komplet RPMI.
  7. Centrifugeret enkeltcelleaffjedringen af milticytter ved 300 x g i 5 min. Kassér supernatantet.
    BEMÆRK: Pellet på dette punkt skal være hvid, ikke rød.
  8. Opslæm pellet i 5 ml af komplet RPMI.
  9. Overfør til en T-25 kolbe og tilsæt 10 μM møl cytokrom-C (MCC, sekvens ANERADLIAYLKQATK). Sæt cellerne i en cellekultur kuvøse ved 37 °C, 5% CO2 natten over.
  10. På den næste dag, tilføje rekombinant mus IL-2 til en endelig koncentration på 100 U / ml.
  11. Overhold for de følgende dage, tilføje friske medier som det aktuelle medie bliver gul. T celler vil dø, hvis venstre i gule medier uden opsyn i over 48 h. Celler er klar til brug 6-10 dage efter høst.

2. Forbered celler

  1. Inkuber5 mm runde dækslips med 0,1% poly-L-lysin i 10 min. Aspirate off og lad tørre naturligt.
  2. Brug et gradientreagensagens (se materialetabellen)til at adskille døde celler og til at opnå 1 x 106 T-celler og 1 x 106 APC'er (CH27-celler21,22 transduced with cytosolic mCherry) separat.
    BEMÆRK: Celler tælles ved hjælp af et hæmocytometer.
    1. Tilføj 3 ml detsitetsgradientreagens til et konisk rør på 15 ml og tilsæt celler, der er dråbemæssigt til rørets kant. Bland ikke. Centrifuger ved 930 x g i 10 min ved 4 °C; acceleration/deceleration: LANGSOM/LANGSOM. Fjern det tynde midterste lag af celler mellem hele mediet og dets hældningsreagens, og hver celletype sættes i separate koniske rør.
      BEMÆRK: Det er nødvendigt at forberede flere celler end nødvendigt for billeddannelse, da vi konstaterer, at 50% går tabt i gennemsnit under processen. Jo flere celler, der anvendes til processen, jo lettere er det at høste dem fra tæthedgradienten. Vi bruger 4-8 ml af begge celletyper til at sikre overskydende celler. Hvis det ønskes, kan celler tælles før dette trin for at sikre, at der er behov for volumen. Eventuelle ekstra celler sættes tilbage i deres respektive kolber.
    2. Begge rør af T-celler og CH27-celler vaskes tre gange med 5 ml komplet RPMI (300 x g i 5 min). Kassér supernatanten hver gang under vasken. Opslæm hvert rør i 1 ml komplet RPMI og tælle celler med et hæmocytometer.
  3. Ophæng 1 x 106 APC'er i 500 μL komplet RPMI og tilsæt 10 μM MCC. Inkuber i 3 timer ved 37 °C, 5% CO2. Cellerne vaskes tre gange med 500 μL komplet Omdrejningstal (300 x g i 5 min). Kassér supernatanterne.
  4. Ophæng 1 x 106 T-celler i 500 μL komplette RPMI. Der tilsættes 2 μg anti-TCRβ Alexa488-mærket Fab (klon H57) til 500 μL celler. Inkuber i 30 min ved 37 °C, 5% CO2. Cellerne vaskes tre gange med 500 μL hele RPMI (300 x g i 5 min). Kassér supernatant efter hver vask.
    BEMÆRK: Det divalente anti-TCR antistof blev skåret i monovalent Fab ved hjælp af en Fab forberedelse kit (se Tabellen over materialer)for at undgå crosslinking T celle receptorer af divalent antistof (dette trin er valgfrit).
  5. Ophæng begge celletyper i 500 μL billedmedier (phenol rødfri Leibovitz's L-15 medium med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin).

3. Gennemførelse af LLSM Daglig tilpasning

BEMÆRK: (Vigtig) Denne justeringsprotokol er baseret på det anvendte LLSM-instrument (se materialetabellen). Hver LLSM kan være forskellige og kræver forskellige tilpasningsstrategier, især dem, der er hjemmebyggede. Udfør den passende rutinemæssige justering og fortsæt til punkt 4.

  1. Tilføj 10 ml vand plus 30 μL fluorescein (1 mg/ml lager) til LLSM-badet (~10 ml volumen), tryk på Image (Home) for at flytte målet til billedposition, og se på et enkelt Bessel laserstrålemønster. Juster laserstrålen ved hjælp af styrene og forudindstillet interesseregion (ROI) for at gøre strålen et tyndt mønster afbalanceret i alle retninger.
    1. Strålen skal også vises fokuseret i finderen kameraet. Brug to spejlvippetjusteringsjusteringsfaktorer, topmikrometer, fokus og emissionsobjektiv halsbånd til at justere. Se figur 2A,B for korrekt justeret stråle.
  2. Vask badet og målene med mindst 200 ml vand for helt at fjerne fluorescein.
  3. Billedstandardlysstofrør i billedmediet (fremstillet ved at holde perler til en 5 mm dæksel med poly-L-lysin, se materialetabellen;dette kan præparateres og genbruges) til fysisk punktspredningsfunktion (PSF) i billedmedier.
    BEMÆRK: Der kan kun være én perle i betragtning til senere behandling, så prøv at finde en perle, der er af sig selv i seeren eller nemt kan beskæres for at få en enkelt perle.
    1. Tænd dither ved at indstille til 3 i feltet 'X Galvo-område'. Tryk på Live for at få vist det aktuelle felt. Flyt langs Z-retningen for at finde dækslet slip og perler. Find midten af en perle ved at bevæge sig langs Z, skal du trykke på Stop for at sætte laseren på pause. Kontroller 3D, tryk på Center , og tryk derefter på Udfør. Dette vil indsamle data.
    2. Juster tiltspejl, objektiv krave og fokusmikrometer manuelt for højeste grå værdier, og juster derefter efter behov for at opnå korrekte mønstre for objektiv scanning, z galvo, z+objective (totPSF) og prøvescanningstilstande (samplePSF). Se figur 2C-F for korrekt justerede maksimale intensitetsfremskrivninger.
      BEMÆRK: De forskellige indfangningstilstande (objektiv scanning, z galvo, z+objective og prøvescanning) ændrer, hvordan lysarket bevæger sig gennem prøven. Alle scanningstilstande skal bruges til justering.
    3. Prøvescanningen viser, hvordan data indsamles under forsøget. Udsaml prøvepolyesterværdien ved at trykke på Udfør i prøvescanningstilstand for at skævvride og deconvolution (se afsnit 5). Skift lasere til tre farvetilstand (488, 560, 647), og tryk på Udfør igen.
      BEMÆRK: Da LLSM-billederne i en vinkel (57,2°), indsamles billeder, der er taget i "prøvescanningstilstand", i denne vinkel og er derfor "skæve". De-skewing er processen med at korrigere for denne vinkel og "re-justere" billedet til en ægte z-stack. Disse data skal indsamles i billedmedier og i alle kanaler, der vil blive afbildet under eksperimentet. Hvis dette ikke indsamles korrekt, vil dataene ikke blive korrekt de-skæv. På samme måde skal du sørge for, at mediet er opvarmet til 37 °C (eller den ønskede eksperimentelle temperatur).

4. Opsætning af celler med LLSM

  1. Der tilsættes 100.000 APC'er (50 μL) fra trin 2,5 til en cirkulær dæksel med 5 mm diameter fra trin 2.1, og lad dem nøjes med 10 min.
  2. Prøveholderen udgtag derefter dækselscellen- op til den. Tilføj en dråbe billeddannelse medier til bagsiden af dæksslip for at undgå bobler, før du placerer i badet. Skru prøveholderen fast på piezoen, og tryk på Billede (Startside).
  3. Find en APC til billede for at sikre, at LLSM og billedbehandling software (se Tabel over materialer)fungerer korrekt.
    BEMÆRK: Vi billede på 0,4 μm trin størrelse med 60 z-trin og 10 ms eksponering for to farver med dither indstillet til 3, hvilket resulterer i 1,54 s per ramme af 3D-billede med ~ 200 nm XY og 400 nm Z opløsning. Disse indstillinger skal muligvis justeres baseret på cellestørrelse, ønsket z-opløsning og signalstyrke fra den anvendte fluorescerende mærkningsteknik. Laser strømforbrug vil også variere baseret på fluorescerende mærkning teknik, der anvendes.
    1. Tryk på Live for at se det aktuelle billede. Flyt langs Z for at finde dækslet slip og celler.
    2. Find midten af en APC ved at bevæge sig i Z-retningen, og tryk derefter på Stop for at sætte laseren på pause. Kontroller 3D, og indtast de ønskede indstillinger (se trin 4.3.1), tryk på Center, og tryk derefter på Udfør. Dette vil indsamle data.
  4. Sænk scenen for at indlæse position og tilsæt 50 μL T-celler i billedmedier (100.000 celler, fra trin 2.5) dråbevis direkte over dæksstødet. Det er bedst at lade en dråbe form på enden af pipette spidsen og derefter røre spidsen til badet væske. Hæv scenen igen ved at klikke på "Billede (Return)".
  5. Begynd billeddannelse. Sørg for at indstille den ønskede stakstørrelse og tidsudløbslængde. Billede 60 z-stakke ved en trinstørrelse på 0,4 μm og input 500 tidsrammer. (Typisk) stoppe optagelsen, før 500 rammer er nået for at undgå fotoblegning. Brug Live-tilstand til at søge efter cellepar, og når der er indtastet klar og ønskede indstillinger, skal du trykke på Udfør for at indsamle data. Se film 1 og figur 1 for et eksempel.

5. Spor Surface Dynamics

  1. Eksporter dataene fra billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen). Dette vil skabe z-stack TIF filer for hvert gang punkt i hver farve.
  2. Først skæv og deconvolve dataene.
    BEMÆRK: Vi bruger LLSpy rørledningen under licens af HHMI's Janelia Research Campus18, men skævvridning og deconvolution er også tilgængelige inden for flere billedbehandlingssoftware (se Tabel over materialer).
  3. Debleach dataene.
    BEMÆRK: Vi bruger Fijis debleach funktion med histogramme matchende (Fiji Pathway: Image | Juster | Korrektion af blegemiddel | Histogram Matchende | OK).
  4. Importér til sporingssoftwaren (se materialetabellen). Spor klynger i henhold til softwarespecifikationer. Se film 2 for et eksempel.
    BEMÆRK: Sporingsresultater afhænger af den anvendte trackingsoftware, den valgte algoritme, de valgte outputparametre osv. For eksempel, i tracking software, vi udnyttede (se Tabellen over materialer),valgte vi at tillade softwaren til at spore uregelmæssige former, snarere end at tildele hver funktion et enkelt sted, da TCR klynger ikke er organiseret i perfekte kugler. Derudover valgte vi at indsamle 35 parametre, herunder hastighed, retning, volumen, intensitet, område, placering og spore oplysninger om varighed. Men forskellige metoder eller parametre vil være gavnligt at besvare forskellige spørgsmål.
    1. Hvis sporing ikke ønskes, skal du bruge ClearVolume-plugin'et til Fiji til at visualisere og oprette film ud fra hyperstack-data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi isolering, forberedelse og billeddannelse af primær mus 5C. C7 T celler ved hjælp af en gitter lysplade mikroskop. I afsnit 3 er det bydende nødvendigt at justere mikroskopet korrekt og indsamle polyesterbrug dagligt, som dataene kan afgrænses efter indsamlingen. I figur 2viser vi de korrekte justeringsbilleder, der vil blive set, når mikroskopet justeres. Figur 2A og figur 2B viser henholdsvis den korrekte strålekurve og strålejustering, når den er afbildet i fluorescein. Den objektive scanning skal vise en stor X form i XZ og YZ fremskrivninger, der er så symmetrisk som muligt; dette bør også justeres til at være så lille af et X som muligt (figur 2C). Dette opnås hovedsagelig ved at justere emissionsmålhalsbåndet. Z galvo scanning skal vise en oval i XZ og XY med en enkelt prik på hver side (over og under for XZ og til venstre og højre for YZ)(Figur 2D). Dette opnås hovedsageligt ved at justere galvospejltiltet, enten manuelt eller med den motoriserede justering i softwaren. Endelig skal både z+-objektivscanningen og prøvescanningen vise prikker, der ser så runde som muligt ud (henholdsvis figur 2E og figur 2F). Disse kan have en lille X, men dette bør være så dæmpet som muligt. Disse bør være godt afstemt, hvis målet scanning og z galvo blev sat godt, men hvis justeringer er nødvendige, vil de for det meste blive gennemført med galvo spejl. Det er vigtigt at bemærke, at i løbet af denne justering, hver gang kraven og galvo er justeret, fokus (mikrometer over emissionsmålet) skal justeres så godt.

Ved hjælp af denne protokol, kan vi se de fire-dimensionelle dynamik tCRs på en T-celle overflade (Figur 1, Movie 1). Den største fordel ved dette mikroskop ligger i evnen til at spore de visualiserede overfladeenheder i TR'erne og til at opnå kvantificerede data fra deres størrelse, bevægelse, signalintensitet osv. Film 2 viser et eksempel på de opnåede numre.

Figure 1
Figur 1: 4-dimensionel billeddannelse af T-celle-APC Synapse. (A) Et repræsentativt eksempel på 3D-timelapse LLSM-billeder, der viser en T-celle, der interagerer med en APC. Vist er TCR (grøn, mærket af anti-TCR-AF488) dynamik i anerkendelse af antigener præsenteret på overfladen af en APC (rød, cytosolic mCherry). Skalastang = 5 μm. Se også Film 1. B) Orthogonal XY skive (A). Indsat er en referenceramme for en hel celle. Skalastang = 5 μm. (C) Orthogonal YZ skive (A). Indsat er en referenceramme for en hel celle. Skalastang = 5 μm. (D) Dobbelt ortogonel skive (A). Indsat er referenceramme for hele cellen. Skalastang = 5 μm. Se også Movie 3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: LLSM-justering. (A) Ønsket strålemønster til LLSM billeddannelseseksperiment. (B) Skærmbillede af strålejusteringsprocessen; til venstre er fokusvinduet, der viser den indsnævrede, fokuserede stråle; øverst til højre er en graf, der viser, at strålen er centreret i vinduet; nederst til højre er finderen kameraet, som også bør være en tynd, fokuseret stråle. C) Maksimal intensitetsfremskrivninger (MIP) for en perle efter objektiv scanning. (D) Maksimal intensitet fremskrivninger (MIP) af en perle ved z-galvo scanning. E) Maksimal intensitetsfremskrivninger (MIP) for en perle ved z+objektiv scanning. F) Maksimal intensitetsfremskrivninger (MIP) af en perle ved prøvescanning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Movie 1
Film 1: T celle synapse dannelse. Tofarvet volumengengivelse af interaktionen mellem en T-celle mærket med αTCR-AF488 (grøn) med et mål APC, der udtrykker cytosolic mCherry (rød) over 70 tidspunkter ved 1,54 s interval. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade).

Movie 2
Film 2: Sporing TCR dynamisk bevægelse. Sammenlign med Movie 1. Klynger, der svarer til synlige TCR-strukturer, blev sporet i 3D over tid med billedbehandlingssoftware. Dragehaler, der viser klyngepositioner i løbet af de foregående fire rammer, er farvekodede af forskydningslængde. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade).

Movie 3
Film 3: Ortogonale skiver af T celle synapse. Sammenlign med Film 1 og Figur 1B-D. Dobbelt ortogonal skive movie 1, der viser, at αTCRβ-AF488 Fab faktisk er mærkning celleoverfladen THRs. Inset er en referenceramme af hele cellen. Skalastang = 5 μm. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den præsenterede protokol blev optimeret til brug af CD4+ T-celler isoleret fra 5C. C7 transgene mus på det anvendte LLSM-instrument, og derfor kan det være nødvendigt at optimere andre cellesystemer og LLSM'er forskelligt. Denne protokol viser imidlertid styrken ved 4D-billeddannelse, da den kan bruges til at kvantificere dynamikken i en overfladereceptor på en hel celle med mindst forvrængning under fysiologiske forhold. Derfor er der mange mulige fremtidige anvendelser af denne teknik.

Et kritisk skridt er at lade cellerne bosætte sig i en passende koncentration. Hvis alt for mange APC'er nøjes med coverslip og bliver for tæt, er det svært at finde en T-celle, der interagerer med kun en enkelt APC. Når en T-celle har flere synapser, kan sporing og fortolkning af data blive meget kompliceret. Tilsvarende, hvis for få APC'er er til stede, at finde en T-celle danner en synapse er også vanskeligt. I vores hænder opnår 50.000 celler at nøjes med 10 minutter en optimal tæthed. Dette problem kan dog undgås, hvis du bruger et system med klæbende celler. Celler kan dyrkes i kuvøse med coverslips til et ønsket sammenløb.

Tilsvarende er antallet af T-celler, der er faldet i systemet, afhængigt af badets størrelse og den afstand, de kan sprede. I LLSM system, der anvendes her, er der en 12 ml bad og en 2,5 ml bad, i modsætning til den tidligere version af systemet, som kun havde en 10 ml bad til rådighed. Vi bruger 12 ml bad til den oprindelige fluorescein imaging derefter skifte til 2,5 ml bad til billeddannelse cellerne. Dette giver mulighed for mindre grundig vask af badet efter strålevisualiseringstrinnet og sænker også antallet af T-celler, der kræves til hver billedsession. Til gengæld vil dette give brugerne mulighed for at udnytte færre celler.

At finde celler på det rigtige interaktionssted er også en udfordring. I vores hænder tager T-celler ca. 2 minutter at slå sig ned til APC'erne på dæksslip, så det er vigtigt at begynde at søge i dækstrækket efter dynamiske T-celler tæt på APC'er. En stor forbedring af dette har været den seneste tilføjelse af LED-lys i finderen kameraet. Hvis du bruger et hjemmebygget system, anbefaler vi på det kraftigste, at du medtager denne funktion i designet.

Endelig er fluorescerende mærkningsstrategier en anden vigtig overvejelse. Hvert fluorescerende protein eller farvestof har et forskelligt kvanteudbytte og fotoblegningshastighed. Fluorescerende farvestoffer er typisk lysere, men hvis cellerne er blevet stabilt transduceret med et fluorescerende protein mærket molekyle, er etiketten genopfyldes som cellen fortsætter med at producere molekylet. Derfor er mærkningsstrategi en vigtig faktor at overveje, når man designer eksperimenter.

Vi vil gerne slutte af med en diskussion om fremtidige retningslinjer for teknologien. LLSM er også i stand til struktureret belysning mikroskopi (SIM), hvilket resulterer i 150 nm XY opløsning og 280 nm Z opløsning, og er mindst 10 gange hurtigere end widefield SIM12. Derfor, mens LLSM giver hidtil uset hastighed på 4D-billedbehandling, kan det ikke opnå den rumlige opløsning af de nuværende super-opløsning teknikker4,5,6. Denne beslutning kan dog forbedres, hvis der kunne oprettes en STED LLSM. Lysark STED og stimuleret emissionsudtynding med selektiv planbelysningsmikroskopi (STED-SPIM) er blevet udnyttet, men mangler den tidsmæssige opløsning af LLSM21,22,23,24. Hvis STED-SPIM blev tilpasset til at indarbejde et gitter, kunne vi potentielt opnå 50 nm aksial opløsning med langt mindre fotoblegning, og billede hurtigere end i øjeblikket tilgængelige teknikker. Ikke desto mindre giver LLSM os med de nuværende tilgængelige teknologier den hurtigste tidsmæssige opløsning med høj aksial opløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende råd og vejledning fra Dr. Vytas Bindokas ved University of Chicago. Vi takker den integrerede Lysmikroskop kernefacilitet ved University of Chicago for at støtte og vedligeholde gitterets lysplademikroskop. Dette arbejde blev støttet af NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 og NSF Career Award 1653782 (Til J.H.). J.R. støttes af NSF Graduate Research Fellowships Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309659 For T cell harvest
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148-25ML For T cell culture
5 mm round coverslips World Precision Instruments 502040 For Imaging
70um Sterile Cell Strainer Corning 7201431 For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody BioLegend 109215 For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) X&Y Cell Culture FBS-500 For T cell culture
Ficoll GE Healthcare 17-1440-02 Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich F6377 For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres Thermo Fisher Scientific F8810 For microscope alignment
Imaris Bitplane N/A Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope 3i N/A Microscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 21083027 For Imaging
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-081 For T cell culture
LLSpy Janelia Research Campus N/A LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK Elimbio Custom Synthesis For T cell harvest
Penacillin/Streptamycin Life Technologies 15140122_3683884612 For T cell culture
Poly-L-Lysine Phenix Research Products P8920-100ML For Imaging
RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4300-54 For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2 Sigma-Aldrich I0523 For T cell culture
RPMI 1640 Medium Corning MT10040CV For T cell culture
Slidebook 3i N/A LLSM imaging software
Surgical Dissection Tools Nova-Tech International DSET10 For T cell harvest
T-25 Flasks Eppendorf 2231710126 For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits Thermo Fisher Scientific 44685 For preparing Fab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
  3. Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3, (10), 793-796 (2006).
  5. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19, (11), 780 (1994).
  7. Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58, (1), 1-28 (2013).
  8. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58, (4), 644-659 (2015).
  9. Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18, (6), 605-616 (2008).
  10. Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
  11. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254, (3), 109-114 (2014).
  12. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. (2014).
  13. Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5, (9), 1219009 (2016).
  14. Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6, (8), 921-929 (2018).
  15. Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10, (5), 1004161 (2014).
  16. Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29, (24), 2959-2968 (2018).
  17. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (6424), New York, N.Y. 8302 (2019).
  18. Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356, (6338), New York, N.Y. 3118 (2017).
  19. Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. (2015).
  20. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
  21. Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39, (5), 846-857 (2013).
  22. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, (6909), 845-849 (2002).
  23. Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99, (9), 2717-2725 (2010).
  24. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11, (9), 919-922 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics