अस्थि प्रतिस्थापन सामग्री में अस्थि विकास और Neovascularization के आकलन के लिए खरगोश में अस्थि संवर्धन के Calvarial मॉडल

Bioengineering

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Summary

यहाँ हम हड्डी पुनर्जनन क्षमताओं के मामले में हड्डी प्रतिस्थापन सामग्री का आकलन करने के उद्देश्य के साथ खरगोशों में एक शल्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। खरगोश खोपड़ी पर तय पीक सिलेंडरों का उपयोग करके, ऑस्टियोडिक्शन, ऑस्टियोप्रेनेंस, ऑस्टियोजेनेसिस और सामग्री द्वारा प्रेरित vascueogenesis या तो रहते हैं या इच्छामृत्यु जानवरों पर मूल्यांकन किया जा सकता है।

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Marger, L., Barone, A., Martinelli-Kläy, C. P., Schaub, L., Strasding, M., Mekki, M., Sailer, I., Scherrer, S. S., Durual, S. Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials. J. Vis. Exp. (150), e59976, doi:10.3791/59976 (2019).

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Abstract

खरगोश calvarial मॉडल के बुनियादी सिद्धांत खोपड़ी के cortical भाग के शीर्ष पर खड़ी नई हड्डी ऊतक विकसित करने के लिए है। इस मॉडल हड्डी विकास और neovascularization समर्थन के मामले में मौखिक और craniofacial हड्डी पुनर्जनन के लिए हड्डी प्रतिस्थापन सामग्री के आकलन की अनुमति देता है. एक बार जब जानवरों को एनेस्थेटाइज्ड और हवादार (एंडोट्रेकल इंटूबेशन) कर दिया जाता है, तो पोलिथर ईथर कीटोन (पीक) से बने चार सिलेंडर मध्य और कोरोनल टांके के दोनों ओर खोपड़ी पर खराब हो जाते हैं। पांच intramedullary छेद हड्डी क्षेत्र प्रत्येक सिलेंडर द्वारा सीमांकित के भीतर drilled रहे हैं, अस्थि मज्जा कोशिकाओं के प्रवाह की अनुमति. सामग्री के नमूने सिलेंडरों में रखे जाते हैं जो फिर बंद हो जाते हैं। अंत में, शल्य चिकित्सा स्थल सीवन है, और जानवरों को जगाने रहे हैं. अस्थि वृद्धि का मूल्यांकन माइक्रोटोमोग्राफी का उपयोग करके जीवित पशुओं पर किया जा सकता है। एक बार जब जानवरों को इच्छामृत्यु कर दी जाती है, तो अस्थि विकास और नवसंवहनीकरण का मूल्यांकन माइक्रोटोमोग्राफी, प्रतिरक्षा-हिस्टोलॉजी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके किया जा सकता है। एक सामग्री के मूल्यांकन के रूप में अधिकतम मानकीकरण और अंशांकन की आवश्यकता है, calvarial मॉडल आदर्श प्रकट होता है. प्रवेश बहुत आसान है, अंशांकन और मानकीकरण परिभाषित सिलेंडरों के उपयोग से मदद कर रहे हैं और चार नमूने एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है. इसके अलावा, लाइव टोमोग्राफी का इस्तेमाल किया जा सकता है और अंततः जानवरों में एक बड़ी कमी इच्छामृत्यु होने का अनुमान लगाया जा सकता है।

Introduction

अस्थि वृद्धि के calvarial मॉडल मौखिक और craniofacial शल्य चिकित्सा डोमेन में निर्देशित हड्डी पुनर्जनन (GBR) की अवधारणा का अनुकूलन करने के उद्देश्य से 90 में विकसित किया गया था। इस मॉडल का मूल सिद्धांत खोपड़ी के cortical भाग के शीर्ष पर खड़ी नई हड्डी ऊतक विकसित करने के लिए है। ऐसा करने के लिए, एक रिएक्टर (उदा., टाइटेनियम-डोम, -सिलेंडर या -केज) एक कलम द्वारा आयोजित हड्डी पुनर्जनन की रक्षा के लिए खोपड़ी पर तय किया जाता है (उदा., हाइड्रोजेल, हड्डी विकल्प, आदि)। इस मॉडल की सहायता से, टाइटेनियम या सिरेमिक पिंजरों1,2,3,4,5,6, जीबीआर झिल्ली7,8,9 ,10, ऑस्टियोजेनिक कारक11,12,13,14,15,16,17, नई हड्डी विकल्प12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 या हड्डी पुनर्जनन प्रक्रिया के दौरान neovascularization के तंत्र30 मूल्यांकन किया गया.

एक अनुवादात्मक दृष्टि से, कैल्वरियल मॉडल एक दीवार दोष का प्रतिनिधित्व करता है जिसकी तुलना जबड़े31में चतुर्थ श्रेणी के दोष से की जा सकती है। उद्देश्य अंतर्जात हड्डी दीवारों से किसी भी पार्श्व समर्थन के बिना, एक cortical क्षेत्र के ऊपर नई हड्डी विकसित करने के लिए है। मॉडल इस प्रकार अत्यंत कठोर है और हड्डी के cortical भाग पर ऊर्ध्वाधर अस्थिचालक की वास्तविक क्षमता का आकलन. यदि यहां वर्णित मॉडल मुख्य रूप से अस्थि विकल्प में अस्थिचालक के आकलन के लिए समर्पित है, अस्थिजनन और/या ऑस्टियोप्रेइंडेशन का भी मूल्यांकन किया जा सकता है, साथ ही वास्कुलोजेनेसिस1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.

नैतिक, व्यावहारिक और आर्थिक कारणों के लिए मूलतः, calvarial मॉडल खरगोश में विकसित किया गया था जिसमें हड्डी चयापचय और संरचना काफी प्रासंगिक हैं जब मानव32की तुलना में . ऊपर उद्धृत 30 संदर्भों में से 80% खरगोश कैलवरियल मॉडल1,2,3,4,5,6,7,8 का इस्तेमाल किया 9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, इस प्रकार इस पशु मॉडल की प्रासंगिकता का प्रदर्शन . 2008 में, Busenlechner समूह सुअर के लिए calvarial मॉडल स्थानांतरित, आठ हड्डी विकल्प की तुलना की अनुमति देने के लिए एक साथ20 (के रूप में खरगोश के साथ दो हड्डी विकल्प की तुलना में). दूसरी ओर, हमारे समूह ने खरगोश के कैल्वरियल मॉडल को भेड़ों को सौंप दिया। संक्षेप में, टाइटेनियम गुंबदों भेड़ खोपड़ी पर रखा गया था एक नया 3 डी मुद्रित हड्डी विकल्प के अस्थि चालक की विशेषता. इन अध्ययनों से हमें कालवारी मॉडल और उसके विश्लेषण16,21को विकसित और महारत हासिल हो गई .

पिछले तीन अध्ययनों में16,20,21, कई अन्य जांचों के साथ12,17,18,19,22का उल्लेख किया गया है, 23,24,26,27,28,29, कैल्वरियल मॉडल की महान क्षमता को स्क्रीनिंग और विशेषता के रूप में पुष्टि की मॉडल. हालांकि, भले ही प्राप्त परिणाम काफी संतोषजनक थे, वे भी कुछ सीमाओं की ओर इशारा किया: (1) टाइटेनियम गुंबदों का उपयोग, जो एक्स-रे प्रसार को रोका और बदले में रहते माइक्रो-सीटी उपयोग. ये हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग से पहले नहीं हटाया जा सका, शोधकर्ताओं को पॉली (मेथिल मेथाक्रिलेट) राल (पीएमएमए) में नमूनों को एम्बेड करने के लिए मजबूर किया गया। परिणामस्वरूप विश्लेषण इसलिए काफी हद तक स्थलाकृति तक सीमित थे. (2) उच्च वित्तीय लागत विशेष रूप से जानवरों की लागत की वजह से, और रसद, रखरखाव और जानवरों की सर्जरी से संबंधित लागत. (3) कठिनाइयों बड़े जानवरों के लिए नैतिक अनुमोदन प्राप्त करने के लिए.

पोलो, एट अल द्वारा हाल ही में एक अध्ययन, एट26 काफी हद तक खरगोश पर मॉडल में सुधार हुआ. टाइटेनियम गुंबदों closable सिलेंडर है कि सामग्री की एक निरंतर मात्रा के साथ भरा जा सकता है द्वारा प्रतिस्थापित किया गया. इनमें से चार सिलेंडर खरगोश की खोपड़ी पर रखे गए थे। पूरा होने पर, सिलेंडरों को हटाया जा सकता है ताकि बायोप्सी धातु मुक्त थे, नमूना प्रसंस्करण के विषय में और अधिक लचीलापन शुरू. खरगोश calvarial मॉडल कम लागत, आसान पशु से निपटने और नमूना प्रसंस्करण की सुविधा के साथ एक साथ परीक्षण के लिए आकर्षक बन गया। इन हाल के घटनाक्रम का लाभ उठाते हुए, हमने सिलेंडरों का उत्पादन करने के लिए पीक के साथ टाइटेनियम की जगह मॉडल में और सुधार किया है, जिससे एक्स-रे प्रसार और जीवित जानवरों पर माइक्रोटोमोग्राफी का उपयोग करने की अनुमति दी गई है।

इस लेख में, हम संज्ञाहरण और सर्जरी प्रक्रियाओं का वर्णन करेंगे और आउटपुट के उदाहरण दिखाएंगे जो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त किए जा सकते हैं, अर्थात, (प्रतिरक्षा-) ऊतक विज्ञान, हिस्टोमोर्होमट्री, लाइव और पूर्व विवो माइक्रोटोमोग्राफी हड्डी के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए पुनर्जनन और हड्डी स्थानापन्न सामग्री द्वारा समर्थित नई हड्डी संश्लेषण मात्रा.

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Protocol

स्विस कानूनी आवश्यकताओं के अनुसार, प्रोटोकॉल एक शैक्षिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और कैंटनल और संघीय पशु चिकित्सा एजेंसियों द्वारा निगरानी (प्राधिकरण n] जीई/

1. विशिष्ट उपकरणों और जानवरों

  1. सिलिन्डरों
    1. PEEK से बाहर पार्श्व स्थिर टैब के साथ मशीन सिलेंडर 5 मिमी के आंतरिक व्यास, 8 मिमी के बाहरी व्यास और 5 मिमी की ऊंचाई (चित्र 1)।
    2. सिलेंडर के शीर्ष पर ठीक क्लिप करने के लिए अनुमति देता है एक डिजाइन के साथ मशीन पीक टोपियां (मोटा ई मिमी).
    3. सर्जरी से पहले ऑटोक्लेविंग द्वारा पीक सिलेंडरों और कैप को स्टरलाइज़ करें।
  2. शिकंजा
    1. सिलेंडर (1.2 मिमी व्यास में, लंबाई में 4 मिमी) को ठीक करने के लिए स्वयं-ड्रिलिंग माइक्रो शिकंजा (वाणिज्यिक शुद्ध टाइटेनियम (ग्रेड 5) का उपयोग करें। सर्जरी से पहले autoclaving द्वारा बाँझ.
  3. जानवरों
    1. तीन महीने के न्यूजीलैंड सफेद खरगोश (पुरुष या महिला), वजन 2.5 किलो प्रत्येक खरीद.
      नोट: हम जिनेवा विश्वविद्यालय में प्रजनन द्वारा खरगोश प्राप्त की.

2. सर्जरी

  1. सर्जिकल ट्रे
    1. स्कैल्पल्स, कैंची, दो संदंश, पेरिओस्टल लिफ्ट, सीरिंज (1, 2, 5, 50 एमएल), सर्जिकल मोटर, राउंड सर्जिकल बर् (0.8 मिमी व्यास), सुइयों, बाँझ नमकीन, चार सिलेंडर, आठ शिकंजा, और पेचकश तैयार रखें।
  2. पूर्व नैदानिक उपचार
    1. सर्जरी से एक सप्ताह पहले जानवरों को अनुकूलित करें।
    2. सर्जरी के बाद 3 दिनों तक सर्जरी से पहले 2 एच शुरू करने वाले एक प्रोफेलेक्टिक एंटीबायोटिक दैनिक (5-10 मिलीग्राम/किग्रा मुंह से)) प्रदान करें।
  3. संज्ञाहरण और intubation
    1. केटामाइन (25 मिलीग्राम/एमएल, 0.5 एमएल/किलोग्राम) + जाइलाजिन (3 मिलीग्राम/किलोग्राम, 20 मिलीग्राम/एमएल, 0.15 एमएल/किलोग्राम) के इंट्रामस्क्युलर (आईएम) इंजेक्शन द्वारा पशुओं को अलग करें। जानवरों को सोने के लिए $ 20 मिनट प्रतीक्षा करें
      गहराई से (पूर्ण पेशी atony).
      नोट: यह premedication एक सरल, तेज और दर्द रहित intubation प्रक्रिया की अनुमति देगा. गहरी analgesia और संज्ञाहरण के रूप में कदम 2.3.8 में वर्णित प्रेरित है.
    2. कान से सीमांत नस में एक अंतःशिरा (IV) कैनुला रखें और इसे तब तक बंद रखें जब तक कि अंत:करण पूरा न हो जाए।
      नोट: यह चतुर्थ पंक्ति क्रमशः गहरी analgesia और संज्ञाहरण के लिए fentanyl और propofol perfuse करने के लिए सेवा करेंगे, (चरण 2.3.8 देखें).
    3. शुद्ध ऑक्सीजन में 5% sevoflurane की आपूर्ति द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखें जब तक intubation किया जाता है.
      नोट: यह कदम केवल तभी आवश्यक है जब जानवर जागृति के लक्षण (आंख आंदोलनों, मांसपेशियों के संकुचन) दिखाता है।
    4. 10% लिओकेन का छिड़काव करके स्थानीय रूप से श्वासनली को एनेस्थेटाइज करें। प्रवण स्थिति में खरगोश प्लेस और ऊर्ध्वाधर विस्तार में अपने सिर को बनाए रखने.
    5. खरगोश श्वासनली में छोटे व्यास (2.5 मिमी) की पहली एंडोट्रेकल ट्यूब स्लाइड जब तक airflow ट्यूब में सुना जा सकता है। यह गला खोलने के लिए और निश्चित ट्यूब की प्रविष्टि की सुविधा होगी.
    6. श्वासनली में ट्यूब की स्थिति को ठीक करने के लिए ट्यूब में एक गाइड (इंटूबेशन कैथेटर) डालें। छोटे व्यास ट्यूब निकालें और गाइड पर निश्चित endotracheal ट्यूब (4.9 मिमी) स्लाइड.
    7. गाइड निकालें और एंडोट्रेकल ट्यूब के अंत में गुब्बारे को सील और श्वासनली में डिवाइस को ब्लॉक करने के लिए फुलाना। ट्यूब जगह में रहना होगा, लेकिन यह माथे के चारों ओर बंधे एक फीता का उपयोग करके सुरक्षित किया जा सकता है।  शुद्ध ऑक्सीजन में 3% सेवोफ्लुरेन के साथ जानवर को तत्काल (7 एमएल/किलोग्राम, 40/मिनट की आवृत्ति) वेंटिलेटर करें।
    8. लगातार perfuse (कान की नस) fentanyl (0.01 mg/mL, 2-4 mL/h) analgesia प्रेरित करने के लिए, 2-4 मिलीग्राम / प्रोपोफोल (20 मिलीग्राम/एमएल, 4-8 एमएल/ज) संज्ञाहरण को प्रेरित करने के लिए, और इसो-खंडीय स्थितियों को बनाए रखने के लिए रिंगर की एसीटेट के 4 एमएल/केएच/
    9. एक गुदा तापमान जांच प्लेस. इसके अलावा पूरी प्रक्रिया के दौरान दिल समारोह, तापमान और ऑक्सीजन संतृप्ति की निगरानी।
    10. स्वायत्त श्वास की निगरानी के द्वारा संज्ञाहरण की गहराई को नियंत्रित; यदि जानवर स्वायत्त सांस लेने के लक्षण दिखाता है, propofol और fentanyl के एक छोटे से बोलस वितरित.
  4. साइट की तैयारी
    1. सर्जरी की मेज पर एक गद्दे पैड (जलसे से बचने के लिए) द्वारा कवर एक गर्म पैड (39 डिग्री सेल्सियस) पर खरगोश प्लेस। खोपड़ी दाढ़ी.
    2. जलन और सूखापन से बचने के लिए आंखों पर एक चिकनाई जेल लागू करें। पोविडोन आयोडीन (10%) के साथ त्वचा को स्क्रबिंग करके साइट को संक्रमित करें। फिर एक बाँझ शल्य चिकित्सा पर्दे के साथ खरगोश कपड़ा और खोपड़ी के लिए एक पहुँच क्षेत्र में कटौती।
    3. पोविडोन आयोडीन के साथ शल्य चिकित्सा साइट को संक्रमित करें (10%) दूसरी बार के लिए. जलन और सूखापन से बचने के लिए आंखों पर एक चिकनाई जेल लागू करें।
    4. एक ड्रेपटेबल (स्टीरटाइल ड्रेप) तैयार करें जिस पर पूरी सर्जिकल ट्रे रखें।
  5. सर्जिकल साइट खोलने
    1. खोपड़ी पर लिडोकेन 2% (1 एमएल) के एक नीचे के नीचे (एससी) इंजेक्शन के साथ स्थानीय स्तर पर एनेस्थेटाइज़ करें।
    2. त्वचा के माध्यम से Incise (एक स्केलपेल के साथ) calvarial sagittal लाइन के साथ, कक्षाओं से बाहरी पश्चकपाल protuberance के लिए (की लंबाई में 4 सेमी). सुनिश्चित करें कि पेरिओस्टेम incised है.
    3. चीरा के दोनों ओर धीरे से पेरिओस्टेम (एक पेरिओस्टील लिफ्ट के साथ) को ऊपर उठाना। बाँझ नमकीन के साथ साइट कुल्ला.
  6. सिलेंडर स्थानन
    1. खोपड़ी पर माध्यिका तथा कोरोनल टांके का पता लगाएँ (चित्र 2क, ख) ध्यान दें कि ये शारीरिक रेखाएँ एक क्रूस बनाती हैं। सिलेंडरों को क्रूस द्वारा परिभाषित प्रत्येक वृत्तक में रखा जाएगा, जिससे यह सुनिश्चित होगा कि बेलन का किनारा सीवन से अधिक नहीं है (चित्र 2ब्) ।
    2. बाएं ऊपरी वृत्त का चतुर्थ भाग (बाएं ललाट हड्डी) पर पहला सिलेंडर रखें, और डिवाइस फ्लैट बिछाने की कोशिश करें। मजबूत हाथ के दबाव के साथ स्थिति में ठीक करें और एक माइक्रो पेंच पेंच, जब तक प्रतिरोध महसूस किया है. सुनिश्चित करें कि पेंच सिर सिलेंडर टैब की सतह के साथ फ्लश है।
    3. खोपड़ी पर कसकर सिलेंडर को ठीक करने के लिए अन्य टैब पर एक ही प्रक्रिया को दोहराएँ। सुनिश्चित करें कि सिलेंडर हड्डी के लिए hermetically तय है.
    4. सही ऊपरी तिमाही (दाएं ललाट हड्डी) पर प्रक्रिया को दोहराएँ, निचले तिमाही (बाएं पार्श्विक हड्डी) और दाएं निचले तिमाही (दाएं पार्श्विक हड्डी) को छोड़ दिया।
  7. सिलेंडरों द्वारा परिवृत् त क्षेत्र के भीतर 5 इंट्रामेडुलरी होल की अस्थि ड्रिलिंग (चित्र 1)
    1. सिलेंडर द्वारा परिनिर्धारित क्षेत्र के केंद्र में, हड्डी पर एक गोल बर के साथ नमकीन सिंचाई (0.8 मिमी व्यास में, $ 1 मिमी गहराई) के तहत एक इंट्रामेडुलरी छेद ड्रिल करें। सुनिश्चित करें कि रक्तस्राव दिखाई देता है।
    2. सिलेंडर के भीतरी किनारों पर, दो टैब शिकंजा के माध्यम से गुजर अक्ष के साथ दो और इंट्रामेडुलरी छेद ड्रिल। सीधा कुल्हाड़ी के साथ, सिलेंडर के भीतरी किनारों पर दो और इंट्रामेडुलरी छेद ड्रिल. सुनिश्चित करें कि रक्तस्राव दिखाई देता है।
    3. तीन अन्य सिलेंडरों के भीतर कार्रवाई दोहराएँ.
  8. सामग्री के नमूनों और कैपिंग के साथ सिलेंडरों को भरना (चित्र 3)
    1. निर्माता निर्देश या सामग्री विनिर्देशों के अनुसार वांछित हड्डी स्थानापन्न सामग्री तैयार करें।
    2. सामग्री के नमूने के साथ सीमा के लिए पहले सिलेंडर भरें और टोपी फिटिंग द्वारा सिलेंडर बंद करें। 3 अन्य सिलेंडरों में प्रक्रिया को दोहराएँ.
  9. सर्जिकल साइट बंद
    1. सिलेंडरों के ऊपर त्वचा को विरामी गैर-रसोबल सीवन के साथ बंद कर लें।
    2. घाव पर एक स्प्रे करने योग्य ड्रेसिंग लागू करें।

3. पोस्ट सर्जिकल उपचार

  1. analgesia और संज्ञाहरण बंद करो (प्रोपोफोल और fentanyl भ्रम गिरफ्तारी) की आपूर्ति और स्वायत्त साँस लेने की वसूली की जाँच करें.
  2. एक बार पशु स्वायत्त साँस लेने में ठीक हो गया है वेंटिलेशन बंद करो. पूरी जागृति से पहले शुद्ध ऑक्सीजन के तहत पशु बनाए रखें।
  3. इंजेक्शन buprenorphine हाइड्रोक्लोराइड अनुसूचित जाति (0.02 mg/kg, 0.03 mg/mL, 0.67 एमएल/kg) इंजेक्शन हर 6 एच के लिए 3 दिनों के लिए पोस्ट सर्जिकल एनाल्जेसिया के रूप में दोहराएँ।
  4. पानी और पूर्ण भोजन के साथ अपने सामान्य आवास में पशु स्थानांतरण.
  5. घाव भरने के बारे में 10 दिनों के बाद टांके निकालें।

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Representative Results

यहाँ वर्णित मॉडल हड्डी के विकल्प में अस्थिचालक के आकलन के लिए समर्पित है. अस्थिजनन और अस्थि के अस्थिप्रेरण या अस्थि प्रतिस्थापन (पूर्व)कोशिकीकृत या जैव सक्रिय अणुओं से भरी हुई भी मूल्यांकन किया जा सकता है, साथ ही वाहिकाजनन1,2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30.एक गतिज अध्ययन का उपयोग किया जा सकता है, 3 दिनों से 3 महीने तक सर्जरी के बाद तंत्र और आउटपुट का विश्लेषण करने के लिए निर्भर करता है. जल्दी और मध्य समय में विवरण की अनुमति एक शास्त्रीय समय है: 2, 4, 6, 8 और 12 सप्ताह. ध्यान दें कि प्रति समय बिंदु 6 नमूनों की एक न्यूनतम महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए अनिवार्य है. प्रत्येक नमूने का परीक्षण किया जा करने के लिए समय बिंदु (यादृच्छिक आवंटन) प्रति खोपड़ी पर प्रत्येक स्थिति में कम से कम एक बार रखा जाना चाहिए। अंत में, शम नमूने (उदा., स्कंदित रक्त से भरे सिलेंडर) को प्रोटोकॉल34में शामिल करना होगा।

एक बार सर्जरी पूरा हो गया है, हड्डी के विकास जीवित जानवरों पर हड्डी टोमोग्राफी का उपयोग करके अलग अलग समय बिंदुओं पर नजर रखी जा सकती है। एक उदाहरण चित्र 4A,Bमें दिखाया गया है। अतिरिक्त विश्लेषण के लिए जानवरों का बलिदान करने की आवश्यकता होती है (घातक अंतःशिरा इंजेक्शन 150 मिलीग्राम/किलोग्राम पेंटोबार्बिटल (100 मिलीग्राम/एमएल)। इच्छामृत्यु के बाद, नमूनों को काट दिया जाता है और सिलेंडरों को सावधानी से हटा दिया जाता है (चित्र 5)। बायोप्सी फॉस्फेट-बफर ेड लवण और 4% फार्मेल्डिहाइड के विलयन के साथ स्थिर की जाती है। इसके बाद अस्थि वृद्धि का मूल्यांकन माइक्रोटोमोग्राफी द्वारा किया जा सकता है (चित्र 4 ब्, डी)। नमूने भी (प्रतिरक्षा-) हिस्टोलॉजिकल धुंधला के लिए संसाधित किया जा सकता है. हिस्टोमॉर्फेट्रिक विश्लेषण और विशिष्ट अभिरंजन तब अधिक विशेष रूप से विश्लेषण को पूरा करने के लिए संभव हैं (चित्र 6) ।

Figure 1
चित्र 1: PEEK सिलेंडरों के विनिर्देशों. दो छेद (0.8 मिमी व्यास में) पेंच के लिए पार्श्व स्थिर टैब पर drilled थे. सिलेंडर द्वारा सीमांकित क्षेत्र के भीतर खोपड़ी पर drilled करने के लिए 5 intramedullary छेद (0.8 मिमी व्यास में) की स्थिति लाल हलकों का उपयोग कर चिह्नित कर रहे हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: खरगोश खोपड़ी और सिलेंडरों की नियुक्ति के प्रतिनिधि छवि. खरगोश की खोपड़ी पर औसत और कोरोनल टांके दिखाने वाली तस्वीरें बाएं-दाएँ पार्श्विक और ललाट हड्डियों (,बी) को डिलिने जाती हैं। सीवनों के दोनों ओर सिलिंडरों की नियुक्ति (सी) स्केल बार्स ] 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: निश्चित, भरा और caped सिलेंडरों की प्रतिनिधि छवि. टाइटेनियम शिकंजा के साथ एक खरगोश की खोपड़ी पर तय चार सिलेंडर दिखा चित्र. प्रत्येक सिलेंडर द्वारा सीमांकित क्षेत्र के भीतर, 5 इंट्रामेडलरी होल (0.8 मिमी व्यास में, $ 1 मिमी गहराई में) हड्डी सेल प्रवास की अनुमति देने के लिए एक गोल बर के साथ सिंचाई के तहत drilled थे। सिलेंडर कैपिंग से पहले अलग हड्डी स्थानापन्न नमूने (कैलिब्रेटेड मात्रा) से भर रहे थे (एक बंद सिलेंडर केवल दिखाया गया है). स्केल बार - 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: माइक्रोटोमोग्राफिक (माइक्रो-सीटी) विश्लेषण से प्रतिनिधि छवियों। हड्डी के विकल्प द्वारा आयोजित हड्डी के विकास का आकलन करने के अंतिम लक्ष्य के साथ, 4 सिलेंडर टाइटेनियम शिकंजा के साथ एक खरगोश खोपड़ी पर तय किए गए थे और हड्डी स्थानापन्न सामग्री से भरा हुआ था। (ए) लाइव इमेजिंग: दो-आयामी अनुप्रस्थ स्कैन (14 मिनट, 99 केवी/88 डिग्रीए) एक बेलन के 20 डिग्री मी के संकल्प के साथ 12 सप्ताह में। (बी) तीन आयामी (3 डी) 4 सप्ताह में लाइव माइक्रो-सीटी विश्लेषण से पुनर्निर्माण (लाल वृत्त: सिलेंडरों में हड्डी विकल्प; लाल तीर: नियंत्रण जिसमें सिलेंडर स्कंदित रक्त से भर जाता है)। (सी,डी) इच्छामृत्यु (12 सप्ताह) के बाद, निर्धारण और माइक्रो-सीटी विश्लेषण से पहले सिलेंडरों को हटा दिया गया था। () 2D अनुप्रस्थ स्कैन (57 मि, 99 केवी/88 जेडए ) एक सिलेंडर के 10 डिग्री मी के संकल्प के साथ और बेलन में कुल नई हड्डी का 3 डी-पुनर्निर्माण (डी) . हड्डी स्थानापन्न कणों (लाल), नई हड्डी (हरी) और हड्डी बिस्तर (पीला) दिखाए जाते हैं। स्केल बार्स - 2 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: 4 सप्ताह में एक बायोप्सी के प्रतिनिधि छवियों. इच्छामृत्यु (4 सप्ताह) के बाद, नमूने ब्लॉक अनुभाग और सिलेंडर4% formalin, माइक्रो-सीटी विश्लेषण और हिस्टोलॉजिकल प्रसंस्करण में निर्धारण से पहले हटा दिया गया था. स्केल बार ] 5mm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: (प्रतिरक्षा-) के प्रतिनिधि चित्र। हड्डी के विकास और हड्डी के विकल्प द्वारा किए गए neovascularization का आकलन करने के लिए अंतिम लक्ष्य के साथ, 4 सिलेंडर टाइटेनियम शिकंजा के साथ एक खरगोश खोपड़ी पर तय किया गया और हड्डी के विकल्प से भरा. इच्छामृत्यु (12 सप्ताह) के बाद, निर्धारण और हिस्टोलॉजिकल प्रसंस्करण से पहले सिलेंडरों को हटा दिया गया था। (ए) मैसन-गोल्डनर धुंधला (50x): हड्डी स्थानापन्न हरे रंग में नई हड्डी से घिरे मावे कणों के रूप में प्रकट होता है। (ख) स्लाइसों को स्कैन किया गया और अस्थि स्थानापन्न सामग्री के डिजिटल निष्कर्षण के लिए संसाधित किया गया ताकि नई हड्डी (लाल) को आसानी से निर्धारित किया जा सके। (ग) सीडी31 (एरो), एंडोथेलियल कोशिकाओं का एक विशिष्ट मार्कर और नवसंवहनी प्रक्रिया का प्रतिरक्षण। (डी) एक अत्यधिक नवसंवहनी क्षेत्र का इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला (हरा) जिसमें कुछ नए केशिकाओं अत्यधिक CD31 (तीर) व्यक्त करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ वर्णित मॉडल सरल है और जब तक सभी चरणों का पालन कर रहे हैं और उपकरण उपयुक्त है के रूप में काफी आसानी से विकसित किया जाना चाहिए. प्रोटोकॉल वर्णित एक शल्य विधि है के रूप में, सभी चरणों महत्वपूर्ण दिखाई देते हैं और ठीक से पालन किया जाना चाहिए। यह पशु प्रयोगों के लिए प्रशिक्षित किया जा करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से खरगोश से निपटने और संज्ञाहरण में. पेशेवर एनेस्थेटिस्ट और पशु चिकित्सा मदद के लिए पूछने में संकोच न करें। सीवन हटाने से पहले और बाद में जानवरों की दैनिक दृश्य निगरानी पर जोर देना महत्वपूर्ण है। यहां तक कि अगर खोपड़ी से त्वचा मोटी, प्रचुर मात्रा में और ढीला है, सिलेंडरों के निर्धारण बड़े तनाव पैदा करता है। यदि टांके बहुत जल्दी हटा दिए जाते हैं, तो घाव फिर से खुल सकता है और एक और सप्ताह के suturing और एक नए एंटीबायोटिक उपचार की आवश्यकता होगी। घाव लाइन से बाहर dehiscence के मामले में, सर्जन अगर suturing संभव है या नहीं पर विचार करना होगा. यदि नहीं, तो नमूना अस्वीकृति पर विचार करना होगा.

प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित महत्वपूर्ण चरणों के अतिरिक्त, नीचे दिए गए विवरण इस प्रोटोकॉल के उचित कार्यान्वयन में सहायक हो सकते हैं. देखने के एक तकनीकी बिंदु से, के रूप में इस्तेमाल खरगोश युवा और छोटे हैं, यह एक दो कदम intubation का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है. दूसरा (और अंतिम) ट्यूब पहले intubation में इस्तेमाल किया जा करने के लिए बहुत बड़ा है, और वहाँ "गलत तरीका" कि हानिकारक या भी घातक हो सकता है की एक असली जोखिम है.
परीक्षण सामग्री के आधार पर, यह कान चतुर्थ लाइन है कि पहले से ही रखा गया है से कुछ ताजा रक्त का नमूना लेने के लिए दिलचस्प हो सकता है. यह प्राकृतिक कोशिकाओं और विकास कारकों के साथ हड्डी स्थानापन्न सामग्री पूर्व निवेश करने के लिए एक अच्छा तरीका प्रदान कर सकता है. ताजा स्कंदित रक्त भी एक आदर्श शर्म नमूना प्रदान कर सकते हैं.

जिस तरह से intramedullary छेद drilled कर रहे हैं भविष्य हिस्टोलॉजिकल प्रसंस्करण और histomorphometricविश्लेषण के लिए बहुत उपयोगी होना चाहिए. प्रभाव में, जब तक छेद हैं (i) एक ही स्थान में, (ii) बायोप्सी इसी तरह उन्मुख हैं और (iii) काटने की प्रक्रिया मानकीकृत है (यानी, एक ही मोटाई, एक ही कट स्तर), क्षेत्रों है कि मूल्यांकन कर रहे हैं बराबर हैं और उनकी तुलना अत्यधिक है उचित. मानकीकरण की बात के रूप में, यह सिलेंडर को भरने के लिए सामग्री की मात्रा मात्रा जांचना वास्तविक ब्याज की हो सकती है, और इसे अग्रिम में तैयार करने के लिए, एक बाँझ तरीके से।

एक वैज्ञानिक दृष्टिकोण से, उत्पादों या परिकल्पना का परीक्षण के आधार पर, यह हड्डी टांके पर सिलेंडर रखने से बचने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. कुछ विशिष्ट स्टेम कोशिकाओं इन संरचनाओं में मौजूद हैं35, mesenchymal हड्डी स्टेम कोशिकाओं है कि intramembranous ossification के तंत्र में शामिल हैं से अलग, अर्थात्, हड्डी पुनर्जनन प्रक्रिया orofacial क्षेत्र में सामना करना पड़ा. इसलिए, एक वास्तविक पूर्वाग्रह misplacement के मामले में हो सकता है.

calvarial मॉडल के प्रमुख लाभों में से एक लाइव माइक्रोटोमोग्राफी का उपयोग है जिसके द्वारा हड्डी के विकास को एक अनुदैर्घ्य अध्ययन के रूप में एक जानवर पर पालन किया जा सकता है। इस रणनीति को काफी हद तक euthanized जानवरों की संख्या को कम कर सकते हैं और इसलिए "3R नियम"36सम्मान करते हैं. इस्तेमाल किया microtomograph डिवाइस पर निर्भर करता है (संकल्प, पशु के लिए उपलब्ध स्थान), विविधताओं संज्ञाहरण की रणनीति के मामले में हो जाएगा (IV, गैस, आदि), साथ ही छवि संकल्प और जिसके परिणामस्वरूप विश्लेषण की प्रासंगिकता में.
हम नियमित रूप से नियमित जांच के लिए पशु प्रयोगों (उदाहरण के लिए, क्वांटम GX) के लिए समर्पित एक microtomograph का उपयोग करें. एक सामान्य प्रयोग एक sedation के साथ शुरू होता है, के रूप में चरण 2.3.1 में वर्णित है. संज्ञाहरण तो शुद्ध ऑक्सीजन में 2% आइसोफ्लुरेन के साथ बनाए रखा है. यह जानवर के बारे में 14 मिनट की एक स्कैनिंग समय के दौरान शांति से साँस लेने के लिए अनुमति देता है (99 केवी / यह बुनियादी मापदंडों की जांच के लिए पर्याप्त है (भ्रष्टाचार, सिलेंडर निर्धारण, हड्डी के विकास के अर्द्धमात्रात्थानीय विश्लेषण, आदि)। जब एक सटीक गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए देख रहे हैं, स्कैनिंग समय, संकल्प, संज्ञाहरण और पशु स्थिति का एक बहुत ठीक ट्यूनिंग की जरूरत होगी.

ऑस्टियोक्क्यूशन, ऑस्टियोजेनेसिस, ऑस्टियोप्रेनेंसिन के साथ-साथ वास्कुलोजेनेसिस के मूल्यांकन के लिए विकसित मौजूदा मॉडल, विशेष रूप से ओरोफैशियल क्षेत्र में कई हैं। नैतिक और आर्थिक विचारों के कारण, हमारा उद्देश्य खरगोश या छोटे जानवरों तक सीमित होगा। खोपड़ी के अलावा, जिन स्थानों में सामग्री का परीक्षण किया जा सकता है , वे हैं मांडीबुला37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, डायस्टेमा48 या तीक्ष्ण सॉकेट ( दांतों की निकासी के बाद )49,50,51. चूहे, चूहे, गिनी सूअरों और खरगोशों नीचे वर्णित मॉडलों में से प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संक्षेप में, एक महत्वपूर्ण दोष drilled है (या एक सॉकेट तीक्ष्ण निष्कर्षण द्वारा बनाई गई है), सामग्री के नमूने से भरा है और फिर एक झिल्ली द्वारा कवर किया. इसके अलावा स्पष्ट तथ्य यह है कि केवल दो नमूनों इन स्थानों में से प्रत्येक में परीक्षण किया जा सकता है (एक नमूना mandible पक्ष या प्रति तीक्ष्ण सॉकेट प्रति), शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को भी काफी हद तक अधिक कठिन और आक्रामक हैं. साइट तक पहुँच सीमित हैं और अगर एक चूहे या चूहों का उपयोग कर रहा है, कठिनाई आगे जानवरों के आकार से बढ़ जाती है. अंत में, दोषों के महत्वपूर्ण आकार (यानी, आयाम है कि एक सहज हड्डी पुनर्जनन की अनुमति नहीं है) अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है और एक जानवर से दूसरे में भिन्न होता है.
इन सामान्यताओं के अलावा, दोष के अधीन शारीरिक स्थान और बाद के विश्लेषण के आधार पर विशिष्ट बाधाएं उत्पन्न हो सकती हैं। एक उदाहरण के रूप में, mandibular मॉडल में, दांत जड़ें दोष के भीतर मौजूद हैं. यह सामग्री के साथ हस्तक्षेप और हड्डी पुनर्जनन प्रक्रिया को संशोधित कर सकते हैं. दोष रैमस पर अधिक distally रखा जा सकता है, लेकिन उस मामले में, हड्डी बहुत पतली हो जाएगा (दो corticals एक अत्यंत पतली मज्जा अंतरिक्ष के साथ चिपका) और जिसके परिणामस्वरूप दोष की मात्रा बहुत छोटा हो सकता है45,46, 47.सीमाओं के इन उदाहरणों को देखते हुए और मॉडल के आधार पर, सामग्री की मात्रा का परीक्षण, गुणवत्ता और एकत्र किए गए डेटा की मात्रा के संदर्भ में बड़े विचलनों का अनुमान लगाया जा सकता है।

एक सामग्री के मूल्यांकन मानकीकरण और अंशांकन की एक अधिकतम की आवश्यकता के रूप में, calvarial मॉडल आदर्श प्रकट होता है. प्रवेश बहुत आसान है, अंशांकन और मानकीकरण परिभाषित सिलेंडरों के उपयोग से मदद कर रहे हैं और 4 नमूने एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है. इसके अलावा, लाइव टोमोग्राफी का इस्तेमाल किया जा सकता है और अंत में जानवरों में एक बड़ी कमी इच्छामृत्यु होने का अनुमान लगाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों Geistlich एजी के ऋणी हैं (Wolhusen, CH) और अस्थिविज्ञान नींव (Lucerne, CH) (अनुदान n $18-049) उनके समर्थन के लिए, साथ ही साथ ग्लोबल डी (ब्रिगनिस, एफआर) शिकंजा प्रदान करने के लिए. एक विशेष धन्यवाद Geistlich से डॉ बी शेफ़र को जाता है. हम भी उनके उत्कृष्ट हिस्टोलॉजिकल प्रसंस्करण और उनके कीमती सलाह के लिए Eliane Dubois और क्लेयर Herrmann के लिए आभारी हैं. अंत में, हम गर्मजोशी से जेवियर बेलिन, सिल्वी रूलेट और Pr Walid Habre की पूरी टीम, "प्रयोगात्मक सर्जरी Dpt", उनके उल्लेखनीय तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10% Bayer Antibiotic
Fentanyl Bischel For analgesia
Ketalar 50mg/ml Pfizer Ketamine for anesthesia
Lidohex Bichsel Lubricating gel for the eyes
Opsite Smith and Nephew 66004978 Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine Mundipharma anti-infective agent
Propofol 2% Braun 3538710 For anesthesia
Rapidocain 2% sintetica Local anesthesia
Ringer-acetate Fresenius Kabi Volume compensation
Rompun 2% Bayer Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5% Abbvie For anesthesia
Sterile saline Sintetica
Temgesic Reckitt Benckiser Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa Ospediala For anesthesia
Xylocaine 10% spray Astra Zeneca For intubation
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C Imexmed Infusion pump
Heated pad Harvard Apparatus
Suction dominant 50 Medela
Suction tubing Optimus Promedical 80342.2
Surgical motor Schick dental Qube Drilling of intramedullary holes
Ventilation Maquet Servo1
Name Company Catalog Number Comments
Material
Cylinders and caps Boutyplast Customized composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft GlobalD ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft GlobalD MTM
Self- drilling screws GlobalD VA1.2KL4 cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm Covidien 86233 For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm Covidien 107-35G For intubation
Ethicon prolene 4-0 Ehticon 8581H Non-resorbable suture
Forceps Marcel Blanc BD027R 145 mm
Intubation catheter Cook medical Guide for intubation
Needlle holder Marcel Blanc BM008R
Needles BD Microlance3 Becton Dickinson 300300/304622 26G; 18G
Periosteal HU-Friedy P9X
Round surgical burs Patterson 78000 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel Swann-Morton n°10 and n°15
Scissors Marcel Blanc 00657 180 mm
Syringes Omnifix Braun 4616057V 5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22 Braun 42690985-01 Vasofix safety for the ear iv line

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References

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