Cortisol-Extraktion aus Störflossen und Kieferknochenmatrizen

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Summary

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Cortisolextraktion aus der Flosse und dem Kieferknochen von Störarten vor. Der Fin- und Kieferknochen-Cortisolspiegel wurde weiter untersucht, indem zwei Waschlösungsmittel mit anschließenden ELISA-Assays verglichen wurden. Diese Studie untersuchte die Durchführbarkeit von Kieferknochen-Cortisol als neuartigen Stressindikator.

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Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Salmanzadeh, M. H., Park, K. T., Lee, H. G., Shoae, A., Rahimi, A., Sung, K. I., Park, K. H. Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices. J. Vis. Exp. (151), e59961, doi:10.3791/59961 (2019).

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Abstract

Ziel dieser Studie war es, eine Technik zur Extraktion von Cortisol aus Störflossen unter Verwendung von zwei Waschlösungsmitteln (Wasser und Isopropanol) zu entwickeln und unterschiede in den Fin-Cortisol-Spiegeln zwischen drei Hauptstörarten zu quantifizieren. Die Flossen wurden von 19 geopferten Stören geerntet, darunter sieben Beluga (Huso huso), sieben Sibirien (Acipenser baerii) und fünf sevruga (A. stellatus). Die Störe wurden in iranischen Farmen für 2 Jahre (2017-2018) aufgezogen, und Cortisol-Extraktionsanalyse wurde in Südkorea durchgeführt (Januar-Februar 2019). Kieferknochen aus fünf H. huso wurden auch zur Cortisolextraktion verwendet. Die Daten wurden mit dem allgemeinen linearen Modellverfahren (GLM) in der SAS-Umgebung analysiert. Die Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen 14,15 bzw. 7,70. Kurz gesagt, die Cortisol-Extraktionstechnik beinhaltete das Waschen der Proben (300 x 10 mg) mit 3 ml Lösungsmittel (Ultrarinduzess und Isopropanol) zweimal, Rotation bei 80 Umdrehungen für 2,5 min, Lufttrocknung der gewaschenen Proben bei Raumtemperatur (22-28 °C) für 7 Tage, weitere Trocknung die Proben mit einem Perlenschlag bei 50 Hz für 32 min und Schleifen sie in Pulver, auftragen 1,5 ml Methanol auf das getrocknete Pulver (75 x 5 mg), und langsame Rotation (40 Rpm) für 18 h bei Raumtemperatur mit kontinuierlichem Mischen. Nach der Extraktion wurden probenweise zentrifugiert (9.500 x g für 10 min), und 1 ml Überstand wurde in ein neues Mikrozentrifugenrohr (1,5 ml) übertragen, bei 38 °C inkubiert, um das Methanol zu verdampfen, und mittels enzymgebundenem Immunsorben-Assay (ELISA) analysiert. . Es wurden keine Unterschiede im Fin-Cortisol-Spiegel zwischen den Arten oder in den Fin- und Kieferknochen-Cortisolspiegeln zwischen Waschlösungsmitteln beobachtet. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Stör-Kieferknochenmatrix ein vielversprechender alternativer Spannungsindikator für feste Matrizen ist.

Introduction

Cortisol ist ein zuverlässiger Indikator für tierischen Stress. Cortisol-Extraktion bietet einen gültigen Rahmen für Forscher, um Stressniveaus und allgemeine Muster in Stressoren zu überwachen. Zum Beispiel haben frühere Studien methodische Validierung von Haarcortisol-Messungen mit verschiedenen Methoden beim Menschendurchgeführt 1,2, Affen3,4, Rinder5, Schafe6, und Goldfisch7,8. Bei Fischarten haben Cortisolmessungen in Matrizen wie Schuppen, Hautschleim, Kot und Blut9 gezeigt, dass sie Informationen über die Gesundheit von Fischen liefern. Wenn die Blutentnahme problematisch ist oder Schuppen fehlen, sind alternative Matrizen für die Cortisolextraktion erforderlich. Bei Fischen können alternative Matrizen den Kieferknochen enthalten, ein hartes Gewebe ähnlich dem menschlichen Zahn10.

Die Entwicklung neuer Matrizen und validierter Techniken zur Bestimmung des Fischstressniveaus ist für die Kaviarindustrie von besonderem Interesse, wo Störe eine längere Exposition gegenüber Umweltstressfaktoren erfahren können11. Das Geschlecht von Stören kann nicht vor 2 Jahren bestimmt werden, und Stör haben keine Schuppen. Da sich Cortisol während der Wachstumsphase nach und nach in festen Matrizen ansammelt, könnten7,12, Langzeit-Cortisolakkumulationsdaten von harten Matrizen wie Flossen und Kieferknochen Einen Einblick in Stress geben in verschiedenen Wachstumsstadien. Im Gegensatz dazu bieten die Cortisolspiegel im Blut eine Momentaufnahme des Stressniveaus zum Zeitpunkt des Todes und können Stress während der Langzeitpflege bedingungen nicht genau darstellen13,14. Angesichts des zunehmenden Wettbewerbs auf dem Kaviarmarkt sind neue Ansätze zur Verbesserung der Stressbedingungen für die Produktion gesünderer Eier bei Störarten während der Langzeitaufzucht (8-12 Jahre oder länger) ein immer wichtigerer Forschungsbereich. Aufgrund der hohen Kosten für Störe sind geerntete Proben extrem kostspielig (8.000-15.000 DOLLAR pro ausgereiftem Fisch je nach Art und Wachstumsstadium), ein begrenzender Faktor für Forschungsprojekte. Die Entwicklung einer geeigneten Technik zur Cortisolextraktion aus Störflossen und Kieferknochen könnte jedoch sowohl auf Fischzuchtsysteme als auch auf Wildfische sinnvoll angewandt werden, um die Qualität und Ernte von Störeiern sowohl für den Verzehr als auch für die erhaltung.

Neben der Bereitstellung zuverlässiger Ergebnisse6ist die Auswahl einer geeigneten Cortisolextraktionstechnik von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass andere Verbindungen, die in der Matrix während der Probenvorbereitung vorhanden sind, den Output nicht verwirren, was zu inkonsistente Ergebnisse. Ebenso wichtig ist es zu bestimmen, ob der Gehalt an Flossen- und Kieferknochen-Cortisol durch Hormonspiegel im umgebenden Wasser beeinflusst wird. Heimbürge et al.15 schlugen vor, dass eine Reihe von Faktoren Cortisolspiegel beeinflussen können, einschließlich Alter, Geschlecht, Schwangerschaft, Jahreszeit, Farbe12und Körperregion, aus der Cortisol extrahiert wird16. Es liegen jedoch nur wenige Informationen über die Auswirkungen des Waschens von Lösungsmitteln auf die Cortisolextraktion in Fischkörpermatrizen8 vor,und keine über diese Effekte bei Stören, mit Ausnahme von Störeiern17.

Obwohl die Analyse der Cortisolspiegel der Basisvon Fischen und Kieferknochen von Stören erfordert, dass die Fische eingeschläfert werden, beinhaltet dieser Ansatz nicht die invasiven Techniken, die für die Blutentnahme bei lebenden Stören erforderlich sind. Flossen- und Kieferknochenproben lassen sich leicht sammeln, und die Extraktion aus diesen Geweben kann schnell durchgeführt werden. In ähnlicher Weise, Hormonextraktion und Analyse sind einfach und erfordern wenig spezielle Ausrüstung.

In dieser Studie stellen wir eine neue und leicht anzuwendende Technik zur Extraktion, Zumwaschung und Bestimmung von Cortisol aus Fischflossen und Kieferknochen vor, mit dem Ziel, zu bestimmen, ob cortisolspiegel, die aus diesen Matrizen gemessen werden, zuverlässig als Spannung verwendet werden können. Indikatoren. Die Vorteile dieser Technik sind ein einfacher und nicht-invasiver8-Ansatz, weniger Datenvariation und zuverlässige Ausgabe1,6,8,17; die Technik ist auf Fischarten ohne Schuppen wie Stör anwendbar. Die Technik erfordert die Schlachtung der Fische, Auswahl der geeigneten Waschlösungsmittel2,4, richtiges Schleifen der Proben3,5, professionelle enzymgebundene Immunosorbent Assay (ELISA) Anwendung5,7, und umfangreiche Kenntnisse der Einbeziehung von Cortisolquellen in feste Matrizen6.

Wir haben zwei verschiedene Waschlösungsmittel (Ultrarinrwasser und Isopropanol) angewendet, um Basalcortisolspiegel in Flossen von drei Störarten zu erhalten: beluga (Huso huso), Siberian (Acipenser baerii) und sevruga (A. stellatus ), unter den üblichen Umweltbedingungen für jede Art. Kieferknochen von H. huso wurden auch verwendet, um Stress in Stören zu bewerten. Dies ist die erste Studie, die Cortisolspiegel in Störkieferknochen misst. Die Ergebnisse dieser Studie werden vergleichende Cortisoldaten für Störarten im frühen Wachstumsstadium (1 Jahr) vor der Geschlechtsbestimmung liefern.

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Protocol

Die folgenden experimentellen Verfahren und Methoden wurden von der Animal Welfare and Ethics Authority der Kangwon National University, Chuncheon, Republik Korea, genehmigt.

1. Flossensammlung

  1. Erfassen Sie den Stör sanft mit einem Netz, um Verletzungen und Stress zu minimieren.
  2. Spülen Sie den Fisch vorsichtig mit frischem Wasser und wischen Sie dann die Körperoberfläche mit einem saugfähigen Handtuch vor der Euthanasie ab.
  3. Schlagen Sie den Kopf des Fisches mit einem Plastikhammer so, dass der Fisch betäubt wird oder das Bewusstsein verliert. Entfernen Sie den Kopf mit einem Messer.
  4. Messen Sie das Körpergewicht (g) und die Länge (cm).
  5. Nach der Euthanasie sammeln Sie Flossenproben, indem Sie mit einer sterilisierten chirurgischen Schere so nah wie möglich am Körper schneiden.
    HINWEIS: Für jeden Fisch müssen individuelle, nicht recycelte saugfähige Handtücher verwendet werden. Die beschreibenden Statistiken für die in dieser Studie verwendeten Arten waren wie folgt: Beluga-Stör (H. huso): Alter = 18 x 2,1 Monate, Körpergewicht = 2.700 x 300 g und Körperlänge = 55 x 5 cm; Sibirischer Stör (A. baerii): Alter = 9,6 x 2,4 Monate, Körpergewicht = 1.750 x 250 g und Körperlänge = 45 x 5 cm; sevruga stör (A. stellatus): Alter = 14 x 1,3 Monate, Körpergewicht = 1.000 x 100 g, und Körperlänge = 65 x 5 cm.

2. Flossenpräparat zur Cortisolextraktion

  1. Legen Sie die Flossenproben (eine Probe pro Gewebe: 3 g) auf Laborwägepapier (107 mm x 210 mm) und trocknen Sie sie bei Raumtemperatur für einige Tage bis zum Trocknen.
  2. Proben in Aluminiumfolienfolien wickeln, in beschriftete Plastiktüten legen und ins Labor bringen.
  3. Proben im Kühlschrank für die weitere Verwendung aufbewahren, einschließlich Waschen, Cortisolextraktion, Trocknung und ELISA-Analyse (Abbildung 2).

3. Fin Cortisol-Analyse

  1. Kalibrieren Sie die digitale Analyseskala (Genauigkeit: 0,0001) und wiegen Sie 300 x 10 mg Proben mit Wägepapier auf der Waage.
  2. Waschen Sie die Proben.
    1. Jede Probe in ein 15 L konisches Polypropylenrohr geben. Fügen Sie 3 ml Isopropanol zu jedem Rohr mit einer 5.000 l Einkanalpipette hinzu.
    2. Drehen Sie die Rohre bei 80 U/min für 2,5 min, um Cortisol auszuwaschen und mögliche äußere Verunreinigungen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.
    3. Die gewaschenen Proben 7 Tage lang bei Raumtemperatur (22-28 °C) lufttrocknen.
    4. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit Reinstwasser als Waschmittel.
  3. Extrahieren Sie den Kieferknochen aus dem Körpergewebe mit Knochenschneiden Zangen. Tragen Sie die Schritte 1.5-3.2.4 auf die Kieferknochenproben auf.
  4. Abwägen (75 x 5 mg) getrocknete Flossen- oder Kieferknochenproben und 32 min mit einem Perlenschlag bei 50 Hz mahlen.
    1. 1,5 ml Methanol in jedes Rohr mit Pulverflossen- oder Kieferknochen mit einer 1000-L-Pipette liefern. Legen Sie die Proben bei langsamer Drehung (40 U/min) 18 h bei Raumtemperatur auf einen Rohrrotator, um Cortisol mit kontinuierlicher Durchmischung zu extrahieren.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben nach Cortisolextraktion bei 9.500 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation die obere organische Schicht, die Cortisol (1 ml) enthält, aus jeder Probe zu sammeln und in ein separates 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr zu geben.
    1. Trocknen Sie die Proben durch Inkubation bei 38 °C, um das Methanol zu verdampfen. Bewahren Sie die extrahierten Cortisolproben über Nacht unter einer Dunstabzugshaube auf, damit methanol ableiten kann.
      HINWEIS: Die Cortisol-haltige Schicht ist in der Regel gelblich gefärbt.

4. Fin Cortisol-Erkennung

  1. Die getrockneten Flossen- oder Kieferknochenproben bei Raumtemperatur 1,5 h auftauen, bevor Sie das ELISA-Kit verwenden.
  2. Fügen Sie 400 l Phosphatpuffer, Wirbel und Zentrifuge bei 1.500 x g für 15 min hinzu.
  3. Führen Sie jede Probe (25 l) in zwei Duplikaten aus, um die Assay-Genauigkeit und -Zuverlässigkeit zu verbessern. Entfernen Sie alle Daten außerhalb der Standardkurve als Ausreißer.
  4. Stellen Sie einen Mikroplattenleser auf 450 nm ein, dann auf g dL-1 und lesen Sie die optische Dichte der Platte.
    1. Verwenden Sie die Mikroplattensoftware mit einer nichtlinearen Regressionskurve mit vier Parametern. Konvertieren Sie die Cortisolspiegel der aus der Software erhaltenen Proben in pg mg-1 mit der folgenden Gleichung:
      F = 10.000E (A/B) (C/D),
      wobei F = der Endwert des Flossencortisolspiegels in (pg mg-1), E = das Volumen (ml) des Assaypuffers, der zur Rekonstituierung des getrockneten Extrakts verwendet wird, A = die Durchdiendurchlage der Assay-Leistung , B = das Gewicht (mg) der Flosse, die extra Ction, C = das Volumen (ml) von Methanol, das der Pulverflosse zugesetzt wird, und D = das Volumen (ml) von Methanol, das aus dem Extrakt gewonnen und anschließend ausgetrocknet3.

5.Statistische Analyse

  1. Teilen Sie jede Probe vor dem Waschvorgang in zwei Unterproben auf und werden Sie dann während des ELISA-Kit-Tests doppelt ausgeführt (2 x 2 = 4 Beobachtungen pro Probe), um die Leistung des Tests und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu verbessern.
  2. Vergleichen Sie die Auswirkungen der beiden Waschlösungsmittel und ihre Wechselwirkungen, indem Sie das allgemeine lineare Modellverfahren (GLM) in der SAS-Softwareumgebung auf die Messdaten18anwenden.
  3. Testunterschiede zwischen Denbeinen mit Tukeys Test auf einem Signifikanzniveau von p < 0,05. Akzeptieren Sie 0,05 < p < 0,10 als Beweis für eine Tendenz und nicht als signifikanten Unterschied.

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Representative Results

Die vorgestellte Fin Cortisol-Extraktionstechnik wurde in dieser Studie unter Verwendung von drei Störarten entwickelt und bestätigt. Die Cortisolspiegel, die mit Reinstwasser und Isopropanol als Waschlösungsmittel gewonnen wurden, wurden verglichen (Abbildung 2). Cortisol aus H. huso Kieferknochen wurde untersucht, um festzustellen, ob Störkieferknochen als alternative Matrix zu Flossen verwendet werden könnten. Die Auswirkungen des Waschens von Lösungsmitteln, Störarten und deren Wechselwirkung sind in Tabelle 1dargestellt. Der Cortisolspiegel war in Flossenproben, die mit Isopropanol gewaschen wurden, tendenziell höher als bei mit Wasser gewaschenen (p = 0,089). Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Flossencortisolspiegeln (p = 0,525) bei Störarten. Es gab keine signifikante Wechselwirkung zwischen Waschlösungsmitteln und Störarten (p = 0,947). Waschlösungsmittel hatten keine signifikante Auswirkung auf den Cortisolspiegel in H. huso Stör (p = 0,45) (Tabelle 2). Die Variationskoeffizienten zwischen den Assay- und Inter-Assay-Koeffizienten betrugen 14,15 bzw. 7,70. Die Daten zeigten eine hohe Ähnlichkeit zwischen den Flossen der drei Störarten (Tabelle 1) und in H. huso kieferknochen (Tabelle 2). Wir untersuchten keine Korrelationen zwischen Cortisolspiegeln in Kieferknochen und denen in Flossen verschiedener Störarten, da wir Kieferknochenproben nur von H. husoerhielten. Diese Beziehungen sollten in einer zukünftigen Studie untersucht werden.

Figure 1
Abbildung 1. (A) Foto von Huso huso stör (10 Jahre alt). (B) Morphologische Eigenschaften von Stören. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Infografik der Flossencortisolanalyse5,6 im Labor durchgeführt. Alle in der Infografik-Zusammenfassung präsentierten Fotografien wurden im Labor aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Störart (SS) Waschmittel (WS) P-Wert
Huso huso Acipenser baerii Acipenser stellatus Sem wasser Isopropanol Sem Ss Ws SS-WS
Cortisol (pg mg-1)
3.46 2.85 3.34 0.41 2.86 3.69 0.33 0.52 0.08 0.95

Tabelle 1. Flossencortisolspiegel bei drei Störarten, die mit zwei verschiedenen Waschlösungsmitteln gewonnen werden.

Waschmittel (WS) Sem P-Wert
wasser Isopropanol
Cortisol (pg mg-1) 1.11 1.43 0.31 0.45

Tabelle 2. Kieferknochen-Cortisolspiegel in Beluga-Stör (Huso huso) mit zwei verschiedenen Waschlösungsmitteln.

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Discussion

Stör wird manchmal als "lebendes Fossil" bezeichnet, weil es in den vergangenen Jahrtausenden nur wenige Anpassungen gezeigt hat. Die Störgattung Acipenser enthält 27 Arten, die Kaviar produzieren; jedoch produzieren drei Arten (Beluga, Baerii und Sevruga) den größten Teil des weltweiten Kaviarangebots. Störe sind anfällig für Überfischung und Einmischung in ihren natürlichen Lebensraum und sind daher stärker gefährdet als jede andere Artengruppe. Störe gehören zur ältesten Gruppe lebender Wirbeltiere, die seit 150 Millionen Jahren besteht. Acipenser Arten reifen und wachsen langsam; einige (z.B. H. huso) können 100 Jahre leben und 2.000 kg gewicht haben. Störe sind knorpelige Fische ohne Schuppen und zeichnen sich durch fünf Reihen von großen, knöchernen Platten, die scutes und taktilen Barben genannt werden, an der Vorderseite des Mundes aus (Abbildung 1). Physiologische Unterschiede zwischen diesen Arten und anderen Fischen sind verminderte Plasmareaktionen (Kortikosteroid) auf Umweltstressoren. Unsere Flossencortisolmessungen belegen, dass sich der Störkieferknochen im Verhältnis zu zirkulierenden Konzentrationen ansammelt.

Fische zeigen zahlreiche Reaktionen auf physikalische, chemische und wahrgenommene Stressoren. Diese Reaktionen sind als adaptive Mechanismen bekannt, die es den Fischen ermöglichen, mit Umweltstörungen fertig zu werden und einen otostatischen Zustand aufrechtzuerhalten. Wenn ein Stressor so verlängert oder ernst ist, dass der Fisch mit seinen natürlichen Reaktionen nicht in der Lage ist, die Homöostase wiederzuerlangen, kann der Fisch negative Auswirkungen haben, die seine allgemeine Gesundheit und/oder sein Leben gefährden19. Das Geschlecht des Störs kann ab etwa 2 Jahren bestimmt werden. Daher, um festzustellen, ob Cortisolspiegel und Störsex korreliert sind, ist es notwendig, die langfristige Cortisolansammlung in Flossen und Kieferknochen (als neuer Ansatz und alternative Matrix) von Stören zu dokumentieren. Diese Studie ist die erste, die Flossen- und Kieferknochen-Cortisolspiegel bei Stören berichtet.

Die Rolle eines Cortisol-Waschmittels besteht darin, externe Cortisolquellen aus dem Hautschleim zu entfernen9. Aerts et al.14 verwendet destilliertes Wasser, um externe Cortisolkontamination aus der Fischhaut zu entfernen; in früheren Studien2,5,12,17, verglichen wir die Auswirkungen der Verwendung von Isopropanol und Wasser als Lösungsmittel, um den Gehalt an Haarcortisol zu untersuchen. Die Wirkung von Waschlösungsmittel kann zwischen Denponen aufgrund von Unterschieden in den Eigenschaften von Störeiern13, Haut15, Flossen und Kieferknochen variieren. Brossa7 berichtete, dass der Cortisolspiegel in Goldfischschuppen (Carassius auratus) konstant blieb, wenn Isopropanol unabhängig von der Anzahl der Wälvorgaben als Lösungsmittel verwendet wurde, während der Cortisolspiegel bei der Verwendung von Wasser variierte. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Waschlösungsmittel keinen Einfluss auf den Cortisolspiegel des Kiefers hatten. Die Unterschiede zwischen diesen Studien umfassen die Anzahl der Waschungen, Schütteln vs. Wirbeln, Isopropanol Reinheit, und vor allem, Empfindlichkeit oder Widerstand von Schuppen / Haut gegen externe Flüssigkeit Penetration. Ghassemi Nejad et al.20 zeigten, dass die Anwendung verschiedener Assays wie RIA und ELISA zu Produktionsunterschieden führen kann. Steroide sind in niedrigeren molekularen Massenalkoholen (z.B. Methanol) löslicher als in Alkoholen mit höherem Molekulargewicht wie Isopropanol4. Die Methanolextraktion denaturiert DasProtein, indem sie nicht-kovalente Bindungen bricht und so die Freisetzung von Haarcortisol ermöglicht. Methanol verändert auch die Hormonstruktur, indem es nicht-kovalente Bindungen bricht, was zur Freisetzung von Cortisol aus Geweben führt. Um Störflossen und Kieferknochen vor der Methanolextraktion effektiv zu homogenisieren, kann ein Perlenschlag verwendet werden, um die Gewebestruktur effizient abzubauen. Dieses Verfahren benötigt Zeit, um Flossen- und Kieferknochenproben vollständig zu schleifen; Daher muss der Prozess wiederholt werden, um eine vollständige Pulverisierung und Homogenisierung vor der Cortisolextraktion zu gewährleisten. Die langsame Rotation für 18 h ermöglicht die allmähliche Entfernung von Cortisol durch Waschen.

Wie in früheren Studien von Säugetierhaarenvorgeschlagen 4,5,6, externe oder interne Quellen von Cortisolgehalt in Flossen und Kiefern, außer Blut, sollte nicht vernachlässigt werden. Obwohl diese Studie nicht speziell entwickelt wurde, um zu untersuchen, wie Cortisol von Blut zu Flossen oder Kiefern diffundiert, unterstreicht sie die Notwendigkeit, unser Wissen über diesen Prozess zu erweitern, um Schwankungen in Cortisol aus diesen Matrizen besser zu interpretieren. Die Eigenschaften von Flossen und Kieferknochen unterscheiden sich von denen von Schuppen und Haut. Bussy et al.17 quantifizierte Cortisolspiegel in Seestöreiern (A. fulvescens) Eier, um Umweltauswirkungen auf den mütterlichen physiologischen Zustand und die Eiqualität zu untersuchen. Sie verwendeten Methyltert-Butylether (MTBE), Ethylacetat (AcOEt) MTBE und Diethylether (Et2O) als Waschlösungsmittel und kamen zu dem Schluss, dass Ethylacetat das beste Extraktionslösungsmittel in Bezug auf Dierückgewinnung und Matrixwirkung ist. In der vorliegenden Studie entfernte Isopropanol beim Waschen größere Mengen an externem Cortisol aus dem Hautschleim, was zu einer leichten Überschätzung von Cortisol aus Störflossen führte, die bei der Interpretation der Extraktionsergebnisse sorgfältig berücksichtigt werden muss. Es ist möglich, dass Isopropanol in der Lage war, die Haut der Flosse auszuwaschen, wie in einer früheren Studie 7 berichtetwurde. Isopropanol ist bekannt, Haarfollikel und Fischschuppen zu durchdringen4,7. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Wahl des Lösungsmittels keine signifikante Nöse auf den Cortisolspiegel hatte, was darauf hindeutet, dass die Cortisolextraktion in einigen Teilen der Flosse schwieriger sein kann als in anderen, die Reinstwasser verwenden; in solchen Fällen kann Isopropanol als Alternative verwendet werden.

Diese Studie zeigte die Anwendbarkeit des Kieferknochens als neuartige Matrix für die zuverlässige Indikation von Stress bei Stören. H. huso kieferknochen Cortisolwerte waren ähnlich denen, die aus Flossen der gleichen Art extrahiert wurden; Zukünftige Studien sollten dieses Ergebnis bei verschiedenen Arten, Altersgruppen und Geschlechtern mittels Korrelationsanalyse bestätigen. Eine geringe Anzahl von Fischen wurde in der aktuellen Studie aufgrund der hohen Kosten von Stören verwendet; wir versuchten, diese Einschränkung zu überwinden, indem wir jede Probe zweimal testeten und auch die Methanolextraktion für den ELISA duplizieren. Die Verwendung der Vierfachenmultiplikation könnte die Leistung des Tests erhöhen, um die geringe Anzahl von Proben abzudecken.

Wir kommen zu dem Schluss, dass die Art des Waschlösungsmittels mäßig Cortisolextraktion aus Flossen, aber nicht von Kiefern, von Stören beeinflusst. Bevor die Schlussfolgerung dieser Studie verallgemeinert und diese Ergebnisse validiert werden, sollten weitere Forschungen mit verschiedenen Arten und Lösungsmitteln durchgeführt werden. Die vorliegende Arbeit liefert Beweise dafür, dass der Störkieferknochen in zukünftigen Studien als alternative Matrix angewendet werden kann, indem Cortisol als Stressindex bei Stören verwendet wird. Die Eignung von ELISA für die Fin- und Kieferknochen-Cortisol-Messung wurde auch in der vorliegenden Studie nachgewiesen. Zukünftige Forschung sollte sich auf zwei Aspekte konzentrieren: 1) Bestimmung der Korrelation zwischen Cortisolspiegeln in Kieferknochen und denen in Flossen von Stören und 2) Ernte matrix Proben für Cortisolmessung von älteren Fischen und ihrem Kaviar zur Bestimmung von Langzeitstress verschiedenen Störarten über die Gesamteinlaufzeit.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde mit Unterstützung des Cooperative Research Program for Agriculture Science & Technology Development (Projekttitel: Tierproduktivitätsänderungsanalyse mit Klimawandel, Projekt Nr. PJ012771), Rural Development Administration, Republik Korea. Auch wurde diese Studie durch ein Stipendium (Nr. PJ01344604) vom Animal Nutrition & Physiology Team, National Institute of Animal Science, RDA, Seoul, Republik Korea. Die Autoren danken dem CEO der persischen Geste Mohammad Hassan Salmanzadeh und seinem Team, das Fische aus den drei in dieser Studie untersuchten Störarten zur Verfügung gestellt hat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposal latex surgical gloves Ansell 63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg Baskoolnikoo 101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL Becton Dickinson Falcon 35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters BioTek 8041000
Reagent reservoirs BrandTech 703459
Zipper storage plastic bag  Cleanwrap 30cm x100m
Isopropyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5035-4400
Methyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro DLAB Scientific  824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL Eppendorf Research Plus M21518D
  Precision pipette to deliver 15 and 25 μL Eppendorf Research Plus R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm) Fisherbrand 09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A GeneReach Biotechnology Corp tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm Hangzhou Miu Instrument  MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL Hyundai Micro  H20050
Fume hood Kwang Dong Industrial KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g Labo Gene  9.900.900.729
Mini vortex mixer LMS VTX-3000L 
Lotte aluminum foil roll  Lotte Aluminum B0722X5FK5
Digital scale Mettler Toledo   ME204
Ultrapure water MDM MDM-0110
Pipette tips Neptune Scientific REF 2100.N
Large fish net Pond H2O Hoz135 
Salivary cortisol kit Salimetrics 1-3002-4
Bone cutting forceps Sankyo 26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL VITLAB 18A68756
Towel Yuhan Kimberly 1707921546
Tissue paper (107 × 210) Yuhan Kimberly 41117

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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