Coxsackievirus 'a karşı antiviral adayların tanımlanması için viral giriş analizinin kullanımı ve moleküler yerleştirme Analizi A16

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protokol amacı, aday viral giriş inhibitörleri tanımlamak için kullanılabilecek viral giriş ile ilgili farklı deneyleri göstermek için.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wang, J. Y., Lin, C. J., Liu, C. H., Lin, L. T. Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16. J. Vis. Exp. (149), e59920, doi:10.3791/59920 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antiviral bir mekanik viral giriş incelemek için hangi adım değerlendirilen ajanlar en etkili olduğunu ayırt etmek için uygun olduğunu, ve aday viral giriş inhibitörleri tanımlanması için izin asdiyor. Burada, virüs parçacıklarını veya erken viral girişteki belirli adımları hedefleyerek, zarfsız coxsackievirus A16 (CVA16) tarafından enfeksiyonun engellenebilen küçük moleküllerin tanımlanması için deneysel yaklaşımlar sunuyoruz. Assays zaman-of-ilaç-ilavesi analizi, akış sitometri tabanlı viral bağlayıcı tahlil ve viral inaktivasyon assay içerir. Ayrıca, antiviral bileşiklerin hedeflediği potansiyel kalıntıları tahmin etmek için virüs kapsid proteinlerini kullanan bir moleküler yerleştirme Protokolü sunuyoruz. Bu tanıtım viral giriş üzerinde hareket aday antiviral ajanlar tanımlanmasını yardımcı olmalıdır. Gelecek yönleri daha fazla ilaç gelişimi için bu olası inhibitörleri keşfedebilirsiniz.

Introduction

El, ayak ve ağız hastalığı (HFMD), küçük çocuklarda coxsackievirus A16 (CVA16) ve enterovirüs 71 (EV71) tarafından en sık neden olan bir hastalıktır. Son zamanlarda Asya-Pasifik Bölgesi genelinde, CVA16 kaynaklı HFMD 'de önemli bir Uptick olmuştur. Belirtiler hafif olabilir iken, şiddetli komplikasyonlar beyin ve kalp etkileyen oluşabilir, potansiyel Fatality ile1,2. Şu anda, hiçbir lisanslı antiviral tedaviler veya aşılar CVA16 için mevcut, ve bu nedenle bir baskı ihtiyacı gelecek salgınlar ve ilişkili komplikasyonlar frenlemek için antiviral stratejiler geliştirmek için vardır.

CVA16 bir icosahedral kapsid her biri 4 yapısal proteinleri yani VP1, VP2, VP3 ve VP4 içeren pentam montajlı bir olmayan zarflı virüs. Pentamer her beş kat ekseni çevreleyen bir ' Kanyon ' bölge bir depresyon olarak gösterir ve reseptör bağlayıcı rolü için belirtilmiştir3. Bu kanyon altında bir hidrofobik cep yatıyor VP1 bölgede doğal bir yağ ligand adlı sphingosine (SPH) içerir. Cellular reseptörleri, insan P selektin glikoprotein ligand 1 (psgl-1) ve çöpçü reseptör sınıf B üyesi 2 (SCARB2) gibi, bu ligand yerinden tarafından viral bağlayıcı bir rol oynamak için önerilmiştir hangi kapsid ve Konformasyonel değişiklikler sonuçlanır viral genomu daha sonra ev sahibi hücreye4,5,6. Viral giriş sürecinde ardışık olayları engelleyen olası inhibitörleri tanımlamak CVA16 enfeksiyonuna karşı potansiyel terapötik stratejiler sağlayabilir.

Virüs yaşam döngüsünde adımlar, mod özgü antiviral ajanlar tanımlamanıza yardımcı olmak için hedefler olarak deneysel yaklaşımlar üzerinden disseke olabilir. Bir zaman-of-ilaç-ek analiz viral enfeksiyon sırasında farklı zamanlarda ilaç tedavi etkisini inceler, ön giriş de dahil olmak üzere (virüs enfeksiyonu önce eklendi), giriş (virüs enfeksiyonu eşzamanlı eklendi), ve sonrası giriş (aşağıdaki eklendi virüs enfeksiyonu)7. Etkisi her tedavi koşullarında oluşan viral plaklar sayısını quantitating standart bir plak tahlil kullanılarak değerlendirilebilir. Akış cytometry tabanlı viral bağlayıcı tahlil ilaç ev sahibi hücrelere viral eki önler Eğer belirler. Bu, insan virüsü enfeksiyonlarının çoğunun oluştuğu 37 °C ' den gelen sıcaklığı, viriyonların ana hücre yüzeyine bağlanabildiği ancak hücreleri7' ye giremeyeceği 4 °c ' ye kadar kaydırarak elde edilir. Hücre membranı bağlı virüs parçacıkları daha sonra viral antijenlere karşı immünostatif ile ölçülmüş ve akış sitometri tarafından değerlendirilir. Diğer taraftan viral inaktivasyon assay ücretsiz virüs parçacıkları ile ilacın potansiyel fiziksel etkileşimlerini değerlendirmek için yardımcı olur, ya kalkanlama ya da virions nötralize, ya da neden toplamalardan ya da onları etkin hale getirmek Konformasyonel değişiklikleri enfeksiyon sırasında ana hücre yüzeyi ile sonraki etkileşimleri8,9. Bu deneyde, viral inokulumunu ilk ilaç ile ana hücre tek tabakalı enfekte ve standart bir plak tahlil8gerçekleştirmeden önce ilaç dışarı titrat için seyreltilmiş olmak için izin verilir. Son olarak, moleküler yerleştirme virion yüzeyinde potansiyel uyuşturucu etkileşimi sitelerini tahmin etmek için güçlü bir araçtır, zarflı virüslerden viral glikoproteinler ve non-zarf virüslerden viral kapsid proteinleri dahil, Hesaplamalı kullanarak Algoritma. Bu mekanik ilaç eylem modu hedeflerini belirlemek için yardımcı olur ve daha fazla aşağı akım assays tarafından doğrulanabilir yararlı bilgiler sağlar.

Son zamanlarda etkili olmayan zarflı CVA169tarafından enfeksiyon bloke antiviral bileşikler tanımlamak için yukarıda açıklanan yöntemleri istihdam. Burada, kullanılan ayrıntılı protokoller açıklanmıştır ve tartışılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Tüm hücre kültürü ve virüs enfeksiyonları, işlenen numunelerin Biyogüvenlik düzeyine uygun sertifikalı Biyogüvenlik davlumbazlarında yapılmalıdır. Küçük moleküllerin chebulagik asit (CHLA) ve punicalagin (PUG) iki tannin-sınıfı, etkili CVA16 enfeksiyon9engellemek için gözlenen, aday inhibitör ajanlar örnekleri olarak kullanılır. Viroloji teknikleri, virüs yayılma, virüs titer belirlenmesi ve plak şekillendirme birimleri (PFU) veya enfeksiyon çokluğu (MOı) kavramları temel ilkeler için, okuyucu referans10denir.

1. hücre kültürü, virüs hazırlama, bileşik hazırlama ve bileşik sitotoksisite

  1. İnsan rhabdomiyoskomi (RD) hücreleri CVA16 enfeksiyon11için ev sahibi hücrelerdir. RD hücrelerini, 10 ml 'lik Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (dmem) ile 10% fetal sığır serumu (FBS) ile tamamlayıcı olarak büyütün, 200 U/ml penisilin G, 200 μg/ml streptomisin ve 0,5 μg/ml Amfoterisin B, T-75 ' d a% 5 Co2 ' de 37 °c ' de flsorat.
  2. RD hücrelerinde virüsü yaymak ve PFU/ml viral titresi belirlemek tarafından CVA16 hazırlayın. Optimize edilmiş protokol için lütfen11' e başvurunuz.
  3. Test bileşiklerini ve denetimlerini ilgili çözücüleri kullanarak hazırlayın: Örneğin, CHLA ve PUG 'yi dimetil sülventide (DMSO) içinde çözülür. Tüm enfeksiyon adımları için, bazal orta DMEM artı 2% FBS ve antibiyotikler oluşur.
    Not: Test bileşik tedavilere DMSO son konsantrasyonu eşit veya% 0,25 altında deneyler; 0,25% DMSO karşılaştırılması için deneyleri bir negatif kontrol tedavisi olarak dahildir.
  4. RD hücrelerinde XTT ((2, 3-bis [2-metoksi-4-Nitro-5-sulfophenyl] 5-fenylamino)-karbonil]-2H-tetrazolium hidroksit) gibi reaktif belirlenmesi ile ilgili test bileşiklerinin sitotoksisite tahlili gerçekleştirin. Ayrıntılı protokol için lütfen12' ye başvurun. Üreticinin protokolüne göre GraphPad Prism gibi bir analitik yazılım kullanarak test bileşiklerinin sitotoksisite konsantrasyonlarını belirleyin. Hücre kalabilirliği önemli ölçüde etkilemez ilaç konsantrasyonları (≥ 95% uygun hücreler) çalışmanın geri kalanı için kullanılır.

2. zaman-of-ilaç-ek assay

  1. Viral enfeksiyondan önce ev sahibi hücrelerde ilaçların etkisini değerlendirmek için (ön tedavi)
    1. 2 x 105 hücreli/iyi bir tohumlama yoğunluğu 12-kuyu plakaları IÇINDE tohum RD hücreleri. Bir monolayer elde etmek için% 5 CO2 kuluçko içinde bir gecede 37 °c ' de inkübe.
    2. RD hücrelerini, 1 h veya 4 h için 1 mL bazal medya hacminde sitotoksisik olmayan konsantrasyonlarda (adım 1,4 ' den belirlenir) test bileşikleri ile tedavi edin.
    3. 1-2 ml PBS ile yıkama hücreleri eklenmeden önce 50 PFU/Well bazal orta virüs (inokulumunu son hacmi olan 300 μL) için 1 h. her 15 dakikada bir taş plaka.
    4. Enfeksiyonun ardından, PBS kullanarak monolayerleri tekrar yıkayın, sonra% 5 CO2 kuluçte 37 °c ' de daha fazla inkübasyon için% 0,8 metilselüloz Içeren 1 ml bazal medyaya bindirin.
    5. 72 sonra inkübasyon, bindirme medyayı çıkarın ve 2 mL PBS kullanarak kuyuları yıkayın.
    6. 15 dakika boyunca 0,5 mL% 37 formaldehit kullanarak kuyuları düzeltin.
    7. Süpernatant çıkarın ve PBS kullanarak tekrar yıkayın.
    8. 0,5 mL% 0,5 kristal menekşe çözeltisi kullanarak kuyuları lekeleyin. Sonra 2 dakika içinde leke solüsyonu çıkarın ve hava kurutmadan önce hafif bir su akışı ile kuyuları yıkayın.
    9. Plaka beyaz ışık kutusuna yerleştirerek viral plakları saymak. Yüzde (%) hesaplayın CVA16 enfeksiyon aşağıdaki gibidir: (ortalama # plak virüsü + ilaç /Mean # plak virüsü + DMSO kontrol) × 100%.
  2. İlaçlar ve virüsün aynı anda eklenmesi etkisini değerlendirmek için (ortak ilavesi)
    1. 2 x 105 hücreli/iyi bir tohumlama yoğunluğu 12-kuyu plakaları IÇINDE tohum RD hücreleri. Bir monolayer elde etmek için% 5 CO2 kuluçko içinde bir gecede 37 °c ' de inkübe.
    2. RD hücrelerini uygun konsantrasyonlarda test bileşikleri ile tedavi edin ve 50 PFU/Well CVA16 (inokulumunu son hacmi 300 μL 'dir) aynı anda 1 h. her 15 dakikada bir plaka kaya.
    3. 1 mL PBS ile yıkayın ve sonra% 5 CO2 kuluçko Içinde 37 °c ' de daha fazla kuluçl için 0,8% metilselüloz içeren bazal medya 1-2 ml ile bindirme.
    4. 72 h sonrası enfeksiyon sonra kristal menekşe ile leke viral plaklar ve yukarıda açıklandığı gibi% CVA16 enfeksiyon belirler.
  3. Viral giriş sonrası ilaç tedavisi etkisini değerlendirmek için (enfeksiyon sonrası)
    1. 2 x 105 hücreli/iyi bir tohumlama yoğunluğu 12-kuyu plakaları IÇINDE tohum RD hücreleri. Bir monolayer elde etmek için% 5 CO2 kuluçko içinde bir gecede 37 °c ' de inkübe.
    2. RD hücrelerini 50 PFU/Well CVA16 (inokulumunu son hacmi 300 μL) ile inoculate 1 h. her 15 dakikada bir plakayı kaya.
    3. 1-2 mL PBS ile kuyuları yıkayın ve 0,8% metilselüloz ve test bileşiklerinin uygun konsantrasyonları içeren bazal medya ile hücreleri bindirme.
    4. Kristal menekşe ile leke viral plaklar ve 72 h sonrası enfeksiyon sonra saymak ve yukarıda açıklanan% CVA16 enfeksiyon inküsyon belirlemek.
      Not: Hücrelerin kaldırılması önlemek için yavaşça tüm PBS yıkanıyor gerçekleştirin.

3. akış sitometri bazlı bağlayıcı tahlil

  1. 2 x 105 hücreli/iyi bir tohumlama yoğunluğu 12-kuyu plakaları IÇINDE tohum RD hücreleri. Bir monolayer elde etmek için% 5 CO2 kuluçko içinde bir gecede 37 °c ' de inkübe edin.
  2. 1 saat için 4 °c ' de hücre tek tabakalı ön Chill.
  3. 4 °C ' de 3 h için test bileşiklerinin varlığı ve yokluğunda CVA16 (MOı = 100) ile RD hücrelerini bulaştırın.
    Not: 4 °c ' de sıcaklık korumak için 4 °c ' de buz üzerinde viral aşı ve ortaya çıkan inkübasyon gerçekleştirin, bu da viral bağlamaya izin verir, ancak giriş yapmaz.
  4. Virüs inokulumunu çıkarın ve 1-2 ml buz soğuk PBS ile bir kez yıkayın.
  5. Hücreleri toplamak ve buz-soğuk akış sitometri tampon (1x PBS artı 2% FBS) onları resuspending önce, 3 dakika buz kuyuları için buz-soğuk ayrışma tampon 1 ml ekleyerek hücreleri kaldırın.
  6. Buz-soğuk akış sitometri tamponunu kullanarak hücreleri iki kez yıkayın ve buz üzerinde 20 dakika boyunca 0,5 mL% 4 paraformaldehit ile hücreleri düzeltin.
  7. Herhangi bir ilişkisiz veya zayıf bağlı virüsleri kaldırmak için PBS kullanarak hücreleri yıkayın ve sonra hücreleri leke Anti-VP1 antikor 1 mL (1:2000;% 3 BSA içeren PBS seyreltilmiş) 1 h için buz üzerinde, ikinci bir Alexa 488-konjuza Anti-fare IgG (1:250 ile inkübasyon izledi; 1 h için buzda% 3 BSA içeren PBS 'de seyreltilir. her antikor tedavisinin ardından PBS yıkasları (3 kez) gerçekleştirin.
  8. 0,5 mL 'Lik buz-soğuk akış sitometri tamponunun hücrelerini resuspend ve standart prosedürler kullanılarak bir akış sitometre üzerinde akış sitometri analizi gerçekleştirin. İlişkili Yazılım ve çubuk grafik gösterimi için quantitate kullanarak histogram verileri mevcut.

4. viral Inaktivasyon assay

  1. Daha önce açıklanan12 aşağıdaki koşulları kullanarak viral inaktivasyon assay gerçekleştirin:
    -106 PFU/ml CVA16 bir başlangıç konsantrasyonu.
    -2 x 105 hücre/iyi bir tohumlama yoğunluğu 12-kuyu plakaları RD hücre monolayers.
    -50-50 PFU/Well son virüs konsantrasyonu sonuçlanan ilaç bileşikleri titreyme için Fold seyreltme.
    -1-2 mL PBS kullanarak yıkama adımları.
    -% 0,8 metilselüloz içeren kaplama ortamı.
  2. Yukarıda ayrıntılı olarak viral plaklar prosedürün kristal menekşe boyama kullanarak viral enfeksiyon son okuma gerçekleştirin.

5. moleküler yerleştirme Analizi

  1. PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) test bileşiklerinin 3D molekülleri indirin. Moleküllerin yüklenmiş bir 3B yapısı yoksa, 2B yapıları indirin veya gülme dize dizisini kullanın ve bir moleküler program (örneğin CORıNA) ile 3D moleküllere dönüştürün.
  2. RCSB protein veri bankasından viral biyolojik montaj birimini indirin (https://www.rcsb.org/) ve viral yapı modelini bir biyobilgisayar programı (örneğin, UCSF Chimera) kullanarak hazırlayın. Örneğin, CVA16 olgun virion kristal yapısı (PDB: 5C4W)3durumunda, pdb dosyasından çözücüleri silin, Dunbrach 2010 Rotamer Kütüphanesi 'nden veri kullanarak tamamlanmamış yan zincirleri değiştirin ve yapıya hidrojenler ve masraflar ekleyin daha önce13bildirdi. Yerleştirme hedefleri, biyolojik montaj bilgileri (protein veri Bankası) ile amaçlanan analiz için herhangi bir ilgili viral proteinler olabilir.
  3. Örnek UCSF Chimera kullanarak hazırlanmış virüs ünitesi üzerine Dock test bileşikleri, ve bir görselleştirme yazılımı ile çıktı dosyaları analiz (örneğin, AutoDock Vina, PyMol):
    1. ' Ligand ' olarak UCSF Chimera içine test bileşik dosyasını yükleyin ve ' reseptör ' olarak hazırlanmış tüm viral protein seçerek kör yerleştirme gerçekleştirin. Arama hacmini tüm ' reseptör ' ile yeniden boyutlandırmak için bilgisayar fareyi veya trackpad 'i kullanın. ' Gelişmiş Seçenekler ' içinde, bağlama modlarının sayısının maksimum olmasını sağlar. Yerleştirme çerçeveleri otomatik olarak en yüksek en düşük bağlayıcı enerji sıralanır.
    2. Isteğe bağlı Daha da kör yerleştirme, arama hacmini azaltmak için tekrar fare veya trackpad kullanarak kör yerleştirme sonuçlarından türetilen ilgi bölgelerindeki virüs proteini üzerine yerleştirme site Confine (örneğin, 100 Å x 100 Å x 100 Å). Bu adım, kör yerleştirme sonuçlarının onaylanması ve özgüllüğü artırır yardımcı olur.
    3. Yerleştirme dosyasını yükleyerek bağlayıcı modların konumlarını çözümlemek için bir moleküler grafik sistemi (örn. PyMol) kullanın. ' Ligand ' seçerek ve ' herhangi bir atom ' seçeneği ile kutup kişileri tanımlayarak viral protein bileşik kutup kişileri bulun; sonuçları inceleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zaman-of-ilaç-ek tahlil Şekil 1 ' de belirtilir ve küçük moleküller CHLA ve pug CVA16 enfeksiyon ya pre-viral giriş (pretreatment), viral giriş sırasında (Co-ilavesi), veya post-viral giriş kullanarak tedavinin etkisini gösterir ( enfeksiyon sonrası). Hem küçük moleküller sadece CVA16 infeksiyonuna karşı marjinal bir etki yaratıp viral enfeksiyondan önce ev sahibi hücrelerin ön tedavisinde (Şekil 1a) veya enfeksiyon sonrası tedavi (Şekil 1C). Bunun aksine, CHLA ve PUG, CVA16 enfeksiyonunu ortak ilavenin tedavisinde >% 80 oranında etkili bir şekilde iptal etmiştir (Şekil 1B). Bu gözlemler bu nedenle, iki bileşiklerin, enfeksiyon sırasında ana hücre yüzeyinde virüs parçacıkları ile aynı anda mevcut olduğunda en etkili olduğunu düşündürmektedir.

Şekil 2' de, akış sitometri bazlı bağlama Analizi ( Şekil 2a'da şemaya göre gösterilmiştir), iki tanenin, ev sahibi hücrelere viral parçacık BAĞLAMASıNı önleyerek CVA16 girişini engellemediğini doğrular. Şekil 2B 'deki miktar VERILERI, RD hücre yüzeyinde algılanan virüsün iki ilacın varlığına göre% 10 ' dan az olduğunu, CVA16 Eki14' ün önlendiği heparin pozitif kontrole benzer olduğunu gösterir. Şekil 2C, 2Bve 2e , CHLA ve pug mevcutken RD hücre yüzeyinde CVA16 algılanması nedeniyle bant kayması önemli ölçüde azaltılan ilişkili akış sitometri histogretini tasvir ediyor.

Şekil 3A Viral inaktivasyon denemenin nasıl gerçekleştirildiği gösterilmektedir. İlaç bileşik ya CVA16 virüs parçacıkları ile karışık ve 1 h (uzun vadeli) seyreltme adımına önce ya da karışık ve hemen seyreltilmiş (kısa vadeli) enfeksiyondan önce inküsyon oldu. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, 1 h için test AJANLARı ile CV16 partiküllerinin ön kuluçk, kısa süreli kuluçk ve DMSO kontrolüne kıyasla RD hücrelerinin Viral enfeksiyona karşı tam bir koruma sağlar. Sonuçlar bu nedenle hem CHLA ve PUG CVA16 parçacıkları ile etkileşim ve onları sonraki enfeksiyon aktif hale mümkün olduğunu düşündürmektedir.

Bizim veri ilaç bileşikleri doğrudan CVA16 parçacıklar devre dışı ve dolayısıyla kendi antiviral aktivite makul bir hedef olarak virion kendisini tanımlayabilir olduğunu belirtmek için, biz bu arasında potansiyel etkileşim (ler) tahmin moleküler yerleştirme kullanılır ajanlar ve CVA16 kapsid pentamer. Şekil 4A CVA16 virion icosahedral kapsid yapar CVA16 pentamer bir yüzey projeksiyon gösterir. Tanilerin moleküler yerleştirme CHLA (Şekil 4b; yeşil) ve pug (Şekil 4c; mavi) her ikisi de CVA16 pentamer Kanyon bölgesinde bağlamak için tahmin edildiğini gösterir. Özellikle, her iki küçük moleküller cep girişi (Şekil 4b ve 4c, zumlanmış paneller), cep faktörü tutan ve CVA16 bağlayıcı ve ana hücre içine giriş aracılık için önemli bir rol oynuyor. CHLA ve PUG bu nedenle, teorik olarak virüs parçacıkları ve ana hücre reseptörleri arasındaki etkileşimleri engelleyecek cep girişi bölgesini maskelemek için görünür. Şekil 4d ve 4E benzersiz kalıntıları chla ve pug, sırasıyla, cep girişinde etrafında kutup kontakları tahmin gösterir, bu etkileşimlerin çoğu VP1 ile oluşan hem bileşikler ve 3 amino asitler ASN85 , LYS257, ve asn417 iki taninler arasında ortak olmak.

Figure 1
Şekil 1: CVA16 infektif karşı CHLA ve PUG Ilaç zaman-ek etkisi. RD hücreleri CVA16 aşı (50 PFU/kuyu) farklı zamanlarında chla (20 μm) veya Pug (25 μm) ile tedavi edildi. DMSO (% 0,25) tedavi negatif kontrol olarak dahil edildi ve tüm testlerinkulasyon sonra kristal menekşe boyama 72 h kullanarak plak tahlil tarafından analiz edildi. (A) ön tedavi için, hücreler 1 h veya 4 h için test bileşikleri ile inküsyon ve daha sonra CVA16 enfeksiyon önce yıkandı. (B) Co-ilavesi için, hücreler aynı anda 1 h ve sonra yıkanmış ilaçlar ve virüs ile uygulandı. (C) sonrası enfeksiyon, hücreler CVA16 ile bulaşmış 1 h, yıkanmış, ve daha sonra test bileşikleri ile tedavi. Gösterilen veriler, üç bağımsız deneyden gelen ± standart sapma (SD) anlamına gelir. *p < 0,05 ilgili ' virüs sadece ' grubuna kıyasla. İstatistiksel analiz, tek yönlü varyans analizi kullanılarak yapılmıştır. Bu rakam referans9' dan uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: CHLA ve PUG CVA16 ana hücreye bağlama kaldırılması. (A) akış sitometri bazlı bağlayıcı tahlil şematik. (B) 4 °c ' de 3 h için Chla (20 ΜM), Pug (25 μM), çözünebilir heparin (500 μg/ml, pozitif kontrol) veya dmso (% 0,25, negatif kontrol) varlığı veya yokluğunda CVA16 (MOI = 100) ile enfekte edildi. Kuyulardan inocula tüpler içine toplandı, iki kez PBS ile yıkanmış, sabit, ve anti-VP1 antikor ile lekelenmiş Alexa 488 tarafından izlenen-yüzeye bağlı virüslerin akış sitometri algılama için konjued ikincil antikor. Algılanan floresan sinyallerinden nicelik veriler, çubuk grafikte üç bağımsız deneyden gelen ± SD olarak ' virüs bağlama (%) ' olarak çizilmiş. *p < 0,05 ' DMSO ' kontrol tedavisine kıyasla. İstatistiksel analiz, tek yönlü varyans analizi kullanılarak yapılmıştır. CHLA (C), Pug (D) ve heparin (E) tedavilerinin temsili akış sitometri histograları gösterilir. Bu rakam referans9' dan uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: chla ve pug hücre içermeyen CVA16 virüs parçacıklarını devre dışı. (A) viral inaktivasyon tahlil şematik. (B) CVA16 (106 PFU/Well) Chla (20 ΜM) veya Pug (25 μM) ile tedavi edildi ve kısa süreli inaktivasyon için hemen karıştırılır veya 37 °c ' de 1 saat boyunca uzun süreli inaktivasyon için% 50-etkili olmayan bir test konsantrasyonuna kadar seyreltilmiş RD hücrelerinde Birmanya önce bileşikler (son virüs konsantrasyonu = 50 PFU/Well). DMSO (% 0,25) negatif kontrol olarak kullanıldı. Deneyler kristal menekşe boyama 72 h sonrası enfeksiyon kullanarak plak tahlil tarafından analiz edildi. Gösterilen veriler, üç bağımsız deneyden gelen ± SD anlamına gelir. *p < 0,05 ilgili ' virüs sadece ' grubuna kıyasla. İstatistiksel analiz, tek yönlü varyans analizi kullanılarak yapılmıştır. Bu rakam referans9' dan uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: CHLA ve PUG, cep girişinin YAKıNıNDAKI CVA16 kapsid 'i hedef aldı. CVA16 virion parçacığın yüzey projeksiyonu kırmızı çizgiler (A) ile tarif monomerik yapısal pentamer ile. Virion ek pentam Camgöbeği, macenta, indigo, bronz ve yeşil gösterilir. CVA16 pentamer (PDB: 5C4W) üzerinde CHLA (B, yeşil) ve pug (C, mavi) molekül yerleştirme Analizi; yakınlaştırılmış paneller sarı renkte çizilmiş. VP1 = turuncu, VP2 = gri, VP3 = beyaz; kutuplu kontaklar siyah tire olarak gösterilir. Makyaj cep girişinde kırmızı renkli kalıntılar (Ile94, ASP95, gln207, met212, met213, LYS257, THR258). D, E. Cep girişinin bulunduğu kanyona yakın yan görünüm ve nerede CHLA (D) ve pug (E) bind. Pentamer üzerindeki bileşiklerin Polar kontaklarından kutup kontakları olan benzersiz kalıntılar sarı (VP1), beyaz (VP2) ve siyah (VP3) fontlarda etiketlenmiştir. Beyaz kesikli çizgi cep giriş bölgesini gösterir. Bu rakam referans9' dan uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu raporda, viral giriş hedefleyen antiviral adayların tanımlanması için yararlı olan protokolleri tarif, özellikle olmayan zarflı CVA16 karşı. Deneyleri viral giriş sırasında erken olayları incelemek için şekillerde tasarlanmıştır, hangi eylem mekanizması (ler) açıklığa kavuşturmak için yararlıdır ve potansiyel hedef (ler) test ajanları ' antiviral aktivite. ' Zaman-of-ilaç-ek tahlil ' büyük ölçüde test bileşiklerinin potansiyel hedefini belirlemek için izin verir, örneğin enfekte olmayan konak hücreleri (ön tedavi Analizi), virüs parçacıkları veya ana hücre yüzeyi ile etkileşimleri (Co-ek analiz ) veya viral çoğaltıcı faz (enfeksiyon sonrası analiz) sırasında virüs enfekte ana hücre. Bu tahlil tek başına bileşiklerin etkileşim yöntemini belirleyebilir (örneğin, Co-ek) Bu protokol (örneğin, viral inaktivasyon tahlil ve bağlayıcı Analizi) açıklanan sonraki testlerde yol açar. Yıkama adımları, incelenen tedavi yönteminin analiz edilmesine özgü olduğundan emin olmak için önemlidir. ' Akış sitometri tabanlı bağlayıcı tahlil ' kullanımı özellikle virüs bağlama ana hücreye bileşiklerin etkilerini değerlendirmek için yardımcı olur. 4 °C ' de deney sıcaklığının korunması, hücre yüzeyinde viriyonlarının son tespiti için önemlidir, çünkü bu sıcaklık viral bağlamaya izin verir, ancak giriş yapmaz. ' Viral inaktivasyon assay ' hücre içermeyen virüs parçacıkları ile ilaç bileşiklerinin potansiyel fiziksel etkileşimi belirlemek için yardımcı olabilir. Kritik adım, viral inoculum ile inkübasyon aşağıdaki ilaç bileşikleri titreyme için seyreltme, bu sonraki enfeksiyon adım12ana hücre yüzeyi ile ilaçların herhangi bir anlamlı etkileşimi önlemek için gerekli olduğu gibi.

Viral giriş çok adımlı bir olay olduğundan, antiviral ajanların bir viral giriş inhibitörü sınıfı muhtemelen de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar, kullanılabilir: (1) hücre yüzeyi giriş faktörleri/reseptörleri veya ilişkili sinyalizasyon yolları modülasyon; (2) hücre membranı akışkanlığı veya bütünlüğünü etkileyen; (3) virüs parçacıkları ve ana hücre yüzeyi arasında elektrostatik veya Van der Waals etkileşimleri hedefleme; (4) parçacık kırılma veya toplama gibi viriylere fiziksel değişikliklerin İndükleme; (5) viral glikoproteinler veya kapsid proteinlerine bağlama ve işlevlerini veya uyum değişikliklerini önleme; (6) Fusion ilişkili mekanizmaları engelleme; ve (7) ana hücre içinde viral genom serbest bırakılması önlemek. Bu raporda açıklanan analizler, bu nedenle ek deneyler tarafından daha fazla doğrulanabilir eylem yukarıdaki listelenen potansiyel modları işaret yardımcı olabilir. Son olarak, ' moleküler yerleştirme Analizi ' burada açıklanan ilaç bileşikleri ve virüs parçacıkları arasında potansiyel etkileşim bölgeleri tahmin etmek için enstrümantal, ve bu nedenle aday viral kapsid veya glikoprotein bağlayıcılar ve hedeflenen belirlemek yardımcı olabilir virüs parçacıkları üzerinde kalıntıları. Ancak, bu tahminler yerleştirme yazılımı ve çözünürlük ve viral protein kristal yapıların doğruluğu bağlıdır. Adım 5.3.2 isteğe bağlı sınırlı yerleştirme yöntemi ' reseptör ' molekül olarak viral yapısal proteinlerin kullanırken Oftentimes eklendiğini dikkat etmek önemlidir, ligand muhtemelen bölgelere normalde erişilemez veya yüzeye maruz bağlamak olabilir ( Örneğin, virion kapsid yüzeyinin altında, viriyon iç, zarf glikoproteinler, transmembran bölgeleri, vb.). Arama kutusunu sınırlandırarak viral proteinin yalnızca erişilebilir bölgelerinin hedeflenmesine ve gerçekçi olmayan etkileşimleri çıkarmasına izin verir. Moleküler yerleştirme kristalize yapılara bağlıdır, ancak Homoloji modellemede son gelişmeler, amino asit dizisini yakından ilişkili kristalize bir yapıya sığdırarak kristalize olmayan yapıların analizini sağladı15. Bu, daha fazla yapının analizine izin verdi ve elde edilen bilgiler, öngörülen etkileşimlerin doğrulanmasına yardımcı olabilecek mutasyonel analizler de dahil olmak üzere daha fazla çalışmalar için yararlı olabilir.

Sonuç olarak, bu raporda açıklanan bilgiler ve protokoller özellikle viral giriş hedefleyen aday antiviral ajanlar tanımlamak için yiyecek, ve test ajanı hedefleyen viral giriş sürecinin hangi adımda bilgi sağlamak, ister onlar ücretsiz virüs parçacıkları ile etkileşim ve virions olası ilaç etkileşimi siteleri tahmin. Bu tür deneyleri diğer olmayan zarflı virüsler üzerinde tekrarlanabilir veya viral giriş olası inhibitörleri için antiviral ilaç bileşikleri tarama bir yöntem olarak zarflı virüsler adapte olabilir. Antiviral adaylar belirlemek için böyle bir mekanizma odaklı yaklaşım kullanarak ilaç geliştirme sürecini hızlandırmak ve antiviral terapi kapsamını genişletmek yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiç bir ilgi çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar Dr Joshua Beckham için Austin Texas Üniversitesi 'nde moleküler yerleştirme ile teknik destek için minnettar. Bu çalışmada, Tayvan bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST107-2320-B-037-002-C.-JL ve L.-m. ' den fon tarafından kısmen destekleniyordu; MOST106-2320-B-038-021 ve MOST107-2320-B-038-034-MY3 için L.-m).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde Sigma AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG Invitrogen A11029
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Anti-VP1 antibody Merck-Millipore MAB979 Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer Beckman Coulter FC500
Corina Molecular Networks GmbH
Crystal violet Sigma C3886-100G
DMEM GIBCO 11995-040
DMSO Sigma D5879
FBS GIBCO 26140-079
Formaldehyde Sigma F8775
Graphpad Prism GraphPad
Heparin sodium salt Sigma H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
Methylcellulose Sigma M0512-100G
PBS pH 7.4 GIBCO 10010023
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
PyMol Schrödinger
UCSF Chimera University of California, San Francisco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
  2. Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
  3. Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
  4. Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
  5. Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
  6. Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
  7. Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
  8. Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
  9. Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
  10. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. 3rd edn, ASM Press. (2008).
  11. Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
  12. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. e53124 (2015).
  13. Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
  14. Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
  15. Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics