Rata automatizada de un solo pellet alcanzando la reconstrucción tridimensional de trayectorias de patas y dígitos

Behavior

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Bova, A., Kernodle, K., Mulligan, K., Leventhal, D. Automated Rat Single-Pellet Reaching with 3-Dimensional Reconstruction of Paw and Digit Trajectories. J. Vis. Exp. (149), e59979, doi:10.3791/59979 (2019).

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Abstract

El alcance con habilidades de roedores se utiliza comúnmente para estudiar habilidades hábiles, pero requiere mucho tiempo y esfuerzo para implementar la tarea y analizar el comportamiento. Recientemente se han desarrollado varias versiones automatizadas de alcance cualificado. Aquí, describimos una versión que presenta automáticamente pellets a ratas mientras graba vídeo de alta definición desde múltiples ángulos a altas velocidades de fotogramas (300 fps). La pata y los dígitos individuales se rastrean con DeepLabCut, un algoritmo de aprendizaje automático para la estimación de la pose sin marcadores. Este sistema también se puede sincronizar con grabaciones fisiológicas, o ser utilizado para desencadenar intervenciones fisiológicas (por ejemplo, estimulación eléctrica u óptica).

Introduction

Los humanos dependen en gran medida de la habilidad dietuta, definida como movimientos que requieren movimientos multi-articulares y digitales coordinados con precisión. Estas habilidades se ven afectadas por una serie de patologías comunes del sistema nervioso central, incluyendo lesiones estructurales (por ejemplo, accidente cerebrovascular, tumor, lesiones desmielinantes), enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, enfermedad de Parkinson) y anomalías funcionales circuitos (por ejemplo, distonía). Entender cómo se aprenden e implementan las habilidades hábiles por los circuitos motores centrales tiene, por lo tanto, el potencial de mejorar la calidad de vida de una gran población. Además, es probable que esta comprensión mejore el rendimiento motor en personas sanas optimizando las estrategias de capacitación y rehabilitación.

Disecijar los circuitos neuronales subyacentes a la habilidad hábil en los seres humanos está limitado por consideraciones tecnológicas y éticas, lo que requiere el uso de modelos animales. Los primates no humanos se utilizan comúnmente para estudiar movimientos de extremidades hábiles dada la similitud de sus sistemas motores y repertorio conductual con los seres humanos1. Sin embargo, los primates no humanos son caros con largos tiempos de generación, lo que limita el número de sujetos de estudio y las intervenciones genéticas. Además, mientras que la caja de herramientas neurocientífica aplicable a los primates no humanos es más grande que para los seres humanos, muchos avances tecnológicos recientes no están disponibles o están significativamente limitados en los primates.

El alcance experto de los roedores es un enfoque complementario para estudiar el control del motor diestro. Las ratas y los ratones pueden ser entrenados para alcanzar, agarrar y recuperar un pellet de azúcar en una secuencia estereotipada de movimientos homólogos a los patrones de alcance humano2. Debido a su tiempo de generación relativamente corto y menores costos de vivienda, así como su capacidad para adquirir alcances calificados durante días o semanas, es posible estudiar un gran número de asignaturas durante las fases de aprendizaje y consolidación de habilidades. El uso de roedores, especialmente ratones, también facilita el uso de potentes herramientas neurocientíficas modernas (por ejemplo, optogenética, imágenes de calcio, modelos genéticos de la enfermedad) para estudiar la habilidad hábil.

El alcance experto de los roedores se ha utilizado durante décadas para estudiar el control motornormal y cómo se ve afectado por patologías específicas como el accidente cerebrovascular y la enfermedad de Parkinson 3. Sin embargo, la mayoría de las versiones de esta tarea son laboristas y de mucho tiempo, mitigando los beneficios del estudio de los roedores. Las implementaciones típicas implican la colocación de roedores en una cámara de alcance con un estante delante de una ranura estrecha a través de la cual el roedor debe alcanzar. Un investigador coloca manualmente los pellets de azúcar en el estante, espera a que el animal llegue, y luego coloca otro. Los alcances se puntúan como éxitos o fracasos, ya sea en tiempo real o por revisión de vídeo4. Sin embargo, simplemente la puntuación alcanza los éxitos o los fracasos ignora los datos cinemáticos enriquecidos que pueden proporcionar información sobre cómo (en lugar de simplemente si) el alcance se ve afectado. Este problema se solucionó mediante la implementación de una revisión detallada de los vídeos de acceso para identificar y puntuar semicuantitativamente los submovimientos5. Si bien esto añadió algunos datos sobre la cinemática de alcance, también aumentó significativamente el tiempo y el esfuerzo del experimentador. Además, los altos niveles de participación de los experimentadores pueden conducir a incoherencias en la metodología y el análisis de datos, incluso dentro del mismo laboratorio.

Más recientemente, se han desarrollado varias versiones automatizadas de alcance cualificado. Algunos se adhieren a la jaula doméstica6,7, eliminando la necesidad de transferir animales. Esto reduce el estrés en los animales y elimina la necesidad de aclimatarlos a una cámara de alcance especializada. Otras versiones permiten el seguimiento de la pata para que los cambios cinemáticos bajo intervenciones específicas se puedan estudiar8,9,10, o tener mecanismos para determinar automáticamente si los pellets fueron arrancados de la plataforma11. Las tareas automatizadas de alcance cualificado son especialmente útiles para el entrenamiento de alta intensidad, como puede ser necesario para la rehabilitación después de una lesión12. Los sistemas automatizados permiten a los animales realizar un gran número de alcances durante largos períodos de tiempo sin necesidad de una participación intensiva de los investigadores. Además, los sistemas que permiten el seguimiento de la pata y la puntuación automatizada de los resultados reducen el tiempo dedicado al investigador a realizar el análisis de datos.

Desarrollamos un sistema automatizado de alcance experto en ratas con varias características especializadas. En primer lugar, mediante el uso de un pedestal móvil para llevar el pellet a "posición de alcance" desde abajo, obtenemos una vista casi sin obstáculos de la extremidad delantera. En segundo lugar, un sistema de espejos permite múltiples vistas simultáneas del alcance con una sola cámara, permitiendo la reconstrucción tridimensional (3-D) de las trayectorias de alcance utilizando una cámara de alta resolución y alta velocidad (300 fps). Con el reciente desarrollo de algoritmos de aprendizaje automático robustos para el seguimiento de movimiento sin marcadores13,ahora rastreamos no sólo la pata, sino los nudillos individuales para extraer el alcance detallado y la cinemática de agarre. En tercer lugar, un frame-grabber que realiza un procesamiento de vídeo simple permite la identificación en tiempo real de distintas fases de alcance. Esta información se utiliza para desencadenar la adquisición de vídeo (la adquisición continua de vídeo no es práctica debido al tamaño del archivo), y también se puede utilizar para desencadenar intervenciones (por ejemplo, optogenética) en momentos precisos. Por último, los fotogramas de vídeo individuales son activados por pulsos de lógica transistor-transistor (TTL), lo que permite que el vídeo se sincronice con precisión con grabaciones neuronales (por ejemplo, electrofisiología o fotometría). Aquí, describimos cómo construir este sistema, entrenar ratas para realizar la tarea, sincronizar el aparato con sistemas externos y reconstruir trayectorias de alcance 3D.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
clear polycarbonate panels TAP Plastics cut to order (see box design)
infrared source/detector Med Associates ENV-253SD 30" range
camera Basler acA2000-340kc 2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link
camera lens Megapixel (computar) M0814-MP2 2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus
camera cables Basler #2000031083 Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables
mirrors Amazon
linear actuator Concentrics LACT6P Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer
pellet reservoir/funnel Amico (Amazon) a12073000ux0890 6" funnel
guide tube ePlastics ACREXT.500X.250 1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long
pellet delivery rod ePlastics ACRCAR.250 0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length)
plastic T connector United States Plastic Corp #62065 3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee
LED lights Lighting EVER 4100066-DW-F 12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool
Light backing ePlastics ACTLNAT0.125X12X36 0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet
Light diffuser films inventables 23114-01 .007x8.5x11", matte two sides
cabinet and custom frame materials various (Home Depot, etc.) 3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure)
acoustic foam Acoustic First FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick)
ventilation fans Cooler Master (Amazon) B002R9RBO0 Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers
cabinet door hinges Everbilt (Home Depot #14609 continuous steel hinge (1.4" x 48")
cabinet wheels Everbilt (Home Depot #49509 Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake
cabinet door handle Everbilt (Home Depot #15094 White light duty door pull (4.5")
computer Hewlett Packard Z620 HP Z620 Desktop Workstation
Camera Link Frame Grabber National Instruments #781585-01 PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full
Multifunction RIO Board National Instruments #781100-01 PCIe-17841R
Analog RIO Board Cable National Instruments SCH68M-68F-RMIO Multifunction Cable
Digital RIO Board Cable National Instruments #191667-01 SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series
Analog Terminal Block National Instruments #782536-01 SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
Digital Terminal Block National Instruments #782536-01 SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
24 position relay rack Measurement Computing Corp. SSR-RACK24 Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel
DC switch Measurement Computing Corp. SSR-ODC-05 Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A
DC Sense Measurement Computing Corp. SSR-IDC-05 solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC
DC Power Supply BK Precision 1671A Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply
sugar pellets Bio Serv F0023 Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored)
LabVIEW National Instruments LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions 64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW
MATLAB Mathworks Matlab R2019a box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox

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References

  1. Chen, J., et al. An automated behavioral apparatus to combine parameterized reaching and grasping movements in 3D space. Journal of Neuroscience Methods. (2018).
  2. Sacrey, L. A. R. A., Alaverdashvili, M., Whishaw, I. Q. Similar hand shaping in reaching-for-food (skilled reaching) in rats and humans provides evidence of homology in release, collection, and manipulation movements. Behavioural Brain Research. 204, 153-161 (2009).
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