Optimisation, conception et éviter les pièges dans l'immunohistochimie fluorescente du multiplex manuel

Cancer Research

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Summary

L'immunohistochimie fluorescente multiplex est une technologie émergente qui permet la visualisation de plusieurs types de cellules dans le tissu intact de formaline-fixe, incorporé de paraffine (FFPE). Présentés sont des lignes directrices pour assurer un multiplexe 7-couleur réussie avec des instructions pour optimiser les anticorps et les réactifs, la préparation des diapositives, la conception et des conseils pour éviter les problèmes communs.

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Lazarus, J., Akiska, Y., Perusina Lanfranca, M., Delrosario, L., Sun, L., Long, D., Shi, J., Crawford, H., Di Magliano, M. P., Zou, W., Frankel, T. Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (149), e59915, doi:10.3791/59915 (2019).

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Abstract

L'évaluation de microenvironnement du tissu intact pour l'analyse de l'infiltration cellulaire et de l'organisation spatiale est essentielle pour comprendre la complexité des processus de la maladie. Les principales techniques utilisées dans le passé comprennent l'immunohistochimie (IHC) et l'immunofluorescence (IF) qui permettent la visualisation des cellules comme un instantané dans le temps en utilisant entre 1 et 4 marqueurs. Les deux techniques présentent des lacunes, notamment des difficultés à colorer des cibles mal antigéniques et des limitations liées à la réactivité inter-espèces. Le CSI est fiable et reproductible, mais la nature de la chimie et la dépendance à l'égard du spectre de la lumière visible ne permettent d'utiliser que quelques marqueurs et rendent la colocalisation difficile. L'utilisation de IF élargit les marqueurs potentiels, mais repose généralement sur le tissu congelé en raison de l'autofluorescence tissulaire étendue après fixation formaline. La cytométrie de flux, une technique qui permet l'étiquetage simultané des épitopes multiples, abroge beaucoup des insuffisances de IF et iHC, cependant, la nécessité d'examiner des cellules comme une suspension de cellules simples perd le contexte spatial des cellules rejetant le biologique important Relations. Multiplex immunohistochemistry fluorescent (mfIHC) ponts ces technologies permettant de phénotypage cellulaire multi-épitographié dans la formaline paraffine intégrée (FFPE) tissu tout en préservant l'architecture microenvironnement globale et spatiale relation des cellules dans le tissu intact non perturbé. Les fluorophores à haute intensité fluorescente qui se lient de façon covalente à l'épitotome tissulaire permettent de multiples applications d'anticorps primaires sans se soucier de la réactivité croisée spécifique des espèces par des anticorps secondaires. Bien que cette technologie ait été prouvée pour produire des images fiables et précises pour l'étude de la maladie, le processus de création d'une stratégie utile de coloration mfIHC peut être long et exigeant en raison de l'optimisation et la conception étendues. Afin de faire des images robustes qui représentent des interactions cellulaires précises in situ et d'atténuer la période d'optimisation pour l'analyse manuelle, présentés ici sont des méthodes pour la préparation des diapositives, l'optimisation des anticorps, la conception des multiplexes ainsi que des erreurs couramment rencontrés au cours du processus de coloration.

Introduction

La visualisation d'un microenvironnement intact de tumeur (TME) est essentielle en évaluant non seulement l'infiltration cellulaire dans les malignités pleines mais les interactions de cellules à cellules aussi bien. Multiplex immunohistochemistry fluorescent (mfIHC) a émergé comme un outil efficace pour le phénotypage multi-antigène des cellules dans l'étude du cancer et des maladies associées1,2,3,4, 5,6,7. Ceci, en combinaison avec de nouveaux logiciels et programmes conçus pour analyser de grands ensembles de données, permet l'observation des interactions complexes entre les cellules1,2,4. Le facteur limitant le taux dans l'acquisition de données est souvent la qualité du tissu taché avant l'analyse.

Les techniques précédentes utilisées pour phénotype des cellules dans le TME incluent l'immunohistochimie (IHC), l'immunofluorescence (IF) et la cytométrie de flux qui présentent toutes des limitations significatives. IHC utilise des sections de tissu incrustés de paraffine fixe de formaline (FFPE) qui sont déparaffinisées et réhydratées avant d'être tachées par le plus souvent un anticorps. L'utilisation d'un anticorps secondaire lié au raifort (HRP) et d'une réaction chimique permet la visualisation d'une seule épitope antigénique8. Bien que le CiSE soit fiable et exécuté sur le tissu FFPE qui est facile à travailler avec, les limitations au spectre de lumière visible signifie que seulement un ou deux marqueurs peuvent être distingués fiables et colocalisation des antigènes tout à fait difficile8. Une façon d'élargir les marqueurs disponibles et donc les antigènes qui peuvent être sondés sur une seule section est de passer à la fluorescence qui permet l'utilisation d'une plus large gamme du spectre visuel. Pour le tissu FI, congelé ou FFPE est transféré sur des lames et des anticorps utilisés qui sont conjugués à divers fluorophores. Bien que cela augmente le nombre d'antigènes qui peuvent être sondés, il ya plusieurs limitations importantes. Tout d'abord, parce que chaque anticorps n'a généralement qu'un seul fluorophore attaché, la luminosité n'est souvent pas assez forte pour surmonter l'autofluorescence des tissus. C'est pour cette raison, la plupart des IF est effectuée sur des tissus congelés qui est coûteux à stocker et difficile à travailler avec. Un nombre limité d'étiquettes fluorescentes sont disponibles pour une utilisation en raison du chevauchement spectral et de la réactivité des espèces croisées, en particulier lorsque des anticorps non conjugués sont utilisés. La cytométrie de flux, qui consiste en un traitement des tissus frais en une seule suspension cellulaire et l'étiquetage avec des anticorps fluorescents a été l'étalon-or de l'immunophénotypage depuis des décennies9,10. Un avantage de la cytométrie de flux est la capacité d'étiqueter plusieurs anticorps sans se soucier de la réactivité croisée des espèces, car la plupart sont conjugués. Parce que les cellules sont «visualisées» par une machine et non les yeux humains, il ya beaucoup plus de fluorophores disponibles, mais cela vient avec un coût. L'indemnisation doit être faite manuellement, ce qui peut modifier considérablement les résultats produisant des populations faussement positives et négatives. La limitation la plus significative de la cytométrie de flux est que l'architecture tissulaire et, par la suite, toutes les informations spatiales sont perdues par la nécessité d'une suspension des cellules individuelles.

L'immunohistochimie fluorescente multiplex (mfIHC) à l'aide d'un microscope fluorescent automatisé en combinaison avec un nouveau logiciel combine les avantages de la cytométrie IHC, IF et flow en permettant la coloration des tissus multi-antigènes avec amplification du signal et la conservation des relations spatiales sans avoir besoin d'une compensation. Le tissu FFPE est placé sur des glissières chargées qui, après la récupération d'antigène, subissent une série d'application d'anticorps primaires à l'antigène cible d'intérêt suivi d'un anticorps secondaire avec une étiquette chimique HRP, semblable à IHC. Après le placement de l'anticorps secondaire, une réaction spécifique HRP se traduit par un fluorophore covalently liant à l'épitopie d'intérêt11. Une fois que le tissu est étiqueté, un autre cycle de chauffage des diapositives est terminé en supprimant le complexe d'anticorps primaire et secondaire précédemment appliqué laissant seulement l'étiquette fluorescente liée à l'épitotoe de tissu11. Cela permet de réappliquer de multiples anticorps de toute espèce sans se soucier de la réactivité croisée11,12. Pour minimiser tout besoin de compensation manuelle de colorants fluorescents multiples, une collection de fluorophores avec peu de chevauchement spectral, y compris une tache de compteur nucléaire est utilisé pour compléter le mfIHC. Pour tenir compte de l'autofluorescence rencontrée avec le tissu FFPE, le logiciel soustrait l'autofluorescence de l'image finale à l'aide d'une image à partir d'une diapositive vierge qui est possible en raison de la force de la fluorescence spécifique à l'antigène après fluorophore l'amplification du signal. À l'aide de nouveaux programmes conçus pour de grands ensembles de données, les emplacements cellulaires peuvent être identifiés et analysés pour le contexte spatial1,2,4. La limitation la plus importante de cette technique est le temps d'optimisation. Une méthodologie détaillée avec des instructions pour la conception expérimentale et la coloration et la stratégie d'imagerie se trouve ici. mfIHC sera utile pour les laboratoires qui ne disposent pas actuellement d'un système de coloration automatisé optimisé qui souhaite mieux comprendre le contexte spatial des interactions cellule-cellule dans le tissu FFPE intact à l'aide de la technique manuelle.

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Protocol

Tous les travaux ont été approuvés par le comité d'examen interne de l'Université du Michigan.

1. Optimiser les anticorps primaires et la préparation des diapositives

  1. Déterminer la concentration idéale d'anticorps pour le multiplexe à l'aide d'IHC conventionnel.
    1. Testez les anticorps pour le multiplexe par immunohistochimie conventionnelle manuelle (IHC)13.
    2. Utilisez des tissus spécifiques qui ont un type de cellules abondante pour chaque anticorps testé comme l'utilisation de tissu amygdale pour l'essai d'anticorps CD3.
    3. Utilisez la concentration de référence pour le CSI recommandée par l'entreprise, puis complétez le CSI avec des concentrations d'anticorps aux concentrations recommandées ainsi que des concentrations supérieures et inférieures à la concentration recommandée.
  2. Préparer le tissu incrusté de paraffine fixe de formaline sur des lames.
    1. À l'aide d'un microtome, couper des blocs de tissu FFPE à une épaisseur comprise entre 4 et 6 m et appliquer sur les lames chargées.
      REMARQUE : L'utilisation d'eau distillée assure le bon montage et l'adhérence des tissus dans tout le multiplexe.
    2. Placer les lames à plat, côté tissu vers le haut, et laisser sécher à 37 oC pendant la nuit.
    3. Rangez les diapositives dans une boîte à glissière loin de la température extrême jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à terminer le multiplexe.

2. Méthode de coloration générale

  1. Préparation de solutions de lavage et de récupération d'antigènes
    1. Préparer la solution de lavage de 0,1 % de TBST en mélangeant 9 L d'eau déionisée, 1 L de tris salin tamponné (TBS) et 10 ml de polysorbate 20.
    2. Préparer les deux solutions de récupération d'antigènes (pH 6 et pH 9; Tableau des matériaux) en diluant à 1x avec de l'eau déionisée.
  2. Déparaffinisation et réhydratation
    1. Cuire les lames, couchées à plat, côté tissu là vers le haut à 60 oC pendant 1 h dans un four d'hybridation1. Retirer les lames du four et laisser refroidir pendant au moins 5 à 10 min, puis placer dans un carré vertical.
    2. Traiter les diapositives dans les solutions suivantes de façon séquentielle : xylène en triplicate, suivie d'un seul traitement à 100 % d'éthanol, 95 % d'éthanol, et enfin 70 % d'éthanol pendant 10 min chacune à l'aide d'un ensemble de teinture sédentaires1.
    3. Laver le rack de toboggans pendant 2 min avec de l'eau déionisée par submersion dans une boîte à glissière en plastique suivie d'une fixation par submersion dans une boîte à glissière en plastique remplie de formaline tamponnée neutre pendant 30 min13. Laver les toboggans dans de l'eau déionisée pendant 2 min, puis procéder à la récupération de l'antigène.
  3. Récupération d'antigène
    1. Placez le rack de diapositives dans une boîte résistante à la chaleur remplie à la ligne interne (environ 300 ml) avec un tampon de récupération d'antigène pH 6 ou pH 9.
      REMARQUE : Le tampon de récupération d'antigène peut être pH 6 ou pH 9 qui peut devoir être optimisé par épitope. Cependant, commencez par utiliser le pH 9 pour les anticorps qui se lient aux épitopes nucléaires et le pH 6 pour tous les autres anticorps.
    2. Couvrir la boîte d'une pellicule plastique et utiliser un élastique pour fixer. Placez la boîte dans le four à micro-ondes au bord de la plaque rotative (le micro-ondes doit être équipé d'une technologie d'onduleur pour un chauffage uniforme). Chauffer les toboggans pour 45 s à 100% de puissance suivie de 15 min à 20% de puissance13.
      REMARQUE : Le traitement par micro-ondes peut avoir besoin d'être optimisé en fonction du micro-ondes utilisé.
    3. Laisser refroidir les lames pendant environ 15 à 20 min.
  4. Préparer des solutions de travail d'anticorps et de fluorophores pendant que les diapositives refroidissent.
    1. Préparer le diluant d'anticorps primaire en dissolvant 0,5 g de granules d'albumine de sérum bovin en 50 ml de TBST. Vous pouvez également utiliser 50 ml de saline tamponnée par phosphate 1x (PBS) pour dissoudre les granules.
    2. Faire de chaque anticorps primaire une solution de travail à la concentration optimisée déterminée à la section 1, dans le diluant d'anticorps primaire. Estimez environ 200 l par diapositive.
    3. Préparer la solution de travail fluorophore en diluant chaque fluorophore dans le diluant de fluorophore à une concentration de 1:100.
      REMARQUE : Cela peut devoir être optimisé en fonction de l'anticorps. Estimez environ 100 L par diapositive.
    4. Le dernier jour de coloration, préparer le 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solution de travail en ajoutant 3 gouttes de DAPI dans 1 mL de TBST.
  5. Coloration de glissement (lavage et blocage)
    1. Retirer la boîte du four à micro-ondes après refroidissement et enlever la pellicule plastique, laver les diapositives avec de l'eau déionisée pendant 2 min suivie d'un lavage de 2 min dans une boîte à glissière en plastique rempli TBST13.
    2. Après le séchage de chaque diapositive autour du tissu avec une tâche délicate essuyer soigneusement de ne pas laisser le tissu sécher, tracer autour de l'extérieur du tissu à l'aide d'un stylo barrière hydrophobe. Ne touchez pas le tissu avec l'essuie-glace ou le stylo délicat.
    3. Placez chaque lame dans la chambre humidifiée et ajoutez la solution de blocage (environ 4 gouttes) au tissu. Incuber 10 min à température ambiante (RT).
  6. Coloration de glissement (application primaire d'anticorps)
    1. Prenez chaque diapositive et retirez la solution de blocage en tapant sur le côté de la glissière sur une pile de serviettes en papier et en utilisant une lingette tâche délicate pour enlever l'agent de blocage excédentaire autour du tissu.
    2. Reposer la glissière dans la chambre humidifiée et ajouter environ 200 l de l'anticorps primaire de travail. Incuber dans la chambre humidifiée pendant 1 h à RT.
    3. Laver avec tBST pendant 2 min par submersion en triplicate13.
      REMARQUE : Après chaque étape de lavage, changer le TBST aidera à assurer une image plus propre.
  7. Coloration de glissement (application secondaire d'anticorps)
    1. Retirez le TBST restant de chaque diapositive et appliquez environ 3 à 4 gouttes d'anticorps secondaires (mélange d'anticorps conjugués HRP secondaires de lapin et de souris). Incuber 10 min dans la chambre humidifiée de la RT13.
      REMARQUE : Si vous prévoyez d'utiliser un anticorps primaire qui nécessite un anticorps secondaire autre que la souris ou le lapin ou si vous choisissez d'utiliser un autre anticorps secondaire, appliquez le HRP approprié conjugué secondaire aux diapositives et incubez à RT pendant 45 min. Optimisation de temps d'incubation peut être nécessaire pour l'alternative secondaire14.
    2. Après l'incubation, laver avec du TBST pendant 2 min dansletriple13 .
  8. Coloration de glissement (application de fluorophore)
    1. Appliquer environ 100 l de la solution de travail fluorophore et incuber dans la chambre humidifiée à RT pendant 10 min13.
    2. Laver avec tBST pendant 2 min en triplicate13.
  9. Enlèvement des anticorps
    1. Glissades à micro-ondes (45 s à 100% puis 15 min à 20%) dans la boîte résistante à la chaleur (voir l'étape 2.3.2) pour l'enlèvement des anticorps13,14.
      REMARQUE: Cela complète un tour du multiplexe. C'est le seul moment où le protocole peut être mis en pause. Pour mettre en pause le protocole, laissez les diapositives immergées dans le tampon de récupération d'antigène pendant la nuit à température ambiante.
  10. Continuer d'autres tours de coloration. Répéter les étapes 2.5.1-2.9.1 pour le reste des paires anticorps-fluorophore. Une fois que tous les anticorps et les fluorophores ont été utilisés, passez à l'article 2.11.
  11. Application et montage DAPI
    1. Après le dernier tour de coloration dans le multiplexe, retirez la dernière application d'anticorps avec la solution de récupération d'antigène pH 613. Laver à l'eau déionisée suivie de TBST pendant 2 min chaque13.
    2. Appliquer environ 150 l de la solution DAPI de travail sur les toboggans et incuber dans la chambre humidifiée pendant 10 min à la RT1.
    3. Laver avec du TBST pendant environ 30 s et monter des couvertures avec un moniant antifade. Appliquer le vernis clair d'ongle aux quatre coins de la couverture une fois que le support de montage a séché pour fixer le coverslip (facultatif).

3. Détails pour la bibliothèque, les monoplexes et le multiplexe

  1. Choisissez des toboggans pour la construction d'une bibliothèque de fluorophore.
    1. Pour un multiplexe de 7 couleurs, rassemblez 7 lames de tissus riches en cellules immunitaires (c.-à-d. amygdale, rate, etc.) pour la bibliothèque.
      REMARQUE : Choisissez des glissières de contrôle qui seront utilisées pour une bibliothèque de fluorophore avec chaque diapositive représentant chaque fluorophore unique qui sera utilisé dans le multiplexe. Les glissières de contrôle doivent avoir un épitope abondant de choix et peuvent être le même type de tissu pour chaque fluorophore.
  2. Diapositives de bibliothèque de taches et d'images pour une utilisation avec des monoplexets et des multiplexes.
    1. Suivez les étapes 2.1-2.9.1 à l'aide des glissières de contrôle et des glissières de tissu de contrôle de choix. Placer un fluorophore différent sur chaque toboggan à une concentration de 1:100; une diapositive ne doit contenir que du DAPI.
    2. Passez à l'article 2.11 sauf omettre la coloration DAPI et utilisez plutôt TBST et monter comme décrit.
    3. Après avoir laissé sécher les diapositives pendant la nuit, l'image avec tous les canaux DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, points quantiques semi-conducteurs, et isothiocyanate de fluorescéine (FITC) fixant l'exposition à 250 ms avec la fonction de protection de saturation1.
      REMARQUE : Les temps d'exposition peuvent être fixés à 50 à 250 ms13.
    4. Téléchargez les images de la bibliothèque sur le logiciel et utilisez-les dans l'analyse des monoplexes et des multiplexes.
  3. Choisissez des diapositives pour les monoplexes.
    1. Choisissez des diapositives de contrôle qui ont un épitope abondant de choix basé sur des anticorps optimisés (section 1). Pour chaque tour de coloration à faire dans le multiplexe, sélectionnez ce nombre de diapositives de contrôle pour créer des monoplexes.
      REMARQUE : Le but du monoplex est de déterminer la meilleure position (ordre) pour chaque anticorps à utiliser dans le multiplexe.
  4. Stain monoplexes.
    1. Suivez les sections 2.1-2.11 à l'aide de l'anticorps primaire dans un ordre différent (position) pour chacune des diapositives. Chaque diapositive doit avoir un seul anticorps primaire appliqué à un ordre (position) différent des autres diapositives.
      REMARQUE : Pour chaque diapositive où la ronde appelle aucun anticorps primaire ou fluorophore, utilisez plutôt le diluant primaire d'anticorps et le diluant de fluorophore13.
  5. Diapositives d'image et analyse le monoplex.
    1. À l'aide du microscope et en réglant le temps d'exposition à 250 ms pour tous les canaux de capture de chaque image en utilisant DAPI pour se concentrer.
      REMARQUE : Les temps d'exposition peuvent être fixés à 50 à 250 ms14.
    2. À l'aide du logiciel d'analyse, évaluez chaque diapositive monoplexenne en examinant l'intensité fluorescente du marqueur taché.
    3. Comparez cette intensité à l'arrière-plan. S'il est au moins 5 à 10 fois plus élevé que l'arrière-plan, la position de cette diapositive est une position optimale à utiliser dans le multiplexe final.
  6. Choisissez des diapositives pour le multiplexe.
    1. Choisissez les diapositives d'intérêt et ajoutez une diapositive supplémentaire à utiliser comme une diapositive vierge pour la soustraction de l'autofluorescence après la coloration et l'imagerie.
  7. Tachez le multiplexe.
    1. Sur la base des résultats monoplex, choisissez l'ordre approprié (positions) pour chaque anticorps basé sur l'étape 3.5.3. Affectez chaque fluorophore à un anticorps.
      REMARQUE: Cela peut avoir besoin d'optimisation; cependant, le plan d'employer des anticorps lumineux pour les marqueurs moins abondants1,les anticorps de co-localisation devraient être assortis avec des fluorophores aux spectres éloignés les uns des autres13,et les fluorophores avec le spectre 540 et 570 ne devraient pas être co-localisés dûment aux problèmes de chevauchement spectral1.
    2. Procédez avec les sections 2.1-2.11 en veillant à ce que la glissière vierge ne reçoive pas l'anticorps primaire, le fluorophore, ou DAPI, au lieu d'utiliser le diluant d'anticorps, le diluant de fluorophore, et Le TST respectivement à sa place.
  8. Image multiplexe et analyser pour l'intégrité de la coloration
    1. À l'aide du microscope et en réglant le temps d'exposition à 250 ms pour tous les canaux, capturez chaque image en utilisant le DAPI pour se concentrer.
    2. À l'aide du logiciel d'analyse (Table of Materials), évaluez chaque multiplexe par fausse couleur fluorescente.
      REMARQUE : Une image claire doit démontrer clairement chaque marqueur. Si un marqueur semble diffus et granuleux ou est inexistant, il est probable que le marqueur n'a pas fonctionné et doit être re-optimisé.
    3. À l'aide du logiciel d'analyse, évaluez chaque multiplexe par vue pathologique. La vue de pathologie confirmera la spécificité de chaque marqueur. Comparez à IHC précédemment optimisé (section 1).

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Representative Results

Le processus global d'obtention d'un analyse multiplexe de 7 couleurs suit un modèle répétitif. La figure 1 décrit le processus sous une forme schématique. Une fois les lames coupées et séchées ou reçues du laboratoire et cuites au four d'hybridation à 60 oC pendant 1 h, puis procéder à la déparaffinisation et à la réhydratation, fixer les lames en formaline à nouveau suivies d'une récupération d'antigène. Chaque tour de multiplexage commence à la récupération d'antigène et se termine à l'enlèvement des anticorps (Figure 1).

L'optimisation de chaque étape du processus est primordiale pour obtenir une image claire et utilisable. Les anticorps doivent être testés par IHC d'abord en utilisant des tampons de récupération d'antigène avec pH 6 et pH 9 pour chaque anticorps pour visualiser quel tampon de récupération d'antigène fonctionne le mieux avec cet anticorps particulier. En général, les cibles nucléaires répondent à la récupération d'antigènes avec un pH tampon 9. Par exemple, FOXP3 fonctionne mieux lorsque le tampon de récupération d'antigène du pH 9 est utilisé par opposition au CD3 qui fonctionne mieux avec tampon de récupération d'antigène de pH 6. Les images tirées du processus IHC doivent être utilisées pour valider la spécificité de l'analyse multiplexe.

Un monoplex est nécessaire pour déterminer l'ordre de chaque anticorps dans le multiplexe. Lors de l'utilisation d'un kit 4 ou 7 couleurs, chaque anticorps aura un ordre préféré dans le tableau. Pour le nombre d'anticorps qui seront utilisés, recueillir les diapositives de contrôle appropriées (c.-à-d., pour un multiplexe de 7 couleurs où une couleur est DAPI, sélectionnez 6 diapositives de contrôle représentatifs spécifiques aux tissus pour les 6 autres fluorophores). Figure 2 A-C est une représentation schématique d'un analyse monoplex à l'aide de 3 diapositives avec le tissu du cancer du côlon FFPE. Chaque diapositive a FOXP3 dans une position différente dans le tableau en utilisant fluorophore 570 comme son tag. DAPI est utilisé comme une tache de compteur pour visualiser adéquatement les noyaux. Dans la figure 3, des images représentatives d'un monoplex et d'un multiplexe avec une position FOXP3 variable sont montrées. À la figure 3A,B, où la FOXP3 se trouve au troisième rang (correspondant à l'ordre indiqué à la figure 2C),la coloration spécifique et robuste de LA FOXP3 (rouge) est considérée comme démontrée par la coloration nucléaire brillante Figure 3A et la colocalisation avec CD3 Figure 3B. L'intensité du signal fluorophore confirme la spécificité de FOXP3 sans coloration non spécifique ailleurs dans le tissu Figure 3A. Dans la figure 3C, où FOXP3 se trouve en première position (correspondant à l'ordre de la figure 2A),il y a une coloration non spécifique de LAFOXP3. Les zones diffuses granuleuses de couverture rouge la plupart de la glissière et l'intensité fluorescente à ces zones sont inférieures à 1. Tenter de faire un multiplexe sans terminer un monoplex d'abord pour tester l'ordre des résultats de coloration dans un résultat similaire et gaspillera réactifs. Une autre étape critique qui ne peut pas être négligée dans le processus multiplexe est la coloration DAPI. Une contre-tache DAPI de travail est la base pour l'identification cellulaire et l'analyse spatiale plus poussée utilisant le logiciel d'analyse. Un contraste important peut être vu dans l'image composite avec le fonctionnement DAPI (bleu) dans la figure 3E et dans le DAPI non-travaillant dans la figure 3F. L'image de la figure 3F n'a pas pu être utilisée pour identifier les cellules du logiciel d'analyse. Une tentative de sauver le multiplexe et l'analyse des tissus, le glissement de couverture peut-être enlevé en trempant la diapositive dans TBST suivie d'une étape de micro-ondes dans pH 6 tampon de récupération d'antigène avec une application supplémentaire de DAPI.

Une fois l'analyse monoplexe terminée et l'ordre optimal des anticorps confirmé, une stratégie multiplexe peut être construite Figure 4. Pour chaque cible, un fluorophore différent doit être choisi. Le nombre associé à chaque fluorophore représente grossièrement la longueur d'onde fluorescente spectrale émise après l'excitation, semblable à la cytométrie du débit. Il faut faire attention lorsqu'on associe les anticorps proposés aux fluorophores pour limiter les chevauchements spectrals et les saignements potentiels des marqueurs. Une bonne stratégie consiste à choisir des longueurs d'onde loin les unes des autres pour co-localiser les anticorps afin de réduire l'excès de chevauchement spectral fournissant une image nette et un phénotypage plus fiable13. Par exemple, dans la stratégie multiplexe affichée (Figure 4), CD8 est jumelé au fluorophore 570 tandis que le CD3 est jumelé au fluorophore 520. Il faut éviter l'utilisation de fluorophore 540 et 570 dans les cibles co-localisées car celles-ci ont tendance à être les plus indiscriminantes et peuvent altérer les résultats. Fluorophore 620 a tendance à être très lumineux et devrait être utilisé pour les anticorps qui ne sont pas abondants dans le tissu. Une bibliothèque récente utilisée comme référence pour chaque fluorophore aide également à réduire le chevauchement spectral des fluorophores. Une glissière vierge qui subit toutes les rondes de récupération d'antigène est nécessaire pour assurer l'extraction de l'autofluorescence à partir de l'image composite. Cette diapositive vierge subira le même traitement que les diapositives multiplexes, sauf à la place d'un anticorps primaire de travail et le fluorophore, le diluant anticorps et le diluant fluorophore seront utilisés respectivement Figure 4B.

Pour s'assurer que la conception du multiplexe fonctionne correctement et que les marqueurs vus dans l'image composite sont spécifiques, utilisez l'image de pathologie en combinaison avec l'option de réglage « brightfield » à l'aide d'un logiciel de microscope qui crée une image iHC fausse qui peut ensuite être par rapport aux essais précédents du CiPH discutés à la section 1. Malheureusement, de belles images composites peuvent ne pas nécessairement refléter une tache précise et c'est une étape importante pour contrôler la qualité du processus et prévenir les résultats faux positifs. La figure 5A montre une image composite sans souci initial. CD3 est visualisé et montre coloration spécifique (vert) et est confirmé par l'image de la pathologie brightfield dans la figure 5B. CD163 (orange) est vu dans l'image composite (figure 5A); cependant, en évaluant la vue de champ lumineux de pathologie de CD163 (figure 5C),l'anticorps n'est pas spécifique. Un exemple d'image multiplexe optimale avec une coloration spécifique est démontré dans une image composite (Figure 5D). La spécificité CD3 et CD163 est confirmée à l'aide de la vue de la pathologie brightfield (figure5E et Figure 5F, respectivement) et se compare favorablement aux essais précédents du CSI effectués à l'aide de ces anticorps (non montrés).

Figure 1
Figure 1 : Diagramme de flux de travail de coloration.
Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Développement du monoplex.
(A) Glissement de cancer du côlon avec FOXP3 à la position 1. (B) Glissement du cancer du côlon avec FOXP3 à la position 2. (C) Glissement de cancer du côlon avec FOXP3 à la position 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Succès et pièges du monoplex et du multiplexe.
(A) Monoplex test of primary colon cancer with FOXP3 at position 3, fluorescent intensity label shown. (B) Multiplex d'assay du cancer du côlon primaire avec FOXP3 à la position 3 et CD3 à la position 2. (C) Test monoplex du cancer du côlon primaire avec FOXP3 à la position 1, étiquette d'intensité fluorescente montrée. (D) Multiplex d'un cancer du côlon primaire avec FOXP3 à la position 1 et CD3 à la position 2. (E) Multiplex d'essais du cancer du côlon primaire avec ordre d'anticorps comme suit: CD8 (jaune), CD3 (vert), CD163 (orange), pancytokeratin (blanc), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rouge), DAPI de travail (bleu). (F) Multiplex d'essais du cancer du côlon primaire avec ordre d'anticorps comme suit: CD8 (jaune), CD3 (vert), CD163 (orange), pancytokeratin (blanc), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rouge), Non-travail DAPI (bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Développement des multiplexes.
(A) Ladiapositive multiplex du cancer du côlon dans un multiplexe de 7 couleurs. (B) Diapositive blanche dans un multiplexe de 7 couleurs utilisant le tissu de cancer du côlon. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Analyse de la spécificité d'un multiplexe 7 couleurs.
(A) Multiplex image composite avec des anticorps comme suit: CD8 (jaune), CD3 (vert), CD163 (orange), pancytokatin (blanc), Ki67 (rouge), DAPI (bleu). (B) Vue de l'image de la pathologie dans le panneau A sur cD3 seulement vue. (C) Vue de l'image de la pathologie dans le panneau A sur CD163 seulement vue. (D) Multiplex image composite avec des anticorps comme suit: CD8 (jaune), CD3 (vert), CD163 (orange), pancytokeratin (blanc), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rouge), DAPI (bleu). (E) Vue de champ lumineux de pathologie de l'image dans le panneau D sur la vue seulement de CD3. (F) Vue de champ lumineux de pathologie de l'image dans le panneau D sur CD163 seulement vue. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Les spécimens intacts de tissu de la biopsie pleine de tumeur et de la résection chirurgicale restent les outils diagnostiques et prédictifs importants pour l'analyse de la maladie aussi bien que le pronostic patient. L'immunohistochimie fluorescente multiplex (mfIHC) est une technique nouvelle qui combine les avantages de l'immunohistochimie (IHC), de l'immunofluorescence (IF) et de la cytométrie de flux. Les méthodes précédentes pour sonder les cellules in situ ont permisl'évaluation des arrangements de cellule à cellule dans un environnement tissulaire 8, cependant, le faible nombre d'épitopes qui peuvent être sondés limite l'analyse complexe. Cytométrie de flux, bien qu'utile dans l'analyse de nombreux types de cellules dans un spécimen, perd le contexte spatial en vertu de la préparation d'échantillons comme une suspension de cellule unique9,10. mfIHC comble ces techniques en conservant le contexte spatial du microenvironnement cellulaire et en augmentant le nombre d'épitopes qui peuvent être étiquetés tout en amplifiant le signal par épitopée étiquetée11. La recherche précédente a employé mfIHC pour phénotypage l'infiltration cellulaire dans le cancer et les spécimens de tissu non-cancer1,2,3,4,5,15. L'analyse post-image a également été utilisée pour analyser les relations spatiales des cellules et des structures dans le microenvironnement tissulaire1,2,4. Pour une analyse fiable, une image spécifique et précise doit d'abord être produite. La technique de coloration manuelle, par opposition à un système de coloration automatisé, permet aux laboratoires plus petits et soucieux des coûts d'accéder à cette technologie. Le temps d'optimisation et le temps de coloration sont parmi les plus grands obstacles à la réalisation d'une image fiable pour une analyse spatiale plus poussée.

Plusieurs règles générales augmentent la probabilité d'une génération réussie d'une image composite fiable multiplexe et permettra d'économiser du temps et des ressources. Les anticorps à utiliser dans le multiplexe doivent être choisis en fonction du succès avec le CSI conventionnel manuel. Les tampons de récupération d'antigène avec pH 6 et pH 9 devraient être utilisés pour iHC afin d'étudier la récupération appropriée d'antigène pour une utilisation dans le multiplexe. Le développement de Monoplex est nécessaire pour identifier le placement des anticorps dans le protocole de multiplexage. La raison d'être de cela est compliquée et varie entre les spécimens de tissus et les épitopes. Dans certains cas, l'épitope peut se dégrader avec plusieurs étapes de micro-ondes et la visualisation des marqueurs est perdue, comme c'est souvent le cas avec CD3. FOXP3, cependant, devient plus lumineux avec plus de pas de micro-ondes et est à peine visible si placé à la première ou deuxième ronde du multiplex13,14.

Le processus de coloration commence par le tissu FFPE coupé sur des lames chargées. Le premier problème qui peut être rencontré est le tissu tombant de la diapositive après le micro-ondes. Lorsque les lames chargées ne sont pas utilisées, l'adhérence du tissu à la surface de verre est limitée et le tissu aura soit pliage excessif ou peut glisser entièrement. Pour s'assurer que le tissu adhère aux diapositives pendant le processus de coloration, plusieurs techniques sont exécutées. Tout d'abord tout en coupant les blocs sur des toboggans, la forme la plus pure de l'eau fonctionne mieux. Pour certains laboratoires, l'eau déionisée peut être suffisante, mais l'eau distillée a mieux fonctionné. Les lames doivent être séchées à plat immédiatement après la coupe à 37 oC pendant la nuit. Afin d'assurer davantage l'adhérence, les glissières sont ensuite placées dans un four d'hybridation et cuites à plat à 60 oC pendant une heure juste avant l'utilisation. Bien que la fixation de formaline ait déjà eu lieu pendant le processus initial de préparation de tissu, placer les glissières dans la formaline tamponnée neutre pendant 30 min après que le processus de déparaffinisation et de réhydratation améliore l'intégrité structurale du monté tissu1,13.

Le processus de coloration manuel peut prendre jusqu'à trois jours de 8 heures selon le nombre d'anticorps utilisés. Éviter les pièges est essentiel pour gagner du temps et épargner les réactifs. La première erreur commune se produit souvent dans la préparation de réactif. L'eau diffère d'un laboratoire à l'autre et peut être la seule différence dans les résultats d'un laboratoire à l'autre. L'utilisation de la même ainsi que d'une source d'eau propre pour toutes les réactions et réactifs assure un résultat cohérent. Les anticorps, la solution de blocage et les fluorophores fonctionnent mieux à température ambiante. Pour éviter les pièges dans la préparation des réactifs et des solutions de travail, utilisez la même eau pour tous les réactifs. Utilisez également toutes les solutions de travail et réactifs à température ambiante.

Le dépannage du mfIHC est important et le respect des directives strictes du laboratoire est crucial pour limiter la contamination des composants et/ou l'erreur de l'opérateur. La production d'images sous-optimales faussera les résultats et conduira à de fausses populations de cellules positives et négatives qui peuvent avoir un impact négatif sur les données. Étant donné que l'analyse finale inclut généralement des phénotypes générés par ordinateur basés sur l'apprentissage automatique, de petites erreurs dans la coloration peuvent être amplifiées pour affecter l'ensemble des données. Par exemple, bien que toutes les taches puissent fonctionner parfaitement, une erreur ou une omission de DAPI empêchera la segmentation future des cellules et le comptage rendant l'expérience inutile. Le logiciel d'analyse utilise la coloration DAPI non seulement pour identifier les cellules, mais attribue des coordonnées x et y à chaque cellule et si le multiplexe a faible, mal circonscrit, ou diffuse dAPI coloration, l'image ne peut pas être plus utilisé et le multiplexe doit être refait ou tenté sauvetage et la re-coloration de DAPI. L'utilisation de composants logiciels tels que la pathologie et les vues de brightfield améliorera la confiance dans la sensibilité et la spécificité tôt dans le processus d'optimisation et de prévenir les erreurs au début du processus multiplexe.

Les aspects de modification du processus d'imagerie peuvent également faciliter l'optimisation de l'image. Par exemple, prendre une image en utilisant DAPI comme aide visuelle pour se concentrer permet d'éviter les images floues. L'ajout de la bibliothèque de fluorophore nouvellement faite au logiciel assurera une image propre et moins de chevauchement spectral de chaque fluorophore pendant la phase d'analyse et l'utilisation de la diapositive blanche pour extraire l'autofluorescence intensifie les marqueurs et améliore l'image qualité.

L'utilisation de spécimens de tissus a et restera un outil essentiel dans l'étude de la pathophysiologie de la maladie. La technologie émergente a permis de mieux comprendre les interactions de cellule à cellule et le MfIHC est un nouveau joueur prometteur. L'optimisation et la précision pendant le processus de coloration dans cette technique est primordiale pour une utilisation appropriée et une analyse plus approfondie des interactions cellule-cellule.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs tient à remercier Ed Stack, précédemment de Perkin Elmer, pour son aide à la configuration et l'optimisation de la coloration multiplexe d'origine. Les auteurs souhaitent également remercier Kristen Schmidt d'Akoya Biosciences pour les conseils à l'aide du logiciel d'analyse. La recherche publiée dans cette publication a été appuyée par les National Cancer Institutes of Health sous le numéro de prix P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA2414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. Jeffery A. Colby Colon Cancer et Tom Liu Memorial Research Funds ont fourni un soutien supplémentaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol Fisher HC8001GAL
70% ethanol Fisher HC10001GL
95% ethanol Fisher HC11001GL
Analysis software Akoya Biosciences CLS135783 inForm version 2.3.0
Antifade mountant ThermoFisher P36961 ProLong Diamond
Blocking solution Vector SP-6000 Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Life Sciences A9647-100G
Cover Slips Fisher 12-548-5E
Delicate task wipe Kimberly-Clark 34120
Fluorescent diluent Akoya Biosciences ARD1A01EA Opal TSA diluent
Fluorophore 520 Akoya Biosciences FP1487001KT 1:100
Fluorophore 540 Akoya Biosciences FP1494001KT 1:100
Fluorophore 570 Akoya Biosciences FP1488001KT 1:100
Fluorophore 620 Akoya Biosciences FP1495001KT 1:100
Fluorophore 650 Akoya Biosciences FP1496001KT 1:100
Fluorophore 690 Akoya Biosciences FP1497001KT 1:100
Fluorophore DAPI Akoya Biosciences FP1490 3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box Tissue-Tek 25608-904 Plastic slide box-green
Humidified Chamber Ibi Scientific AT-12
Hybridization oven FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen Vector H-4000 ImmEdge
Microscope Perkin Elmer CLS140089 Mantra quantitative pathology workstation
Microwave Panasonic NN-A661S with inverter technology
Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4 10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR600 AR6
pH 9 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR900 AR9
Phosphate buffered saline Fisher BP3994 PBS
Plastic slide box Tissue-Tek 25608-906
Plastic wrap Fisher NC9070936
Polysorbate 20 Fisher BP337-800 Tween 20
Primary antibody CD163 Lecia NCL-LCD163 1:400
Primary antibody CD3 Dako A0452 1:400
Primary antibody CD8 Spring Bio M5390 1:400
Primary antibody FOXP3 Dako M3515 1:400
Primary antibody pancytokeratin Cell Signaling 12653 1:500
Primary antibody PD-L1 Cell Signaling 13684 1:200
Secondary antibody Akoya Biosciences ARH1001EA Opal polymer
Slide stain set Electron Microscopy Sciences 6254001
Tris buffered saline Corning 46-012-CM TBS
Vertical slide rack Electron Microscopy Sciences 50-294-72
Xylene Fisher X3P1GAL

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References

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