अलग प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृति में ग्लूटामेट रिसेप्टर तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक एंटीबॉडी खिला दृष्टिकोण

Neuroscience

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Summary

यह लेख अलग प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों में ग्लूटामेट रिसेप्टर (GluR) तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। औषधीय दृष्टिकोण के साथ संयोजन में अंतर्जात या overexpressed रिसेप्टर्स लेबल करने के लिए एक एंटीबॉडी खिला दृष्टिकोण का उपयोग करना, इस विधि नियमन द्वारा GluR सतह अभिव्यक्ति को विनियमित आणविक तंत्र की पहचान के लिए अनुमति देता है आंतरिककरण या रीसाइक्लिंग प्रक्रियाओं.

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Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

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Abstract

बाह्य उद्दीपकों के लिए कोशिकीय प्रक्रियाएँ किसी दिए गए क्षण में कोशिका पृष्ठ पर व्यक्त अभिग्राहियों के समुच्चय पर भारी निर्भर करती हैं। तदनुसार, सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स की आबादी लगातार अनुकूलन और विनियमन के सख्त तंत्र के अधीन है. प्रतिमानात्मक उदाहरण और जीव विज्ञान में सबसे अधिक अध्ययन तस्करी की घटनाओं में से एक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (GluRs) के synaptic अभिव्यक्ति के विनियमित नियंत्रण है. GluRs केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में उत्तेजक न्यूरोसंचरण के विशाल बहुमत मध्यस्थता और synaptic और न्यूरॉन स्तर पर शारीरिक गतिविधि पर निर्भर कार्यात्मक और संरचनात्मक परिवर्तन नियंत्रण (उदाहरण के लिए, synaptic प्लास्टिक). सतह की संख्या, स्थान, और उपइकाई संरचना में संशोधन GluRs गहराई से न्यूरॉन समारोह को प्रभावित और, वास्तव में, इन कारकों में परिवर्तन विभिन्न neuropathies के साथ जुड़े रहे हैं. यहाँ प्रस्तुत अलग हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन्स में GluR तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक विधि है. एक "एंटीबॉडी-फीडिंग" दृष्टिकोण का उपयोग सतह और आंतरिक झिल्ली पर व्यक्त ग्लूआर आबादी को अंतर-विज़ुअल कल्पना करने के लिए किया जाता है। जीवित कोशिकाओं पर सतह रिसेप्टर्स लेबलिंग और उन्हें अलग अलग समय पर फिक्सिंग रिसेप्टर्स endocytosis और / यह एक बहुमुखी प्रोटोकॉल है कि औषधीय दृष्टिकोण या बदल रिसेप्टर्स के overexpression के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है उत्तेजनाओं और GluR तस्करी को प्रभावित करने वाले आणविक तंत्र के बारे में बहुमूल्य जानकारी हासिल है. इसी तरह, यह आसानी से अन्य रिसेप्टर्स या सतह व्यक्त प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

सेल विशिष्ट उपकोशिकीय स्थानीयकरणों में प्रोटीन जुटाने के लिए अवैध व्यापार की सक्रिय प्रक्रिया का उपयोग करते हैं और उनके कार्य1पर सख्त स्पैटियोटेम्पोरल विनियमन लागू करते हैं . इस प्रक्रिया transmembrane रिसेप्टर्स के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, के रूप में विभिन्न पर्यावरण उत्तेजनाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं रिसेप्टर सक्रियण द्वारा ट्रिगर intracellular cascades पर भरोसा करते हैं. सेल रिसेप्टर subcellular तस्करी विनियमन2के माध्यम से सेल सतह पर व्यक्त रिसेप्टर्स के घनत्व, स्थानीयकरण, और subunit संरचना बदलकर इन प्रतिक्रियाओं को संशोधित करने में सक्षम हैं. प्लाज्मा झिल्ली में नए synthetized रिसेप्टर्स की प्रविष्टि, endocytosis और मौजूदा रिसेप्टर्स के रीसाइक्लिंग के साथ तस्करी प्रक्रियाओं है कि सतह expressed रिसेप्टर्स2के शुद्ध पूल का निर्धारण के उदाहरण हैं. कई आणविक तंत्र प्रोटीन तस्करी को विनियमित करने के लिए सहयोग करते हैं, जिसमें प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत और फॉस्फोरिलेशन, सर्वव्यापकता, या पामिटोयलेशन2जैसे पोस्टट्रांसल संशोधन शामिल हैं।

रिसेप्टर तस्करी के विनियमन विशेष रूप से अत्यधिक विशेष संरचनाओं के साथ दृढ़ता से polarized कोशिकाओं में आवश्यक है. प्रतिमानात्मक उदाहरण ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के विनियमित तस्करी द्वारा न्यूरोनल समारोह का नियंत्रण है (GluRs)3,4. ग्लूटामेट, मुख्य उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर, बांधता है और इस तरह के synaptic neurotransmission और synaptic प्लास्टिक के रूप में मौलिक शारीरिक न्यूरॉन कार्यों को नियंत्रित करने के लिए सतह expressed GluRs सक्रिय करता है. तथ्य यह है कि परिवर्तित GluR तस्करी neuropathies के एक व्यापक स्पेक्ट्रम में देखा गया है, neurodevelopmental विकारों से neurodegenerative रोगों को लेकर, इस प्रक्रिया के महत्व पर प्रकाश डाला गया5. इस प्रकार, GLUR तस्करी को नियंत्रित करने वाली आणविक घटनाओं को समझना अनुसंधान के कई क्षेत्रों में रुचि का है।

इस प्रोटोकॉल में, एक एंटीबॉडी खिला आधारित विधि प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में सतह-एक्सप्रेस्ड ग्लूआर के स्तर को निर्धारित करने के साथ-साथ यह मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है कि मनाया शुद्ध सतह अभिव्यक्ति में आंतरिककरण और रीसाइक्लिंग परिणाम में परिवर्तन कैसे होता है। विशेष उत्परिवर्तनों को आश्रय देने वाले बाह्य जनजन रिसेप्टर्स के औषध विज्ञान और/या अतिअभिव्यक्ति का उपयोग इस प्रोटोकॉल को विभिन्न पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के लिए न्यूरॉन अनुकूलन के अंतर्निहित आणविक तंत्र ों के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से शक्तिशाली दृष्टिकोण बनाता है। इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता का एक अंतिम उदाहरण अध्ययन कर रहा है कि कैसे पर्यावरण में बहुकारक परिवर्तन (जैसे एक रोग मॉडल में) ऐसे मॉडलों में सतह अभिव्यक्ति की परीक्षा के माध्यम से GluR तस्करी को प्रभावित करता है.

विशिष्ट उदाहरणों का उपयोग करके, यह शुरू में दिखाया जाता है कि कैसे एक फार्माकोलॉजिक हेरफेर शारीरिक synaptic उत्तेजना नकल [रासायनिक LTP (cLTP)] GLURs के AMPA-प्रकार के अंतर्जात GluA1 उपइकाई की सतह अभिव्यक्ति बढ़ जाती है (AMPARs) 6.NMDA-प्रकार के ग्लूआर (NMDARs) के GluN2B subunit के GluN2B subunit के एक overexpressed फॉस्फो-मिमेटिक रूप की तस्करी भी उदाहरण के लिए विश्लेषण किया जाता है कि कैसे इस प्रोटोकॉल विशिष्ट posttranslational द्वारा GluR तस्करी के विनियमन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संशोधन. हालांकि इन विशिष्ट उदाहरण का उपयोग किया जाता है, इस प्रोटोकॉल आसानी से अन्य GluRs और अन्य रिसेप्टर्स और प्रोटीन है कि antigenic extracellular डोमेन के अधिकारी के लिए लागू किया जा सकता है. मामले में है कि वहाँ कोई antibodies extracellular डोमेन के लिए उपलब्ध हैं, extracellular epitope-टैग (उदाहरण के लिए, झंडा, Myc-, GFP टैग, आदि) प्रोटीन लेबलिंग में सहायता कर सकते हैं की overexpression.

वर्तमान प्रोटोकॉल विशिष्ट GluR उपप्रकार घनत्व और विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर तस्करी की मात्रा निर्धारित करने के लिए निर्देश प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता 1) कुल GluR सतह अभिव्यक्ति, 2) GluR internalization, और 3) GluR रीसाइक्लिंग. प्रत्येक प्रक्रिया का व्यक्तिगत रूप से अध्ययन करने के लिए, यह 1 और 2 अनुभाग के साथ शुरू करने और या तो अनुभाग 3, 4, या 5 के साथ जारी रखने के लिए सलाह दी जाती है। सभी मामलों में, अनुभाग 6 और 8 (चित्र 1) के साथ समाप्त करें।

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Protocol

हिप्पोकैम्पस प्राथमिक संस्कृति तैयारी से संबंधित कार्य की समीक्षा की गई और उत्तर पश्चिमी विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल #IS00001151) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. लेबलिंग से पहले तैयारी

  1. प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों की तैयारी और रखरखाव
    1. पाली-डी-लाइसिन लेपित (0.1 मिलीग्राम/एमएल) 18 मिमी कवर चश्मा पर चढ़ाया 150,000 कोशिकाओं के घनत्व पर प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों को तैयार करें। अलग न्यूरोनल संस्कृति की तैयारी के लिए उत्कृष्ट गाइड उपलब्ध हैं7,8.
      नोट: यदि आवश्यक हो, संस्कृतियों cytosine arabinoside के साथ इलाज किया जा सकता है (आरा-सी, DIV1 से 10 m)।
      नोट: वैकल्पिक कोटिंग अभिकर्मकों जैसे फाइब्रोनेक्टिन (1 मिलीग्राम/एमएल) या लेमिन (5 मिलीग्राम/एमएल) पॉली-डी-लाइसिन के बजाय उपयोग किया जा सकता है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल इनक्यूबेटर में संस्कृतियों को बनाए रखें और 5% सीओ2 में 2 एमएल/वेल में न्यूरोबेसल मीडिया के बी 27 और 2 एम एम एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक।
      नोट: एल-ग्लूटामाइन के लिए विकल्प (जैसे, ग्लूटामैक्स) का उपयोग किया जा सकता है, यदि वांछित हो।
    3. साप्ताहिक आधार पर, मीडिया की आधी मात्रा को हटा दें और पूरक neurobasal मीडिया की एक ही मात्रा के साथ बदलें.
  2. वैकल्पिक: उत्परिवर्तित और/या epitope-टैग किए गए रिसेप्टर्स का संक्रमण
    नोट:
    न्यूरॉन्स रिसेप्टर अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देने के लिए विश्लेषण समय बिंदु से पहले कम से कम 3-4 दिन transfected किया जाना चाहिए. युवा न्यूरॉन्स का उपयोग [इन विट्रो में दिन 6-9 (DIV6-9)] पुराने से बेहतर transfection दक्षता में परिणाम (DIV15-20) न्यूरॉन्स, लेकिन transfected कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या (और gt; 20) प्राप्त किया जा सकता है की परवाह किए बिना DIV कार्यरत.
    1. एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए, एक microcentrifuge ट्यूब में B27 या glutamine पूरकता के बिना ताजा neurobasal मीडिया के 100 डिग्री एल में ब्याज के निर्माण युक्त प्लाज्मिड के 1.5 डिग्री ग्राम पतला और जल्दी से भंवर द्वारा मिश्रण.
      नोट: सफल transfection के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि neurobasal मीडिया का इस्तेमाल किया संभव के रूप में ताजा है, आदर्श रूप से कम से कम 1 सप्ताह बोतल खोलने के बाद.
    2. एक दूसरे microcentrifuge ट्यूब में, ताजा neurobasal मीडिया के 100 डिग्री एल में एक उपयुक्त lipofection अभिकर्मक के 1 डिग्री सेल्सियस मिश्रण और धीरे मिश्रण.
      नोट: लिपोफेक्शन अभिकर्मक मिश्रण भंवर मत करो. ताजा lipofection अभिकर्मकों का उपयोग transfection दक्षता में सुधार कर सकते हैं.
    3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    4. डीएनए मिश्रण करने के लिए lipofection अभिकर्मक मिश्रण dropwise जोड़ें, धीरे मिश्रण, और आर टी पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट.
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एमएल के लिए वातानुकूलित मीडिया में मीडिया की मात्रा समायोजित करें।
    6. अच्छी तरह से lipofection अभिकर्मक -डीएनए मिश्रण dropwise जोड़ें.
    7. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को लौटाएं और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कम से कम 3-4 दिनों की अनुमति दें।
      नोट: आंतरिककरण और रीसाइक्लिंग प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए नीचे उल्लिखित, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स DIV11-12 पर transfected थे के साथ निर्माण GluN2B व्यक्त करने के साथ GLUN2B extracellular डोमेन में GFP के साथ टैग (GFP-GluN2B) और DIV15-16 पर छवि.
  3. वैकल्पिक: निर्धारण तक वातानुकूलित मीडिया में दवाओं (पुरानी या तीव्रता से) के साथ कोशिकाओं की इनक्यूबेशन।
    नोट:
    तीव्र उपचार के लिए, लेबलिंग से पहले कोशिकाओं का इलाज शुरू करें। दवा उपचार प्रोटोकॉल के आधार पर इस्तेमाल किया, कोशिकाओं धारा 2 के दौरान दवा युक्त मीडिया में बनाए रखा जा सकता है. हमारे उदाहरण में, DIV21 कक्षों को सतह-एक्सप्रेस्ड AMPAR9को बढ़ाने के लिए cLTP प्रोटोकॉल के अधीन थे।
    1. विनिमय वातानुकूलित मीडिया extracellular समाधान (ईसीएस) के लिए.
    2. आरटी में 3 मिनट के लिए ईसीएस में 300 डिग्री सेल्सियस ग्लिसिन के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। एक नियंत्रण के रूप में, ईसीएस के साथ एक बहन कवरस्लिप का इलाज (बिना ग्लाइसिन के)।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस ईसीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धोएं और अनुभाग 2 के साथ जारी रखने से पहले 20 मिनट के लिए सेल इनक्यूबेटर में ईसीएस (ग्लिसिन के बिना) में कोशिकाओं को वापस करें।
      नोट:ईसीएस (एमएम में): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 ग्लूकोज, 0.001 TTX, 0.01 strychnine, और 0.03 picrotoxin pH 7.4 पर.

2. सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स की लाइव लेबलिंग

  1. लेबलिंग के लिए कवरलिप तैयार करें
    1. अभिकर्मकों को बचाने और हेरफेर की सुविधा के लिए, स्थानांतरण कवर सेल पक्ष एक पैराफिन फिल्म कवर ट्रे करने के लिए।
      नोट: यह नमूने बाहर सूखी कभी नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    2. ऊष्मायन और धोने के चरणों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर वातानुकूलित मीडिया सहेजें और बनाए रखें।
      नोट: 18 मिमी कवरस्लिप के लिए एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए मीडिया के 75-1000 डिग्री सेल्सियस के साथ ऊष्मायन और आंतरिककरण/पुनर्चक्रण के लिए 120-150 डिग्री सेल्सियस की सिफारिश की जाती है।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सतह रिसेप्टर्स की लेबलिंग
    1. आरटी में 15 मिनट के लिए वातानुकूलित मीडिया में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं।
      नोट: GFP टैग रिसेप्टर्स के लिए, खरगोश विरोधी GFP एंटीबॉडी की एक कमजोर पड़ने पर 1:1000 इस्तेमाल किया गया था. अंतर्जात GluA1 के लिए, माउस विरोधी GluA1 एक 1:200 कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया गया था.
    2. ध्यान से एक वैक्यूम पाइपेट का उपयोग कर एंटीबॉडी युक्त मीडिया बंद aspirate और वातानुकूलित मीडिया के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोने.
      नोट: यदि वातानुकूलित मीडिया उपलब्ध नहीं है, तो सभी वाशिंग चरण PBS+ [फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (PBS) का उपयोग करके किया जा सकता है जिसमें 1 m MgCl2 और 0.1 m CaCl2]. यदि कोमल निर्वात आकांक्षा उपलब्ध नहीं है तो माइक्रोपिपेट का उपयोग करने वाली मैनुअल आकांक्षा की जा सकती है।

3. सतह अभिव्यक्ति (चित्र 2)

  1. सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स की माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग
    1. पीबीएस + के साथ एक बार धो लें।
    2. 7-8 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) और 4% सुक्रोज के साथ इनक्यूबेट करके कोशिकाओं को ठीक करें।
      नोट: मेथनॉल ऊष्मायन जैसे अन्य निर्धारण विधियों के विपरीत, पीएफए प्लाज्मा झिल्ली को पार नहीं करता है और इसलिए सतह-अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। इष्टतम परिणामों के लिए, ताजा तैयार पीएफए का उपयोग करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर पीएफए का अल्पकालिक भंडारण 4 डिग्री सेल्सियस या लंबी अवधि (30 दिनों तक) भंडारण पर्याप्त निर्धारण के लिए स्वीकार्य है।
      चेतावनी: पीएफए एक ज्ञात कासिफ्यी है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा त्मक उपकरण और एक सुरक्षा हुड का प्रयोग करें जब हैंडलिंग.
    3. नियमित पीबीएस के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोएं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, 0.1 M ग्लिसिन का उपयोग पीबीएस के बजाय पीएफए धोने के लिए किया जा सकता है, क्योंकि ग्लिसिन किसी भी शेष स्थिरकरनेटिव को बुझा देगा जो तैयारी में पृष्ठभूमि को बढ़ा सकता है।
    4. आरटी में 30 मिनट के लिए पीबीएस में 10% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस) के साथ इनक्यूबेट करके गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक करें।
      नोट: लेबलिंग पर प्रतिकूल प्रभाव के बिना समय अवरुद्ध किया जा सकता है।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी-लेबल रिसेप्टर्स (यानी, सतह-एक्सप्रेस्ड) को लेबल करने के लिए आरटी में 1 एच के लिए पीबीएस में 3% एनजीएस में पतला फ्लोरोसेंट-टैग ्ड ्ड ्ड्डेरियन के साथ इनक्यूबेट।
      नोट: इन उदाहरणों में, Alexa 555-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के एक 1:500 कमजोर पड़ने: GFP लेबल रिसेप्टर्स और GluA1 के लिए बकरी विरोधी माउस के लिए बकरी विरोधी rabbit इस्तेमाल किया गया था.
    6. पीबीएस 3x के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  2. इंट्रासेल्यूलर रिसेप्टर्स की लेबलिंग
    1. आरटी में 5-10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.25% Triton X-100 के साथ permeabilize कोशिकाओं.
      नोट: यह देखने के लिए कि एंटीबॉडी लेबलिंग के प्रारंभिक दौर में सभी सतह के प्रतीक हैं, यह permebilization कदम एक बहन संस्कृति में छोड़ दिया जा सकता है. इस मामले में, इंट्रासेल्यूलर रिसेप्टर्स के लिए कोई संकेत प्राप्त किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, यह जांचने के लिए कि पिछले अनुभाग 2 (यानी, संस्कृति में प्लाज्मा झिल्ली की अखंडता को दिखाने के लिए, permeabilization कदम एक बहन संस्कृति में छोड़ दिया जा सकता है, और एक के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन (उदा., PSD-95 या MAP2) का उपयोग चरण 2.2.1 में किया जा सकता है। इन परिस्थितियों में इस प्राथमिक से कोई संकेत प्राप्त नहीं किया जाना चाहिए। इस मामले में, एक खरगोश विरोधी PSD-95 एंटीबॉडी (1:500) इस्तेमाल किया गया था.
    2. आरटी में 30 मिनट के लिए पीबीएस में 10% एनजीएस के साथ ब्लॉक।
    3. एक ही प्राथमिक एंटीबॉडी खंड में इस्तेमाल किया के साथ permebilized कोशिकाओं incubating द्वारा intracellular रिसेप्टर्स लेबल 2.2 आरटी में 1 एच के लिए पीबीएस में 3% NGS में पतला.
      नोट: अंत:कोशिकीय रिसेप्टर्स लेबलिंग के लिए एंटीबॉडी कमजोर पड़ने सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स लेबलिंग के लिए आवश्यक से अलग हो सकता है। GluA1 के उदाहरण में, एक ही एंटीबॉडी कमजोर पड़ने (1:200) इस्तेमाल किया गया था.
    4. पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें।
    5. आरटी पर 1 एच के लिए पीबीएस में 3% एनजीएस में पतला दूसरा फ्लोरोसेंट-टैग ्ड ्ड ्ड ्ड सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ लेबल।
      नोट: इन उदाहरणों में, बकरी विरोधी माउस Alexa 647-संयुग्मी माध्यमिक एंटीबॉडी (GluA1 के लिए) के एक 1:500 कमजोर पड़ने का इस्तेमाल किया गया था.
    6. पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें।

4. आंतरिककरण (चित्र 3)

  1. एंटीबॉडी लेबल सतह रिसेप्टर्स के आंतरिककरण
    1. सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स और एंटीबॉडी धोने (अनुभाग 2.2) की लेबलिंग के बाद, एंटीबॉडी के बिना वातानुकूलित मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखने और आंतरिककरण के लिए अनुमति देने के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए उन्हें वापस।
      नोट: NMDA रिसेप्टर्स के लिए, आंतरिककरण के लिए 30 मिनट की सिफारिश की है. एक नियंत्रण के रूप में, एक बहन संस्कृति आंतरिकीकरण प्रक्रिया के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर वातानुकूलित मीडिया के साथ बनाए रखा जा सकता है। न्यूनतम रिसेप्टर आंतरिकीकरण इन स्थितियों के तहत होना चाहिए.
  2. सतह रिसेप्टर्स की लेबलिंग
    1. पीबीएस + के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं।
    2. 7-8 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पीएफए और 4% सुक्रोज के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
      चेतावनी: उचित व्यक्तिगत सुरक्षा त्मक उपकरण और एक सुरक्षा हुड का प्रयोग करें जब पीएफए से निपटने.
    3. नियमित रूप से पीबीएस के साथ कोशिकाओं 3x धो लें।
    4. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को रोकने के लिए आरटी में 30 मिनट के लिए पीबीएस में 10% एनजीएस के साथ ब्लॉक।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी-लेबल रिसेप्टर्स लेबल करने के लिए आरटी में 1 एच के लिए पीबीएस में 3% एनजीएस में पतला फ्लोरोसेंट-टैग किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट नमूने (यानी, सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स जो आंतरिक नहीं थे)।
      नोट: इस उदाहरण के लिए, एलेक्सा 555-संयुग्मी बकरी विरोधी rabbit माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था.
    6. पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें।
  3. आंतरिक रिसेप्टर्स की लेबलिंग
    1. 5-10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.25% Triton X-100 के साथ permeabilize कोशिकाओं.
    2. आरटी में 30 मिनट के लिए पीबीएस में 10% एनजीएस के साथ ऊष्मायन द्वारा गैर-विशिष्ट बाइंडिंग ब्लॉक करें।
    3. फ्लोरोसेंट टैग माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट नमूने पीबीएस में 3% एनजीएस में पतला 1 एच के लिए आरटी में internalized एंटीबॉडी लेबल रिसेप्टर्स लेबल करने के लिए.
      नोट: इस उदाहरण के लिए, एलेक्सा 647-संयोजित बकरी विरोधी rabbit माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) लेबलिंग के लिए प्रयोग किया जाता है।
    4. पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें।

5. पुनर्चक्रण (चित्र 4)

  1. एंटीबॉडी लेबल सतह रिसेप्टर्स के आंतरिककरण
    1. सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स और एंटीबॉडी धोने (अनुभाग 2.2) की लेबलिंग के बाद, एंटीबॉडी के बिना वातानुकूलित मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखने और आंतरिककरण के लिए अनुमति देने के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए उन्हें वापस।
      नोट: NMDA रिसेप्टर्स के लिए, आंतरिककरण के लिए 30 मिनट की सिफारिश की है.
  2. स्थिर सतह व्यक्त रिसेप्टर्स के अवरुद्ध
    1. सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स से जुड़े प्राथमिक एंटीबॉडी पर एपिटोप को ब्लॉक करने के लिए, असंयुग्मज फैब एंटी-आईजीजी (एच +एल) एंटीबॉडी टुकड़े के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं (धारा 2.2 में इस्तेमाल प्राथमिक के खिलाफ) वातानुकूलित मीडिया में पतला () आरटी में 20 मिनट के लिए 20 ग्राम/ यह उपचार माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ भविष्य की बातचीत को रोकता है।
      नोट: इस उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी rabbit फैब टुकड़े इस्तेमाल किया गया.
      नोट: नियंत्रण प्रयोग: यह सुनिश्चित करने के लिए कि सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स का पूरा ब्लॉकिंग हुआ है, बहन कवरलिप्स को फैब के साथ और बिना इनक्यूबेट किया जा सकता है। संस्कृति फैब उपचार के तुरंत बाद तय किया जाना चाहिए, और दोनों संस्कृतियों Alexa 555-संयोजित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ incubated हैं. फैब-इनक्यूबेट्ड कोशिकाओं में कोई एलेक्सा 555 सिग्नल उचित एंटीबॉडी अवरुद्ध इंगित करता है।
    2. वातानुकूलित मीडिया के साथ कक्ष 3x धोएं.
    3. आगे आंतरिककरण को रोकने के लिए 80 डिग्री सेल्सियस डाइनेसोर वाले वातानुकूलित मीडिया वाले इनक्यूबेट कोशिकाओं को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) पर वापस जाने के लिए आंतरिक रिसेप्टर्स के रीसाइक्लिंग के लिए अनुमति देने के लिए। डाइनासोर एक GTPase अवरोध करनेवाला है जो डाइनामिन को रोकता है और इसलिए आंतरिककरण को रोकता है।
      नोट: NMDAR रीसाइक्लिंग के लिए 45 मिनट की सिफारिश की है. ध्यान दें कि Dynasore विशेष रूप से गतिशीलता पर निर्भर internalization प्रक्रिया (उदा., NMDARs internalization) ब्लॉक. हालांकि, अन्य synaptic प्रोटीन का आंतरिककरण (dynamin-स्वतंत्र) अभी भी Dynasore की उपस्थिति में हो सकता है.
  3. पुनर्नवीनीकरण रिसेप्टर्स की लेबलिंग
    1. पीबीएस + के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं।
    2. 7-8 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पीएफए और 4% सुक्रोज के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
      चेतावनी: उचित व्यक्तिगत सुरक्षा त्मक उपकरण और एक सुरक्षा हुड का प्रयोग करें जब पीएफए से निपटने.
    3. पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें।
    4. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को रोकने के लिए आरटी में 30 मिनट के लिए पीबीएस में 10% एनजीएस के साथ ब्लॉक।
    5. पहली फ्लोरोसेंट-टैग्ड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल कोशिकाओं को पीबीएस में 3% एनजीएस में 1 एच के लिए आरटी पर पतला।
      नोट: इस उदाहरण के लिए, एलेक्सा 555-संयुग्मी बकरी विरोधी रैबिट एंटीबॉडी (1:500) लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था।
    6. पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें।
      नोट: पीबीएस (5-10 मिनट) के साथ लंबे समय तक washes तैयारी में पृष्ठभूमि को कम करने में मदद कर सकते हैं.
  4. आंतरिक रिसेप्टर्स की लेबलिंग
    1. 5-10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.25% Triton X-100 के साथ permeabilize कोशिकाओं.
    2. आरटी में 30 मिनट के लिए पीबीएस में 10% एनजीएस के साथ ब्लॉक।
    3. आरटी पर 1 एच के लिए पीबीएस में 3% एनजीएस में पतला दूसरा फ्लोरोसेंट-टैग ्ड ्ड ्ड ्ड सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ लेबल।
      नोट: इस उदाहरण के लिए, एलेक्सा 647-संयुग्मी बकरी विरोधी रैबिट एंटीबॉडी (1:500) लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था।
    4. पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें।

6. बढ़ते और नमूनों की इमेजिंग

  1. उपयुक्त बढ़ते मीडिया के 12-15 एमएल पर धीरे से कवरलिप्स सेल साइड को नीचे रखकर कोशिकाओं को माउंट करें।
    नोट: अतिरिक्त बढ़ते मीडिया की आकांक्षा छवियों की गुणवत्ता में सुधार होगा.
  2. एक उपयुक्त confocal माइक्रोस्कोप पर छवि कोशिकाओं.
    नोट: यह 0.35 डिग्री मीटर कदम के साथ 60x आवर्धन पर एक z-स्टैक छवि करने के लिए सिफारिश की है, न्यूरॉन की पूरी मोटाई शामिल.

7. समय विचार

  1. यह एक लंबा प्रोटोकॉल है जिसे कई बिंदुओं पर रोका जा सकता है। यदि वांछित हो, तो एक आर्द्र कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर अवरुद्ध और प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन चरण करें।
  2. वैकल्पिक रूप से, यदि वांछित, एक माइक्रोवेव ऊतक प्रोसेसर का उपयोग करने के लिए काफी तेजी से पोस्ट-फिक्सेशन ऊष्मायन समय. सभी चरणों के लिए, "पर" सेटिंग्स के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 150 W का उपयोग करें।
    1. ब्लॉक करने के लिए, प्रोसेसर को 2 मिनट "पर," 1 मिनट "बंद" और 2 मिनट "ऑन" पर चलाएँ.
    2. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन चरणों के लिए, प्रोसेसर को 3 मिनट "पर," 2 मिनट "ऑफ़" और 3 मिनट "ऑन" पर चलाएँ.
      नोट: हम प्रोटोकॉल के लिए ऊपर परिवर्तन करके गुणवत्ता में कोई अंतर नहीं देखते हैं।

8. छवि विश्लेषण

  1. यह यह कई फ़ाइल स्वरूपों के साथ संगत है के रूप में, छवि विश्लेषण का संचालन करने के लिए FIJI-lt;https://fizi.sc/ का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। हमारे डेटा के लिए, Nikon ND2 फ़ाइल स्वरूप में छवियों का अधिग्रहण किया गया.
  2. एक मैक्रो स्क्रिप्ट FIJI द्वारा पूर्व चयनित विभिन्न मापदंडों के आसान बैच परिमाणीकरण के लिए प्रदान की जाती है. निम्न चरणों को मैक्रो में शामिल किया गया है:
    नोट: इन उदाहरणों के लिए, "एकीकृत तीव्रता" मापा गया था.
  3. FIJI और अलग चैनल में छवि फ़ाइलें खोलें।
  4. एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में प्रत्येक चैनल ढेर परियोजना.
  5. प्रत्येक चैनल के लिए एक कम सीमा सेट करें.
    नोट: थ्रेसहोल्ड का निर्धारण प्रत्येक प्रयोगात्मक डेटा सेट के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए. जबकि प्रत्येक चैनल एक अलग कम थ्रेशोल्ड मान हो सकता है, यह महत्वपूर्ण है कि चैनल थ्रेशोल्ड मान लगातार एक ही डेटा सेट की सभी छवियों के लिए बनाए रखा जाता है.
  6. तीन से पांच द्वितीयक या तृतीयक डेन्ड्रोइट्स का चयन करें और उन्हें ब्याज क्षेत्रों (आरओआई) के रूप में सहेजें।
  7. सतह और intracellular चैनलों में प्रत्येक रॉय के एकीकृत घनत्व को मापने.
  8. सतह चैनल के एकीकृत घनत्व मूल्य को इंट्राकोशिकीय चैनल से विभाजित करके प्रत्येक ROI के लिए संकेत को सामान्य करें।
  9. सभी नियंत्रण और प्रयोगात्मक छवियों के लिए माप दोहराएँ और मूल्यों को नियंत्रित करने के लिए प्रयोगात्मक मूल्यों को सामान्य (उदाहरण के लिए, GluN2B WT या नहीं-glycine शर्तों).

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Representative Results

ग्लूटामेट रिसेप्टर तस्करी का अध्ययन करने के लिए यह प्रोटोकॉल कोशिका की सतह पर व्यक्त रिसेप्टर्स के अंतर लेबलिंग और आंतरिक झिल्ली में व्यक्त किए गए लोगों पर आधारित है। अलगाव से पहले और झिल्ली permeabilization के बाद रिसेप्टर्स लेबलिंग द्वारा हासिल की है, एक ही प्राथमिक एंटीबॉडी लेकिन एक अलग fluorophore करने के लिए एक माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मी का उपयोग कर. के रूप में वैकल्पिक कदम प्रोटोकॉल शामिल द्वारा उल्लिखित, यह इस तरह के internalization और रीसाइक्लिंग के रूप में विभिन्न रिसेप्टर तस्करी प्रक्रियाओं, पूछताछ के लिए एक बहुत बहुमुखी तरीका है, और आसानी से अन्वेषक की जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (चित्र 1) .

सबसे पहले, एक विधि न्यूरॉन सतह पर व्यक्त रिसेप्टर्स के परिमाणीकरण के लिए प्रदान की जाती है. इस प्रोटोकॉल बेसल सतह अभिव्यक्ति के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है और साथ ही आणविक तंत्र जिसके द्वारा विभिन्न दवाओं या उत्परिवर्तनों सतह expressed रिसेप्टर्स के बेसल स्तर को बदलने का अध्ययन. सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स पहले permeabilization से पहले दोनों प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ incubating द्वारा लेबल किया गया. 0.25% Triton X-100 के साथ permebilization के बाद, रिसेप्टर्स के intracellular पूल एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए सुलभ है. इस प्रोटोकॉल को समझाने के लिए, सतह बनाम नियंत्रण संस्कृतियों में AMPA रिसेप्टर्स (AMPARs) के intracellular धुंधला और cLTP के प्रेरण के बाद आयोजित किया गया था. विशेष रूप से, लाइव कोशिकाओं AMPAR के GluA1 उपइकाई में एक extracellular epitope के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर लेबल थे, और कोशिकाओं तो Alexa 555-संयोजित माध्यमिक के साथ लेबल तय किए गए थे. कोशिकाओं तो permeabilized और एक ही विरोधी AMPAR एंटीबॉडी के साथ लेबल और एलेक्सा 647 के लिए एक माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मी के साथ incubated थे. इस दोहरी लेबलिंग दो GluA1 आबादी के स्पष्ट दृश्य की अनुमति देता है.

confocal छवियों को प्राप्त करने के बाद, फ्लोरोसेंट संकेत आसानी से सतह अभिव्यक्ति में वृद्धि दिखाने के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, intracellular जनसंख्या के सापेक्ष, निम्नलिखित CLTP (चित्र 2A, बी). एक नियंत्रण के रूप में, permeabilization कदम छोड़ दिया गया था (0.25% Triton एक्स-100 के साथ इनक्यूबेशन) एक बहन coverslip में और एक प्राथमिक एंटीबॉडी PSD-95 के खिलाफ इस्तेमाल किया गया था, उत्तेजक synapses के लिए एक मानक intracellular मार्कर. जैसा कि चित्र 2Cमें दिखाया गया है, PSD-95 के लिए कोई संकेत गैर-permeabilized कोशिकाओं में प्राप्त किया जा सकता है, प्लाज्मा झिल्ली की अखंडता का प्रदर्शन. यह इंगित करता है कि संकेत के लिए प्राप्त "सतह GluA1" वास्तव में सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स से मेल खाती है (यानी, सतह के लिए संकेत expressed GluA1 intracellular रिसेप्टर्स शामिल नहीं है). महत्वपूर्ण बात, के लिए एक न्यूनतम संकेत "आंतरिक GluA1" गैर permeabilization शर्तों के तहत मनाया जा सकता है, दिखा रहा है कि सभी सतह epitopes एंटीबॉडी लेबलिंग के प्रारंभिक दौर द्वारा कब्जा कर रहे हैं (यानी, intracellular GluA1 के लिए संकेत शामिल नहीं है सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स).

एक दूसरी प्रक्रिया है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग जांच की जा सकती है सतह expressed रिसेप्टर्स के internalization है. विशेष रूप से, सतह रिसेप्टर्स एक जीवित सेल पर लेबल कर रहे हैं, और न्यूरॉन्स clathrin-मध्यस्थ endocytosis द्वारा रिसेप्टर internalization से गुजरना करने के लिए एक दिए गए समय के लिए इनक्यूबेटर को वापस कर रहे हैं. इस कदम के बाद, कोशिकाओं को प्राथमिक एंटीबॉडी लेबल रिसेप्टर्स (यानी, सतह-एक्सप्रेस्ड और internalized रिसेप्टर्स) के स्थानिक अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए तय कर रहे हैं। फिर, सतह रिसेप्टर्स (यानी, जो ब्याज की समय अवधि में internalized नहीं किया गया है), permeabilization से पहले एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं. permeabilization के बाद, रिसेप्टर्स कि internalized किया गया है एक अलग फ्लोरोफोर के साथ एक माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा लेबल हैं.

इस प्रोटोकॉल में, यह जांच की गई थी कि कैसे NMDARs के GluN2B subunit के पीडीजेड लिगेंड के भीतर एक विशेष फॉस्फोरिलेशन (S1480 पर) NMDAR आंतरिककरण प्रेरित करता है. ऐसा करने के लिए, प्राथमिक संस्कृतियों को फॉस्फो-मिमेटिक रिसेप्टर के साथ ट्रांसफेक्टेड किया गया था, जिसमें सेरीन (एस1480) को ग्लूटामेट (ई) द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। परिणामी उत्परिवर्ती, GluN2B S1480E, GluN2B के एक "संविधानात्मक रूप से फॉस्फोरीलेटेंड" रूप के रूप में कार्य करता है। GluN2B की लेबलिंग को कम करने और फॉस्फो-मीटिक उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए, GFP GluN2B (GFP-GluN2B S1480E) के extracellular पक्ष पर एक epitope टैग के रूप में इस्तेमाल किया गया था। लाइव कोशिकाओं पर सतह रिसेप्टर्स आरटी में 15 मिनट के लिए एक विरोधी जीएफपी एंटीबॉडी के साथ लेबल थे. इसके बाद, अतिरिक्त एंटीबॉडी वातानुकूलित मीडिया के साथ धोया गया था और एंडोसाइटोसिस के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं को वापस कर दिया। फिर, कोशिकाओं रिसेप्टर आंदोलन फ्रीज करने के लिए तय कर रहे थे. रिसेप्टर्स कि सतह पर बने रहे तो Alexa 555 के साथ लेबल थे-संयोजित माध्यमिक एंटीबॉडी permeabilization से पहले.

30 मिनट ऊष्मायन अवधि के दौरान internalized किया गया था कि रिसेप्टर्स की पहचान करने के लिए, कोशिकाओं permebilized थे, और internalized रिसेप्टर्स (पहले से ही एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल) तो Alexa 647 के साथ लेबल थे-संयोजित एंटीबॉडी. फिर, इस दोहरी लेबल रणनीति internalized रिसेप्टर्स के अनुपात के परिमाणीकरण की अनुमति देता है. इस उदाहरण पर प्रकाश डाला गया है कि S1480 पर GluN2B फॉस्फोरिलेशन रिसेप्टर internalization को बढ़ावा देता है, के रूप में फॉस्फो-मिमेटिक उत्परिवर्ती S1480E WT रिसेप्टर्स की तुलना में एक बहुत अधिक internalization अनुपात प्रदर्शित (चित्र 3A, बी). एक नियंत्रण के रूप में, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बहन संस्कृति आंतरिककरण के दौरान वातानुकूलित मीडिया में बनाए रखा गया था दृढ़ता से प्रक्रिया धीमी गति से. जैसा कि अपेक्षित है, इन परिस्थितियों के अंतर्गत "आंतरिक" रिसेप्टर्स के लिए कोई संकेत प्राप्त नहीं किया गया था (चित्र 3C)।

अंत में, इस प्रोटोकॉल को पहले आंतरिक रिसेप्टर्स के रीसाइक्लिंग की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल भिन्नता internalization प्रोटोकॉल की एक निरंतरता है, इन रिसेप्टर्स वापस सेल सतह के लिए निम्नलिखित द्वारा. इस भिन्नता के दो महत्वपूर्ण घटक हैं। सबसे पहले, रिसेप्टर्स जो स्थिर पूरे प्रोटोकॉल के दौरान सतह पर व्यक्त बने रहे (यानी, रिसेप्टर्स कि internalized या पुनर्नवीनीकरण नहीं थे) होना चाहिए "अवरोधित" इतना है कि वे पुनर्नवीनीकरण रिसेप्टर्स के लिए गलत नहीं हैं. ऐसा करने के लिए, रीसाइक्लिंग कदम प्रदर्शन करने से पहले, लाइव न्यूरॉन्स फैब की उच्च सांद्रता के साथ इनक्यूबेट किए जाते हैं जो सतह पर व्यक्त प्राथमिक एंटीबॉडी-लेबल रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करते हैं ताकि फ्लोरोफोर-कंजुटेड सेकेंडरी के आगे बाध्यकारी को रोका जा सके एंटीबॉडी. दूसरा, रीसाइक्लिंग चरण के दौरान आंतरिककरण को रोका जाना चाहिए, ताकि पुनर्नवीनीकरण रिसेप्टर्स internalized दोहराने नहीं कर रहे हैं. यह रीसाइक्लिंग के दौरान मीडिया के लिए डाइनासोर जोड़कर किया गया था क्योंकि यह दवा ब्लॉक डाइनामिन पर निर्भर प्रक्रियाओं जैसे क्लैथ्रिन-मध्यस्थ एंडोसाइटोसिस, जैसे कि एनएमडी आंतरिकीकरण। इस प्रोटोकॉल में, फॉस्फो-मिमेटिक उत्परिवर्ती GluN2B S1480E के अवैध व्यापार का अध्ययन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीवित कोशिकाओं पर GFP-GluN2B की सतह लेबलिंग प्रदर्शन किया गया था, जो एक 30 मिनट की अवधि के दौरान internalization के लिए अनुमति दी के रूप में पहले समझाया.

इस के बाद, सतह रिसेप्टर्स कि इस अवधि के दौरान internalized नहीं थे आरटी में 20 मिनट के लिए फैब के साथ कोशिकाओं incubating द्वारा अवरुद्ध कर रहे थे. अगले, कोशिकाओं को फिर से 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated थे पहले internalized GluN2B के लिए अनुमति देने के लिए सेल सतह पर वापस पुनर्नवीनीकरण किया जा करने के लिए. रीसाइक्लिंग चरण के दौरान मीडिया में डाइनासोर मौजूद थे। इस कदम के बाद कोशिकाओं का निर्धारण पुनर्नवीनीकरण रिसेप्टर्स की पहचान के लिए अनुमति देता है (यानी, उन है कि unblocked और सेल सतह पर व्यक्त कर रहे हैं) और internalized रिसेप्टर्स (यानी, उन है कि प्राथमिक एंटीबॉडी लेबल और intracellular हैं). द्वारा 1) एक Alexa 555 के साथ पुनर्नवीनीकरण रिसेप्टर्स लेबलिंग permebilization से पहले माध्यमिक एंटीबॉडी और 2) लेबलिंग internalized, लेकिन पुनर्नवीनीकरण नहीं, Alexa 647 के साथ रिसेप्टर्स-कंगेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी, एक रीसाइक्लिंग अनुपात दिखाने के लिए उत्पन्न किया गया था कि GluN2B S1480E NMDAR रीसाइक्लिंग पर कोई प्रभाव नहीं है (चित्र 4A, बी)। एक नियंत्रण के रूप में, यह सुनिश्चित किया गया था कि सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स का पूरा अवरुद्ध बहन Fab की उपस्थिति या अनुपस्थिति में coverslips द्वारा हुई, पीएफए निर्धारण के साथ पीछा किया. जैसा कि चित्र 4Cमें दिखाया गया है, फैब ब्लॉकिंग के अभाव में सतह-एक्सप्रेस्ड ग्लूएन2बी के लिए एक मजबूत संकेत देखा जा सकता है। यह संकेत फैब इलाज संस्कृतियों में गायब हो जाता है, प्रदर्शन है कि अवरुद्ध प्रोटोकॉल पूरी तरह से सतह-एक्सप्रेस्ड epitopes ब्लॉक करने के लिए पर्याप्त है और सतह संकेतों रीसाइक्लिंग के बाद मनाया वास्तव में रिसेप्टर्स करने के लिए वापस तस्करी के अनुरूप प्लाज्मा झिल्ली.

Figure 1
चित्रा 1: रिसेप्टर सतह अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल विविधताओं के Schematic, रिसेप्टर internalization (एंडोसाइटोसिस), और रिसेप्टर रीसाइक्लिंग. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: CLTP GluA1 की सतह अभिव्यक्ति बढ़ जाती है। DIV21 में प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स ग्लिसिन युक्त ईसीएस के साथ इनक्यूबेट करके रासायनिक एलटीपी (cLTP) के अधीन थे। सतह-एक्सप्रेस्ड (लाल) बनाम इंट्रासेल्यूलर (नीला) ग्लूए1 आबादी की विशिष्ट लेबलिंग AMPAR की सतह अभिव्यक्ति में अपेक्षित वृद्धि का पता चलता है। (क) एकल तल और(ब) $-स्टैक्ड (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण) confocal चित्र. स्केल बार्स - 50 डिग्री (पूरे सेल) या 5 डिग्री (डेन्ट्रीट)। ग्राफ CLTP प्रोटोकॉल के बाद GluA1 की वृद्धि हुई सतह अभिव्यक्ति से पता चलता है. सतह अभिव्यक्ति सूचकांक: सतह/इंट्रासेल्यूलर रिसेप्टर्स (n ] 3; कोशिकाओं की संख्या: con ] 7; cLTP ] 7; मान ों का प्रतिनिधित्व करते हैं ] SEM; * * * p और lt; 0.0001 मान-Whitney यू परीक्षण का उपयोग कर। (ग) नियंत्रण प्रयोग जिसमें परिक्षाकरण चरण छोड़ दिया गया था। सतह और आंतरिक GluA1 के अलावा, intracellular उत्तेजक synaptic मार्कर PSD-95 मूल्यांकन किया गया था. स्केल बार्स - 50 डिग्री (पूरे सेल) या 5 डिग्री (डेन्ट्रीट)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: S1480 पर GluN2B के फॉस्फोरिलेशन NMDAR आंतरिकीकरण को बढ़ावा देता है. प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स या तो GFP-GluN2B WT या फॉस्फो-मिमेटिक उत्परिवर्ती GFP-GluN2B S1480E DIV11-12 पर के साथ transfected थे. प्रोटीन अभिव्यक्ति के 3-4 दिनों के बाद, सतह GFP एक खरगोश विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ लाइव कोशिकाओं पर लेबल किया गया था और कोशिकाओं को तो एंडसाइटोसिस द्वारा रिसेप्टर आंतरिककरण के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए लौट रहे थे. सतह-एक्सप्रेस्ड exogenous रिसेप्टर्स Alexa 555-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कल्पना की गई, और आंतरिक आबादी Alexa 647-कंजुगेटेड एंटीबॉडी का उपयोग कर permeabilization के बाद की पहचान की. स्पष्टता के लिए, सतह GFP-GluN2B हरे रंग में छद्म रंग है और internalized GFP-GluN2B सफेद में छद्म रंग है. (क) एकल तल और(ब) $-स्टैक्ड (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण) confocal चित्र. स्केल बार्स - 50 डिग्री (पूरे सेल) या 5 डिग्री (डेन्ट्रीट)। ग्राफ फास्फो-मिटिक उत्परिवर्ती GluN2B S1480E द्वारा प्रदर्शित ऊंचा internalization से पता चलता है. आंतरिककरण सूचकांक: आंतरिककृत रिसेप्टर्स/सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स (एन ] 6; कोशिकाओं की संख्या: WT ] 34; S1480E ] 28; मूल्यों का प्रतिनिधित्व मतलब है - SEM; p;lt; 0.001 मान-व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग कर। (ग) नियंत्रण प्रयोग जिसमें आंतरिककरण चरण (इन्टेनेलिज़.) 4 डिग्री सेल्सियस पर किया गया था। स्केल बार्स - 50 डिग्री (पूरे सेल) या 5 डिग्री (डेन्ट्रीट)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: S1480 पर GluN2B का फॉस्फोरिलेशन NMDAR रीसाइक्लिंग को संशोधित नहीं करता है। प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स या तो GFP-GluN2B WT या फॉस्फो-मिमेटिक उत्परिवर्ती GFP-GluN2B S1480E पर DIV11-12 के साथ transfected थे के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है. प्रोटीन अभिव्यक्ति के 3-4 दिनों के बाद, सतह GFP एक खरगोश विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ लाइव कोशिकाओं पर लेबल किया गया था और कोशिकाओं को तो एंडसाइटोसिस द्वारा रिसेप्टर आंतरिककरण के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए लौट रहे थे. शेष सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स फैब ऊष्मायन द्वारा अवरुद्ध कर दिया गया था और रीसाइक्लिंग 45 मिनट के लिए अनुमति दी गई थी। उपलब्ध सतह व्यक्त exogenous रिसेप्टर्स (पुनर्नवीनीकरण) Alexa 555-संयोजित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कल्पना की गई थी, और internalized जनसंख्या Alexa 647-कंजुटेड एंटीबॉडी का उपयोग कर permebilization के बाद की पहचान की. स्पष्टता के लिए, सतह GFP-GluN2B सफेद और internalized GFP-GluN2B में छद्म रंग है हरे रंग में छद्म रंग है.  (A) एकल तल और () ] -स्टैक्ड (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण) confocal चित्र. स्केल बार्स - 50 डिग्री (पूरे सेल) या 5 डिग्री (डेन्ट्रीट)। ग्राफ प्रभाव की कमी से पता चलता है GluN2B S1480 फॉस्फोरिलेशन रीसाइक्लिंग पर है. पुनर्चक्रण सूचकांक: पुनर्नवीनीकरण रिसेप्टर्स /आंतरिक रिसेप्टर्स (एन $ 5; कोशिकाओं की संख्या: WT ] 27; S1480E ] 24; मूल्यों का प्रतिनिधित्व मतलब है - SEM; n.s. - गैर महत्वपूर्ण मान-Whitney यू परीक्षण का उपयोग कर. (ग) नियंत्रण प्रयोग जिसमें सतह-एक्सप्रेस्ड एपिटोपों को अवरोधित करने के लिए फैब ऊष्मायन चरण को छोड़ दिया गया था। स्केल बार्स - 50 डिग्री (पूरे सेल) या 5 डिग्री (डेन्ट्रीट)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एक सेल और उसके पर्यावरण के बीच बातचीत (उदा., अन्य कोशिकाओं के साथ संचार, विभिन्न उत्तेजनाओं, आदि के लिए प्रतिक्रिया), भारी सेल सतह पर रिसेप्टर्स की सही अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है. सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर सामग्री में तेजी से और ठीक धुन विनियमन एक लगातार बदलते वातावरण के लिए उचित सेलुलर प्रतिक्रिया सक्षम बनाता है. न्यूरॉन्स के विशेष मामले में, संख्या में परिवर्तन, स्थानीयकरण, और synaptically व्यक्त रिसेप्टर्स की उपइकाई संरचना भारी synaptic संचार को प्रभावित करती है, synaptogenesis, और synaptogenesis, और synaptic pruning3, 5,10. इसलिए, रिसेप्टर सतह अभिव्यक्ति का सटीक विश्लेषण और इसके विनियमन अंतर्निहित तंत्र अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण विषय है.

कई तौर-तरीके मौजूद हैं जिनके द्वारा ग्राही सतह अभिव्यक्ति का अध्ययन किया जा सकता है। सामान्य में, इन तीन मुख्य श्रेणियों के तहत गिरावट: (i) सतह व्यक्त रिसेप्टर आबादी के जैव रासायनिक अलगाव, (ii) इमेजिंग तकनीक सतह पर रिसेप्टर्स कल्पना करने के लिए, और (iii) कार्यात्मक तकनीक रिसेप्टर के परिणामों की निगरानी करने के लिए सक्रियण. इन दृष्टिकोण पूरक हैं और रिसेप्टर्स की सतह अभिव्यक्ति के बारे में विशिष्ट सवालों के जवाब देने के लिए संयोजन के रूप में उपयोग किया जा सकता है.

सतह व्यक्त रिसेप्टर्स के जैव रासायनिक अलगाव के उदाहरणों में सुसंस्कृत कोशिकाओं या मस्तिष्क स्लाइसों में बायोटिनिलन प्रोटोकॉल और सुसंस्कृत कोशिकाओं या ऊतक11के उपकोशिकीय प्रभाजन शामिल हैं . सतह biotinylation एस्टर सक्रिय बायोटिन के साथ संस्कृतियों incubating द्वारा बायोटिन के साथ सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स की लेबलिंग पर आधारित है। एस्टर समूह प्राथमिक अमीनो समूहों (-एनएच2) के साथ स्थिर ऐमाइड आबंध बनाने के लिए अभिक्रिया करता है। क्योंकि इस अभिकर्मक सेल-अपारगम्य है, केवल सतह-एक्सप्रेसप्रोटीन biotin के साथ लेबल कर रहे हैं. डिटर्जेंट का उपयोग सेलुलर lysis के बाद, लेबल रिसेप्टर Agarose मोती avidin या उसके वेरिएंट जो बायोटिन के लिए एक मजबूत संबंध है, तो इम्यूनोब्लोtting द्वारा मूल्यांकन करने के लिए संयुग्मी के साथ सेल lysate incubating द्वारा बरामद किया जा सकता है. उपकोशिकीय विदारण एक जैव रासायनिक प्रोटोकॉल है जो विभिन्न घनत्व12के आधार पर विभिन्न कोशिकीय झिल्लीवाले डिब्बों को अलग करने के लिए अनेक सेंट्रीफ्यूगेशन चरणों का उपयोग करता है। दोनों तकनीकअंतर्जात प्रोटीन की सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोगी होते हैं और औषधीय दृष्टिकोण के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (दोनों विवो में और संस्कृति में) कैसे आणविक जोड़तोड़ सतह अभिव्यक्ति को प्रभावित निर्धारित करने के लिए रिसेप्टर्स की. वे विशेष रूप से उपयोगी होते हैं क्योंकि कई अंतर्जात रिसेप्टर्स में परिवर्तन, एक मानक के सापेक्ष, एक साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. हालांकि, इमेजिंग तौरतरीकों के विपरीत, जैसे कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित, स्थानिक संकल्प नमूनों के जैव रासायनिक प्रसंस्करण के माध्यम से खो जाता है।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल इमेजिंग तकनीक श्रेणी के अंतर्गत आता है. दृष्टिकोणों का यह समूह (जैसे सतह लेबलिंग और फ्लोरोसेंट रूप से टैग किए गए अति-संहारित प्रोटीन के लाइव-सेल इमेजिंग) रिसेप्टर्स की सतह अभिव्यक्ति के लिए spatiotemporal संकल्प देने के लिए उपयोगी होते हैं। उदाहरण के लिए, एएमएपीआर की सतह बनाम इंट्रासेल्यूलर अभिव्यक्ति की जांच करके, जैसा कि पहले उदाहरण दिया गया है, एक जांच कर सकता है कि डिपेंड्राइट (इस विशेष आवेदन के लिए ब्याज के जैविक डिब्बे) में अभिव्यक्ति में परिवर्तन कैसे स्पष्ट किए जाते हैं। जैव रासायनिक प्रभाज की तरह, दवाओं इमेजिंग तकनीक के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है सतह अभिव्यक्ति पर एक दवा के प्रभाव का निर्धारण. इसके अलावा, संशोधनों युक्त रिसेप्टर्स के साथ न्यूरॉन्स के transfection (परिवर्तन या टैग) आगे इमेजिंग के लिए possiblities बताते हैं. उत्परिवर्ती रिसेप्टर्स के साथ संक्रमण सतह अभिव्यक्ति पर एक विशेष उत्परिवर्तन के प्रभाव को रेखांकित कर सकते हैं.

रिसेप्टर तस्करी की कल्पना करने के लिए एक और उपयोगी दृष्टिकोण फ्लोरोसेंटटैग के साथ प्राथमिक संस्कृतियों के transfection के बाद लाइव इमेजिंग माइक्रोस्कोपी है, जैसे Superecliptic phluorin (SEP)- या अन्य फ्लोरोफोर-टैग निर्माण13. SEP-टैग रिसेप्टर्स सतह व्यक्त रिसेप्टर्स का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है, के रूप में इस fluorophore केवल fluoresce जब extracellular माध्यम के संपर्क में होगा. पिछले उदाहरण की तरह, औषधीय दृष्टिकोण इस्तेमाल किया जा सकता है, या रिसेप्टर पर किए गए उत्परिवर्तनों, निर्धारित करने के लिए अगर इन रिसेप्टर की सतह अभिव्यक्ति विशेषताओं को बदलने. दवाओं के मामले में, लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग वास्तविक समय में सतह अभिव्यक्ति में संशोधनों की निगरानी के लिए किया जा सकता है। लाइव इमेजिंग के लिए एक सीमा सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन में मशीनी अंतर्दृष्टि की कमी है. उदाहरण के लिए, एक कम सतह अभिव्यक्ति या तो वृद्धि हुई रिसेप्टर internalization का एक परिणाम हो सकता है, कम रिसेप्टर रीसाइक्लिंग, या दोनों.

इस प्रश्न का उत्तर देने के लिए, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है. एक अन्य महत्वपूर्ण तस्करी घटना है कि लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग कर निगरानी किया जा सकता है प्लाज्मा झिल्ली में विभिन्न डिब्बों के बीच रिसेप्टर्स के पार्श्व प्रसार है (जैसे, synaptic और extrasynaptic साइटों के बीच). इस मामले में, पसंद की तकनीक एकल-कण ट्रैकिंग दृष्टिकोणों का उपयोग करती है जिसमें एक फ्लोरोसेंट अर्धचालक नैनोक्रिस्टल [यानी, क्वांटम डॉट (क्यूडी)] ब्याज के प्रोटीन पर एक extracellular epitope के खिलाफ एक एंटीबॉडी से जुड़ा हुआ है। QDs उल्लेखनीय स्थिरता (पारंपरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तुलना में बहुत कम photobleaching की अनुमति), मजबूत चमक, और / बंद स्थिति के बीच परिवर्तन की विशेषता है ("blinking"). उपयुक्त माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करके, यह सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली14के माध्यम से एक ही QD के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए संभव है (और, इसलिए, ब्याज की एक प्रोटीन) .

वर्तमान प्रोटोकॉल सतह की आबादी में रिसेप्टर्स की एक परीक्षा प्रदान करता है, internalized जनसंख्या, और पुनर्नवीनीकरण जनसंख्या, अनुपात की गणना के लिए अनुमति निर्धारित करने के लिए कैसे इन प्रक्रियाओं कुल सतह अभिव्यक्ति नियंत्रण. इसके अलावा, विभिन्न timepoints पर internalization या रीसाइक्लिंग प्रक्रियाओं को रोकने लौकिक संकल्प कहते हैं. इस विधि, इसलिए, spatiotemporal सतह अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए अनुमति देता है. अन्य इमेजिंग तकनीकों के विपरीत, अंतर्जात सतह अभिव्यक्ति के स्तर का भी अध्ययन किया जा सकता है (उदा., AMPAR), बशर्ते कि रिसेप्टर के अतिरिक्त कोशिकीय भाग के खिलाफ एक एंटीबॉडी मौजूद है। हालांकि, क्योंकि इस विधि कोशिकाओं के निर्धारण की आवश्यकता है, यह लाइव सेल इमेजिंग के साथ संगत नहीं है और इस तरह वास्तविक समय की जानकारी प्रदान नहीं कर सकते.

अंत में, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी15 या कैल्शियम इमेजिंग16 जैसे कार्यात्मक दृष्टिकोण शक्तिशाली हैं, हालांकि अक्सर अप्रत्यक्ष, रिसेप्टर्स की सतह अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए शिष्टाचार। इन तरीकों रिसेप्टर सक्रियण के बाद सेल में कार्यात्मक परिवर्तन के परिमाणीकरण पर आधारित हैं (उदाहरण के लिए, झिल्ली क्षमता या कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन). किसी दिए गए रिसेप्टर की प्रतिक्रिया को अलग करने के लिए औषध विज्ञान का उपयोग करना, इन तरीकों को एक सटीक, spatiotemporal तरीके से सेल सतह पर व्यक्त रिसेप्टर्स के आकलन के लिए अनुमति देते हैं. इन तरीकों बहुमुखी हैं और संस्कृति में कोशिकाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं और अधिक शारीरिक स्थितियों में ex vivo (उदाहरण के लिए, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस) और विवोमें. हालांकि, लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण के मामले में के रूप में, मशीनी जानकारी अक्सर जब कार्यात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर याद किया है.

सारांश में, रिसेप्टर सतह अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए तकनीकों का एक संयोजन पूरी तरह से कैसे सतह अभिव्यक्ति नियंत्रित किया जाता है समझने के लिए नियोजित किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल विशेष रूप से शक्तिशाली है क्योंकि यह अलग प्राथमिक संस्कृतियों में रिसेप्टर्स की spatiotemporal सतह अभिव्यक्ति की एक मशीनी समझ प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम Nikon A1 Confocal माइक्रोस्कोप और योजना और प्रयोगों का विश्लेषण करने में उनकी सहायता के उपयोग के लिए उन्नत माइक्रोस्कोपी के लिए नॉर्थवेस्टर्न सेंटर धन्यवाद. इस शोध NIGMS (T32GM008061) (ए एम सी), और एनआईए (R00AG041225) और मस्तिष्क और व्यवहार अनुसंधान फाउंडेशन (#24133) (ए एस -सी) से एक NARSAD युवा अन्वेषक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

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References

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