DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

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Summary

このプロトコルは、DNA損傷を評価するために彗星アッセイで使用するための壊死時に高品質の凍結組織サンプルを調製するためのいくつかの手順を説明します:1)細かい組織、2)消化管からの掻き取られた上皮細胞、および3)立方体組織サンプルは、組織ミンチ装置を用いて均質化を必要とする。

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Hobbs, C. A., Recio, L., Winters, J., Witt, K. L. Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage. J. Vis. Exp. (157), e59955, doi:10.3791/59955 (2020).

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Abstract

この彗星アッセイは、培養細胞や組織、特に化学物質やその他の環境ストストレス剤への暴露後のDNA損傷を評価する手段として人気を集めています。げっ歯類の遺伝子毒性ポテンシャルに対する規制試験における彗星アッセイの使用は、2014年に経済協力開発機構(OECD)の試験ガイドラインの採択によって推進されている。彗星アッセイスライドは、典型的には、壊死時に新鮮な組織から調製される。しかし、凍結組織サンプルは、動物1匹当たりおよび研究ごとに多くの動物からの複数の臓器からのスライドの同時調製に関連する物流上の課題を回避することができます。凍結はまた分析のために暴露施設から別の実験室にサンプルを出荷することを可能にし、凍結組織の貯蔵は、特定の器官のDNA損傷データを生成する決定を延期することを容易にする。アルカリ性彗星アッセイは、露光関連DNAの二重および一本鎖の破断、アルカリ性不安定性病変、不完全なDNA切除修復に関連する鎖破断を検出するのに有用である。しかし、DNA損傷は、機械的なせん断または不適切なサンプル処理手順からも生じ、アッセイの結果を混乱させる可能性があります。壊死時の組織サンプルの収集と処理における再現性は、彗星アッセイのための組織の収穫の経験の様々なレベルを持つ実験室の人員の変動のために制御することが困難である可能性があります。経験豊富なラボスタッフを配置したリフレッシュトレーニングやモバイルユニットの展開を通じて一貫性を高めるにはコストがかかり、必ずしも実現可能とは限りません。彗星アッセイ分析用の高品質サンプルの生成を一貫して最適化するために、カスタマイズされた組織ミンチ装置を用いて組織の凍結された立方体のフラッシュを均質化する方法を評価した。この方法によって彗星アッセイのために調製されたサンプルは、壊死中にミンチすることによって調製された新鮮で凍結した組織サンプルと品質において良好に比較した。さらに、長期保存後の組織の凍結キューブからの細胞における低ベースラインDNA損傷を測定した。

Introduction

この彗星アッセイは、化学物質や他の環境ストルッサー1にさらされた培養細胞および組織におけるDNA損傷を評価する手段としてますます使用されている。このアッセイは、不完全なDNA修復に関連するDNA二重および一本鎖の破断、アルカリ陰茎病変、および一本鎖の破断を検出することができる。医薬品検査のための医薬品技術要件の国際協議会(ICH)ガイドラインは、生体内の遺伝毒性を評価するためのげっ歯類赤血球微小核アッセイを補完し、腫瘍誘導の標的臓器における作用様式を評価するためのフォローアップテストとして、彗星アッセイなどのDNA鎖破損アッセイを推奨しています。欧州食品安全機関(EFSA)は、生体内彗星アッセイを、体外遺伝毒性試験3における陽性結果の関連性を調査するための適切なフォローアップ試験として推奨している。2014年、OECD試験ガイドラインがげっ歯類彗星アッセイに承認され、遺伝子毒性ポテンシャルの規制試験に使用するアッセイの受容性が高められた。このアッセイは、リラックスしたDNAループと、リセド細胞のヌクレオイドから移行する断片の電気泳動分離に基づいています。基本的に、単一の細胞は、顕微鏡スライドに重ねられたアガロースに埋め込まれています。スライドは溶解バッファーに浸漬され、その後にアルカリ性(pH > 13)溶液が続き、しっかりとコイル状の核DNAがリラックスしてくつろぐことができます。その後、スライドを電界に配置し、負に帯電したDNAを負の電荷から陽極に向かって移動させ、彗星に似た画像を作成します。彗星の頭部と比較して彗星の尾のDNAの相対的な量はDNA損傷の量に直接比例する;尾部のDNA含有量は、典型的には、デジタルイメージングソフトウェアを用いて定量される。

彗星アッセイは断片化したDNAを検出するため、治療による細胞毒性またはストレスに起因する壊死またはアポトーシスに関連するクロマチン断片化によって、暴露誘発DNA損傷の正確な定量化が可能です。さらに、機械的なせん断または不適切なサンプル処理4の結果としてDNA損傷が起こり得。DNA損傷のベースラインレベルを最小限に抑えるためにスライド調製の前に、収穫された組織を冷やして維持することの重要性は、前に5,6,6に実証されている。多くの研究所は、新鮮なティッシュから彗星アッセイスライドを準備します。しかし、これは、多数の動物を含む研究で動物ごとに複数の組織タイプからのスライドを準備する場合、ロジスティックに困難な場合があります。さらに、これは、スライドの準備と分析がリモートの実験室で発生する場合に問題を提示し、サンプルの出荷を必要とします。例えば、米国の国家毒物学プログラムは、その遺伝子毒物学試験プログラム(https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html)の構成要素として彗星アッセイを含み、時には28日または90日の反復用量毒性試験にアッセイを組み込む。これは、インライフラボによる組織の収集と分析のために別の実験室へのサンプルの転送を必要とします。これを達成するために、組織片が細かく切断され、および/または胃腸管の上皮細胞が掻き取られ、細胞懸濁液が凍結し、その後の出荷および記憶のために冷凍庫に保管され、その後の検査室による分析7まで保存される。サンプルの適切な取り扱いは、凍結組織を使用して高品質のデータを取得するために重要です。しかし、絶えず変化する人員によって行われる壊死時の組織サンプルの再現性操作は、特に彗星アッセイのために日常的に組織を収穫しないインライフラボでは制御が困難である。壊死のスタッフのリフレッシュトレーニングや、経験豊富な研究室のスタッフが新鮮または凍結した組織サンプルを収集するためのモバイルユニットの使用は、多くの場合、あまりにも高価で、実現不可能であるか、単に過小評価されています。

彗星アッセイ分析のために遠隔部位に移送するための高品質の組織サンプルの一貫した生成をより良くするために、組織のフラッシュ凍結キューブからの組織保存の公表された方法6の有用性が検討された。この方法では、凍結した組織の立方体をステンレス鋼組織ミンチ装置(図1)に装填し、冷たい緩衝液を含むマイクロ遠心管に入れる。組織の立方体は、デバイスの端にある小さなゲージメッシュを通して押されます。メッシュのふるいを介して繰り返し組織懸濁液を両側向きに押し付けると、比較的均一な単一細胞懸濁液が生じる。この方法で調製されたサンプルは、ミンチによって調製された新鮮な組織および凍結した組織サンプルと品質において良好に比較した。追加の利点として、ひきびサンプルとは異なり、組織キューブは長期間凍結保存することができ、まだ彗星アッセイで高品質の結果をもたらす。

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Protocol

組織は、グッドラボラトリー実践規則(21 CFR Part 58)および施設動物によって承認された動物使用プロトコルに従って、NTP契約研究所のAAALAC認定施設で行われた研究の実施中に収穫された各研究室のケア・使用委員会(IACUC)

1. 組織の収穫と加工

注:サンプルチューブ(例えば肝臓)を調製したり、サンプルの約半分を別の貯蔵管(例えば、十二指腸、胃)に移して、必要に応じて再分析を可能にするのに有用である。腸管組織のサンプル間変動の可能性を最小限に抑えるために、各動物の胃に対して同じ組織領域をサンプリングし、サンプルを分割して重複サンプルを生成することを注意してください。プラスチック鉗子は、脳などの粘着性の組織を移すため推奨されます。オプションとして、ミンチ、掻き取られた、または均質化された組織製剤は、円錐管に取り付けられた40μmの細胞ストレーナーを使用して均質な単一細胞懸濁液を達成するために濾過され得る。

  1. 関連する組織、臓器、破片を、目的の器官から取り除きます。取り外し直後に、残りの血液および破片を除去するために、冷たく作りたてのミンチ液の〜7 mL(Mg++、Ca++およびフェノール赤自由ハンクのバランス塩溶液、10%v/v DMSO、および20 mM EDTA pH 7.5)を含む中型の重量船で臓器を激しくスウィッシュします。
  2. 各臓器を、さらに処理するまで、氷上で、水没した組織を維持するのに十分な冷たいミンチ液を含む別のクリーンな重量のボートに移す。
  3. 目的の各器官のセクションを取り除き、埋め込みカセットに入れる。可能な将来の病理学的評価のための実験室の標準的なプロシージャに従って10%中性緩衝ホルマリン、トリムおよびパラフィン埋め込みで修正する。
  4. 肝臓の場合は、左葉の5mmの縦断面を切断し、冷たいミンチ溶液の〜7 mLを穏やかにスウィッシュします。冷たいミンチ液の〜7 mLを含むきれいな中型の重量を量るボートにティッシュのストリップを置き、さらに処理する準備ができるまで氷の上に維持する(ステップ1.8または1.11)。
  5. 十二指腸の場合は、胃に近位の十二指腸の10mmの部分を切断します。21~25Gの針を使用して、残骸や細菌を除去します。
    1. 十二指腸の一端に針を挿入し、冷たいミンチ溶液の1 mLで洗い流す。
    2. 十二指腸をひっくり返し、別の1 mLのミンチ溶液で繰り返して、他の方向を洗い流します。針を捨てます。
    3. 十二指腸をスライスし、洗浄液の〜7 mLを含む中型の計量ボートに入れる前に、〜7 mLのミンチ液でそれを洗いす。さらに処理する準備ができるまで氷の上に維持する(ステップ1.8または1.11)。
  6. 脳の場合は、最初に脳を2つの半球に分けておくのに役立つかもしれません。1つの半球は、可能な組織病理学のために保存することができる(ステップ1.2を参照)。
    1. 関心のある脳領域を解剖し、冷たいミンチ液の〜7 mLで穏やかにスウィッシュ。
    2. 冷たいミンチ液の〜7 mLを含むきれいな中型の計量船に組織を移し、さらに処理する準備ができるまで氷の上に維持する(ステップ1.8または1.11;小さな領域、小脳や海馬などの小さな領域はそれ以上のトリミングを必要としないことに注意してください)。
  7. 胃のために
    1. 前胃を取り除いて捨てます。腺胃を切り開き、中型の計量ボートで〜7 mLの冷たいミンチバッファーを使用して食品から自由に洗います。
    2. 可能な組織病理学の評価のための固定のために十二指腸に近位腺の腺胃の5mmストリップを取り除く(ステップ1.2を参照)。
    3. 残りの胃を中型の計量艇で約7mLの冷たいミンチバッファーに入れ、氷の上で15〜30分間インキュベートします。
      注:このインキュベーションステップは必要ないかもしれません。このステップは JaCVAM 検証プロトコルに含まれていましたが、OECD テストガイドライン8,,9には記載されていません。
    4. 腹をきれいなパラフィン(またはペトリ皿または計量船)に移し、メスの刃またはポリテトラフルオロエテン(PTFE)スクレーパーを使用して表面上皮を2回以上静かに掻き取り、破片を取り除きます。ピペットを使用して、1 mLの冷たいミンチバッファーで鉗子とすすいで胃粘膜を拾います。胃組織をきれいな表面または皿に移す。
    5. スカルデルブレードまたはPTFEスクレーパーの裏部で、ミンチ液(通常は250μL/マウスまたは500-1,000 μL/ラット)で胃上皮を4~5回(必要に応じて)慎重に削り取り、細胞を放出します。必要に応じて、より多くの細胞を回収するために、ほぼ等量のミンチ溶液で組織をすすい取る。ピペットを使用して放出された細胞を含むミンチ液を回収し、氷上のマイクロ遠心分離管に移します。
  8. 組織サンプルを細かくする場合は、肝臓または脳組織の3〜4mmのセクションまたは十二指腸の〜5mmを切断し、1 mLの冷たいミンチ溶液を含む標識された1.5または2.0 mLマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを冷たく保ちながら、細かく分散するまでミンチハサミ(≤30 s)を急速にミンチします。サンプルは少し曇りで見えるはずです。しかし、チューブの底に落ち着く部分が残ることは一般的です。
  9. 新鮮な組織を使用するには、氷の上にひき肉または掻き取られた上皮細胞を含むチューブを維持します。収穫の約1時間以内に彗星スライドを準備するために組織を使用する(セクション2で概説)。
  10. 組織サンプルを凍結する場合、切り取られた上皮細胞のミンチまたは回収の直後
    1. チューブ蓋を固定し、液体窒素を含むデュワーフラスコにチューブをドロップします。チューブは、壊死の間液体窒素(≤3時間)に維持され得る。
    2. 取鍋を使用してチューブを取り出し、ドライアイスの上に置いて並べ替えます。ドライアイスの冷凍庫にチューブを移し、箱を-80 °Cの冷凍庫に保管します。
  11. 組織の凍結キューブを準備するには、組織のいくつかの小片(直径≤4 mm、長さ約6mm)をカットします。図 1)。
    1. 液体窒素を含む中型の計量艇または他の適切な容器に直接それらを直接落とします。
    2. 作品が完全に凍結し、個々の凍結組織キューブをドライアイスに維持されたラベル付きマイクロ遠心分離管またはクライオチューブに移すのを数秒待ちます。凍結プロセス中にピースが凝集しないようにしてください。
    3. ドライアイスの冷凍庫にチューブを移し、箱を-80 °Cの冷凍庫に保管します。

2. スライドの準備

  1. ひき肉/擦り傷付き組織用
    1. 湿った氷の上に新鮮なティッシュを含む管を維持する。
    2. 凍結した組織のチューブを室温の水浴に入れて、サンプルが完全に解凍されるまで、冷たく保たれます。すぐにチューブを氷の上に移します。
    3. アガロースに移すために細胞を引き出す直前(ステップ2.3)、各細胞懸濁液を穏やかに混ぜます。フィルター処理されていないサンプルの場合は、大きなチャンクをチューブの底面に落ち着かせるようにします。スライドがすべてのサンプルに対して準備されるまで、氷上のすべてのチューブを維持します。
  2. 立方体組織用
    1. 80°C冷凍庫から組織キューブを含むチューブを取り出し、スライド準備までドライアイスで維持します。
    2. アリコート1 mLのマーチャント培地(0.14 M NaCl、1.47 mM KH2PO 4、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、10mM NaEDTA、pH 7.4)またはミンチ溶液を各サンプル用のラベル付き1.7 mLマイクロ遠心チューブに入れ、氷上に維持する。4
    3. 組織の解凍を避けるために迅速に働いて、室温組織ミンチ装置の開いた端に組織の立方体を置く(図1)。複数の組織片が使用されてもよい。必要に応じて、凍結した組織を、冷たいモルタルと害虫を使用して小さく切り取って、立方体のサイズを小さくして装置に収まるようにします。
    4. サイズに合ったシリンジプランジャーを素早くデバイスに挿入して、組織をメッシュエンドに押し込み、冷たいミンチ溶液を含むマイクロ遠心分離管に入れる必要があります。液体を無理にチューブをオーバーフローさせないようにしてください。冷たいミンチ液に約5〜10のデバイスのメッシュ端を浸し、組織を完全に解凍できるようにします。
    5. 細胞がメッシュの毛穴を突き出して見えるまで、プランジャーを完全に押し落とします。その後、プランジャーを約2.5cm引き上げ、完全にもう一度押し下げる。このプロセスを、ミンチ液が濁るまで数回繰り返します。
    6. 必要に応じて、試料を1100rpmで5分間冷蔵遠心分離し、上清の一部を除去することによって細胞密度を高めるために濃縮してもよい。
    7. 各サンプルに対してクリーンティッシュミンチ装置を使用して、すべてのサンプルに対してこのプロセスを繰り返します。
  3. 50 μLの細胞懸濁液を、37°Cで0.5%低融点アガロースの450 μLを含むチューブに移します。
    注:ボリュームは調整できますが、アガロースの量は≤1%でなければなりません。
  4. 前述の10, 11に従ってスライドを準備し、スコアを付けます

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Representative Results

研究1
肝臓は、トウモロコシ油を4日間投与した雄のスプレイグ・ドーリーラットの2つのコホートから収穫され、1週間ずらした。スライドは、ティッシュミンチを挽きたてのティッシュ、凍結したひき肉、および組織ミンチ装置を用いてマーチャントの培地またはミンチ溶液で処理された凍結立方体組織から調製した。第1コホートから得られた動物から得られた凍結組織を、約3.5ヶ月間冷凍保存後に評価した。第2コホートから得られた動物から得られた凍結組織を、約6ヶ月間保存後に評価した。特徴的な「ヘッジホッグ」形態を示す彗星は、大きな損傷を受けた細胞(細胞障害性または機械的ストレスを含む可能性のある不確実な病因)を示すものであり、%尾DNAのスコアリングには含まれていなかった。ハリネズミの割合は、形態の目視検査の際にのみ同定され、OECD TG 4899に従って別々に表された。2つのコホートの動物の平均%尾DNA結果(100個の細胞/動物のスコアリングに基づく)を図2Aに要約する。凍結組織を用いたすべての方法は、新鮮な組織よりも常に統計的に異なるとは限らないが、より高い値を産生した。新鮮なラット肝臓における%尾DNAの推奨上限が6%9であることを考えると、これらの方法のいずれかが凍結組織の評価にうまく機能することを示している。ミンチソリューションは、少なくとも同様に、商人の媒体と同様に行われた。後者は準備に時間がかかるので、その後の研究のために溶液を切り取った。3.5ヶ月の保存後に処理された最初のコホートからの組織と比較して、処理前に約6ヶ月間凍結保存されていた第2の動物コホートからの組織の損傷に統計的に有意な差はなかった。全体として、% ヘッジホッグは%尾DNAと平行していますが、新鮮な組織に対する凍結組織の% ヘッジホッグは% テールDNAよりも可変的でした (図 2B)。新鮮な組織におけるこれらのエンドポイントの値は、凍結方法によって実際に導入されたDNA損傷アルテフを測定できるベースラインを提供する。

研究2
雌B6C3F1マウスは、正常生理食塩基または変異原、エチルメタンスルホン酸塩(EMS)を正常生理食塩分中200mg/kg/日で3日間投与した。組織は最終投与後3時間採取し、彗星アッセイで新鮮に処理した。追加の組織は、ミンチ液中でミンチされた後、またはキューブとして採取された後にフラッシュ凍結した。立方体サンプルは、彗星スライドの調製の直前に篩装置を用いて、その後、ミンチ液中で処理した。ヘッジホッグ形態を示す細胞が化学的に誘発されたDNA損傷の連続体の上端にある細胞を表す前提で、イメージングソフトウェアによって造られるヘッジホッグは%尾DNAの自動スコアリングに含まれていた。%テールDNAの結果(150個の細胞/動物のスコアリングに基づく)を図3に要約します。肝臓組織をキューブとして凍結し、その後組織ミンチ装置を用いて処理し、新たにひき肉組織について得られたものと非常によく似た結果をもたらした。凍結したひき肉に対する%の尾DNA値はやや高かったが、凍結したひき肉のベースライン値は6%以下であったが、彗星アッセイ9のOECD試験ガイドラインで新鮮なラット肝臓に推奨されるように。EMS誘導DNA損傷の統計的に有意な増加を、3つの方法すべてで処理された組織サンプルで測定した。

研究3
遠隔実験室で行われた試験化学物質の90日間の毒性試験で雌のB6C3F1マウスから採取された肝臓組織の一部を、立方体に細かくまたは切断し、フラッシュ凍結し、ドライアイスで一晩この実験室に出荷して分析した。ミンチ組織は、約2ヶ月の冷凍庫貯蔵後に分析した(図4)。目視検査時にヘッジホッグと見なされたが、イメージングソフトウェアによって可作であった細胞は、テールDNA測定(150個の細胞スコア/動物)に含まれていた。合計150個の細胞/動物の形態の目視検査のためだけに同定されたハリネズミの数(スコラーブルか非可分か)は、これらの非常に損傷した細胞の頻度に関する情報を提供するために別々に集計された。全体として、凍結したひき肉組織におけるDNA損傷(%テールDNAとして測定)は、車両制御群を含む動物に対する実質的な動物の変動性を有するすべての用量群にわたって高かった。% テールDNAの結果は、%ヘッジホッグ(形態に基づいてのみ同定)と相関し、ヘッジホッグがこれらのサンプルで観察された高レベルのDNA損傷に実質的に寄与したことを示す。ひき肉組織で測定された高いバックグラウンドレベルのDNA損傷に基づいて、凍結立方体組織を、〜22ヶ月保存した後に後で分析した(図4)。DNA損傷と%ヘッジホッグの両方は、ひき肉組織サンプルと並行して調製されたフラッシュ凍結立方体組織において非常に低かった。したがって、ひき肉サンプル中のヘッジホッグ形態によって反射された損傷の強い細胞は、明らかに生物学的プロセスの結果ではなかったが、フラッシュ凍結される前のミンチ手順の間に機械的破壊および/または組織の温暖化によって導入された可能性が高い。これらのデータは信頼できないと考えられていました。幸いなことに、凍結された立方体組織の分析は、明確な結果、すなわち試験化学物質への3ヶ月間の暴露の後の雌マウスの肝臓におけるDNA損傷応答の欠如を提供した。このケーススタディが提供する結果は、比較的経験の浅い実験室によるひき肉組織の調製に関連するリスクを例示し、この問題を回避するための凍結立方体組織法の有用性を実証する。

Figure 1
図1:凍結組織から単一細胞懸濁液を調製するために使用される組織ミンチ装置およびプランジャー。プロトタイプ装置(内径4.5mm、0.4mmメッシュサイズ)は、グンナー・ブランボー博士(ノルウェー、ノルジェノテック、オスロ)が提供しました。右側のパネルは、装置と共に使用するための組織の適切なサイズの立方体の例を提供する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:新鮮なマウスと冷凍のマウス肝サンプルで測定されたDNA損傷の比較。肝臓は、4日間トウモロコシ油を投与した雄のスプレイグ・ドーレーラットの2つの驚異的なコホート(n=5/グループ/コホート)から採取した。スライドは、ティッシュミンチを挽きたてのティッシュ、凍結したひき肉、および組織ミンチ装置を用いてマーチャントの培地またはミンチ溶液で処理された凍結立方体組織から調製した。凍結組織は、コホート1及び2について、それぞれ、約3.5ヶ月及び6カ月後に、コホート1及び2について分析した。形態に基づくハリネズミに分類される彗星は、%尾DNAの採点には含まれなかった。(A) コホートは、テールDNAの結果%を意味する。(B) コホートは、ヘッジホッグの結果%を意味する。誤差範囲は標準偏差を反映します。各コホートの新鮮な組織に対して凍結組織を比較し、各組織調製方法について2つのコホート間の結果を比較するために、統計的分析を行った。*統計的に異なる(p < 0.05)学生のt検定を使用して同じコホート内の新鮮なひき肉組織から;#statistically非正規分布データのマン・ホイットニー検定を使用して、同じコホート内の新鮮なひき肉組織とは異なる(p < 0.05)。学生のt検定pを使用したコホート間の円統計差(p<0.05)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:異なる手順によって処理された肝臓組織におけるEMSによって誘導されるDNA損傷の比較。雌B6C3F1マウスの平均尾DNAは、3日間の車両または200mg/kg/日EMSを投与した(n= 5/群)。肝臓は最終用量投与後3時間収穫し、彗星アッセイで新鮮に処理した。追加の肝臓組織は、ミンチ液でミンチされた後に凍結またはキューブとして収集されたフラッシュ;立方体サンプルは、彗星スライドの調製の直前に組織ミンチ装置を用いて均質化した。EMS誘導DNA損傷の連続体のハイエンドの細胞を分析から除外しないようにするために、目視検査の際にハリネズミの形態学的記述を満たしているように見えたが、イメージングソフトウェアによってスコリックであることが判明した彗星が含まれていた。誤差範囲は標準偏差を反映します。学生のt検定を使用して、EMSにさらされた動物のDNA損傷の量を、各サンプル調製方法の車両制御動物のDNA損傷量と比較しました。*p < p 0.05 で統計的に有意な増加。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4.長期保存後に得られる凍結キューブ法と高品質データの有用性を実証するケーススタディ。試験薬の様々な濃度に曝露した雌のB6C3F1マウスから採取した肝組織の一部(n=5/群)を、インライフラボで立方体またはフラッシュ凍結に切り取ったり切断したり、その後分析のためにこの実験室に出荷した。ひき肉組織は、約2ヶ月の貯蔵後に分析した。データの質が悪いため、凍結された立方体組織は、その後〜22ヶ月の貯蔵後に分析された。化学的に誘発されたDNA損傷の連続体の上端の細胞を分析から除外しないようにするために、目視検査の際にハリネズミと思われるスコアブル細胞からのデータが含まれていた。(A) グループは、尾DNAの結果%を意味する。ひき肉組織と比較して、長期保存後でも凍結した立方体組織から高品質の結果が得られた。(B) グループ平均ヘッジホッグ結果%悪いミンチ技術は、ひき肉サンプル中のハリネズミ彗星として観察される広範な非生物学的DNA損傷から明らかである。誤差範囲は標準偏差を反映します。ダネットの検定を用いたANOVAを用いて、各サンプル調製方法について試験化学薬品に対する陽性反応を評価しました。いずれの方法でも統計的に有意なp(p<0.05)用量群は検出されなかった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:凍結ラット脳組織で測定されたベースラインDNA損傷。彗星アッセイの結果は、オスとメスのスプレイグ・ドーリーラットの脳のいくつかの異なる領域を表す凍結ミンチまたは立方体組織に対して提供される。データ(スコアブルヘッジホッグ彗星を含む)は、いくつかの研究で照合された。n = 各サンプル調製方法について評価された脳組織の総数。誤差範囲は標準偏差を反映します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

前に示したように7、7、12、13、12,13適切に取り扱うフラッシュ凍結ひき肉組織は、彗星アッセイにおいて良好な結果を提供する。実際、私たちの研究室で調製された凍結したひき肉およびマウス肝臓のベースライン%テールDNA値は、典型的には、新たにひき刻まれたラット肝臓サンプルに対するOECD試験ガイドライン9によって推奨されるように、6%である。良い結果は、細かくして凍結保存されている組織の種類の様々なを使用して複数の実験室によって得られました;同様に、胃腸管内の器官から掻き取られたフラッシュ凍結上皮細胞は、彗星アッセイ77、12、13、1412,13,14でうまく使用されている。凍結したひき肉/掻き取り組織は、少なくとも数ヶ月間は比較的安定しているように見える。ジャクソンら6によって最初に記述された組織ミンチ装置を用いて肝臓のフラッシュ凍結キューブの均質化を採用する方法は、結果として、凍結されたミンチ肝臓に対して得られたものよりも少なくとも同等かつ典型的にはより良い(すなわち、DNA損傷のベースラインレベルの低下)彗星アッセイをもたらす。この方法論は、他の組織タイプ6にも適用可能です。我々の経験では、同様に凍結立方体十二指腸(図示しないデータ)と脳組織を用いて優れた結果が得られている(図5)。しかしながら、篩装置は、全ての組織タイプの均質化に適さない場合がある。パイロット研究では、筋肉の心臓組織がふるい装置を介して容易に強制されないことが判明し、結果として細胞の回復が悪い。代わりに、解凍時にすぐに組織をミンチすると、フラッシュ凍結前に細かく刻んだものと同等のベースライン%テールDNA値を有する細胞懸濁液が生じる(データは示されていない)。特に、壊死中に適切に処理すると(すなわち、冷たく湿った状態に保たれ、フラッシュは個々の部分として凍結し、部分的に解凍することは許されない)、凍結された立方体のフラッシュは、約2年間の冷凍保存後でさえ非常に低いベースラインDNA損傷をもたらした(図4)。

彗星アッセイにおける凍結細胞懸濁液または立方体組織の使用は、以下を含む新鮮な組織に対していくつかの利点を提供する:1)彗星分析のための複数の組織タイプの同時収集の促進;2)インライフラボでの組織収集の促進と分析のために別の実験室へのサンプルの転送;3)数ヶ月間、所定の組織を分析する決定を延期する利便性。スライド調製時の凍結組織の均質化は、収穫時に新鮮な組織をミンチするよりも面倒ですが、凍結立方体組織の使用には、彗星アッセイで訓練された人員(例えば、移動ユニット)や壊死時の特殊な消耗品/試薬に対する要件が含まれるいくつかの追加の利点があります。2)壊死中の技術的な誤り(例えば、サンプルの温暖化;細胞の不十分な放出;最適以下の組織サンプルサイズ)の機会が少ない。3)サンプル処理中に機械的なDNA損傷を導入する最小限の機会(例えば、せん断を切る);4)長期保存後でも低ベースラインDNA損傷。

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Disclosures

この研究は、NIHの壁内研究プログラム、国立環境衛生科学研究所(NIEHS)契約HHSN273201300009Cの下で支援されました。しかしながら、ここに含まれる記述、意見、または結論は、必ずしもNIEHS、NIH、または米国政府の発言、意見、結論を表すものではない。

Acknowledgments

著者らは、リンカーン・マーティンとケリー・オーエンズに対し、彗星スライドの準備と採点に関する専門的な技術支援と、統計分析を行うためのキャロル・スワルツ博士に恩恵を受けている。著者らはまた、ILSの遺伝的毒物学、調査毒物学、および壊死プログラムのメンバーの支持的な貢献を認めている。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryovials Corning Costar 430488
Dental Wax Sheets Electron Microscopy Sciences 72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors Fisher Scientific 08-953-1B
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175-079
KCl Teknova P0315-10
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
Low Melting Point Agarose Lonza 50081
Microfuge Tubes (1.7 mL) Corning 3207
Na2EDTA Sigma-Aldrich E5134
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S6191
Neutral Buffered Formalin Leica 600
Scalpel Blades Miltex 4-110
Syringe Plunger (1 mL) Fisher Scientific or Vitality Medical 14-826-88; 8881901014 Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device NorGenoTech (Oslo, Norway) None Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic Trade Winds Direct DF8088N Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats Krackler Scientific/Heathrow Scientific 6290-14251B

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References

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