בסיס מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז חזקה עבור כימות ציטוסינוס-גואנין-גואנין Trinucleotide גאות חוזר בצורה שברירית X פיגור-1 גן

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מדויק וחזק מבוסס תגובת שרשרת פולימראז ' המבוססת על ככמת ציטוסינוס-גואן ין-גואנין trinucleotide גאות חוזר על הפיגור שברירי X 1 גן מקלה אבחנה מולקולרית והקרנה של תסמונת X שביר והקשורות X שברירי הפרעות עם הזמן להסתובב קצר והשקעה בציוד.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

תסמונת X שביר (FXS) והפרעות הקשורות נגרמות על ידי התרחבות של ציטוסין-גואן-גואן-גואנין (CGG) טריטוקלאואדה חוזר באזור 5 ' בלתי מתורגם (UTR) של פיגור שברירי X 1 (FMR1) גן יזם. מקובל, ניתוח מקטע של אלקטרופורזה קפילר על מנתח גנטי משמש לשינוי גודל CGG חוזר של FMR1, אך ניתוח כתמי דרומי נוסף נדרש למדידה מדויקת כאשר מספר החזרה גבוה מ-200. כאן, אנו מציגים שיטה מדויקת ואיתנה של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) לקוונפיקציה של ה-CGG חוזר על FMR1. השלב הראשון של בדיקה זו הוא ה-PCR הגברה של רצפי חוזר ב 5 ' UTR של FMR1 יזם באמצעות ערכת ה-pcr X שביר, ואחריו טיהור של מוצרי ה-PCR ושינוי גודל על מכשיר אלקטרופורזה מיקרופלואידיסי נימי, ו פרשנות הבאה של מספר ה-CGG חוזר על-ידי התייחסות לתקנים עם הידוע חוזר באמצעות תוכנת הניתוח. שיטת ה-PCR מבוססת ומסוגלת לזהות את הטווח המלא של CGG חוזר על FMR1 יזמים, כולל אלה עם מספר חוזר של יותר מ 200 (מסווג כמוטציה מלאה), 55 כדי 200 (premutation), 46 ל54 (ביניים), ו 10 כדי 45 (רגיל). זוהי שיטה חסכונית המאפשרת סיווג של FXS ו-X שברירי הפרעות הקשורות עם החוסן וזמן דיווח מהיר.

Introduction

תסמונת X שביר (FXS) ושברירי X הפרעות הקשורות, למשל, רעד תסמונת אטקסיה (FX-TAS), ואת אי ספיקה השחלות הראשונית (FX-פוי) נגרמים בעיקר על ידי ציטוסין-גואן-ין (CGG) טריאוקליאואס חוזר על התרחבות 5 ' לא תורגם אזור (UTR) של הפיגור שברירי X-1 (FMR1) גן על xq 27.31,2. חלבון FMR1 מקודד (FMRP) הוא חלבון רב-תפקודי מסוג RNA-binding המשויכים להתפתחות העצבית והפלסטיות הסינפטית על-ידי ויסות שילוב אלטרנטיבי, יציבות, והובלת הדנדריטים של mrna או סינתזה של מודליטינג של חלבונים חלקיים מתוך הסינפטית3,4,5,6,7.

הווריאציה הדינמית עם גודל החזרה CGG של > 200 מתוארת כמוטציה מלאה, אשר מעוררת את ההיפרלציה החריגה ובעקבות השתקה של FMR1 יזם8. העדר או חוסר של חלבון FMRP משבש את פיתוח עצבי נורמלי גורם FXS9, מאופיין בסימפטומים קליניים שונים, כולל מתון עד מוגבלות אינטלקטואלית חמורה, עיכוב התפתחותי, התנהגויות היפראקטיביות, קשרים עניים וביטויים אוטיסטים10,11,12. המצגת אצל הנקבה FXS לחולי הוא בדרך כלל מתון יותר מזה אצל זכרים. גודל החזרה CGG החל מ 55 אל 200 ו 45 כדי 54 מסווגים כסטטוס מוטציה וביניים, בהתאמה. בשל הרמה הגבוהה של חוסר יציבות, גודל החזרה cgg ב מוטציה או ביניים אלל ככל הנראה מתרחב כאשר מועברים מהורים לצאצאים13,14. לפיכך, נושאות עם אללים מוטציות בסיכון גבוה של הילדים מושפעים FXS בגלל התרחבות חוזר, ובמקרים מסוימים, אללים ביניים יכול להרחיב את גודל החזרה שלהם לטווח מוטציה מלא על פני שני דורות15, . שישה עשרה יתר על כן, זכרים עם premutation גם להעביר סיכון מוגבר לפתח מאוחר התפרצות FX-TAS17,18,19, בעוד נקבות premutation וטציה הם מראש עבור שני fx-TAS ו-fx-פוי20, 21,22. לאחרונה, דווח כי הפרעות הספקטרום האוטיסטי עם עיכוב התפתחותי ובעיות בהתנהגויות חברתיות מוצגות אצל ילדים עם premutation אללים 23,24.

כדי לקבוע את גודל החזרה cgg מדויק הוא של משמעות רבה עבור סיווג וחיזוי של FXS ו-X שברירי הפרעות הקשורות25,26. מבחינה היסטורית, התגובה הספציפית של CGG שרשרת פולימראז (PCR) עם שינוי גודל בתוספת ניתוח הכתם הדרומי היה תקן זהב עבור פרופיל מולקולרי של FMR1 cgg חוזר27. עם זאת, ה-PCR הספציפי המסורתי הוא פחות רגיש למוטציות גדולות עם יותר מ 100 כדי 130 חוזר ואינו מסוגל להגברה מוטציות מלאות27,28. יתר על כן, אלקטרופורזה קפילר על מנתח גנטי מסורתי לשינוי גודל נכשל לזהות FMR1 PCR מוצרים עם יותר מ-200 cgg חוזר. ניתוח הכתם הדרומי מאפשר הבידול של מגוון רחב יותר של גודל חוזר, מהרגיל למספרים חוזרים מוטציה מלאה, והיה בשימוש נרחב לאישור מוטציות מלאות (אצל גברים) וההבחנה heterozygous אללים עם מוטציה מלאה מ כנראה homozygous אללים עם גדלי חזרה נורמליים (אצל נקבות). עם זאת, הרזולוציה עבור כימות החזרה מוגבלת. חשוב מכך, אסטרטגיית הבדיקה של שלב אחר שלב היא אינטנסיבית לעבודה, גוזלת זמן וחסכונית.

כאן, אנו מציגים שיטה מדויקת ואיתנה המבוססת על PCR לכמת של CGG חוזר על FMR1. השלב הראשון של מבחן זה הוא הגברה PCR של רצפי חוזר ב 5 ' UTR של יזם FMR1 באמצעות ערכת X PCR שביר. מוצרי ה-PCR מטוהרים ושינוי גודל מבוצע על-ידי מכשיר אלקטרופורזה במיקרופלואידיסי, והפרשנות העוקבת של מספר cgg חוזרת באמצעות תוכנת הניתוח על-ידי התייחסות לתקנים הידועים ומבוססים על ה רציונל כי אורך קטע ה-PCR פרופורציונלי באופן ישיר למספר החזרה של CGG. מערכת ה-PCR כוללת ריאגנטים המקל על הגברה של האזור הגדול ביותר במערכת האנטי-GC העשיר. שיטת ה-PCR מבוססת ומסוגלת לזהות את כל הטווחים של CGG חוזר על FMR1 יזמים. זוהי שיטה חסכונית שיכולה למצוא יישום רחב באבחנה מולקולרית והקרנת של FXS ו-X שברירי הפרעות הקשורות עם פחות סיבוב הזמן וההשקעה בציוד ולכן, יכול להיות מנוצל בספקטרום רחב של קליני מעבדות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישור מוסרי הוענק על ידי האוניברסיטה הסינית המשותפת של הונג קונג – שטחים חדשים באשכול המחקר הקליני של הטריטוריות החדשות ועדת האתיקה (מספר אסמכתא: 2013.055)

1. הגברה הPCR

  1. לפני תחילת, להסיר את ערבוב מאגר ה-PCR, לדוגמה מדלל ו-DNA דגימות (שניהם DNA בדיקה והתייחסות) (לראות את הטבלה של חומרים) מ-20 ° c מקפיא ולשמור אותם בטמפרטורת החדר עבור 20 – 30 דקות כדי לוודא כל ריאגנטים ו-DNA הם הופלו במלואו. מערבולת ולקצר לסובב למטה לפני השימוש.
  2. מדוד את הריכוז של דגימות ה-DNA באמצעות ספקטרוסקופיה (ראה טבלת חומרים). ריכוז ה-DNA צריך להיות 25 ng/μL; לדלל עם דגימה מדלל לריכוז המתאים אם נדרש.
    הערה: יש לחלץ את הדנ א ולטהר אותו כדי להסיר חומרים מפריעים, כגון חלבונים וריכוזים גבוהים של מלח. לא מושפל, DNA באיכות גבוהה צריך לשמש עבור הגברה וניתוח של PCR הבאים (A260/A280:1.8 – 2.0 ו A260/A230: > 1.0).
  3. תוויות בארות של צלחת PCR או 0.2 mL PCR צינורות כדי לזהות התייחסות דגימות DNA נבדק.
  4. חשב את מספר תגובות ה-PCR הנדרשות לדגימות הבדיקה, 2 דוגמאות התייחסות ודגימת שליטה שלילית. הכנת מיקס מאסטר PCR על ידי הוספת 15 μL של ערבוב מאגר PCR, 2.6 μL של לדוגמה דילול ו 0.4 μL של פולימראז עבור כל תגובה.
    הערה: שליטה שלילית באמצעות מדלל דגימה חיונית כדי לנטר את ביצועי ה-PCR. הכינו את המיקס הראשי של ה-PCR בטמפרטורת החדר, אל פיפטה על הקרח. . שילוב מאגר ה-PCR הוא צמיגי ערבב את השפופרת ולאחר מכן הסתובב בקצרה לפני השימוש.
  5. מערבולת מאסטר ה-PCR ערבוב משלב 1.4 עבור 10 – 20 s ו ספין למטה. מוותר באיטיות על 18 μL של התערובת לתוך כל טוב או צינור.
  6. וורטקס ולסובב. את דגימות הדי. אנ. איי פיפטה 2 μL של כל דנ א לתוך הבאר המתאים או צינור לנפח PCR הסופי של 20 μL. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה 5 פעמים.
    הערה: הסכום הכולל של הדנ א לכל תגובה צריך להיות 50 – 100 ng. כמויות ה-DNA גדול יותר מ 150 ng לתוך 20 μL התגובה הPCR עלולה לגרום הגברה נמוכה של האללים לחזור גדול. עבור DNAs נמוך מרוכז, כמות מדלל לדוגמה ב-PCR לערבב מאסטר ניתן להחליף על ידי פתרון DNA.
  7. חותם את הצלחת עם איטום לוחית דבק, או עם כובעי צינור.
  8. מניחים את לוחית ה-PCR האטומה או את החצוצרות בתוך הציקלייר התרמי עם מכסה מחומם. הפעל את התוכנית עם ההגדרות הבאות: 95 ° c עבור 5 דקות, ואחריו 25 מחזורים של הרפתקאות ב 98 ° צ' עבור 35 s, ריפוי ב 59 ° c עבור 35 s, ואת השלוחה ב 72 ° c עבור 4 דקות; צעד אחרון ב 72 ° c עבור 10 דקות. החזק את מוצרי ה-PCR ב-4 ° c בציקלייר עד להסרת עיבוד נוסף.
  9. לאחר הגברה, לטהר ולנתח את המוצרים מיד, או לאחסן ב + 2 עד 8 ° c בלילה. לחילופין, ניתן לאחסן את המוצר עד 30 יום ב-30 עד 16 ° c.

2. טיהור מוצרי ה-PCR

  1. מחממים את שייקר החממה עד 65 ° c.
  2. עבור כל תגובה PCR, להוסיף 80 μL של מאגר 1x TE (לראות את הטבלה של חומרים) ל 20 μl של כל מוצר ה-pcr מסעיף 1.
  3. העבר את התערובת לדוגמה לצלחת הניקוי של ה-PCR (ראה טבלת חומרים) באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
  4. לשמור על הצלחת נחשף ולמקם אותו לתוך שייקר חממה, ו דגירה ב 65 ° צ' בעוד רועד ב 1,200 rpm עבור 10 דקות.
  5. לאחר הדגירה, להגדיר את כלי ואקום ב 250 mbar (או 25 kPa, 188 mmHg, 7.4 ב Hg) ו לשאוב את הפתרון דרך המסנן עבור 15 דקות.. וולס לא צריך להישאר נוזלי
  6. מצננים את שייקר החממה עד 25 ° c.
  7. לאחר השאיפה הראשונה, לכבות את הוואקום ולהוסיף 50 μL של מאגר 1x TE לכל טוב. אל תערבב. לשאוב את הפתרון עבור 10 דקות באמצעות הגדרות ואקום בשלב 2.5.
  8. נגב את תחתית לוחית הסינון על-ידי לחיצה בחוזקה על ערימת מגבות נייר.
  9. הוסף 20 μL של מאגר 1 x TE למרכז התחתון של כל באר. מניחים את הצלחת בשייקר החממה והדגירה ב -25 ° c תוך כדי טלטול ב 1,200 rpm עבור 5 דקות.
  10. לאחר הדגירה, להעביר > 15 μL של כל ה-DNA מטוהרים של PCR משלב 2.9 לצלחת חדש 96-היטב PCR. את הדנ א הטהור ניתן לנתח ישירות, או לחילופין ניתן לאחסן ב-30 עד 16 ° צ' עד הנדרש.

3. שינוי גודל של מוצרי PCR

  1. לפני ההתחלה, לאפשר להתרכז לצבוע DNA, DNA ג'ל מטריצה, סמן ה-DNA, סולם DNA ומטוהרים דגימות DNA משלב 2 כדי לequiלטמפרטורה החדר עבור 30 דקות.
  2. . הגדר את תחנת הקרקע
    1. החלף את המזרק (ראה טבלת חומרים) בעת שימוש בקבוצה חדשה של ריאגנטים.
    2. כוונן את לוח הבסיס, ושחרר את המנוף של קליפ המזרק והחלק אותו למצב העליון.
  3. הפעל את שינוי הגודל של תוכנה (ראה טבלת חומרים) ולהכין את תערובת ג'ל צבע.
  4. צבע מערבולת להתרכז 10 s ו ספין למטה. הוסף 25 μL של הצבע לבקבוקון מטריצת ג'ל. מערבולת הפתרון המעורב היטב ולהסתובב.
    1. העבר את תערובת ג'ל-צבע למסנן ספין. מניחים את מסנן ספין ב מיקרוצנטריפוגה ו ספין עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר ב 1,500 x g ± 20%.
      הערה: הגן על הפתרון באמצעות צבע מאור ואחסן ב-4 ° צ' לאחר השימוש. תערובת ג'ל צבע ניתן להשתמש במשך כ 15 צ'יפס שהוכנו פעם אחת. הניחו לתערובת הג'ל לערבב את טמפרטורת החדר במשך 30 דקות בכל פעם לפני השימוש.
  5. לטעון את מיקס צבע ג'ל.
    1. הכנס שבב די. אן. איי חדש. בתחנת הקרקע הוסף 9 μL של תערובת ג'ל לצבע לתוך היטב מסומן עם "G". נא ודא שבוכנה ממוקמת בסימן של 1 מ"ל ולאחר מכן סגור את תחנת הקרקע.
    2. לחץ על המזרק עד שהוא מוחזק על-ידי הקליפ. לחכות בדיוק 30 ואז לשחרר את הקליפ. לחכות 5 s, ולאחר מכן לאט למשוך את הבוכנה בחזרה 1 mL מיקום.
    3. פתחו את תחנת הקרקע והוסיפו 9 μL של תערובת ג'ל לצבע לתוך הבארות המסומנות ב-"G".
  6. הוסף 5 μL של סמן לתוך היטב מסומן עם סמל הסולם וגם להוסיף 5 μL של סמן לתוך כל 12 בארות לדוגמה. . אל תשאירו בארות ריקות
  7. הוסף 1 μL של סולם DNA לתוך הבאר מסומן עם סמל הסולם. הוסף 1 μL של מוצר ה-PCR (בארות משומשים) משלב 3.1 או 1 μL של מים באולטרסאונד (בארות שאינן בשימוש) לכל אחת מ -12 בארות המדגם. לשים את השבב אופקית במתאם של מערבל מערבולת ומערבולת עבור 1 דקות בהגדרה המצוין (2,400 rpm).
  8. הכנס את השבב בכלי הביומנתח והפעל את השבב בתוך 5 דקות.
  9. לאחר שהבקרה תושלם, הסר מיד את השבב שבשימוש מכלי הנגינה.
  10. באיטיות להוסיף 350 μL של מים מפוהים לתוך אחת הבארות של מנקה האלקטרודה. פתחו את המכסה של הביומנתח והניחו את מנקה האלקטרודות לתוכו. סגור את המכסה ואת הדגירה עבור 10 s. פתח את המכסה ולהסיר את מנקה האלקטרודה. לחכות עוד 10 s כדי לאפשר את המים על האלקטרודות להתאדות ולאחר מכן לסגור את המכסה.

4. ניתוח תוצאות שינוי גודל הקטע

הערה: דגימות התייחסות צריך להיות מוגבר ומנותח על ידי הציקלer תרמית אותו bioanalyzer באותה אצווה עם דגימות לא ידוע.

  1. לאחר שהפעלת bioanalyzer משלימה, יצא את נתוני השיא מכל הפעלה כקובץ בטבלת csv לצורך הניתוח העוקב.
  2. הפעל את תוכנת הניתוח ופתח את קובץ השיא מיוצא של הטבלה. csv משלב 4.1.
  3. באמצעות הכרטיסייה תפריט QC , סקור את קו הרגרסיה המצויד בארבע הנקודות (המוצגות כיהלומים כחולים על המגרש) משתי דגימות הייחוס. ערך R2 של קו הרגרסיה אמור להיות > 0.98 (ערכים טיפוסיים חורגים מ-0.999).
  4. באמצעות הכרטיסיה תפריט תוצאות , בדוק את גודל החזרה של כל מדגם שאורכם (s) של הקטעים מותווים באופן אוטומטי מול עקומת הרגרסיה הליניארית הנגזרת מדגימות הייחוס. התוכנה גם מספקת את הסיווג של כל מדגם בהתאם להנחיות שונות.
  5. באמצעות הכרטיסיה תפריט ייצוא , יצא את דוח התוצאה עבור כל מדגם עם מספרי החזרה והסיווג האבחוני, כמו גם סיכום של מידע לדוגמה ודוח QC עבור כל הפעלה.
    הערה: ניתוח תוכנה מאפשר את השימוש בהנחיות סיווג מותאם אישית, כגון המכללה האמריקנית לגנטיקה רפואית (ACMG) או החברה המולקולרית גנטיקה מולקולרית/החברה האירופית של גנטיקה אנושית (CMGS/אשתג) הנחיות, כמו גם סיווג מוגדר מראש קריטריונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות לשינוי גודל של התייחסות נקבה טרום מוטציה מדגם (NA20240, לחזור על גודל של 30 ו 80) ואת מוטציה מלאה נקבה התייחסות מדגם (NA20239, גודל חוזר של 20 ו 200) מוצגים באיור 1a ואיור 1a, בהתאמה. בדרך כלל, שני פסגות סמן (נמוך סמן 50 בסיס זוגות [bp] ו-סמן העליון 10,380 bp) נכללים בפרופיל גודל הקטע. יש בדרך כלל שיא מורכב בגודל של כמעט 95 bp. באמצעות דגימת ההפניה, ניתן לבנות עקומת רגרסיה ליניארית עם ארבע נקודות, כפי שהוצג באיור 1C.

התכונות של גודל המייצג של הקליני נורמלי, ביניים, premutation, ודגימות מוטציה מלאה מוצגים באיור 2א – D. במיוחד, פסיפס מלא מוטציות עם שתי פסגות השבר מורחב אחד בשיא נורמלי מוצגים באיור 2E. במקרים מסוימים, רק פסגה אחת מוצגת בתוצאות האלקטרופורזה במיקרופלואידיג, כפי שמוצג באיור 2F. זה יכול להיות מוסבר על ידי המצגת של homozygous אללים רגיל (עם מספרי חוזר זהה cgg בשני האללים) במקרים אלה או חוסר היכולת של הבחנה heterozygous אללים כי יש לחזור מספר הבדלים של ארבעה או פחות29. עם זאת, אלה לשיא התוצאות יכול להיות מסווג כרגיל, כי זה כבר אומת כי הצינור מבוסס PCR מאפשר הגברה חזקה וזיהוי של מוטציה מלאה או alleles הממזער את האפשרות של שלילי שווא ב מצב הזה סוג אחד של מצב תת-אופטימלי הוא הטיה בסיסית, כפי שמוצג באיור 2G, שיכול ליצור תוצאות דו-משמעיות או בלתי מפרספרות במקרים מסוימים. מצב כזה נחשד כתוצאה מבעיית מכשירים. גודלי הקטעים הנמדדים של דגימות לא ידועות מותוות כנגד עקומת הרגרסיה הליניארית הנגזרת מדגימות הייחוס כדי לחשב באופן אוטומטי את גדלי החזרה באמצעות תוכנת הניתוח, כפי שמוצג באיור 2H. גודל המקטע קטן מ-200 חוזר מתבצע אינטרפולציה לתוך עקומת הרגרסיה הקווית הרגילה בעוד שגודלי המוטציה המלאים הגדולים יותר נמדדים על-ידי הפחתה לאורך קו התקן זהה. התוכנה מציגה גם את הסיווג של כל מדגם בהתאם להנחיות שונות.

Figure 1
איור 1: תוצאות שינוי הגודל של דגימות ההפניה הנשית ועקומת הרגרסיה הליניארית המתאימה. (A, B) להראות את התכונות בגודל של התייחסות נקבה טרום מוטציה מדגם (NA20240, חזרה בגדלים של 30 ו 80) ואת מוטציה מלאה נקבה התייחסות מדגם (NA20239, לחזור על גדלים של 20 ו 200), בהתאמה. שני סמנים (סמן תחתון, 50 bp ו-סמן העליון 10380 bp) כלולים בתוצאת האלקטרופורזה עבור כל מדגם. הפסגה עם גודל של כמעט 95 bp מצביע על מתחם פריימר. חיצים שחורים מציינים את גודל השיא של מורכבות תחל וחצים כחולים מייצגים את אורך הקטע של דגימת הייחוס. (ג) עקומת הרגרסיה הלינארית עם ארבע נקודות (יהלומים כחולים) משתי דגימות הייחוס נבנית בתוכנת הניתוח. הצירים האופקיים והאנכיים מציגים את מספרי החזרה המחושבים של CGG ואת אורך הקטע הנמדד באלקטרופורזה במיקרופלואידיג. ערך ה-R2 של הרגרסיה היה 0.99967. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התוצאות הייצוגיות של דגימות קליניות עם גודל CGG שונה לחזור. (A – E) להראות את גודל הנציג תכונות על ידי bioanalyzer בסדר של נורמלי (עם אורכי קטע של 328 bp ו 353 bp, המתאים מספרי חוזר של 28 ו 36), ביניים (עם אורכי קטע של 335 bp ו-390 bp, המתאים מספר חוזר של 30 ו 49), premutation (עם אורכי קטע של 332 bp ו 439 bp, המתאים מספרי חוזר של 29 ו 65), מוטציה מלאה (עם אורכי קטע של 337 bp ו 1911bp, המתאים למספר חוזר של 31 ו-545) פסיפס מלא מוטציות (עם אורכי קטע של 349 bp, 1201 bp ו 2688 bp, המתאים למספר חוזר של 33, 294 ו-751) דגימות. (ו) מציג מיקרופלואידיג הפסגה בודדת התוצאה (עם אורך קטע של 334 bp, המתאים מספר חוזר של 30) של נקבה אשר כנראה יש homozygous אללים עם אותו מספרי חזרה cgg בשני האללים) או heterozygous אללים (עם הבדלי מספר חזרה CGG של ארבעה או פחות). (G) מציג סוג אחד של מצב המשנה האופטימלי המהווה הטיה בסיסית. חיצים שחורים מציינים את גודל השיא של מורכבות תחל, וחיצים אדומים מייצגים את אורך הקטע של המדגם. (ח) מציג את ממשק התוצאה העיקרי של תוכנת הניתוח. גודלי הקטעים הנמדדים של דגימות לא ידועות מותווים נגד עקומת הרגרסיה הליניארית כדי לחשב באופן אוטומטי את גודל החזרה. אלל נורמלי של פסיפס מלא מוטציה נקבה מדגם המוצג (E) ממופה לעיקול רגיל בפינה השמאלית התחתונה של אזור ציר הקואורדינטות (המותוות בירוק), ואת הגדול מוטציה מלאה האלולים (המותוות באדום) מחוץ ל ארבע נקודות סטנדרטיות (יהלומים כחולים בעקומה). המקטעים הטבלאיים בחצי התחתון של האיור מציגים את גודל הקטעים ואת סיווג האבחון המתאים בהתאם לגבולות הקווים הנבחרים של ACMG. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FXS הוא הגורם השכיח ביותר השני של ליקוי אינטלקטואלי לאחר טריזומיה 21, חשבונאות עבור כמעט אחד מחצית של פיגור שכלי מנטלי של X30, אשר עשוי להשפיע על כ 1 ב 4,000 זכרים 1 ב 8,000 נקבות. חשוב יותר, כמעט 1 ב 250 – 1000 הנקבות לשאת premutation, ואת התדר הזה הוא 1 ב 250 – 1600 בזכרים26,31,32,33. מאז הסיכון של cgg חזרה על התרחבות מוטציות מלאות בעת שידור אללים מוטציה לצאצאים מרומם באופן דרמטי, למשל, מ 4% כאשר גודל החזרה אימהי הוא 55 – 59 כדי 98% כאשר הגודל הוא 100 – 20014, קביעת cgg גודל חוזר בטווח רחב יותר יכול להקל על האבחנה של FXS והקרנת נושאות טרום מוטציה עבור תכנון הרבייה שלהם. השיטה מבוססת PCR הציג כאן הוא מדויק, מהיר וחזק כדי להגביר את רצפי החזרה ב 5 ' utr של FMR1 יזם ולכמת את הספקטרום המלא של cgg מספרים חוזרים על מכשיר אלקטרופורזה מיקרופלואידיג נימי, ובכך יכול ל להגביר את היישום הרחב שלה באבחנה מולקולרית והקרנת של FXS ו-X שברירי הפרעות הקשורות עם פחות סיבוב הזמן והשקעה בציוד. מכשיר bioanalyzer יכול להיות מנוצל בביטחון נמוך עד מתון הגדרות בדיקת תפוקה למדידת גודל חוזר. הציוד הוא הרבה יותר קטן, פחות יקר ופשוט יותר לשמור מאשר מכשירים אחרים אלקטרופורזה נימים, כגון מאבחנים גנטיים מסוג ABI נימי. להקרנה בעוצמה גבוהה, מערכת MultiDX המכילה עד 384-מודל דגם מספק גמישות ותפוקה נרחבת עבור הבדיקות.

המנה כוללת ארבעה צעדים עיקריים: ה-PCR הגברה של רצפי החזרה ב-5 ' UTR של FMR1 יזם (pcr הגדרת הגברה ו-pcr לוקח כמעט 3.5 h), טיהור של מוצרי ה-pcr (לוקח כמעט 1 h), קטע הגודל על מיקרופלואידיג מכשיר אלקטרופורזה קפילי (לוקח כמעט 1 h), והפרשנות של מספר CGG חוזר באמצעות תוכנת הניתוח על ידי מסקנות מתקני הייחוס עם ידוע חוזר (לוקח כמעט 0.5 h). בסך הכל, זמן הסיבוב של התקופה הזאת הוא כ-6 שעות. לקבלת ביצועים מיטביים, יש לטהר דגימות DNA כדי להסיר חומרים מפריעים כגון חלבונים וריכוזים גבוהים של מלח. בנוסף, הכמות המומלצת של ה-DNA קלט הוא 50 – 100 ng לכל 20 μL של התגובה PCR. כמויות ה-DNA גדול יותר מ 150 ng לכל 20 μL של מערכת ה-PCR הוכחו כתוצאה הגברה ירודה של האללים לחזור גדול. יתרה מזאת, מומלץ מאוד להגדיר לפחות שתי דוגמאות להפניות עם גדלי חזרה מאופיינים היטב בכל מערכת ה-PCR לניתוח סימולטני של מספרים חוזרים כבקרת איכות ושינוי הגודל האוטומטי של הנתונים בתוכנת הניתוח. 29. בדרך כלל, ערך R2 של עקומת הרגרסיה הליניארית שנגזר מדגימות הייחוס צריך להיות גדול מ-0.98. בנוסף, יש לטהר את מוצרי ה-PCR לפני אלקטרופורזה קפילואידים מיקרופלואידיג כדי לשפר את יעילות הזיהוי. ככל שניתן לבצע את הפעולה של ה-PCR עם מערכת הקרינה הפלואורסצנטית29, קטע השינוי במערכת האלקטרופורזה המתאימה (למשל, bioanalyzer ומערכת multidx) יכול להתבצע ישירות ללא תיוג נוסף.

מגוון של מתודולוגיות לאבחון ולימוד של FXS והפרעות הקשורות כבר נבדקו באופן מקיף על ידי ברוס E. הייוורד ואח ', כולל מבוסס DNA ו fmrp חלבון בחני34. כמו ברוב המקרים את הבסיס המולקולרי של FXS הוא מוטציה דינמית המאופיינת cgg חוזר הרחבת באזור המקדם של FMRP1 gene, הדרום בלוק הגברה מבוסס בחני באמצעות DNA גנומית הם הנפוצים ביותר בשימוש בחני קביעת מספר החזרה. ידוע היטב כי ה-PCR מבוסס שוקל יתר על המידה הדרומית בעלות-יעילות והמינימום בדרישה DNA סכום. עם זאת, הגברה של CGG-repeat הוא אתגר עיקרי מאז גבוהה התוכן GC יכול להשפיע על היעילות, ומאמץ רב נעשה עבור אופטימיזציה של מערכת ה-PCR במהלך השנים34. הקיט השברירי X PCR כבר אופטימיזציה עבור הגברה מדויקת של כל טריג trinucleotide גאות חוזר, ומחקר אימות על הביצועים של שיטה זו מבוססת PCR כבר דווחה על ידי הקבוצה שלנו29. שיטה דומה מבוססת-PCR דווחה על ידי מיינק זלצר ואח '. ב 201235, אבל המכשיר ABI 3730xl שימש לקביעת גודל חוזר ויחידים עם גודל חזרה פחות מ 200 זוהו. זה יכול להיות בגלל העובדה כי הפלטפורמה שנבחרו לא היה מסוגל לזהות את הגדול יותר חוזר עם גודל חוזר מעל 200. לעומת זאת, מכשיר bioanalyzer אנו משתמשים מציע מגוון חזק יותר השינוי השינוי, כפי שהוא יכול באופן מדויק וחסכוני לזהות את הספקטרום המלא של FMR1 CGG חוזר כולל מוטציות מלאות29.

מלבד מספר חזרה, מספר גורמים אחרים גם צריך להיות מוכן לאבחנה המתאימה של FXS ו-FXS הפרעות הקשורות, כולל FMR1 מוטציה, היקף מתילציה ו מפסיפס34. מצב מתילציה יכול להיות מפוקח על ידי שיטות שונות כגון שילוב של שלבי העיכול באמצעות אנזים הגבלה רגיש מתילציה או שינוי יסולפיט תאמה34, עם זאת, התיקון שלנו אינו מסוגל לקבוע את ה מצב מתילציה של 5 UTR של היזם FMR1 . בנוסף, הסיכון התרחבות של אלל FMR1 גם תלוי בנוכחות של הפסקות agg, אשר יכול לייצב את הגן במהלך השידור. ה-PCR המבוסס על החזרות שונו כדי לזהות הפסקות AGG ואילו חוסר יציבות באנזים העיכול הוא אחד המגבלות העיקריות. PCR שלישיה (TP) על-ידי שימוש בכריכה היברידית של ה-PCR ב-CGG חוזר או בהפרעות AGG הוא סוג אחר של מערך PCR אשר יכול לזהות את הזמן החוזר של CGG והפסקות AGG בו. עם זאת, שיטת ה-PCR הספציפי לגנים הFMR1 שתיארנו אינה מסוגלת לזהות את הפסקות ה-AGG, אלא אם כן FMR1 ברצף הגנים לאחר הגברה מבוצעת. לאחרונה, הייוורד ואח ' דיווחו על שיטות ה-PCR המשמשות במעבדה שלהם לקביעת כל הפרמטרים הנחוצים עבור בדיקות גנטיות מלאות או מחקר יסודי מעבדה, כולל בחני שיכול לזהות מספר חוזר, מעמד הפרעה agg ו מצב מתילציה36 למרבה הצער, אף אחת מהשיקולים אינה מסוגלת לקבוע באופן מקיף את כל הגורמים האלה מעודכנים.

ראוי לציין כי השיטת אינו מסוגל לזהות מחיקות או בודד-נוקלאוטיד משתנים בתוך FMR1 gene, אשר מהווה כ 1% מהמקרים FXS27. לעתים נדירות, אצל אנשים בעלי פסיפס תאי לFMR1 החוזר, ה-PCR עשוי לתת תוצאה שלילית כוזבת בגלל כישלון בגילוי פסיפס עבור מוטציה גדולה יותר ומוטציה מלאה של אלטלס37,38. זה כבר הוכיח כי הסף של זה PCR המבוסס על מדגם מוטציה מלאה פסיפס זכר (341 חוזר) הוא 2.5% כאשר סף גלאי השיא מוגדר בשלוש יחידות הזריחה מעל בסיסית29. במקרים שבהם מסומנים כלים מפסיפס, מומלץ לעשות ניתוח כתמי אבן בדרום. יתר על כן, בנוגע לפלטפורמות האלקטרופורזה, המחקר הקודם ציין כי לעומת מערכות אלקטרופורזה קפילר (g., ABI 3130XL מכשיר), המכשיר bioanalyzer אינו מסוגל להבדיל את homozygous נורמלי דגימות נשיות עם פסגות של קטעים בודדים מדגימות נשיות עם גדלי חזרה heterozygous, הכוללים הבדלי מספרים חוזרים של ארבעה או פחות29. עם זאת, אלה השיא הדגימות יכול להיות מסווג כרגיל, כי זה כבר אומת כי זה הצינור המבוסס PCR מאפשר הגברה חזקה וזיהוי של מוטציה מלאה או alleles אשר ממזער את האפשרות של שלילי שווא ב מצב הזה ללא קשר למגבלות הנ ל, השיטה יכולה להיות מנוצל כמו צינור הראשון ברמה עבור זיהוי מולקולרי של FXS ו-X שברירי מחלות הקשורות עם עלות-תועלת, חוסן ודיווח מהיר זמן, שיושלם על ידי רצף של ה FMR1 gene וניתוח כתמי בדרום של רמות מתילציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים NSFC ניהול חירום הפרויקט (גרנט No. 81741004), הארגון הלאומי למדע הטבע של סין (גרנט No. 81860272), תוכנית המחקר העיקרי של המדע המחוזי הקרן טכנולוגיה של גואנגשי ( . גרנט לא AB16380219), בקרן המדע הפוסט-דוקטורט של סין (גרנט No. 2018M630993), והקרן למדע הטבע גואנגשי (מענק No. 2018GXNSFAA281067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M. Jr, et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20, (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics