Modelo calvarial de aumento ósseo em coelho para avaliação do crescimento ósseo e neovascularização em materiais de substituição óssea

Bioengineering

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Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo cirúrgico nos coelhos com o objetivo avaliar materiais da substituição do osso nos termos de capacidades da regeneração do osso. Usando cilindros PEEK fixados em crânios de coelhos, osteocondução, osteoindução, osteogênese e vasculogênese induzida pelos materiais podem ser avaliados tanto em animais vivos ou eutanasiados.

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Marger, L., Barone, A., Martinelli-Kläy, C. P., Schaub, L., Strasding, M., Mekki, M., Sailer, I., Scherrer, S. S., Durual, S. Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials. J. Vis. Exp. (150), e59976, doi:10.3791/59976 (2019).

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Abstract

O princípio básico do modelo calvarial coelho é crescer novo tecido ósseo verticalmente em cima da parte cortical do crânio. Este modelo permite a avaliação de materiais de substituição óssea para a regeneração óssea oral e craniofacial em termos de crescimento ósseo e suporte de neovascularização. Uma vez que os animais são anestesiados e ventilados (intubação endotraqueal), quatro cilindros feitos de éter cetona de poliéter (PEEK) são parafusados no crânio, em ambos os lados das suturas mediana e coronal. Cinco furos Intramedullary são perfurados dentro da área do osso delimitada por cada cilindro, permitindo o afluxo de pilhas da medula. As amostras de material são colocadas nos cilindros que são fechados então. Finalmente, o local cirúrgico é suturado, e os animais são despertares. O crescimento ósseo pode ser avaliado em animais vivos usando microtomografia. Uma vez que os animais são eutanasiados, o crescimento ósseo e a neovascularização podem ser avaliados por meio de microtomografia, imunofluorescência e imunohistologia. Como a avaliação de um material exige a padronização e a calibração máximas, o modelo calvarial parece ideal. O acesso é muito fácil, a calibração e a padronização são facilitadas pelo uso de cilindros definidos e quatro amostras podem ser avaliadas simultaneamente. Além disso, a tomografia ao vivo pode ser usada e, finalmente, uma grande diminuição nos animais a serem eutanasiados pode ser antecipada.

Introduction

O modelo calvarial de aumento ósseo foi desenvolvido na 90 ' s com o objetivo de otimizar o conceito de regeneração óssea guiada (GBR) no domínio cirúrgico oral e craniofacial. O princípio básico deste modelo é crescer o tecido ósseo novo verticalmente em cima da parte cortical do crânio. Para isso, um reator (por exemplo, titânio-cúpula,-cilindro ou gaiola) é fixado no crânio para proteger a regeneração óssea conduzida por um enxerto (por exemplo, hidrogel, substituto ósseo, etc.). Com o auxílio deste modelo, gaiolas de titânio ou cerâmica1,2,3,4,5,6, membranas GBR7,8,9 ,10, fatores osteogênicos11,12,13,14,15,16,17, osso novo substitutos12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 anos de , 29 ou o mecanismo de neovascularização durante o processo de regeneração óssea30 foram avaliados.

Do ponto de vista translacional, o modelo calvarial representa um defeito de uma parede que pode ser comparado a um defeito de classe IV na mandíbula31. O objetivo é crescer o osso novo acima de uma área cortical, sem nenhum apoio lateral das paredes endógenas do osso. O modelo é assim extremamente estrito e avalia o potencial real da osteocondução vertical sobre a parte cortical do osso. Se o modelo aqui descrito se dedica principalmente à avaliação da osteocondução em substitutos ósseos, a osteogênese e/ou a osteoindução também podem ser avaliadas, bem como a vasculogênese1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.

Essencialmente para razões éticas, práticas e econômicas, o modelo calvarial foi desenvolvido no coelho em que o metabolismo e a estrutura do osso são completamente relevantes quando comparado ao32humano. Das 30 referências citadas acima, 80% utilizaram o modelo calvarial de coelho1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, demonstrando assim a relevância deste modelo animal. Em 2008, o grupo Busenlechner transferiu o modelo calvarial para o porco, para permitir a comparação de oito substitutos ósseos simultaneamente20 (em comparação com dois substitutos ósseos com o coelho). Por outro lado, nosso grupo transferiu o modelo calvarial de coelhos para ovelhas. Em resumo, as abóbadas Titanium foram coloc em crânios dos carneiros para caracterizar o osteocondução de um substituto 3D-impresso novo do osso. Esses estudos nos permitiram desenvolver e dominar o modelo calvarial e sua análise16,17.

Os três últimos estudos citados16,20,21, juntamente com várias outras investigações12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, confirmaram o grande potencial do modelo calvarial como uma triagem e caracterização Modelo. Entretanto, embora os resultados obtidos tenham sido bastante satisfatórios, também apontaram algumas limitações: (1) o uso de abóbadas de titânio, que impediram a difusão de raios X e, por sua vez, o uso de microtc ao vivo. Estes não puderam ser removidos antes do processamento histológico, forçando os pesquisadores a incorporar as amostras em resina poli (metacrilato de metilo) (PMMA). As análises resultantes foram, portanto, largamente limitadas à topografia. (2) custos financeiros elevados, especialmente devido ao custo dos animais, e custos relacionados com a logística, manutenção e cirurgia dos animais. (3) dificuldades para obter aprovações éticas para grandes animais.

Um estudo recente de Polo, et al.26 melhorou em grande parte o modelo no coelho. As abóbadas Titanium foram substituídas por cilindros closable que poderiam ser enchidas com um volume constante de material. Quatro destes cilindros foram colocados em crânios de coelhos. Na conclusão, os cilindros podiam ser removidos de modo que as biópsias fossem metal-livres, introduzindo muito mais flexibilidade a respeito do processamento da amostra. O modelo calvarial do coelho tornou-se atrativo para o teste simultâneo com uns mais baixos custos, manipulação animal fácil e facilitação do processamento da amostra. Aproveitando-se destes desenvolvimentos recentes, nós melhoramos mais o modelo substituindo o titânio com o auge para produzir cilindros, permitindo desse modo a difusão do raio X e o uso do microtomografia em animais vivos.

Neste artigo, descreveremos os processos de anestesia e cirurgia e mostraremos exemplos de saídas que podem ser obtidas utilizando este protocolo, ou seja, (imuno-) histologia, Histomorfometria, microtomografia ao vivo e ex vivo para avaliar os mecanismos do osso regeneração e quantificar a nova síntese óssea apoiada por materiais substitutos ósseos.

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Protocol

Em consonância com as exigências jurídicas suíças, o protocolo foi aprovado por um comitê acadêmico e supervisionado pelas agências veterinárias cantonal e federal (autorizações n ° GE/165/16 e GE/100/18).

1. dispositivos e animais específicos

  1. Cilindros
    1. Cilindros de máquina com abas estabilizadoras laterais de PEEK para ter diâmetro interno de 5 mm, diâmetro externo de 8 mm e uma altura de 5 mm (Figura 1).
    2. Tampas do PEEK da máquina com um projeto que permite o grampo precisamente na parte superior do cilindro (espessura 1 milímetro).
    3. Esterilize cilindros e tampões do auge por autoclavagem antes da cirurgia.
  2. Parafusos
    1. Use parafusos micro de perfuração própria (feitos de titânio comercial puro (grau 5)) para fixar os cilindros (1,2 mm de diâmetro, 4 mm de comprimento). Esterilizar por autoclavagem antes da cirurgia.
  3. Animais
    1. Compre coelhos brancos da Nova Zelândia com três meses de idade (masculino ou feminino), pesando ~ 2,5 kg cada.
      Nota: obtivemos coelhos por reprodução na Universidade de Genebra.

2. cirurgia

  1. Bandeja cirúrgica
    1. Mantenha bisturis, tesouras, dois fórceps, elevador periosteal, seringas (1, 2, 5, 50 mL), motor cirúrgico, brocas cirúrgicas redondas (diâmetro de 0,8 milímetros), agulhas, soro fisiológico estéril, quatro cilindros, oito parafusos, e chave de fenda pronta.
  2. Tratamento pré-clínico
    1. ACCLIMATE os animais uma semana antes da cirurgia.
    2. Forneça um antibiótico profiláctico diário (5 – 10 mgs/quilograma pela boca (PO)) que começa 2 h antes da cirurgia até 3 dias após a cirurgia.
  3. Anestesia e intubação
    1. Sedate os animais por injeção intramuscular (IM) de cetamina (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) + xilazina (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Aguarde ~ 20 min para os animais dormirem
      profundamente (atonia muscular completa).
      Nota: esta pré-medicação permitirá um processo de intubação simples, rápido e indolor. A analgesia profunda e a anestesia são induzidas conforme descrito na etapa 2.3.8.
    2. Coloque uma cânula intravenosa (IV) na veia marginal da orelha e mantenha-a fechada até que a intubação seja completada.
      Nota: esta linha IV servirá para perfuse fentanil e propofol para analgesia profunda e anestesia, respectivamente (ver passo 2.3.8).
    3. Mantenha a anestesia fornecendo sevoflurano a 5% em oxigênio puro até que a intubação seja realizada.
      Nota: este passo é necessário apenas se o animal mostra sinais de despertar (movimentos oculares, contrações musculares).
    4. Anestesie a traquéia localmente por pulverização de lidocaína a 10%. Coloque o coelho em posição prona e manter a cabeça na extensão vertical.
    5. Deslize o primeiro tubo endotraqueal de pequeno diâmetro (2,5 mm) na traquéia do coelho até que o fluxo de ar possa ser ouvido no tubo. Isto abrirá a laringe e facilitará a inserção do tubo definitivo.
    6. Insira um guia (cateter de intubação) no tubo para fixar a posição do tubo na traqueia. Retire o tubo de diâmetro pequeno e deslize o tubo endotraqueal definitivo (4,9 mm) na guia.
    7. Retire a guia e inflar o balão no final do tubo endotraqueal para selar e bloquear o dispositivo na traquéia. O tubo vai ficar no lugar, mas pode ser fixado usando um laço amarrado ao redor da testa.  Ventilar imediatamente (7 mL/kg, frequência de 40/min) o animal com sevoflurano 3% em oxigénio puro.
    8. Perfuse continuamente (veia da orelha) fentanil (0, 1 mg/ml, 2 – 4 ml/h) para induzir a analgesia, 2 – 4 MGS/quilograma de (2%) propofol (20 mg/mL, 4 – 8 mL/h) para induzir anestesia e 4 mL/kg/h de acetato de Ringer para manter as condições ISO-volumétricas.
    9. Coloque uma sonda de temperatura retal. Também monitorar a função cardíaca, temperatura e saturação de oxigênio durante todo o processo.
    10. Controlar a profundidade da anestesia através da monitorização da respiração autónoma; Se o animal mostrar sinais de respiração autônoma, dispense um pequeno bolus de propofol e fentanil.
  4. Preparação do site
    1. Coloc o coelho em uma almofada aquecida (39 ° c) coberta por uma almofada de colchão (para evitar queimaduras) na tabela da cirurgia. Raspar o couro cabeludo.
    2. Aplique um gel lubrificante nos olhos para evitar irritação e secura. Desinfete o sítio esfregando a pele com iodo povidona (10%). Em seguida, Drape o coelho com uma cortina cirúrgica estéril e cortar uma área de acesso para o crânio.
    3. Desinfete o local cirúrgico com iodo povidona (10%) pela segunda vez. Aplique um gel lubrificante nos olhos para evitar irritação e secura.
    4. Prepare uma mesa drapeada (estéril drapeje) em que para coloc a bandeja cirúrgica completa.
  5. Abertura cirúrgica do local
    1. Anestesie localmente com uma injeção subcutânea (SC) de lidocaína 2% (1 mL) no crânio.
    2. Incise através da pele (com um bisturi) ao longo da linha sagital calvarial, das órbitas à Protuberância occipital externa (~ 4 cm de comprimento). Assegure-se de que o periósteo seja incitado.
    3. Elevar suavemente o periósteo (com um elevador periosteal) em ambos os lados da incisão. Enxague o local com soro fisiológico estéril.
  6. Colocação do cilindro
    1. Localize as suturas mediana e coronal no crânio (Figura 2a, B). Note-se que estas linhas anatômicas formam uma cruz. Os cilindros serão colocados em cada um dos quadrantes definidos pela Cruz, assegurando que a borda do cilindro não esteja sobre a sutura (Figura 2C).
    2. Coloque o primeiro cilindro no quadrante superior esquerdo (osso frontal esquerdo) e tente colocar o dispositivo plano. Fixar na posição com forte pressão da mão e aparafusar um micro-parafuso, até que a resistência é sentida. Assegure-se de que a cabeça do parafuso esteja nivelada com a superfície da aba do cilindro.
    3. Repita o mesmo procedimento na outra guia para fixar o cilindro firmemente sobre o crânio. Assegure-se de que o cilindro esteja fixado hermeticamente ao osso.
    4. Repita o procedimento no trimestre superior direito (osso frontal direito), trimestre inferior esquerdo (osso parietal esquerdo) e trimestre inferior direito (osso parietal direito).
  7. Perfuração óssea de 5 furos intramedulares dentro da área circunscritas pelos cilindros (Figura 1)
    1. Perfure um furo Intramedullary a irrigação salina (0,8 milímetros no diâmetro, ~ 1 milímetro na profundidade) com uma broca redonda no osso, no centro da área circunscritas pelo cilindro. Assegure-se de que o sangramento apareça.
    2. Perfure mais dois furos intramedulares ao longo do eixo que passa pelos dois parafusos de tabulação, nas bordas internas do cilindro. Ao longo do machado perpendicular, perfure mais dois furos Intramedullary nas bordas internas do cilindro. Assegure-se de que o sangramento apareça.
    3. Repita a operação dentro dos três outros cilindros.
  8. Cilindros de enchimento com amostras de material e tampagem (Figura 3)
    1. Prepare o material substituto ósseo desejado de acordo com as instruções do fabricante ou as especificações do material.
    2. Encha o primeiro cilindro até a borda com a amostra de material e feche o cilindro ajustando a tampa. Repita o processo nos 3 outros cilindros.
  9. Fechamento cirúrgico do local
    1. Feche a pele acima dos cilindros com uma sutura não reabsorvível intermitente.
    2. Aplique um curativo pulverizáveis na ferida.

3. tratamento pós-cirúrgico

  1. Pare a analgesia e a anestesia (apreensão da perfusão do propofol e do fentanil) e verific a recuperação da respiração autônoma.
  2. Pare a ventilação uma vez que o animal recuperou a respiração autônoma. Manter o animal oxigênio puro antes do despertar completo.
  3. Injete o cloridrato de buprenorfina SC (0, 2 mg/kg, 0, 3 mg/mL, 0,67 mL/kg) e repita a injeção a cada 6 h durante 3 dias como analgesia pós-cirúrgica.
  4. Transfira o animal para a sua habitação habitual com água e alimentação completa.
  5. Retire as suturas após cerca de 10 dias de cicatrização de feridas.

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Representative Results

O modelo aqui descrito dedica-se à avaliação da osteocondução em substitutos ósseos. Osteogénese e-ou osteoindução de substitutos ósseos (pre-) Cellularized ou carregado com as moléculas bioativos podem igualmente ser avaliados, assim como o vasculogênese1,2,3,4, 5. º , 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9 anos de , 10 de , 11 anos de , 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de , 15 anos de , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 anos de , 29. º , 30. um estudo cinético pode ser utilizado, a partir de 3 dias até 3 meses após a cirurgia, dependendo dos mecanismos e saídas a serem analisadas. Uma cronologia clássica que permite descrições no início e no meio do tempo é: 2, 4, 6, 8 e 12 semanas. Note-se que um mínimo de 6 amostras por ponto de tempo é obrigatório para obter resultados significativos. Cada amostra a ser testada precisa ser colocada pelo menos uma vez em cada posição para o crânio por ponto de tempo (alocação aleatória). Finalmente, as amostras Sham (por exemplo, cilindros cheios de sangue coagulado) devem ser incluídas no protocolo34.

Uma vez que a cirurgia é terminada, o crescimento do osso pode ser monitorado em pontos diferentes do tempo usando a tomografia óssea em animais vivos. Um exemplo é mostrado na figura 4a, B. A análise adicional exige que os animais sejam sacrificados (injeção intravenosa letal de 150 mg/kg de pentobarbital (100 mg/mL). Após a eutanásia, as amostras são seccionadas e os cilindros são cuidadosamente removidos (Figura 5). As biópsias são fixadas com solução de soro fisiológico tamponado com fosfato e formaldeído a 4%. O crescimento ósseo pode ser avaliado por meio de microtomografia (Figura 4 C, D). As amostras também podem ser processadas para (imune-) coloração histológica. A análise histomorfométrica e os colorações específicos são, então, possíveis para completar a análise mais especificamente (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: especificações dos cilindros Peek. Dois furos (0,8 mm de diâmetro) foram perfurados nas abas estabilizadoras laterais para parafusar. As posições dos 5 furos Intramedullary (0,8 milímetros no diâmetro) a ser perfuradas no crânio dentro da área delimitada pelo cilindro são marcadas usando círculos vermelhos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: imagem representativa do crânio do coelho e colocação dos cilindros. Imagens mostrando as suturas mediana e coronal no crânio do coelho delineando os ossos parietal e frontal esquerdo-direito (a,B). Colocação dos cilindros em ambos os lados das suturas (C). Barras de escala = 5 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: imagem representativa dos cilindros fixos, preenchidos e tampados. Retrato que mostra quatro cilindros reparados no crânio de um coelho com parafusos Titanium. Dentro da área delimitada por cada cilindro, 5 furos intramedulares (0,8 mm de diâmetro, ~ 1 mm de profundidade) foram perfurados irrigação com uma broca redonda para permitir a migração de células ósseas. Os cilindros foram preenchidos com diferentes amostras de substitutos ósseos (volumes calibrados) antes da tampagem (um cilindro fechado só é mostrado). Barra de escala = 5 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: imagens representativas da análise microtomográfica (micro-TC). Com o objetivo final de avaliar o crescimento ósseo conduzido por substitutos ósseos, 4 cilindros foram fixados sobre um crânio de coelho com parafusos de titânio e preenchidos com materiais substitutos ósseos. (A) imagem latente viva: varredura transversal bidimensional (14 minutos, 99 kV/88 μA com uma definição de 20 μm) de um cilindro em 12 semanas. (B) reconstrução tridimensional (3D) da análise de microtc ao vivo em 4 semanas (círculos vermelhos: substitutos ósseos em cilindros; seta vermelha: controle no qual o cilindro é preenchido com sangue coagulado). (C,D) Após a eutanásia (12 semanas), os cilindros foram removidos antes da fixação e da análise do microtc. (C) 2D varredura transversal (57 min, 99 kV/88 μA com uma definição de 10 μm) de um cilindro e 3D-reconstrução do osso novo total no cilindro (D). Partículas de substitutos ósseos (vermelho), novo osso (verde) e leito ósseo (amarelo) são mostrados. Barras de escala = 2 mm por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: imagens representativas de uma biópsia em 4 semanas. Após eutanásia (4 semanas), as amostras foram seccionadas em bloco e os cilindros foram removidos antes da fixação em formalina a 4%, análise de microtc e processamento histológico. Barra de escala = 5mm. Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: retratos representativos de seções histológicas (imunes). Com o objetivo final de avaliar o crescimento ósseo e a neovascularização conduzida por substitutos ósseos, 4 cilindros foram fixados sobre um crânio de coelho com parafusos de titânio e preenchidos com substitutos ósseos. Após a eutanásia (12 semanas), os cilindros foram removidos antes da fixação e do processamento histológico. (A) coloração de Masson-Goldner (50x): o substituto ósseo aparece como partículas malvas rodeadas por um novo osso em verde. (B) as fatias foram escaneadas e processadas para extração digital de material substituto ósseo para que o novo osso (vermelho) pudesse ser facilmente quantificado. (C) IMUNOCOLORAÇÃO de CD31 (setas), um marcador típico de células endoteliais e o processo de neovascularização. (D) coloração imunofluorescente (verde) de uma zona altamente córneas em que alguns capilares novos altamente expressam CD31 (seta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O modelo aqui descrito é simples e deve ser desenvolvido com bastante facilidade, desde que todos os passos sejam seguidos e o equipamento seja adequado. Como o protocolo descrito é um método cirúrgico, todas as etapas aparecem críticas e devem ser seguidas corretamente. É fundamental ser treinado para experimentos com animais, especialmente em manuseio de coelhos e anestesia. Não hesite em pedir anestesista profissional e ajuda veterinária. É crítico insistir na monitoração Visual diária dos animais antes e depois da remoção da sutura. Mesmo que a pele do crânio seja grossa, abundante e solta, a fixação dos cilindros induz grandes tensões. Se as suturas são removidas muito cedo, a ferida pode reabrir e exigirá mais uma semana de sutura e um novo tratamento antibiótico. Em caso de deiscência fora da linha da ferida, o cirurgião terá que considerar se a sutura é possível ou não. Se não, a rejeição da amostra terá que ser considerada.

Além das etapas críticas descritas na seção de protocolo, os detalhes abaixo podem ser úteis na implementação adequada deste protocolo. Do ponto de vista técnico, como os coelhos utilizados são jovens e pequenos, é importante utilizar uma intubação em duas etapas, conforme descrito no protocolo. O segundo (e final) tubo é muito grande para ser usado na primeira intubação, e há um risco real de "maneira errada" que pode ser deletério ou mesmo fatal.
Dependendo dos materiais testados, pode ser interessante tomar alguma amostra de sangue fresca da linha de orelha IV que já está colocada. Isso poderia fornecer um bom método para pré-inutilizar o material substituto ósseo com células naturais e fatores de crescimento. Sangue recém-coagulado também pode fornecer uma amostra de Sham ideal.

A maneira que os furos Intramedullary são perfurados deve ser muito útil para o processamento histológico futuro e a análise histomorphométrica. Com efeito, desde que os orifícios sejam (i) no mesmo local, (II) as biópsias são igualmente orientadas e (III) o processo de corte é padronizado (ou seja, a mesma espessura, o mesmo nível de corte), os campos que são avaliados são equivalentes e sua comparação é altamente Pertinentes. Como uma questão de padronização, pode ser de interesse real para calibrar o volume-quantidade de material para encher o cilindro, e para prepará-lo com antecedência, de forma estéril.

Do ponto de vista científico, dependendo dos produtos ou hipóteses testadas, pode ser importante evitar colocar os cilindros em suturas ósseas. Algumas células-tronco específicas estão presentes nessas estruturas35, diferentes das células-tronco mesenquimais do osso que estão envolvidas nos mecanismos de ossificação intramembranosa, ou seja, o processo de regeneração óssea encontrado na área orofacial. Portanto, um viés real pode ocorrer em caso de má colocação.

Uma das principais vantagens do modelo calvarial é o uso de microtomografia ao vivo pelo qual o crescimento ósseo pode ser seguido em um único animal como um estudo longitudinal. Esta estratégia pode, em grande medida, reduzir o número de animais eutanasiados e, por conseguinte, respeitar a "regra 3R"36. Dependendo do dispositivo microtomográfico utilizado (resolução, espaço disponível para o animal), variações ocorrerão em termos de estratégia de anestesia (IV, gás, etc.), bem como na resolução da imagem e na relevância da análise resultante.
Utilizamos rotineiramente um microtomografo dedicado a experimentos com animais (por exemplo, Quantum GX) para verificações de rotina. Um experimento típico começa com uma sedação, conforme descrito na etapa 2.3.1. A anestesia é então mantida com isoflurano a 2% em oxigênio puro. Isto permite que o animal respire calmamente durante um tempo de digitalização de cerca de 14 min (99 kV/88 μA com uma resolução de 20 μm); Isto é suficiente para verificar os parâmetros básicos (Engraftment, fixação do cilindro, análise semiquantitativa do crescimento ósseo, etc.). Ao procurar uma análise qualitativa e quantitativa precisa, uma sintonia muito fina do tempo de digitalização, resolução, anestesia e posicionamento animal será necessária.

Os modelos existentes desenvolvidos para o Assessement do osteocondução, da osteogénese, do osteoindução assim como do vasculogenesis, são numerosos, especial no campo orofacial. Devido a considerações éticas e econômicas, nosso objetivo será limitado a coelhos ou animais menores. Além do crânio, os locais em que o material pode ser testado são os mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, o diastema48 ou os soquetes incisivos (após a extração dos dentes)49,50,51. Ratos, camundongos, cobaias e coelhos podem ser usados para cada um dos modelos descritos abaixo. Resumidamente, um defeito crítico é perfurado (ou um soquete é criado por extração incisiva), preenchido com a amostra de material e, em seguida, coberto por uma membrana. Aparte do fato óbvio que somente duas amostras podem ser testadas em cada um destes locais (uma amostra por o lado do mandíbula ou por o soquete incisiva), os procedimentos cirúrgicos são igualmente pela maior parte mais difíceis e invasivos. Os acessos ao local são limitados e se um estiver usando o rato ou os ratos, a dificuldade é aumentada mais pelo tamanho dos animais. Finalmente, o tamanho crítico dos defeitos (i.e., dimensões que não permitem uma regeneração óssea espontânea) não é bem definido e varia de um animal para outro.
Além destas Generalidades, as limitações específicas podem levantar-se dependendo da posição anatômica sujeitada ao defeito e à análise subseqüente. Como exemplo, no modelo mandibular, as raízes dos dentes estão presentes dentro do defeito. Isso pode interferir com o material e modificar o processo de regeneração óssea. O defeito poderia ser coloc mais distalmente no ramus, mas nesse caso, o osso seria muito fino (dois corticais afixados com um espaço medular extremamente fino) e o volume resultante do defeito pode ser demasiado pequeno45,46, 47. tendo em conta estes exemplos de limitações e dependendo do modelo, podem ser antecipados grandes desvios em termos de volume de material a ser testado, qualidade e quantidade de dados recolhidos.

Como a avaliação de um material requer um máximo de padronização e calibração, o modelo calvarial parece ideal. O acesso é muito fácil, a calibração e a padronização são facilitadas pelo uso de cilindros definidos e 4 amostras podem ser avaliadas simultaneamente. Além disso, a tomografia ao vivo pode ser usada e, finalmente, uma grande diminuição nos animais a serem eutanasiados pode ser antecipada.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores estão endividados com Geistlich AG (Wolhusen, CH) e a Fundação de Osteologia (Lucerna, CH) (Grant n ° 18-049) por seu apoio, bem como global D (Brignais, FR) para fornecer os parafusos. Um agradecimento especial vai para o Dr. B. Schaefer de Geistlich. Agradecemos também a eliane Dubois e a Claire Herrmann pelo seu excelente processamento histológico e pelos seus preciosos conselhos. Finalmente, reconhecemos calorosamente Xavier Belin, Sylvie Roulet e toda a equipe de PR Walid Habre, "cirurgia experimental DPT", por sua notável assistência técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10% Bayer Antibiotic
Fentanyl Bischel For analgesia
Ketalar 50mg/ml Pfizer Ketamine for anesthesia
Lidohex Bichsel Lubricating gel for the eyes
Opsite Smith and Nephew 66004978 Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine Mundipharma anti-infective agent
Propofol 2% Braun 3538710 For anesthesia
Rapidocain 2% sintetica Local anesthesia
Ringer-acetate Fresenius Kabi Volume compensation
Rompun 2% Bayer Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5% Abbvie For anesthesia
Sterile saline Sintetica
Temgesic Reckitt Benckiser Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa Ospediala For anesthesia
Xylocaine 10% spray Astra Zeneca For intubation
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C Imexmed Infusion pump
Heated pad Harvard Apparatus
Suction dominant 50 Medela
Suction tubing Optimus Promedical 80342.2
Surgical motor Schick dental Qube Drilling of intramedullary holes
Ventilation Maquet Servo1
Name Company Catalog Number Comments
Material
Cylinders and caps Boutyplast Customized composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft GlobalD ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft GlobalD MTM
Self- drilling screws GlobalD VA1.2KL4 cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm Covidien 86233 For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm Covidien 107-35G For intubation
Ethicon prolene 4-0 Ehticon 8581H Non-resorbable suture
Forceps Marcel Blanc BD027R 145 mm
Intubation catheter Cook medical Guide for intubation
Needlle holder Marcel Blanc BM008R
Needles BD Microlance3 Becton Dickinson 300300/304622 26G; 18G
Periosteal HU-Friedy P9X
Round surgical burs Patterson 78000 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel Swann-Morton n°10 and n°15
Scissors Marcel Blanc 00657 180 mm
Syringes Omnifix Braun 4616057V 5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22 Braun 42690985-01 Vasofix safety for the ear iv line

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References

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