מיצוי הקורטיזול של החדקן פין ואת עצם הלסת מטריצות

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול להפקת קורטיזול מן הסנפיר ואת עצם הלסת של מינים חדקניים. פין והלסת רמות קורטיזול נבדקו נוסף על ידי השוואת שני ממיסים כביסה ואחריו אליסה assays. מחקר זה מנווט את הכדאיות של עצם הלסת קורטיזול כמו אינדיקטור מתח הרומן.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Salmanzadeh, M. H., Park, K. T., Lee, H. G., Shoae, A., Rahimi, A., Sung, K. I., Park, K. H. Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices. J. Vis. Exp. (151), e59961, doi:10.3791/59961 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מטרות מחקר זה היו לפתח טכניקה להפקת קורטיזול מתוך סנפירים חדקניים באמצעות שני ממיסים כביסה (מים איזופנול) ולכמת את כל ההבדלים רמות קורטיזול סנפיר בין שלושה המינים העיקריים חדקניים. סנפירים נקצרו מ 19 sturgeons הוקרב כולל שבעה בלוגה (huso huso), שבעה סיבירי (acipenser baerii), ו חמש סרומגה (א. stellatus). הsturgeons הועלו בחוות איראניות במשך שנתיים (2017-2018), וניתוח הוצאת קורטיזול נערך בדרום קוריאה (ינואר-פברואר 2019). ג'ווונז מ 5 ה. huso שימשו גם להפקת קורטיזול. הנתונים נותחו באמצעות הליך המודל הליניארי (GLM) הכללי בסביבת SAS. מקדמי הווריאציה הפנים והבין-שונות של וריאציה היו 14.15 ו-7.70, בהתאמה. בקצרה, שיטת החילוץ קורטיזול מעורב כביסה את הדגימות (300 ± 10 מ"ג) עם 3 מ ל של ממס (מים באולטרטהורים ו איזופנול) פעמיים, סיבוב ב 80 rpm עבור 2.5 דקות, ייבוש האוויר הדגימות שנשטפו בטמפרטורת החדר (22-28 ° c) במשך 7 ימים, ייבוש נוסף דגימות באמצעות מקצף חרוז ב 50 Hz עבור 32 דקות ושחיקה אותם אבקה, החלת 1.5 mL מתנול לאבקה מיובש (75 ± 5 מ"ג), וסיבוב איטי (40 rpm) עבור 18 h בטמפרטורת החדר עם ערבוב רציפה. בעקבות החילוץ, דגימות היו centrifuged (9,500 x g עבור 10 דקות), ו-1 mL supernatant הועבר צינור מיקרוצנטריפוגה חדש (1.5 mL), הדגירה ב 38 ° צ' כדי להתאדות את מתנול, וניתח באמצעות האנזים מקושר אנזימים מחובר בדיקות (אליסה) . הבדלים לא נצפו ברמות הקורטיזול סנפיר בין מינים או בתוך סנפיר והלסת רמות קורטיזול בין שטיפת ממיסים. התוצאות של מחקר זה להפגין כי מטריצה הלסת החדקן הוא מחוון מתח אלטרנטיבי מבטיח מטריצות מוצק.

Introduction

קורטיזול הוא מחוון אמין של מתח בעלי חיים. מיצוי הקורטיזול מספק מסגרת תקפה לחוקרים לניטור רמות הלחץ ודפוסים כלליים של התוקפים. לדוגמה, מחקרים קודמים ניהלו אימות מתודולוגי של מדידות קורטיזול שיער באמצעות שיטות שונות בבני אדם1,2, קופים3,4, בקר5, כבשים6, ו דג זהב7,8. במינים של דגים, מדידות קורטיזול בתוך מטריצות כגון קשקשים, ריר העור, צואה, ו9 דם הוכחו לספק מידע על בריאות הדגים. כאשר דגימת דם היא בעייתית או קשקשים חסרים, מטריצות חלופיות עבור חילוץ קורטיזול נחוצים. בדגים, מטריצות חלופיות יכולות לכלול את עצם הלסת, רקמה קשה הדומה להשן האנושית10.

הפיתוח של מטריצות חדשות וטכניקות מאומת כדי לקבוע את רמות הלחץ של דגים הוא עניין מיוחד לתעשיית הקוויאר, שם חדקן יכול לחוות חשיפה ממושכת לגורמי הלחץ הסביבתי11. לא ניתן לקבוע את מין החידקן לפני גיל שנתיים, ולחדקן אין קשקשים. בגלל הקורטיזול בהדרגה מצטבר מטריצות מוצק בשלב הצמיחה2,7,12, לטווח ארוך הצטברות קורטיזול נתונים מתוך מטריצות קשות כגון סנפירים ובעצמות הלסת יכול לספק תובנה לחץ רמות בשלבי צמיחה שונים. לעומת זאת, רמות הקורטיזול של דם לספק תמונה של רמות הלחץ בזמן המוות ולא יכול במדויק לייצג לחץ במהלך הגידול לטווח ארוך13,14. עם הגוברת התחרות בשוק הקוויאר, גישות חדשות כדי לשפר את תנאי הלחץ לייצור של ביצים בריאות בין מינים חדקניים במהלך הגידול לטווח ארוך (8-12 שנים או יותר) הם אזור חשוב יותר ויותר של מחקר. בשל העלות הגבוהה של חדקן, דגימות שנקטפו יקרים מאוד ($ 8000-15000 לכל דג בוגר בהתאם למינים ולשלב הצמיחה), גורם מגביל עבור פרויקטים מחקר. עם זאת, התפתחות הטכניקה המתאימה להפקת קורטיזול מן הסנפירים החדקניים והלסת יכול להיות שימושית באופן מלא הן מערכות חקלאיות דגים בדגים בר כדי לשפר את האיכות והקציר של ביצי חדקן עבור הצריכה ו שימור.

כמו גם מתן תוצאות אמינות6, הבחירה של טכניקה מתאימה לחילוץ קורטיזול היא בעלת חשיבות קריטית כדי להבטיח כי תרכובות אחרות הקיימות במטריקס במהלך הכנת המדגם לא לבלבל את התפוקה, אשר עשוי להוביל ל תוצאות לא עקביות. זה חשוב באותה מידה לקבוע אם הפין ואת הלסת רמות קורטיזול מושפעים רמות ההורמונים במים המקיפים. היימבורה ואח '15 הציע כי מספר גורמים עשויים להשפיע על רמות קורטיזול כולל גיל, מין, הריון, העונה, צבע12, אזור הגוף שממנו הקורטיזול מחולץ16. עם זאת, מידע קטן זמין על ההשפעות של כביסה ממיסים על הפקת קורטיזול בתוך מטריצות הגוף דגים8, ואף אחד על ההשפעות האלה בחדקן, למעט ביצים חדקן17.

למרות ניתוח רמות קורטיזול בסיסית מן הסנפירים והלסת של החידקן דורש כי הדגים להיות מורדמים, גישה זו אינה כרוכה הטכניקות פולשני הדרושים לדגימת דם ב חדקן חי. הדגימות פין ואת עצם הלסת נאספים בקלות, והפקת מרקמות אלה ניתן לבצע במהירות. באופן דומה, חילוץ הורמון וניתוח הם פשוטים ודורשים ציוד מיוחד קטן.

במחקר זה, אנו מציגים טכניקה חדשה ומיושם בקלות עבור החילוץ, כביסה, ונחישות של קורטיזול מן הדגים סנפירים והלסת, במטרה לקבוע אם רמות הקורטיזול נמדד מטריצות אלה ניתן להשתמש באופן אמין כמתח אינדיקטורים. היתרונות של טכניקה זו כוללים גישה קלה ולא פולשנית8 , פחות וריאציה נתונים, פלט אמין1,6,8,17; הטכניקה מתאימה למינים של דגים ללא קשקשים כגון חדקן. הטכניקה דורשת טבח של הדג, מבחר של ממיסים כביסה המתאים2,4, שחיקה נכונה של דגימות3,5, מקצועי מקושר אנזימים מקושרים בדיקות (אליסה) יישום5,7, וידע נרחב של התאגדות של מקורות קורטיזול לתוך מטריצות מוצק6.

התחלנו שני ממיסים שונים כביסה (מים באולטרסאונד ואיזופנול) כדי להשיג רמות קורטיזול בסיס של סנפירים מ שלושה מינים חדקניים: בלוגה (huso huso), סיבירי (acipenser baerii), ו סבראגה (א. סטאטוס ), בתנאים סביבתיים סטנדרטיים לכל מין. ג'ווונז של ה. huso היו גם שימשו כדי להעריך את הלחץ בחדקן. זהו המחקר הראשון למדוד רמות קורטיזול ב חדקן ג'ווונז. תוצאות מחקר זה יספק נתונים קורטיזול השוואתי עבור מינים חדקניים בשלב הצמיחה המוקדמת (~ 1 שנה) לפני קביעת מין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים הניסיוניים והשיטות הבאות אושרו על ידי הרשות לרווחת בעלי חיים והאתיקה של האוניברסיטה הלאומית של קנגוון, צ'אנצ'צ, הרפובליקה של קוריאה.

1. אוסף פין

  1. ללכוד את החדקן בעדינות באמצעות רשת כדי למזער את הפציעה והלחץ.
  2. שטפו בזהירות את הדג במים מתוקים ולאחר מכן נגבו את משטח הגוף עם מגבת ספיגה לפני המתת החסד.
  3. הכה את ראש הדג בעזרת פטיש פלסטי שהדג המום או מאבד את ההכרה. . תסיר את הראש בעזרת סכין
  4. מדוד את משקל הגוף (גר') ואורך (ס מ).
  5. לאחר המתת חסד, לאסוף דגימות סנפיר ידי חיתוך קרוב ככל הגוף ככל האפשר באמצעות מספריים כירורגי מעוקר.
    הערה: מגבות ספיגה בודדות שאינן ממוחזרות חייבות לשמש עבור כל דג. סטטיסטיקה תיאורית עבור המינים המשמשים במחקר זה היו כדלקמן: בלוגה חדקן (H. huso): גיל = 18 ± 2.1 חודשים, משקל גוף = 2,700 ± 300 g, ואת אורך הגוף = 55 ± 5 ס מ; חדקן סיבירי (A. baerii): גיל = 9.6 ± 2.4 חודשים, משקל גוף = 1,750 ± 250 g, ואורך הגוף = 45 ± 5 ס מ; סקן סארגגה (A. stellatus): גיל = 14 ± 1.3 חודשים, משקל גוף = 1,000 ± 100 g, ואת אורך הגוף = 65 ± 5 ס מ.

2. הכנת סנפיר להפקת קורטיזול

  1. מניחים את דגימות סנפיר (מדגם אחד לכל רקמה: ~ 3 g) על נייר מעבדה במשקל (107 מ"מ × 210 מ"מ) ויבש בטמפרטורת החדר כמה ימים עד יבש.
  2. לעטוף דגימות בגיליונות של רדיד אלומיניום, המקום בשקיות פלסטיק מתויג, ולהעביר למעבדה.
  3. החנות דגימות במקרר לשימוש נוסף, כולל כביסה, הפקת קורטיזול, ייבוש, וניתוח אליסה (איור 2).

3. ניתוח קורטיזול של פין

  1. כיול את קנה המידה האנליטי הדיגיטלי (דיוק: 0.0001) ושקול 300 ± 10 מ"ג דגימות עם נייר שקילה על המחבת בקנה מידה.
  2. . שטוף את הדגימות
    1. העבר כל אחת מהדוגמאות לצינור פוליפרופילן מדגם 15 L. הוסף 3 מ ל של איזופנול לכל צינור באמצעות מ5,000 μL ערוץ יחיד.
    2. לסובב את הצינורות ב 80 rpm עבור 2.5 דקות לשטוף את הקורטיזול ולהסיר כל זיהום חיצוני פוטנציאלי. חזור על הליך זה פעמיים.
    3. האוויר יבש את הדגימות שנשטפו בטמפרטורת החדר (22-28 ° c) במשך 7 ימים.
    4. חזור על הליך הכביסה באמצעות מים באולטרטהורים כסוכן הכביסה.
  3. לחלץ את עצם הלסת מרקמת הגוף באמצעות מלקחיים חיתוך עצמות. החל את שלבים 1.5-3.2.4 לדגימות עצם הלסת.
  4. שקול out (75 ± 5 מ"ג) מיובש סנפיר או דגימות עצם הלסת לטחון באמצעות מקצף חרוז ב 50 הרץ עבור 32 דקות.
    1. לספק 1.5 mL של מתנול לתוך צינור כל המכיל אבקה סנפיר או עצם הלסת באמצעות מ1000 μL. מניחים את הדגימות על מסובבי צינור בסיבוב איטי (40 rpm) עבור 18 h בטמפרטורת החדר כדי לחלץ קורטיזול עם ערבוב רציפה.
  5. בעקבות חילוץ קורטיזול, צנטריפוגה את הדגימות ב 9,500 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את השכבה האורגנית העליון המכיל קורטיזול (1 מ ל) מכל מדגם ומניחים אותו לתוך צינור נפרד 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
    1. מייבשים את הדגימות על ידי דגירה ב 38 ° צ' כדי להתאדות מתנול. שמור את דגימות הקורטיזול שחולצו תחת מכסה המנוע בלילה כדי לאפשר מתנול להתפזר.
      הערה: השכבה המכילה קורטיזול היא בדרך כלל בצבע צהבהב.

4. פין זיהוי קורטיזול

  1. הפשרה של הסנפיר היבש או דגימות עצם הלסת בטמפרטורת החדר עבור 1.5 h לפני שימוש בערכת אליסה.
  2. הוסף 400 μL של מאגר פוספט, מערבולת, ו צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 15 דקות.
  3. הפעל כל אחת מהדוגמאות (25 μL) בשכפול כדי לשפר את רמת הדיוק והמהימנות של התיקון. הסר נתונים כלשהם מחוץ לעקומה הסטנדרטית כגבולות.
  4. להגדיר קורא מיקרו לוחית 450 ננומטר, ואז להגדיר μg dL-1 ולקרוא את הדחיסות האופטית של הצלחת.
    1. השתמש בתוכנת המיקרו-לוחית עם התאמה של עקומת רגרסיה לא ליניארית בעלת ארבעה פרמטרים. להמיר את רמות הקורטיזול של דגימות שהתקבלו מהתוכנה לתוך pg mg-1 באמצעות המשוואה הבאה:
      F = 10, 000E (A/B) (C/D),
      כאשר F = הערך הסופי של רמת הקורטיזול של סנפיר (pg mg-1), E = אמצעי האחסון (mL) של מאגר הנתונים המשמש ליצור מחדש את התמצית היבשים, A = הריכוז (Μg dL-1) המסופק על ידי פלט הספק, B = המשקל (mg) של הסנפיר נתון לתוספת מטר, C = אמצעי האחסון (mL) של מתנול הוסיף אבקת סנפיר, ו D = אמצעי האחסון (mL) של מתנול התאושש מן התמצית ולאחר מכן התייבש3.

5. אנליזה סטטיסטית

  1. חלק כל דוגמה לשני תתי-דגימות לפני הליך הכביסה ולאחר מכן הפעל בשכפול במהלך הטיפול בערכת ה-אליסה (2 × 2 = 4 תצפיות לכל מדגם) כדי לשפר את העוצמה של הבדיקה והמהימנות של התוצאות.
  2. השוו בין ההשפעות של שני ממיסים הכביסה והאינטראקציות שלהם על ידי החלת המודל הליניארי הכללי (GLM) בסביבת התוכנה של SAS לנתוני המדידה18.
  3. בדיקת ההבדלים בין האמצעים באמצעות מבחן של Tukey ברמת משמעות של p < 0.05. קבל 0.05 < p < 0.10 כהוכחה לנטייה ולא כהפרש משמעותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שהוצגו הציג את הטכניקה מיצוי הקורטיזול שפותחה ואושרה במחקר זה באמצעות שלושה מינים חדקניים. רמות הקורטיזול הושגו באמצעות מים באולטרטהור ו איזופנול כמו ממיסים הכביסה הושוו (איור 2). הקורטיזול משנת H. huso ג'ווונז נבדק כדי לקבוע אם הלסת החדקניים יכול לשמש כמטריצה חלופית סנפירים. ההשפעות של שטיפת ממיסים, מינים חדקניים, האינטראקציה שלהם מוצגים בטבלה 1. רמות הקורטיזול נטו להיות גבוה יותר בדגימות סנפיר שטף עם איזופנול מאשר אלה שטף עם מים (p = 0.089). לא היו הבדלים משמעותיים ברמות הקורטיזול של סנפיר (p = 0.525) בין מינים חדקניים. לא היתה כל אינטראקציה משמעותית בין ממיסים כביסה ומינים חדקניים (p = 0.947). מרכך כביסה לא היתה השפעה משמעותית על רמת הקורטיזול ב H. huso חדקן (p = 0.45) (שולחן 2). מקדמי הווריאציה והתנודות הבין-משתנות היו 14.15 ו-7.70, בהתאמה. הנתונים הראו דמיון גבוה בקרב סנפירים של שלושת המינים החדקניים (שולחן 1) ו H. huso ג'ווונז (שולחן 2). אנחנו לא לחקור את היחסים בין רמות קורטיזול בלסת ואלה בסנפירים של מינים חדקניים שונים, כי הגענו דגימות עצם הלסת רק מ H. huso. יש לחקור קשרים אלה במחקר עתידי.

Figure 1
איור 1. (א) צילום של האוסו הווחדקן (בן 10). (ב) תכונות מורפולוגיות של חדקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. אינפוגרפיקה של ניתוח הקורטיזול סנפיר5,6 ביצע במעבדה. כל התצלומים שהוצגו בתקציר המידע נלקחו במעבדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מינים חדקניים (SS) מרכך כביסה (WS) ערך פי
האוסו הווסו חדקן בארשני חדפן סטלטוס SEM מים אלכוהול איזופרופיל SEM האס WS אס × WS
קורטיזול (pg mg-1)
3.46 2.85 3.34 0.41 2.86 3.69 0.33 0.52 0.08 0.95

. שולחן 1 פין רמות קורטיזול בשלושה מינים חדקניים מושגת באמצעות שני ממיסים שונים כביסה.

מרכך כביסה (WS) SEM ערך פי
מים אלכוהול איזופרופיל
קורטיזול (pg mg-1) 1.11 1.43 0.31 0.45

. שולחן 2 הלסת רמות קורטיזול בלוגה חדקן (huso huso) באמצעות שני ממיסים שונים כביסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חדקניים נקרא לפעמים "מאובן חי" כי זה הציג עיבודים מעטים במהלך אלפי שנים האחרונות. הסוג החדקן מכיל 27 מינים המייצרים קוויאר; עם זאת, שלושה מינים (בלוגה, baerii, ו סברוגה) לייצר את רוב האספקה הגלובלית של קוויאר. החדקניים חשופים לדיג יתר ולהפרעות בסביבתם הטבעית ולכן הם בסכנת הכחדה אנושות יותר מכל קבוצה אחרת של מינים. החדקן שייך לקבוצה העתיקה ביותר של החוליות החיים, אשר קיים במשך 150,000,000 שנים. המינים מבוגרים וגדלים לאט; כמה (למשל, H. huso) יכול לחיות במשך 100 שנים ועולה 2,000 ק ג במשקל. החדקניים הם דגי סחוס ללא קשקשים, ומאופיינים בחמש שורות של צלחות גדולות וגרמיות הנקראות scutes וברמנים מישוש הממוקמים בקדמת הפה (איור 1). הבדלים פיזיולוגיים בין מינים אלה לבין דגים אחרים כוללים הפחתה של פלזמה (סטרואידים) התגובות לגורמי הסביבה. מדידות הקורטיזול הסנפיר שלנו לספק ראיות כי הלסת החדקן מצטבר קורטיזול בפרופורציה למחזור ריכוזי.

דגים מציגים תגובות רבות ללחצים פיזיים, כימיים ונתפסים. תגובות אלה ידועות היטב כמנגנונים גמישים המאפשרים לדגים להתמודד עם הפרעות סביבתיות ולשמור על מצב הומסטטי. אם גורם מלחיץ הוא ממושך מספיק או רציני כי הדג אינו מסוגל להחזיר את הומאוסטזיס באמצעות התגובות הטבעיות שלו, אז הדג עלול לחוות תופעות לוואי, סיכון הבריאות הכללית שלה ו/או החיים19. המין החדקן יכול להיקבע. מסביבות גיל שנתיים לכן, כדי לקבוע אם רמות הקורטיזול והמין החדקן הם מתואמים, יש צורך לתעד הצטברות קורטיזול לטווח ארוך בסנפירים ובעצמות הלסת (כגישה חדשה ומטריצה חלופית) של חדקן. מחקר זה הוא הראשון לדווח סנפיר ו עצם הלסת רמות הקורטיזול בחדקן.

התפקיד של ממיס קורטיזול לשטוף היא להסיר מקורות קורטיזול חיצוניים מן ריר העור9. Aerts ואח '14 השתמשו במים מזוקקים כדי להסיר זיהום קורטיזול חיצוני מעור הדג; במחקרים קודמים2,5,12,17, השוואנו את ההשפעות של שימוש באיזופנול ובמים כממס כדי לבחון את תוכן הקורטיזול של השיער. ההשפעות של הממס לשטוף יכול להשתנות בין דגימות בשל הבדלים בתכונות של ביצים חדקן13, עור15, סנפירים, ו ג'ווונס. Brossa7 דיווחה כי רמת הקורטיזול בקשקשים של דגי זהב (carassius קרסיוס) נשאר קבוע כאשר איזופנול שימש הממס ללא קשר למספר שוטף, בעוד רמות קורטיזול מגוונות כאשר השתמשו במים. התוצאות שלנו הראו כי הממס כביסה לא היתה השפעה על רמות קורטיזול הלסת. הבדלים בין מחקרים אלה כוללים את מספר שוטף, טלטול לעומת vortexing, טוהר איזופנול, וחשוב, רגישות או עמידות של קשקשים/עור לחדירה נוזלית חיצונית. Ghassemi nejad ואח '20 הפגינו כי היישום של בחני שונים כגון RIA ו-אליסה יכול להוביל הבדלים בפלט. סטרואידים הם מסיסים יותר באלכוהול מסה נמוכה יותר (למשל, מתנול) מאשר אלכוהול של משקל מולקולרי גבוה יותר כגון איזופנול4. מתנול מיצוי חלבון על ידי שבירת איגרות חוב לא קוולנטי, ובכך מאפשר שיער קורטיזול שחרור. מתנול גם משנה את מבנה ההורמונים על-ידי שבירת איגרות חוב בלתי קוולנטי, והתוצאה היא שחרורו של קורטיזול מרקמות. כדי להפוך ביעילות הומוחידקן סנפירים והלסת לפני החילוץ מתנול, מקצף חרוז יכול לשמש ביעילות לשבור את מבנה הרקמה. הליך זה דורש זמן לטחון לחלוטין דגימות סנפיר ועצם הלסת; לכן, התהליך חייב להיות חוזר על מנת להבטיח לחלוטין מתישה והמגון המגון לפני חילוץ קורטיזול. סיבוב איטי של 18 שעות מאפשר הסרה הדרגתית של קורטיזול על ידי כביסה.

כפי שהוצע במחקרים קודמים של יונקים שיער4,5,6, מקורות חיצוניים או פנימיים של תוכן קורטיזול בסנפירים ומלתעות, מלבד דם, לא צריך להיות מוזנח. למרות שמחקר זה לא תוכנן במיוחד כדי לחקור כיצד קורטיזול מפזר מדם סנפירים או לסתות, הוא מדגיש את הצורך להרחיב את הידע שלנו על תהליך זה כדי לפרש טוב יותר תנודות הקורטיזול מתוך מטריצות אלה. המאפיינים של סנפירים ועצמות הלסת שונים מאלה של קשקשים ועור. Bussy et al.17 רמות קורטיזול כמותית באגם חדקן (א. fulvescens) ביצים לחקור השפעות סביבתיות על מצב פיזיולוגי אימהי ואיכות ביצה. הם השתמשו מתיל tert-בוטיטר (mtbe), אתיל אצטט (acoet) מmtbe, ו דיאתיל אתר (Et2O) כמו כביסה ממיסים וסיכם כי אתיל אצטט היה ממיס החילוץ הטוב ביותר במונחים של התאוששות אפקט מטריצה. במחקר הנוכחי, איזופנול הסיר כמויות גדולות יותר של קורטיזול חיצוניים מריר העור במהלך הכביסה, המוביל להערכת יתר קלה של קורטיזול מפני סנפירים חדקניים, שיש לשקול בזהירות בעת פענוח תוצאות החילוץ. יתכן כי האיזופנול היה מסוגל לשטוף את העור של הסנפיר, כפי שדווח במחקר הקודם7. איזופנול ידוע כחודרים לזקיקי השיער ולצירי הדגים4,7. התוצאות של המחקר הנוכחי עולה כי הבחירה של ממס לא היתה השפעה משמעותית על רמות קורטיזול, הרומז כי חילוץ קורטיזול עשוי להיות קשה יותר בחלקים מסוימים של הסנפיר מאשר באחרים באמצעות מים באולטרטהורים; במקרים כאלה, איזופנול עשוי לשמש כחלופה.

מחקר זה הדגים את תחולתה של עצם הלסת כמטריצה הרומן עבור אינדיקציה אמינה של לחץ חדקן. H. huso בעצם הקורטיזול הערכים היו דומים לאלה שחולצו מתוך סנפירים של אותו מין; מחקרים עתידיים צריכים לאשר תוצאה זו בין מינים, גילאים והמינים שונים באמצעות ניתוח מתאם. מספר נמוך של דגים שימש במחקר הנוכחי בשל העלות הגבוהה של חדקן; ניסינו להתגבר על מגבלה זו על ידי בדיקת כל מדגם פעמיים וגם לשכפל מתנול החילוץ עבור אליסה. שימוש בכפל מרובע יכול להגביר את כוחה של הבדיקה כדי לכסות את המספר הנמוך של דגימות.

אנו מסיקים כי סוג של כביסה הממס בינוני מושפע קורטיזול מתוך סנפירים, אבל לא לסתות, של חדקן. לפני להכליל את סיום המחקר הזה ולאמת את התוצאות, מחקר נוסף באמצעות מינים שונים ממיסים צריך להתבצע. העבודה הנוכחית מספקת ראיות לכך שעצם הלסת החדקן יכולה להיות מיושמת כמטריצה חלופית במחקרים עתידיים באמצעות קורטיזול כמדד של לחץ בחדקן. ההתאמה של אליסה עבור מדידה קורטיזול ועצם הלסת העצם הפגינו גם במחקר הנוכחי. מחקר עתידי צריך להתמקד בשני היבטים: 1) קביעת הקורלציה בין רמות קורטיזול בלסת ואלה סנפירים של חדקן ו 2) מטריקס דגימות למדידה קורטיזול מדגים מבוגרים וקוויאר שלהם לקבוע לחץ לטווח ארוך רמות במינים שונים של חידקן על תוחלת החיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו נערכה בתמיכת תוכנית המחקר השיתופי למדעי החקלאות & פיתוח טכנולוגיה (כותרת פרוייקט: שינוי פרודוקטיביות במשק החי עם שינויי האקלים, Project No. PJ012771), המינהל הכפרי לפיתוח, הרפובליקה של קוריאה. כמו כן, מחקר זה היה נתמך על ידי מענק (לא. PJ01344604) מצוות התזונה של בעלי חיים & פיזיולוגיה, המכון הלאומי למדעי החי, RDA, סאול, הרפובליקה של קוריאה. המחברים מכירים בהכרת התנועה הפרסית המנכ ל מוחמד חסן סלמנדה וצוותו, שסיפק דגים משלושת המינים המנוקניים שנבחנו במחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposal latex surgical gloves Ansell 63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg Baskoolnikoo 101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL Becton Dickinson Falcon 35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters BioTek 8041000
Reagent reservoirs BrandTech 703459
Zipper storage plastic bag  Cleanwrap 30cm x100m
Isopropyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5035-4400
Methyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro DLAB Scientific  824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL Eppendorf Research Plus M21518D
  Precision pipette to deliver 15 and 25 μL Eppendorf Research Plus R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm) Fisherbrand 09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A GeneReach Biotechnology Corp tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm Hangzhou Miu Instrument  MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL Hyundai Micro  H20050
Fume hood Kwang Dong Industrial KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g Labo Gene  9.900.900.729
Mini vortex mixer LMS VTX-3000L 
Lotte aluminum foil roll  Lotte Aluminum B0722X5FK5
Digital scale Mettler Toledo   ME204
Ultrapure water MDM MDM-0110
Pipette tips Neptune Scientific REF 2100.N
Large fish net Pond H2O Hoz135 
Salivary cortisol kit Salimetrics 1-3002-4
Bone cutting forceps Sankyo 26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL VITLAB 18A68756
Towel Yuhan Kimberly 1707921546
Tissue paper (107 × 210) Yuhan Kimberly 41117

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
  2. Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
  3. Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
  4. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
  5. Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
  6. Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
  7. Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
  8. Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
  9. Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
  10. Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
  11. Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
  12. Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
  13. Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
  14. Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
  15. Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. 10-17 (2019).
  16. Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
  17. Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
  18. SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
  19. Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
  20. Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics