स्टर्जन फिन और जबड़े की हड्डी मैट्रिक्स से Cortisol निष्कर्षण

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Summary

इस अध्ययन में, हम स्टर्जन प्रजातियों के पंख और जबड़े की हड्डी से कोर्टिसोल निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। फिन और जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल के स्तर को आगे दो धोने सॉल्वैंट्स की तुलना के बाद एलिसा परख द्वारा जांच की गई. इस अध्ययन में एक उपन्यास तनाव सूचक के रूप में जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल की व्यवहार्यता पायलट.

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Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Salmanzadeh, M. H., Park, K. T., Lee, H. G., Shoae, A., Rahimi, A., Sung, K. I., Park, K. H. Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices. J. Vis. Exp. (151), e59961, doi:10.3791/59961 (2019).

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Abstract

इस अध्ययन का उद्देश्य दो धोने सॉल्वैंट्स (पानी और आइसोप्रोपेनोल) का उपयोग कर के स्टर्जन पंख से कोर्टिसोल की निकासी के लिए एक तकनीक विकसित करने और तीन मुख्य स्टर्जन प्रजातियों के बीच फिन कोर्टिसोल के स्तर में किसी भी मतभेद की मात्रा निर्धारित करने के लिए थे। फिन्स को 19 बलिदान स्टर्जनों से काटा गया था , जिनमें सात बेलुगा (हुसो हसो), सात साइबेरियाई (एसिपेन्सर बैरी) और पांच सेवरूगा (ए स्टेलेटस) शामिल थे . Sturgeons 2 साल (2017-2018) के लिए ईरानी खेतों में उठाए गए थे, और कोर्टिसोल निष्कर्षण विश्लेषण दक्षिण कोरिया में आयोजित किया गया (जनवरी-फरवरी 2019). कोर्टिसोल निष्कर्षण के लिए पांच एच हूसो से जबड़े की हड्डी का भी उपयोग किया गया था। डेटा SAS वातावरण में सामान्य रेखीय मॉडल (GLM) प्रक्रिया का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। अंतर-एवं अंतर-आस्पर गुणांक क्रमशः 14.15 और 7.70 थे। संक्षेप में, कोर्टिसोल निष्कर्षण तकनीक में 3 एमएल विलायक (अल्ट्रापुरे पानी और आइसोप्रोपेनोल) के साथ नमूने (300 डिग्री 10 मिलीग्राम) को धोने में दो बार, 2.5 मिनट के लिए 80 आरपीएम पर रोटेशन, कमरे के तापमान पर धोया गया नमूनों को हवा में सुखाने (22-28 डिग्री सेल्सियस) 7 दिनों के लिए, आगे सुखाने के लिए 32 मिनट के लिए 50 हर्ट्ज पर एक मनका beater का उपयोग कर नमूने और उन्हें पाउडर में पीस, सूखे पाउडर के लिए 1.5 एमएल मेथनॉल लागू करने (75 डिग्री 5 मिलीग्राम), और धीमी गति से रोटेशन (40 rpm) के लिए 18 एच लगातार मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर. निष्कर्षण के बाद, नमूनों को सेंट्रीफ्यूड (9,500 x ग्राम 10 मिनट के लिए) किया गया था, और 1 एमएल सुपरनेट को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (1.5 एमएल) में स्थानांतरित किया गया था, मेथनॉल को वाष्पित करने के लिए 38 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था, और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसमोरबेंट परख (एलिसा) के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। . प्रजातियों के बीच फिन कोर्टिसोल के स्तर में या धोने सॉल्वैंट्स के बीच फिन और जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल के स्तर में कोई अंतर नहीं देखा गया। इस अध्ययन के परिणामों से पता चलता है कि स्टर्जन जबड़े की हड्डी मैट्रिक्स ठोस matrices के लिए एक आशाजनक वैकल्पिक तनाव सूचक है.

Introduction

Cortisol पशु तनाव का एक विश्वसनीय सूचक है. Cortisol निष्कर्षण शोधकर्ताओं तनाव के स्तर और तनाव में सामान्य पैटर्न पर नजर रखने के लिए एक वैध रूपरेखा प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों से मनुष्य में विभिन्न विधियों का उपयोग करते हुए बाल कोर्टिसोल माप का पद्धतिसत्यापन किया गयाहै 1,2, बंदर3,4, पशु5, भेड़6, और सुनहरी मछली7,8. मछली प्रजातियों में, तराजू, त्वचा बलगम, मल, और रक्त9 जैसे matrices में कोर्टिसोल माप मछली स्वास्थ्य के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। जब रक्त नमूने समस्याग्रस्त है या तराजू की कमी है, कोर्टिसोल निष्कर्षण के लिए वैकल्पिक matrices की जरूरत है. मछली में, वैकल्पिक matrices जबड़े की हड्डी, मानव दांत10के समान एक कठिन ऊतक शामिल कर सकते हैं.

मछली तनाव के स्तर को निर्धारित करने के लिए नई matrices और मान्य तकनीकों का विकास कैवियार उद्योग के लिए विशेष रुचि का है, जहां स्टर्जन पर्यावरण तनाव कारकों11के लिए लंबे समय तक जोखिम का अनुभव कर सकते हैं। स्टर्जन का लिंग 2 साल की उम्र से पहले निर्धारित नहीं किया जा सकता है, और स्टर्जन के पास तराजू नहीं होते हैं। क्योंकि कोर्टिसोल धीरे-धीरे विकास चरण के दौरान ठोस matrices में जमा हो जाता है2,7,12, लंबी अवधि कोर्टिसोल संचय डेटा हार्ड matrices से इस तरह के पंख और जबड़े की हड्डी के रूप में तनाव में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है विभिन्न विकास चरणों में स्तर। इसके विपरीत, रक्त कोर्टिसोल स्तर मृत्यु के समय तनाव के स्तर का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं और दीर्घकालिक पालन स्थितियों13,14के दौरान तनाव का सही प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते. कैवियार बाजार में बढ़ती प्रतिस्पर्धा के साथ, दीर्घकालिक पालन (8-12 वर्ष या उससे अधिक) के दौरान स्टर्जन प्रजातियों के बीच स्वस्थ अंडे के उत्पादन के लिए तनाव की स्थिति में सुधार करने के लिए नए दृष्टिकोण अनुसंधान के एक तेजी से महत्वपूर्ण क्षेत्र हैं। स्टर्जन की उच्च लागत के कारण, काटा नमूने बहुत महंगा कर रहे हैं (8,000-15,000 प्रति परिपक्व मछली प्रजातियों और विकास के चरण के आधार पर), अनुसंधान परियोजनाओं के लिए एक सीमित कारक. हालांकि, स्टर्जन पंख और जबड़े की हड्डी से कोर्टिसोल निष्कर्षण के लिए एक उपयुक्त तकनीक के विकास उपयोगी दोनों मछली खेती प्रणालियों के लिए और जंगली मछली में दोनों की खपत के लिए स्टर्जन अंडे की गुणवत्ता और फसल में सुधार करने के लिए लागू किया जा सकता है और संरक्षण.

के रूप में अच्छी तरह से विश्वसनीय परिणाम प्रदान करने के रूप में6, एक उपयुक्त कोर्टिसोल निष्कर्षण तकनीक का चयन महत्वपूर्ण महत्व का है यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना तैयारी के दौरान मैट्रिक्स में मौजूद अन्य यौगिकों उत्पादन उलझन में नहीं है, जो करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं असंगत परिणाम. यह निर्धारित करने के लिए समान रूप से महत्वपूर्ण है कि क्या फिन और जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल का स्तर आसपास के पानी में हार्मोन के स्तर से प्रभावित हैं। Heimb-rge एट अल.15 सुझाव दिया है कि कारकों की एक संख्या उम्र, लिंग, गर्भावस्था, मौसम, रंग12,और शरीर क्षेत्र जिसमें से कोर्टिसोल निकाला जाता है सहित कोर्टिसोल के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं16. हालांकि, मछली शरीर matrices में कोर्टिसोल निष्कर्षण पर सॉल्वैंट्स धोने के प्रभाव पर कम जानकारी उपलब्ध है8, और स्टर्जन अंडे17के अलावा स्टर्जन में इन प्रभावों पर कोई भी .

हालांकि पंख और स्टर्जन के जबड़े की हड्डी से आधारभूत कोर्टिसोल के स्तर का विश्लेषण करने की आवश्यकता है कि मछली ethanized किया जा, इस दृष्टिकोण आक्रामक तकनीक लाइव स्टर्जन में रक्त नमूने के लिए आवश्यक जरूरत नहीं है. फिन और जबड़े की हड्डी के नमूने आसानी से एकत्र किए जाते हैं, और इन ऊतकों से निष्कर्षण तेजी से किया जा सकता है। इसी तरह, हार्मोन निष्कर्षण और विश्लेषण सीधा कर रहे हैं और थोड़ा विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है.

इस अध्ययन में, हम निष्कर्षण के लिए एक नई और आसानी से लागू तकनीक प्रस्तुत, धोने, और मछली पंख और जबड़े की हड्डी से कोर्टिसोल के निर्धारण, निर्धारित करने के उद्देश्य के साथ कि क्या कोर्टिसोल स्तर इन matrices से मापा मज़बूती से तनाव के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है संकेतक. इस तकनीक के फायदे एक आसान और गैर इनवेसिव8 दृष्टिकोण, कम डेटा भिन्नता , और विश्वसनीय उत्पादन1,6,8,17शामिल हैं; तकनीक ऐसे स्टर्जन के रूप में तराजू के बिना मछली प्रजातियों के लिए लागू है. इस तकनीक के लिए मछली के वध की आवश्यकता होती है, उचित वाशिंग सॉल्वैंट्स2,4,नमूनोंकी उचित पीस3 ,5,पेशेवर एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) का चयन आवेदन5,7, और ठोस matrices6में कोर्टिसोल स्रोतों के समावेश का व्यापक ज्ञान .

हमने तीन स्टर्जन प्रजातियों से पंख में बेसल कोर्टिसोल स्तर प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग वाशिंग सॉल्वैंट्स (अल्ट्रापुरे पानी और आइसोप्रोपेनोल) लागू किए हैं: बेलुगा (हुसो हूसो), साइबेरियाई (एकिसपेन्सर बेरीई), और सेवरूगा (ए. स्टेलेटस) ), प्रत्येक प्रजाति के लिए मानक पर्यावरण की स्थिति के तहत. स्टर्जन में तनाव का मूल्यांकन करने के लिए एच हूसो के जबड़े की हड्डी का भी उपयोग किया गया था। स्टर्जन जबड़े की हड्डी में कोर्टिसोल के स्तर को मापने के लिए यह पहला अध्ययन है। इस अध्ययन के परिणाम सेक्स निर्धारण से पहले प्रारंभिक विकास चरण (1 वर्ष) में स्टर्जन प्रजातियों के लिए तुलनात्मक कोर्टिसोल डेटा प्रदान करेंगे।

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Protocol

निम्नलिखित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और तरीकों Kangwon राष्ट्रीय विश्वविद्यालय, Chuncheon, कोरिया गणराज्य के पशु कल्याण और आचार प्राधिकरण द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. फिन संग्रह

  1. चोट और तनाव को कम करने के लिए धीरे से एक जाल का उपयोग कर स्टर्जन पर कब्जा।
  2. ताजा पानी के साथ ध्यान से मछली कुल्ला और फिर इच्छामृत्यु से पहले एक शोषक तौलिया के साथ शरीर की सतह पोंछ।
  3. मछली के सिर को प्लास्टिक के हथौड़ा का उपयोग करके मारो ताकि मछली स्तब्ध हो जाए या चेतना खो दे। चाकू से सिर निकाल लें।
  4. शरीर के वजन (छ) और लंबाई (सेमी) को मापने।
  5. इच्छामृत्यु के बाद, बाँझ शल्य कैंची का उपयोग कर के रूप में संभव के रूप में शरीर के रूप में बंद काटने से फिन के नमूने इकट्ठा।
    नोट: व्यक्तिगत, गैर recycled शोषक तौलिए प्रत्येक मछली के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस अध्ययन में प्रयुक्त प्रजातियों के लिए वर्णनात्मक आँकड़े इस प्रकार थे: बेलुगा स्टर्जन(एच. हूसो): उम्र - 18 - 2.1 महीने, शरीर का वजन ] 2,700 - 300 ग्राम, और शरीर की लंबाई ] 55 - 5 सेमी; साइबेरियाई स्टर्जन (ए. बेरिई): आयु - 9.6 - 2.4 महीने, शरीर का वजन ] 1,750 - 250 ग्राम, और शरीर की लंबाई - 45 - 5 सेमी; sevruga sturgeon (A. stellatus): उम्र - 14 - 1.3 महीने, शरीर का वजन ] 1,000 - 100 ग्राम, और शरीर की लंबाई ] 65 - 5 सेमी.

2. कोर्टिसोल निष्कर्षण के लिए फिन तैयारी

  1. प्रयोगशाला वजन कागज पर पंख के नमूने (एक नमूना प्रति ऊतक: $ 3 जी) रखें (107 मिमी - 210 मिमी) और सूखी जब तक कुछ दिनों के लिए कमरे के तापमान पर सूखी.
  2. एल्यूमीनियम पन्नी की चादरों में नमूने लपेटें, लेबल प्लास्टिक की थैलियों में जगह है, और प्रयोगशाला में स्थानांतरण.
  3. आगे के उपयोग के लिए एक रेफ्रिजरेटर में नमूने स्टोर, धोने सहित, कोर्टिसोल निष्कर्षण, सुखाने, और ELISA विश्लेषण (चित्र 2).

3. फिन कोर्टिसोल विश्लेषण

  1. डिजिटल विश्लेषणात्मक पैमाने (सटीक: 0.0001) कैलिब्रेट और बाहर वजन 300 - 10 पैमाने पैन पर वजन कागज के साथ मिलीग्राम नमूने.
  2. नमूनों को धो लें।
    1. प्रत्येक नमूने को 15 एल शंकु पॉलीप्रोपीलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक 5,000 डिग्री एल एकल चैनल पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूब के लिए आइसोप्रोपेनोल के 3 एमएल जोड़ें।
    2. कोर्टिसोल को धोने और किसी भी संभावित बाहरी संदूषण को हटाने के लिए ट्यूब को 2.5 मिनट के लिए 80 आरपीएम पर घुमाएं। इस कार्यविधि को दो बार दोहराएँ.
    3. 7 दिनों के लिए कमरे के तापमान (22-28 डिग्री सेल्सियस) पर धोया नमूनों हवा सूखी।
    4. धोने के एजेंट के रूप में अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग कर कपड़े धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ।
  3. हड्डी काटने संदंश का उपयोग कर शरीर के ऊतकों से जबड़े की हड्डी निकालें। जबड़े की हड्डी के नमूनों के लिए चरण 1.5-3.2.4 लागू करें।
  4. वजन बाहर (75 ] 5 mg) सूखे पंख या जबड़े की हड्डी के नमूने और 32 मिनट के लिए 50 हर्ट्ज पर एक मनका beater का उपयोग कर पीस.
    1. एक 1000 डिग्री एल पिपेट का उपयोग कर पाउडर पंख या जबड़े की हड्डी युक्त प्रत्येक ट्यूब में मेथनॉल के 1.5 एमएल उद्धार। लगातार मिश्रण के साथ कोर्टिसोल निकालने के लिए कमरे के तापमान पर 18 एच के लिए धीमी रोटेशन (40 आरपीएम) पर एक ट्यूब रोटेटर पर नमूने रखें।
  5. कोर्टिसोल निष्कर्षण के बाद, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 9,500 x ग्राम पर नमूने centrifuge। अपकेंद्रण के बाद, प्रत्येक नमूने से कोर्टिसोल (1 एमएल) युक्त शीर्ष कार्बनिक परत एकत्र करें और इसे एक अलग 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
    1. मेथनॉल वाष्पित करने के लिए 38 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा नमूनों को सुखा लें। निकाले कोर्टिसोल के नमूनों को रात भर एक धूआं हुड के तहत रखें ताकि मेथनॉल को नष्ट करने की अनुमति दी जा सके।
      नोट: कोर्टिसोल युक्त परत आमतौर पर पीले रंग में होती है।

4. फिन कोर्टिसोल का पता लगाने

  1. ELISA किट का उपयोग करने से पहले 1.5 एच के लिए कमरे के तापमान पर सूखे पंख या जबड़े की हड्डी के नमूने thaw.
  2. फॉस्फेट बफर, भंवर, और 15 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के 400 $L जोड़ें।
  3. परख सटीकता और विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूना (25 जेडएल) चलाएँ। मानक वक्र के बाहर किसी भी डेटा को बाहरी के रूप में निकालें.
  4. 450 एनएम के लिए एक microplate पाठक सेट, तो $g dL-1 के लिए सेट और प्लेट के ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें.
    1. एक चार-पैरामीटर गैर रेखीय प्रतिगमन वक्र फिट के साथ microplate सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. सॉफ्टवेयर से प्राप्त नमूनों के कोर्टिसोल स्तर को निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके पीजी मिलीग्राम-1 में कनवर्ट करें:
      एफ $ 10,000E (ए/बी) (सी/
      जहाँ एफ - फिन कोर्टिसोल स्तर के अंतिम मूल्य में (पीजी मिलीग्राम-1),ई - मात्रा (एमएल) परख बफर के सूखे निकालने के पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल किया, एक ] एकाग्रता ($g dL-1) परख उत्पादन द्वारा प्रदान की, बी - वजन (mg) अतिरिक्त के अधीन फिन के ction, C - मेथनॉल की मात्रा (एमएल) पाउडर पंख में जोड़ा, और डी - मेथनॉल की मात्रा (एमएल) निकालने से बरामद और बाद में3नीचे सूख गया.

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. प्रत्येक नमूने को धोने की प्रक्रिया से पहले दो उप-नमूने में विभाजित करें और फिर परीक्षण और परिणामों की विश्वसनीयता की शक्ति में सुधार करने के लिए एलिसा किट परख (2 $ 2 ] 4 अवलोकन प्रति नमूना) के दौरान डुप्लिकेट में चलाएँ।
  2. एसएएस सॉफ्टवेयर वातावरण में सामान्य रैखिक मॉडल (जीएलएम) प्रक्रिया को मापन डेटा18पर लागू करके दो वाशिंग सॉल्वैंट्स और उनकी अन्योन्यक्रियाओं के प्रभावों की तुलना करें।
  3. P.lt; 0.05 के महत्व के स्तर पर Tukey के परीक्षण का उपयोग करने के बीच अंतर का परीक्षण करें। एक महत्वपूर्ण अंतर के रूप में बजाय एक प्रवृत्ति के सबूत के रूप में 0.05 और lt; p और lt; 0.10 स्वीकार करें।

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Representative Results

प्रस्तुत फिन कोर्टिसोल निष्कर्षण तकनीक विकसित किया गया था और इस अध्ययन में तीन स्टर्जन प्रजातियों का उपयोग कर की पुष्टि की. अल्ट्राप्यूरेट जल और आइसोप्रोपेनोल का उपयोग करके प्राप्त कॉर्टिसोल स्तर ों की तुलना वाशिंग सॉल्वैंट्स के रूप में की गई थी (चित्र 2) । एच हसो जबड़े की हड्डी से Cortisol निर्धारित करने के लिए कि क्या स्टर्जन जबड़े की हड्डी पंख के लिए एक वैकल्पिक मैट्रिक्स के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है की जांच की थी. वाशिंग विलायक, स्टर्जन प्रजातियों और उनकी अन्योन्यक्रिया के प्रभाव सारणी 1में दर्शाए गए हैं। Cortisol का स्तर पानी के साथ धोया उन लोगों की तुलना में आइसोप्रोपेनॉल के साथ धोया फिन नमूनों में अधिक हो जाता था (p $ 0.089). स्टर्जन प्रजातियों के बीच फिन कोर्टिसोल के स्तर (च $ 0.525) में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। धोने सॉल्वैंट्स और स्टर्जन प्रजातियों के बीच कोई महत्वपूर्ण बातचीत नहीं थी (च $ 0.947)। वाशिंग विलायक का एच हसो स्टर्जन (च र् 0ण्45) (सारणी 2) में कोर्टिसोल स्तर पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा। अंतर-आस्पर और अंतर-आस्से गुणांक क्रमशः 14.15 और 7.70 थे। आंकड़ों में तीन स्टर्जन प्रजातियों (सारणी 1) के पंखके बीच और एच हसो जबड़े की हड्डी (सारणी 2) में उच्च समानता दिखाई दी । हमने जबड़े की हड्डियों में कोर्टिसोल के स्तर और विभिन्न स्टर्जन प्रजातियों के पंखों में सहसंबंधों की जांच नहीं की क्योंकि हमने केवल एच . हसोसे जबड़े की हड्डी के नमूने प्राप्त किए . इन संबंधों को भविष्य के अध्ययन में पता लगाया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्र 1| (ए) हुसो हसो स्टर्जन (10 वर्ष) की तस्वीर। (बी) स्टर्जन की रूपात्मक विशेषताएं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2| फिन कोर्टिसोलविश्लेषण5,6 प्रयोगशाला में प्रदर्शन की इन्फोग्राफिक। इन्फोग्राफिक सार में प्रस्तुत सभी तस्वीरों को प्रयोगशाला में ले जाया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्टर्जन प्रजाति (एसएस) वाशिंग विलायक (WS) P-मान
हूसो हूसो Acipenser baerii एसिपेन्सर स्टेलेटस Sem पानी आइसोप्रोपेनॉल Sem एस एस WS एस एस जेडडब्ल्यूएस
कॉर्टिसोल (पीजी मिलीग्राम-1)
3.46 2.85 3.34 0.41 2.86 3.69 0.33 0.52 0.08 0.95

तालिका 1| दो अलग-अलग वाशिंग सॉल्वैंट्स का उपयोग करके प्राप्त की गई तीन स्टर्जन प्रजातियों में फिन कोर्टिसोल का स्तर।

वाशिंग विलायक (WS) Sem P-मान
पानी आइसोप्रोपेनॉल
कॉर्टिसोल (पीजी मिलीग्राम-1) 1.11 1.43 0.31 0.45

तालिका 2| दो अलग-अलग वाशिंग सॉल्वैंट्स का उपयोग करते हुए बेलुगा स्टर्जन (हुसो हसो) में जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल का स्तर ।

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Discussion

Sturgeon कभी कभी एक "जीवित जीवाश्म" कहा जाता है क्योंकि यह पिछले सदियों भर में कुछ रूपांतरों का प्रदर्शन किया है. स्टर्जन जीनस एकिपेन्सर में 27 प्रजातियां होती हैं जो कैवियार का उत्पादन करती हैं; हालांकि, तीन प्रजातियों (बेलुगा, baerii, और sevruga) वैश्विक कैवियार आपूर्ति के सबसे उत्पादन. स्टर्जियन अधिक मछली पकड़ने और उनके प्राकृतिक निवास स्थान में हस्तक्षेप की चपेट में हैं और इसलिए प्रजातियों के किसी भी अन्य समूह की तुलना में अधिक गंभीर रूप से खतरे में हैं। स्टर्जन जीवित कशेरुकियों के सबसे पुराने समूह से संबंधित है, जो 150 मिलियन वर्षों से अस्तित्व में है। Acipenser प्रजातियों परिपक्व और धीरे धीरे हो जाना; कुछ (उदाहरण के लिए, एच huso)100 साल के लिए रह सकते हैं और वजन में 2,000 किलो से अधिक है. स्टर्जियन तराजू के बिना उपास्थि मछली हैं, और बड़े, बोनी प्लेटों की पांच पंक्तियों की विशेषता है जिसे स्कट और स्पर्श कंबेसेल कहा जाता है जो मुंह के सामने स्थित है (चित्र 1)। इन प्रजातियों और अन्य मछली के बीच शारीरिक मतभेदों में कम प्लाज्मा (कॉर्टिकोस्टेरॉइड) पर्यावरण तनाव के लिए प्रतिक्रियाएं शामिल हैं। हमारे फिन कोर्टिसोल माप सबूत है कि स्टर्जन जबड़े की हड्डी सांद्रता घूम के अनुपात में कोर्टिसोल जमा प्रदान करते हैं।

मछली शारीरिक, रासायनिक, और कथित तनाव के लिए कई प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित करते हैं। इन प्रतिक्रियाओं को अच्छी तरह से अनुकूली तंत्र के रूप में जाना जाता है जो मछली को पर्यावरण संबंधी गड़बड़ी से निपटने और एक होमियोस्टेटिक स्थिति को बनाए रखने की अनुमति देता है। यदि एक तनाव पर्याप्त रूप से लंबे समय तक या गंभीर है कि मछली अपनी प्राकृतिक प्रतिक्रियाओं का उपयोग करhomeostasis हासिल करने में असमर्थ है, तो मछली प्रतिकूल प्रभाव का अनुभव हो सकता है, इसके समग्र स्वास्थ्य और / स्टर्जन का लिंग लगभग 2 वर्ष की आयु से निर्धारित किया जा सकता है। इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कोर्टिसोल का स्तर और स्टर्जन सेक्स सहसंबद्ध हैं, स्टर्जन के पंख और जबड़े की हड्डियों में दीर्घकालिक कोर्टिसोल संचय को दस्तावेज़ करना आवश्यक है (एक नया दृष्टिकोण और वैकल्पिक मैट्रिक्स के रूप में)। यह अध्ययन स्टर्जन में फिन और जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल के स्तर की रिपोर्ट करने वाला पहला अध्ययन है।

कोर्टिसोल धोने विलायक की भूमिका त्वचा बलगम9से बाहरी कोर्टिसोल स्रोतों को हटाने के लिए है . Aerts एट अल14 मछली त्वचा से बाहरी कोर्टिसोल संदूषण को दूर करने के लिए आसुत पानी का इस्तेमाल किया; पिछलेअध्ययनोंमें 2,5,12,17, हम एक विलायक के रूप में आइसोप्रोपेनोल और पानी का उपयोग करने के प्रभाव की तुलना में बाल कोर्टिसोल सामग्री की जांच. धोने विलायक के प्रभाव स्टर्जन अंडे13, त्वचा15, पंख, और जबड़े की हड्डी के गुणों में मतभेद के कारण नमूनों के बीच भिन्न हो सकते हैं। Brossa7 की सूचना दी है कि कोर्टिसोल स्तर सुनहरी के तराजू में (Carasius auratus) स्थिर रहे जब आइसोप्रोपेनॉल washes की संख्या की परवाह किए बिना विलायक के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जबकि कोर्टिसोल का स्तर विभिन्न जब पानी का इस्तेमाल किया गया था. हमारे परिणामों से पता चला है कि धोने विलायक जबड़े कोर्टिसोल के स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा. इन अध्ययनों के बीच अंतर washes की संख्या में शामिल हैं, मिलाते हुए बनाम भंवर, आइसोप्रोपेनॉल शुद्धता, और महत्वपूर्ण बात, संवेदनशीलता या तराजू के प्रतिरोध / घसेमी नेजद एट अल20 ने दिखा दिया कि RIA और ELISA जैसे विभिन्न परखों के अनुप्रयोग से उत्पादन में अंतर हो सकता है। स्टेरॉयड कम आणविक द्रव्यमान alcohols में अधिक घुलनशील हैं (जैसे, मेथनॉल) इस तरह के रूप में उच्च आणविक वजन की alcohols में 4. मेथेनॉल निष्कर्षण गैर सहसंयोजक बांड को तोड़ने के द्वारा प्रोटीन denatures, इस प्रकार बाल कोर्टिसोल रिलीज की अनुमति. मेथेनोल भी गैर-सहसंयोजक बांड को तोड़ने के द्वारा हार्मोन संरचना को संशोधित करता है, ऊतकों से कोर्टिसोल की रिहाई में जिसके परिणामस्वरूप। मेथनॉल निष्कर्षण से पहले स्टर्जन पंख और जबड़े की हड्डी को प्रभावी ढंग से homogenize करने के लिए, एक मनका beater कुशलतापूर्वक नीचे ऊतक संरचना को तोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को पूरी तरह से फिन और जबड़े की हड्डी के नमूने पीसने के लिए समय की आवश्यकता है; इसलिए, कोर्टिसोल निष्कर्षण से पहले पूर्ण चूर्णन और homogenization सुनिश्चित करने के लिए प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए। 18 एच के लिए धीमी गति से रोटेशन धोने से कोर्टिसोल के क्रमिक हटाने की अनुमति देता है।

जैसा कि स्तनधारी बालों के पिछले अध्ययनों में सुझाव दिया गया है4,5,6, पंख और जबड़े में कोर्टिसोल सामग्री के बाहरी या आंतरिक स्रोतों, रक्त के अलावा, की उपेक्षा नहीं की जानी चाहिए। हालांकि इस अध्ययन विशेष रूप से जांच कैसे cortisol पंख या जबड़े के लिए रक्त से diffuses डिजाइन नहीं किया गया था, यह बेहतर इन matrices से कोर्टिसोल में उतार चढ़ाव की व्याख्या करने के लिए इस प्रक्रिया के हमारे ज्ञान का विस्तार करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया. पंख और जबड़े की हड्डी के गुण तराजू और त्वचा के उन लोगों से अलग हैं। जसी एट अल17 झील स्टर्जन में कोर्टिसोल का स्तर (ए fulvescens) अंडे मातृ शारीरिक स्थिति और अंडे की गुणवत्ता पर पर्यावरण ीय प्रभाव की जांच करने के लिए। उन्होंने मिथाइल टर्ट-ब्यूथीथर (एमटीबीई), एथिल एसीटेट (एकोएट) एमटीबीई, और डाइएथिल ईथर (ईटी2ओ) को वाशिंग सॉल्वैंट्स के रूप में इस्तेमाल किया और निष्कर्ष निकाला कि एथिल एसीटेट वसूली और मैट्रिक्स प्रभाव के मामले में सबसे अच्छा निष्कर्षण विलायक था। वर्तमान अध्ययन में, आइसोप्रोपेनोल ने धोने के दौरान त्वचा बलगम से बाहरी कोर्टिसोल की अधिक मात्रा को हटा दिया, जिससे स्टर्जन पंख से कोर्टिसोल का थोड़ा अधिक अनुमान लगाया जा सकता है, जिसे निष्कर्षण परिणामों की व्याख्या करते समय सावधानी से विचार किया जाना चाहिए। यह संभव है कि आइसोप्रोपेनोल पंख की त्वचा को धोने में सक्षम था, जैसा कि पिछलेअध्ययन7 में बताया गया है। आइसोप्रोपेनॉल को बालों के रोम और मछली के तराजू4,7में प्रवेश करने के लिए जाना जाता है . वर्तमान अध्ययन के परिणामों से संकेत मिलता है कि विलायक की पसंद कोर्टिसोल के स्तर पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं था, सुझाव है कि कोर्टिसोल निष्कर्षण ultrapure पानी का उपयोग कर दूसरों की तुलना में फिन के कुछ हिस्सों में और अधिक कठिन हो सकता है; ऐसे मामलों में, आइसोप्रोपेनोल एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस अध्ययन में स्टर्जन में तनाव के विश्वसनीय संकेत के लिए एक उपन्यास मैट्रिक्स के रूप में जबड़े की हड्डी की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया. एच हसो जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल मूल्यों एक ही प्रजाति के पंख से निकाले गए उन लोगों के समान थे; भविष्य के अध्ययन विभिन्न प्रजातियों के बीच इस परिणाम की पुष्टि करनी चाहिए, उम्र, और संबंध विश्लेषण के माध्यम से लिंग. वर्तमान अध्ययन में स्टर्जन की उच्च लागत के कारण मछली की कम संख्या का उपयोग किया गया था; हम दो बार प्रत्येक नमूना परीक्षण और भी ELISA के लिए मेथनॉल निष्कर्षण duplicating द्वारा इस सीमा को दूर करने का प्रयास किया। चौगुनी गुणा का उपयोग नमूने की कम संख्या को कवर करने के लिए परीक्षण की शक्ति में वृद्धि हो सकती है.

हम निष्कर्ष है कि धोने विलायक के प्रकार मामूली पंख से कोर्टिसोल निष्कर्षण प्रभावित है, लेकिन जबड़े नहीं, स्टर्जन की. इस अध्ययन के निष्कर्ष को सामान्य बनाने और इन परिणामों को मान्य करने से पहले, विभिन्न प्रजातियों और सॉल्वैंट्स का उपयोग करके आगे अनुसंधान किया जाना चाहिए। वर्तमान काम सबूत है कि स्टर्जन जबड़े की हड्डी भविष्य के अध्ययन में एक वैकल्पिक मैट्रिक्स के रूप में लागू किया जा सकता है sturgeon में तनाव के एक सूचकांक के रूप में कोर्टिसोल का उपयोग कर प्रदान करता है. वर्तमान अध्ययन में फिन और जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल माप के लिए एलिसा की उपयुक्तता का भी प्रदर्शन किया गया था। भविष्य के अनुसंधान दो पहलुओं पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए: 1) जबड़े की हड्डी में कोर्टिसोल के स्तर और स्टर्जन के पंख में उन लोगों के बीच संबंध का निर्धारण और 2) पुरानी मछली से कोर्टिसोल माप के लिए मैट्रिक्स नमूने कटाई और उनके caviar लंबी अवधि के तनाव का निर्धारण करने के लिए उम्र भर में विभिन्न स्टर्जन प्रजातियों में स्तर।

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.

Acknowledgments

यह काम कृषि विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास के लिए सहकारी अनुसंधान कार्यक्रम के समर्थन के साथ आयोजित किया गया (परियोजना शीर्षक: पशुधन उत्पादकता परिवर्तन जलवायु परिवर्तन के साथ विश्लेषण, परियोजना नहीं. PJ012771), ग्रामीण विकास प्रशासन, कोरिया गणराज्य. इसके अलावा, इस अध्ययन के एक अनुदान द्वारा समर्थित था (नहीं. पशु पोषण और शरीर विज्ञान टीम, राष्ट्रीय पशु विज्ञान संस्थान, आरडीए, सियोल, कोरिया गणराज्य से PJ01344604)। लेखकों ने फारसी इशारे के मुख्य कार्यकारी अधिकारी मोहम्मद हसन सलमानजादे और उनकी टीम को आभारी ताक पर रखा, जिन्होंने इस अध्ययन में जांची गई तीन स्टर्जन प्रजातियों से मछली उपलब्ध कराई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposal latex surgical gloves Ansell 63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg Baskoolnikoo 101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL Becton Dickinson Falcon 35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters BioTek 8041000
Reagent reservoirs BrandTech 703459
Zipper storage plastic bag  Cleanwrap 30cm x100m
Isopropyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5035-4400
Methyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro DLAB Scientific  824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL Eppendorf Research Plus M21518D
  Precision pipette to deliver 15 and 25 μL Eppendorf Research Plus R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm) Fisherbrand 09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A GeneReach Biotechnology Corp tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm Hangzhou Miu Instrument  MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL Hyundai Micro  H20050
Fume hood Kwang Dong Industrial KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g Labo Gene  9.900.900.729
Mini vortex mixer LMS VTX-3000L 
Lotte aluminum foil roll  Lotte Aluminum B0722X5FK5
Digital scale Mettler Toledo   ME204
Ultrapure water MDM MDM-0110
Pipette tips Neptune Scientific REF 2100.N
Large fish net Pond H2O Hoz135 
Salivary cortisol kit Salimetrics 1-3002-4
Bone cutting forceps Sankyo 26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL VITLAB 18A68756
Towel Yuhan Kimberly 1707921546
Tissue paper (107 × 210) Yuhan Kimberly 41117

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