En antikropps matning metod för att studera glutamat-Receptorhandel i dissocierade primära hippocampal kulturer

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den här artikeln presenterar en metod för att studera handel med glutamatreceptorer (GluR) i dissocierade primära Hippocampus kulturer. Med hjälp av en metod för antikropps matning för att märka endogena eller överuttryckta receptorer i kombination med farmakologiska metoder, möjliggör denna metod identifiering av molekylära mekanismer som reglerar GluR-ytans uttryck genom att modulera processer för internalisering eller återvinning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cellulära svar på yttre stimuli är starkt beroende av den uppsättning av receptorer som uttrycks på cellytan vid en given tidpunkt. Följaktligen är befolkningen i ytan-uttryckta receptorer ständigt anpassar sig och omfattas av strikta mekanismer för reglering. Det paradigmatiska exemplet och en av de mest studerade människohandel händelserna i biologi är den reglerade kontrollen av det synaptiska uttrycket av glutamatreceptorer (GluRs). GluRs förmedlar de allra flesta excitatoriska neurotransmission i centralanervsystemet och kontrollera fysiologiska aktivitet-beroende funktionella och strukturella förändringar på Synaptic och neuronala nivåer (t. ex., synaptisk plasticitet). Ändringar i antal, plats och subenhet sammansättning av ytan uttryckt glurs påverkar djupt neuronala funktion och, i själva verket, förändringar i dessa faktorer är förknippade med olika neuropatier. Presenteras här är en metod för att studera GluR trafficking i dissocierade Hippocampus primära nervceller. En "antikropps matning" metod används för att Differentiellt visualisera GluR populationer uttrycks på ytan och inre membran. Genom att märka ytan receptorer på levande celler och fastställa dem vid olika tidpunkter för att möjliggöra receptorer endocytos och/eller återvinning, dessa människohandel processer kan utvärderas och selektivt studeras. Detta är ett mångsidigt protokoll som kan användas i kombination med farmakologiska metoder eller överuttryck av förändrade receptorer för att få värdefull information om stimuli och molekylära mekanismer som påverkar GluR-handeln. På samma sätt, det kan lätt anpassas för att studera andra receptorer eller ytan uttrycks proteiner.

Introduction

Celler utnyttjar den aktiva processen för människohandel för att mobilisera proteiner till specifika subcellulära lokaliseringar och utöva strikt spatiotemporal reglering över sin funktion1. Denna process är särskilt viktigt för transmembranreceptorer, som cellulära svar på olika miljömässiga stimuli förlitar sig på intracellulära kaskader utlöses av receptor aktivering. Celler kan ändra dessa svar genom att ändra täthet, lokalisering, och subenhet sammansättning av receptorer uttrycks på cellytan via receptor subcellulära människohandel regulation2. Införandet av nyligen syntetiserade receptorer i plasmamembranet, tillsammans med endocytos och återvinning av befintliga receptorer är exempel på människohandel processer som avgör nätet pool av ytan-uttryckta receptorer2. Många molekylära mekanismer samverkar för att reglera protein handel, inklusive protein-protein interaktioner och posttranslationella modifieringar såsom fosforylering, ubiquitination, eller palmitoylation2.

Regleringen av receptor handel krävs bestämt i starkt polariserade celler med högt specialiserade strukturerar. Det paradigmatiska exemplet är kontrollen av neuronala funktion genom reglerad handel med glutamatreceptorer (glurs)3,4. Glutamat, den huvudsakliga excitatoriska neurotransmittorn, binder och aktiverar ytan-uttryckte GluRs att kontrollera grundläggande fysiologiska neuronala funktioner såsom synaptisk neurotransmission och synaptisk plasticitet. Det faktum att förändrad GluR-handel har observerats i ett brett spektrum av neuropatier, alltifrån neurologiska utvecklingsstörningar till neurodegenerativa sjukdomar, belyser vikten av denna process5. Att förstå de molekylära händelser som styr GluR-trafficking är därför av intresse för många forskningsområden.

I detta protokoll, en antikropp-utfodring baserad metod används för att kvantifiera nivån på ytan-uttryckta GluRs i primära Hippocampus nervceller samt utvärdera hur förändringar i internalisering och återvinning resultera i den observerade net ytan uttryck. Användning av farmakologi och/eller överuttryck av exogena receptorer härma specifika mutationer gör detta protokoll en särskilt kraftfull metod för att studera molekylära mekanismer bakom neuronala anpassning till olika miljömässiga stimuli. Ett sista exempel på nyttan med detta protokoll är att studera hur multifaktoriella förändringar i miljön (t. ex. i en sjukdoms modell) påverkar GluR-handeln genom undersökning av ytuttryck i sådana modeller.

Med hjälp av specifika exempel, det är initialt visat hur en farmakologisk manipulation imitera fysiologiska synaptisk stimulering [kemisk ltp (cltp)] ökar ytan uttrycket av endogena GluA1 subenhet av AMPA-typ av glurs (ampars) 6. handeln med en överuttryckt Phospho-mimetic form av GluN2B subenhet av NMDA-typ av glurs (nmdars) analyseras också för att exemplifiera hur detta protokoll kan användas för att studera regleringen av Glur-handel med specifika posttranslationella Ändringar. Även om dessa specifika exempel används, detta protokoll kan lätt appliceras på andra GluRs och andra receptorer och proteiner som besitter antigen extracellulära domäner. I det fall att det inte finns några antikroppar tillgängliga för extracellulära domäner, överuttryck av extracellulära Epitope-märkta (t. ex., flagga-, MYC-, GFP-märkta, etc.) proteiner kan bistå i protein märkning.

Det nuvarande protokollet innehåller anvisningar för att kvantifiera specifik GluR subtypdensitet och människohandel med hjälp av specifika antikroppar. Detta protokoll kan utnyttjas för att studera 1) totalt GluR ytuttryck, 2) GluR Internalization, och 3) GluR återvinning. För att studera varje enskild process bör man börja med avsnitten 1 och 2 och fortsätta med antingen avsnitt 3, 4 eller 5. I samtliga fall, avsluta med avsnitten 6 och 8 (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Arbete som hänför sig till Hippocampus primär kultur beredning granskades och godkändes av Northwestern University djuromsorg och användning kommittén (protokoll #IS00001151).

1. Förberedelser före märkning

  1. Beredning och underhåll av primära Hippocampus kulturer
    1. Förbered primära Hippocampus kulturer vid en densitet av 150 000 celler pläterade på Poly-D-lysin-belagda (0,1 mg/ml) 18 mm täckglas. Utmärkta guider för dissocierad neuronala kultur beredning finns7,8.
      Anmärkning: Vid behov kan kulturerna behandlas med cytosinarabinosid (ara-C, 10 mM från DIV1) för att undvika glialproliferation i preparatet.
      Anmärkning: Alternativa beläggnings reagenser som Fibronektin (1 mg/ml) eller laminin (5 mg/ml) kan användas i stället för Poly-D-lysin.
    2. Bibehålla kulturer i en cellinkubator vid 37 ° c och 5% CO2 i 2 ml/brunn av neurobasal Media kompletterat med B27 och 2 mm L-glutamin.
      Anmärkning: Substitut för L-glutamin (t. ex., Glutamax) kan användas, om så önskas.
    3. På veckobasis, ta bort halva volymen av media och ersätta med samma volym kompletteras neurobasal media.
  2. TILLVAL: transfektion av muterade och/eller Epitope-märkta receptorer
    Obs:
    neuroner bör transfekterade minst 3 – 4 dagar före Analystid punkt för att möjliggöra receptor uttryck. Användningen av unga nervceller [dagar in vitro-6 – 9 (DIV6)] resulterar i bättre transfektion effektivitet än äldre (DIV15 – 20) nervceller, men ett tillräckligt antal transfekterade celler (> 20) kan uppnås oavsett div används.
    1. För varje brunn av en 12-bra tallrik, späd 1,5 μg plasmid innehållande konstruktionen av intresse i 100 μl av färska neurobasal media utan B27 eller glutamin tillskott i en microcentrifug rör och blanda genom vortexa snabbt.
      Anmärkning: För framgångsrik transfektion är det viktigt att de neurobasal medier som används är så färskt som möjligt, helst mindre än 1 vecka efter flasköppningen.
    2. I ett andra microcentrifugerör, blanda 1 μL av ett lämpligt lipofektionsreagens i 100 μL av färska neurobasala medier och blanda varsamt.
      Anmärkning: Vortexblanda inte blandningen av lipofektionsreagens. Användning av färska lipofektion reagens kan förbättra transfektion effektivitet.
    3. Inkubera rören i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
    4. Tillsätt lipofektionsreagensblandningen droppvis till DNA-blandningen, blanda försiktigt och inkubera i 20 minuter vid RT.
    5. Justera volymen på mediet i varje brunn till 1 mL konditionerade medier.
    6. Tillsätt lipofektionreagens-DNA-blandningen droppvis till brunnen.
    7. Återsända celler till inkubatorn och tillåta minst 3 – 4 dagar för proteinuttryck.
      Anmärkning: Vid tillämpning av internalisering och återvinning protokoll som beskrivs nedan, Hippocampus nervceller var transfekterade på DIV11-12 med konstruktioner uttrycker GluN2B märkta med GFP i extracellulära domän (GFP-GluN2B) och avbildas på DIV15-16.
  3. TILLVAL: inkubering av celler med läkemedel (kroniskt eller akut) i de konditionerade medierna tills fixering.
    Anmärkning:
    för akut behandling, börja behandla celler innan märkning. Beroende på vilket läkemedels behandlingsprotokoll som används kan celler bibehållas i läkemedel som innehåller Media under avsnitt 2. I vårt exempel var DIV21 celler föremål för ett cLTP-protokoll för att öka ytan-uttryckte AMPAR9.
    1. Utbyte av konditionerade medier för extracellulär lösning (ECS).
    2. Behandla celler med 300 μM glycin i ECS för 3 min vid RT. Som kontroll, behandla en syster täckslip med ECS (utan glycin).
    3. Tvätta cellerna 3x med 37 ° c ECS och returnera cellerna i ECS (utan glycin) till cellinkubatorn i 20 minuter innan du fortsätter med avsnitt 2.
      Anmärkning: ECS (i mm): 150 NaCl, 2 CaCl2,5KCL, 10 Hepes, 30 glukos, 0,001 TTX, 0,01 Strychnine, och 0,03 pikrotoxin vid pH 7,4.

2. live märkning av ytan-uttryckta receptorer

  1. Förbered täcklappar för märkning
    1. För att spara reagenser och underlätta manipulering, överför täckglas cell sidan upp till ett paraffin film täckt bricka.
      Anmärkning: Det är viktigt att aldrig låta proverna torka ut.
    2. Spara och underhålla konditionerade media vid 37 ° c för inkubering och tvättsteg.
      Anmärkning: För en 18 mm täckslip rekommenderas inkubering med 75 – 100 μL media för antikropps märkning och 120 – 150 μL för internalisering/återvinning.
  2. Märkning av ytreceptorer med primär antikropp
    1. Inkubera celler med primär antikropp utspädd i konditionerade medier för 15 min vid RT.
      Anmärkning: För GFP-märkta receptorer, kanin anti-GFP antikropp vid en utspädning av 1:1000 användes. För endogena GluA1, mus anti-GluA1 vid en 1:200 utspädning användes.
    2. Sug försiktigt bort de antikroppshaltiga medierna med hjälp av en vakuum pipett och tvätta celler tre gånger med konditionerade medier.
      Anmärkning: Om konditionerat material inte är tillgängligt kan alla tvättsteg utföras med PBS + [fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1 mM MgCl2 och 0,1 mm CaCl2]. Manuell aspiration med en mikropipett kan utföras om skonsam vakuum aspiration inte finns tillgänglig.

3. ytuttryck (figur 2)

  1. Sekundär antikropp märkning av ytan-uttryckta receptorer
    1. Tvätta en gång med PBS +.
    2. Fix celler genom inkuberande med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) och 4% sackaros i PBS för 7-8 min.
      Anmärkning: Till skillnad från andra fixeringsmetoder såsom metanol inkubering, PFA inte permeabilize plasmamembranet och är därför lämplig för yt-Expression analys. För optimalt resultat, Använd nyberedd PFA. Korttidsförvaring av PFA vid 4 ° c eller långtidslagring (upp till 30 dagar) vid-20 ° c är tillåtande för adekvat fixering.
      Försiktighet: PFA är en känd carcinogen. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och en säkerhets huv vid hantering.
    3. Tvätta celler tre gånger med vanlig PBS.
      Anmärkning: Alternativt, 0,1 M glycin kan användas för tvättning PFA i stället för PBS, som glycin kommer att släcka eventuella kvarvarande fixativ som kan öka bakgrunden i beredningen.
    4. Blockera icke-specifika bindningsställen genom att inkuberera med 10% normalt get serum (NGS) i PBS i 30 minuter vid RT.
      Anmärkning: Blockeringstid kan utökas utan negativa effekter på märkningen.
    5. Inkubera med Fluorescent-märkt sekundär antikropp utspädd i 3% NGS i PBS för 1 h vid RT för att märka primära antikroppsmärkta receptorer (dvs yta-uttryckt).
      Anmärkning: I dessa exempel, en 1:500 utspädning av Alexa 555-konjugerade sekundära antikroppar: Goat anti-kanin för GFP-märkta receptorer och get anti-Mouse för GluA1 användes.
    6. Tvätta celler med PBS 3x.
  2. Märkning av intracellulära receptorer
    1. Permeabilize celler med 0,25% Triton X-100 i PBS för 5 – 10 min vid RT.
      Anmärkning: För att kontrollera att den initiala omgången av antikropp märkning upptar alla ytan epitopes, detta depolarisering steg kan hoppas över i en syster kultur. I detta fall, ingen signal för intracellulära receptorer bör erhållas. Dessutom, för att kontrollera att inga interna receptorer har märkts i föregående avsnitt 2 (dvs., visar integriteten av plasma membranen i kulturen), depolarisering steg kan hoppas över i en syster kultur, och en primär antikropp mot en intracellulärt protein (t. ex., PSD-95 eller MAP2) kan utnyttjas i steg 2.2.1. Ingen signal bör erhållas från denna primär under dessa förhållanden. I detta fall, en kanin anti-PSD-95 antikropp (1:500) användes.
    2. Block med 10% NGS i PBS för 30 min vid RT.
    3. Etikett intracellulära receptorer genom inkuberande permeabiliserade celler med samma primära antikropp som används i avsnitt 2,2 utspädd i 3% NGS i PBS för 1 h vid RT.
      Anmärkning: Den antikropps utspädning för märkning intracellulära receptorer kan vara annorlunda än den som krävs för märkning ytan-uttryckta receptorer. I exemplet GluA1 användes samma antikropps utspädning (1:200).
    4. Tvätta celler 3x med PBS.
    5. Etikett med andra Fluorescent-märkt sekundär antikropp utspädd i 3% NGS i PBS för 1 h vid RT.
      Anmärkning: I dessa exempel användes en 1:500 utspädning av Goat anti-Mouse Alexa 647-konjugerad sekundär antikropp (för GluA1).
    6. Tvätta celler 3x med PBS.

4. internalisering (figur 3)

  1. Internalisering av antikroppsmärkta ytreceptorer
    1. Efter märkning av ytuttryckta receptorer och antikropps tvätt (avsnitt 2,2), underhålla celler i konditionerade medier utan antikropp och returnera dem till inkubatorn (37 ° c) för att möjliggöra internalisering.
      Anmärkning: För NMDA-receptorer, 30 min för internalisering rekommenderas. Som kontroll kan en syster kultur underhållas med konditionerade medier vid 4 ° c under internalisering processen. Minimal receptor internalisering bör ske under dessa förhållanden.
  2. Märkning av ytreceptorer
    1. Tvätta celler en gång med PBS +.
    2. Fix celler med 4% PFA och 4% sackaros i PBS för 7-8 min.
      Försiktighet: Använd lämplig personlig skyddsutrustning och en säkerhets huv vid hantering av PFA.
    3. Tvätta celler 3x med vanlig PBS.
    4. Blockera med 10% NGS i PBS i 30 minuter vid RT för att förhindra icke-specifik bindning.
    5. Inkubera prover med Fluorescent-märkt sekundär antikropp utspädd i 3% NGS i PBS för 1 h vid RT för att märka primära antikroppsmärkta receptorer (dvs., ytaktiva receptorer som inte var internaliserade).
      Anmärkning: I det här exemplet användes Alexa 555-konjugerad get anti-Rabbit sekundär antikropp (1:500) för märkning.
    6. Tvätta celler 3x med PBS.
  3. Märkning av internaliserade receptorer
    1. Permeabilize celler med 0,25% Triton X-100 i PBS för 5 – 10 min.
    2. Blockera ospecifik bindning genom inkubering med 10% NGS i PBS under 30 min vid RT.
    3. Inkubera prover med Fluorescent taggade sekundär antikropp utspädd i 3% NGS i PBS för 1 h vid RT att märka internaliserade antikroppsmärkta receptorer.
      Anmärkning: I det här exemplet används Alexa 647-konjugerad get anti-Rabbit sekundär antikropp (1:500) för märkning.
    4. Tvätta celler 3x med PBS.

5. återvinning (figur 4)

  1. Internalisering av antikroppsmärkta ytreceptorer
    1. Efter märkning av ytuttryckta receptorer och antikropps tvätt (avsnitt 2,2), underhålla celler i konditionerade medier utan antikropp och returnera dem till inkubatorn (37 ° c) för att möjliggöra internalisering.
      Anmärkning: För NMDA-receptorer, 30 min för internalisering rekommenderas.
  2. Blockering av stabil yta uttryckt receptorer
    1. Om du vill blockera epitoper på den primära antikroppen som är kopplad till ytan-uttryckta receptorer som inte har internaliserats, inkubera celler med okonjugerat fab anti-IgG (H + L)-antikroppsfragment (mot det primära som används i avsnitt 2,2) utspädd i konditionerade medier ( 20 μg/mL) i 20 minuter vid RT. Denna behandling förhindrar framtida interaktion med sekundära antikroppar.
      Anmärkning: För detta exempel, Goat anti-kanin fab fragment användes.
      Anmärkning: Kontroll experiment: för att säkerställa att fullständig blockering av ytan-uttryckta receptorer har inträffat, kan syster täckband inkuberas med och utan fab. Kulturer bör fastställas omedelbart efter fab behandling, och båda kulturerna inkuberas med Alexa 555-konjugerad sekundär antikropp. Ingen Alexa 555 signal i fab-inkuberade celler indikerar korrekt antikropps blockering.
    2. Tvätta celler 3x med konditionerade medier.
    3. Inkubera celler med konditionerade medier som innehåller 80 μM dynasore för att förhindra ytterligare internalisering och returnera celler till inkubatorn (37 ° c) för att möjliggöra återvinning av internaliserade receptorer. Dynasore är en GTPase hämmare som hämmar dynamin och därmed förhindrar internalisering.
      Anmärkning: 45 min för nmdar-återvinning rekommenderas. Observera att Dynasore uteslutande blockerar dynamin-beroende internalisering process (t. ex., NMDARs internalisering). Emellertid, internalisering av andra synaptiska protein (dynamin-oberoende) kan fortfarande förekomma i närvaro av Dynasore.
  3. Märkning av återvunna receptorer
    1. Tvätta celler en gång med PBS +.
    2. Fix celler med 4% PFA och 4% sackaros i PBS för 7-8 min.
      Försiktighet: Använd lämplig personlig skyddsutrustning och en säkerhets huv vid hantering av PFA.
    3. Tvätta celler 3x med PBS.
    4. Blockera med 10% NGS i PBS i 30 minuter vid RT för att förhindra icke-specifik bindning.
    5. Märk celler med den första Fluorescent-märkta sekundära antikroppen utspädd i 3% NGS i PBS för 1 h vid RT.
      Anmärkning: I det här exemplet användes Alexa 555-konjugerad get anti-kanin-antikropp (1:500) för märkning.
    6. Tvätta celler 3x med PBS.
      Anmärkning: Längre tvättar med PBS (5 – 10 min) kan bidra till att minska bakgrunden i preparatet.
  4. Märkning av internaliserade receptorer
    1. Permeabilize celler med 0,25% Triton X-100 i PBS för 5 – 10 min.
    2. Block med 10% NGS i PBS för 30 min vid RT.
    3. Etikett med andra Fluorescent-märkt sekundär antikropp utspädd i 3% NGS i PBS för 1 h vid RT.
      Anmärkning: I det här exemplet användes Alexa 647-konjugerad get anti-kanin-antikropp (1:500) för märkning.
    4. Tvätta celler 3x med PBS.

6. montering och avbildning av prover

  1. Montera celler genom att försiktigt placera täckglas cell sidan nedåt på 12 – 15 mL av lämpligt monteringsmedium.
    Anmärkning: Aspiration av överskott montering media kommer att förbättra kvaliteten på bilderna.
  2. Bildceller på ett lämpligt konfokalmikroskop.
    Anmärkning: Det rekommenderas att bilden en z-stack på 60x förstoring med 0,35 μm steg, som omfattar hela tjockleken av neuron.

7. tids överväganden

  1. Detta är ett långt protokoll som kan stoppas på flera punkter. Om så önskas, utför blockering och primär antikropps inkubering steg över natten vid 4 ° c i en fuktig kammare.
  2. Alternativt, om så önskas, Använd en mikrovågsugn vävnad processor för att kraftigt påskynda efter fixering inkubationstider. För alla steg, Använd 150 W vid 30 ° c för "on"-inställningar.
    1. För att blockera, kör processorn vid 2 min "på", "1 min" off, "och 2 min" på. "
    2. För primära och sekundära antikropps inkubations steg, kör processorn vid 3 min "på", "2 min" off, "och 3 min" på.
      Anmärkning: Vi iakttar ingen kvalitetsskillnad genom att göra ovanstående ändringar i protokollet.

8. bildanalys

  1. Det rekommenderas att använda FIJI < https://Fiji.SC/> att genomföra bildanalys, eftersom det är kompatibelt med flera filformat. För våra data förvärvades bilder i Nikon ND2 filformat.
  2. Ett makro skript tillhandahålls för enkel batchkvantifiering av olika parametrar som redan valts av FIJI. Följande steg ingår i makrot:
    Anmärkning: För dessa exempel mättes "Integrated intensitet".
  3. Öppna avbildningsfiler i FIJI och separata kanaler.
  4. Z-projicera varje kanalstapel som en maximal intensitetsprojektion.
  5. Ange ett lägre tröskelvärde för varje kanal.
    Anmärkning: Tröskelvärden bör fastställas empiriskt för varje experimentell datauppsättning. Även om varje kanal kan ha ett separat lägre tröskelvärde, är det viktigt att kanal tröskelvärden bibehålls konsekvent för alla avbildningar av samma datauppsättning.
  6. Välj tre till fem sekundära eller tertiära dendriter och spara dem som regioner av intresse (ROIs).
  7. Mät den integrerade densiteten för varje ROI i yt-och intracellulära kanaler.
  8. Normalisera signalen för varje ROI genom att dividera den integrerade densitetsvärdet av ytan kanalen av intracellulära kanalen.
  9. Upprepa mätningarna för alla kontroll-och experimentella bilder och normalisera experimentella värden för att kontrollera värden (t. ex. GluN2B WT eller No-glycin villkor).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll för att studera handel med glutamatreceptorer bygger på differential märkning av receptorer uttryckta på cellytan och de som uttrycks i inre membran. Segregering uppnås genom märkning receptorerna före och efter membran permeabilization, med samma primära antikropp men en sekundär antikropp konjugerat till en annan fluorophore. I enlighet med de frivilliga åtgärder som ingår i protokollet är detta en mycket mångsidig metod för förhör av olika processer för receptor handel, såsom internalisering och återvinning, och kan lätt anpassas till prövarens behov (figur 1). .

För det första ges en metod för kvantifiering av receptorer uttryckta på neuronala ytan. Detta protokoll möjliggör kvantifiering av basala ytuttryck samt studier av molekylära mekanismer genom vilka olika läkemedel eller mutationer förändrar basala nivåer av ytuttryckta receptorer. Ytuttryckta receptorer var först märkta med inkuberande med både primär och sekundär antikropp före permeabilisering. Efter depolarisering med 0,25% Triton X-100, den intracellulära pool av receptorer är tillgänglig för antikropp märkning. För att illustrera detta protokoll utfördes yta kontra intracellulär färgning av AMPA-receptorer (AMPARs) i kontrollkulturer och efter induktion av cLTP. Specifikt var levande celler märkta med hjälp av en antikropp mot en extracellulär epitop i GluA1 subenhet av ampar, och celler fastställdes sedan märkt med Alexa 555-konjugerat sekundärt. Cellerna var då permeabiliserade och märkta med samma anti-AMPAR antikropp och inkuberades med en sekundär antikropp konjugerat till Alexa 647. Denna dubbla märkning tillåter tydlig visualisering av de två GluA1 populationerna.

Efter att ha förvärvat konfokala bilder, kan den fluorescerande signalen lätt kvantifieras för att visa en ökning av ytan uttryck, i förhållande till den intracellulära populationen, efter cLTP (figur 2A, B). Som en kontroll, depolarisering steg hoppades över (inkubering med 0,25% Triton X-100) i en syster täckslip och en primär antikropp användes mot PSD-95, en vanlig intracellulär markör för excitatoriska synapser. Som framgår av figur 2Ckan ingen signal för PSD-95 erhållas i icke-permeabiliserade celler, vilket visar på integriteten hos plasmamembranet. Detta indikerar att den signal som erhålls för "Surface GluA1" faktiskt motsvarar ytan-uttryckta receptorer (dvs., signal för ytan-uttryckt GluA1 inte inkluderar intracellulära receptorer). Viktigt, en minimal signal för "internaliserad GluA1" kan observeras under icke-permeabilization villkor, visar att alla ytan epitoper upptas av den initiala omgången av antikropp märkning (dvs., signal för intracellulära GluA1 ingår inte som uttrycks i yt-uttryckta receptorer).

En andra process som kan undersökas utnyttja detta protokoll är internaliseringen av ytan-uttryckta receptorer. Specifikt, ytan receptorer är märkta på en levande cell, och nervceller är tillbaka till inkubatorn för en viss tid att genomgå receptor internalisering av clathrin-medierad endocytos. Efter detta steg, celler är fasta för att bevara det rumsliga uttrycket av primära antikroppsmärkta receptorer (dvs., yt-uttryckta och internaliserade receptorer). Sedan, ytan receptorer (dvs., de som inte har internaliserats i tidsperioden av intresse), är märkta med en sekundär antikropp före permeabilisering. Efter permeabilisering, receptorer som har internaliseras är märkta med en sekundär antikropp med en annan fluorophore.

I detta protokoll, det var undersökt hur en viss fosforylering inom PDZ ligand av GluN2B subenhet av nmdars (vid S1480) inducerar nmdar internalisering. För att göra detta, var primära kulturer transfekterade med en Phospho-mimetic receptor, där serin (S1480) hade ersatts av glutamat (E). Den resulterande Mutant, GluN2B S1480E, fungerar som en "konstitutivt-fosforylerad" form av GluN2B. För att underlätta märkning av GluN2B och identifiera Phospho-mimetic Mutant, GFP användes som en epitop tagg på den extracellulära sidan av GluN2B (GFP-GluN2B S1480E). Ytan receptorer på levande celler var märkta med en anti-GFP antikropp för 15 min vid RT. Därefter tvättades överskottet antikropp med konditionerade medier och återvände cellerna till 37 ° c i 30 min för att möjliggöra endocytos. Sedan, celler fastställdes för att frysa receptor rörelse. Receptorer som återstod på ytan var sedan märkta med Alexa 555-konjugerad sekundär antikropp före permeabilisering.

För att identifiera receptorer som hade internaliserats under den 30 min inkubationstiden, celler var permeabilized, och internaliserade receptorer (redan märkt med en primär antikropp) var sedan märkta med Alexa 647-konjugerad antikropp. Återigen, denna Dual-märkning strategi möjliggör kvantifiering av andelen internaliserade receptorer. Detta exempel belyser att GluN2B fosforylering på S1480 främjar receptor internalisering, som Phospho-mimetiska Mutant S1480E visade en mycket högre internalisering förhållande jämfört med WT-receptorer (figur 3a, B). Som en kontroll upprätthölls en syster kultur vid 4 ° c i konditionerade medier under internaliseringen för att kraftigt bromsa processen. Som väntat erhölls ingen signal för "internaliserade" receptorer under dessa förhållanden (figur 3c).

Slutligen kan detta protokoll utnyttjas för att undersöka återvinningen av tidigare internaliserade receptorer. Detta protokoll variation är en fortsättning av internalisering Protocol, genom att följa dessa receptorer tillbaka till cellytan. Det finns två viktiga komponenter till denna variation. För det första, receptorer som förblev stabilt uttryckt på ytan under hela protokollet (dvs. receptorer som inte var internaliserade eller återvinnas) måste vara "blockerad" så att de inte misstas för återvunna receptorer. För att göra detta, innan du utför återvinning steg, levande nervceller inkuberas med höga koncentrationer av Fab som interagerar med primära antikroppsmärkta receptorer uttrycks på ytan för att förhindra ytterligare bindning av fluoroforekonjugerade sekundära Antikropp. För det andra bör internaliseringen förhindras under återvinnings fasen, så att återvunna receptorer inte upprepas internaliseras. Detta gjordes genom att lägga dynasore till medierna under återvinning som denna drog blockerar processer beroende av på dynamin såsom clathrin-medierad endocytos, såsom nmdar internalisering. I detta protokoll, studera handel med fosho-mimetic Mutant GluN2B S1480E utfördes samt ytmärkning av GFP-GluN2B på levande celler, som tillät internalisering under en 30 min period som förklarats tidigare.

Efter detta blockerades ytan receptorer som inte internaliserades under denna period genom inkuberande cellerna med fab för 20 min vid RT. Därefter inkuberades celler igen vid 37 ° c för 45 min för att möjliggöra tidigare internaliserade GluN2B att återvinnas tillbaka till cellytan. Dynasore var närvarande i media under återvinnings steget. Fixering av cellerna efter detta steg möjliggör identifiering av återvunna receptorer (dvs. de som är oblockerade och uttrycks på cellytan) och internaliserade receptorer (dvs. de som är primär antikropp märkta och intracellulära). Av 1) märkning av återvunna receptorer med en Alexa 555-konjugerad sekundär antikropp före permeabilisering och 2) märkning internaliserad, men inte återvunnen, receptorer med Alexa 647-konjugerad sekundär antikropp, ett återvinnings förhållande genererades för att visa att GluN2B S1480E har ingen effekt på återvinning av NMDAR (figur 4a, B). Som en kontroll, det säkerställdes att fullständig blockering av ytan-uttryckta receptorer inträffade genom inkuberande syster COVERSLIPS i närvaro eller frånvaro av Fab, följt med PFA fixering. Som framgår av figur 4c, kan en stark signal observeras för ytan-uttryckt GluN2B i avsaknad av Fab blockering. Denna signal försvinner i fab-behandlade kulturer, vilket visar att blockeringsprotokollet är tillräckligt för att helt blockera ytan-uttryckta epitoper och att de ytsignaler som observerats efter återvinning faktiskt motsvarar receptorer som smugglade tillbaka till plasmamembranet.

Figure 1
Figur 1: Schematisk av protokoll variationer för att studera receptor ytans uttryck, receptor internalisering (endocytos), och receptor återvinning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: cLTP ökar ytan uttrycket av GluA1. Primära Hippocampus nervceller vid DIV21 utsattes för kemisk LTP (cLTP) genom inkuberande med glycin-innehållande ECS. Distinkt märkning av ytan-uttryckt (röd) vs intracellulära (blå) GluA1 populationer avslöjar den förväntade ökningen av ytan uttryck av AMPAR. (A) enda plan och (B) Z-staplade (maximal intensitetsprojektion) konfokalbilder. Skalstreck = 50 μm (hela cellen) eller 5 μm (Dendrite). Grafen visar det ökade ytuttrycket av GluA1 efter cLTP-protokollet. Yta uttrycks index: yta/intracellulära receptorer (n = 3; antal celler: con = 7; cLTP = 7; värdena motsvarar medelvärdet ± SEM; * * * * p < 0,0001 med Mann-Whitney U-test). (C) kontroll experiment där permeabiliseringssteget hoppades över. Förutom yta och inre GluA1, den intracellulära excitatoriska synaptisk markör PSD-95 utvärderades. Skalstreck = 50 μm (hela cellen) eller 5 μm (Dendrite). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: fosforylering av GluN2B på S1480 främjar NMDAR internalisering. Primära Hippocampus nervceller var transfekterade med antingen GFP-GluN2B WT eller Phospho-mimetic Mutant GFP-GluN2B S1480E på DIV11-12. Efter 3-4 dagar av proteinuttryck, yta GFP var märkt på levande celler med en kanin anti-GFP antikropp och celler sedan återvände till 37 ° c för att möjliggöra receptor internalisering av endocytos. Yt-uttryckta exogena receptorer visualiserades med Alexa 555-konjugerad sekundär antikropp, och den internaliserade populationen identifierades efter permeabilisering med hjälp av Alexa 647-konjugerad antikropp. För tydlighetens skull är ytan GFP-GluN2B pseudofärgad i grönt och internaliserad GFP-GluN2B är pseudofärgad i vitt. (A) enda plan och (B) Z-staplade (maximal intensitetsprojektion) konfokalbilder. Skalstreck = 50 μm (hela cellen) eller 5 μm (Dendrite). Grafen visar den förhöjda internaliseringen visas av Phospho-mimetic Mutant GluN2B S1480E. Internalization index: internaliserade receptors/ytbehandla-uttryckta receptors (n = 6; numrera av celler: WT = 34; S1480E = 28; värden motsvarar medelvärdet ± SEM. p < 0,001 med Mann-Whitney U-test). (C) kontroll experiment där internaliserings steget (Intenaliz.) utfördes vid 4 ° c. Skalstreck = 50 μm (hela cellen) eller 5 μm (Dendrite). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: fosforylering av GluN2B vid S1480 ändrar inte NMDAR-materialåtervinningen. Primära Hippocampus nervceller var transfekterade med antingen GFP-GluN2B WT eller Phospho-mimetic Mutant GFP-GluN2B S1480E på DIV11-12 som visas i figur 3. Efter 3-4 dagar av proteinuttryck, yta GFP var märkt på levande celler med en kanin anti-GFP antikropp och celler sedan återvände till 37 ° c för att möjliggöra receptor internalisering av endocytos. Återstående ytan-uttryckta receptorer blockerades av Fab inkubation och återvinning var tillåten för 45 min. tillgänglig yta uttryckt exogena receptorer (återvunnet) visualiserades med Alexa 555-konjugerad sekundär antikropp, och den internaliserade populationen identifierades efter permeabilisering med hjälp av Alexa 647-konjugerad antikropp. För tydlighetens skull är ytan GFP-GluN2B pseudofärgad i vitt och internaliserad GFP-GluN2B är pseudofärgad i grönt.  (A) enda plan och (B) Z-staplade (maximal intensitetsprojektion) konfokalbilder. Skalstreck = 50 μm (hela cellen) eller 5 μm (Dendrite). Grafen visar bristen på effekt GluN2B S1480 fosforylering har på återvinning. Återvinnings index: återvunna receptorer/internaliserade receptorer (n = 5; antal celler: WT = 27; S1480E = 24; värden motsvarar medelvärdet ± SEM. ns = ej signifikant med Mann-Whitney U-test). Ckontroll experiment där fab-inkuberingsteckningen för att blockera ytaktiva epitoper hoppades över. Skalstreck = 50 μm (hela cellen) eller 5 μm (Dendrite). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Samspelet mellan en cell och dess omgivning (t. ex. kommunikation med andra celler, respons på olika stimuli, etc.), är starkt beroende av det korrekta uttrycket av receptorer på cellytan. Den snabba och finjusterade regleringen i ytan-uttryckt receptor innehåll möjliggör korrekt cellulära svar på en ständigt föränderlig miljö. I det särskilda fallet av nervceller, förändringar i antalet, lokalisering, och subenhet sammansättning synaptically uttryckt receptorer starkt påverkar synaptisk kommunikation, synaptisk plasticitet, synaptogenes, och synaptisk beskärning3, 5,10. Därför är noggrann analys av receptor ytans uttryck och mekanismen bakom dess reglering ett viktigt ämne för forskning.

Det finns ett antal modaliteter genom vilka receptor ytans uttryck kan studeras. I allmänhet faller dessa under tre huvudkategorier: (i) biokemisk isolering av ytan uttryckt receptor population, (II) avbildningstekniker för att visualisera receptorer på ytan, och (III) funktionella tekniker för att övervaka konsekvenserna av receptor Aktiveringen. Dessa metoder kompletterar varandra och kan användas tillsammans för att besvara specifika frågor om ytans uttryck för receptorer.

Exempel på biokemiska isolering av ytan uttryckt receptorer inkluderar biotinylation protokoll i odlade celler eller hjärn skivor och subcellulär fraktionering av odlade celler eller vävnad11. Ytbehandla biotinylation baseras på märka av ytbehandla-uttryckte receptors med biotin, genom att ruinera kulturerna med Ester-aktiverat biotin. Ester-gruppen reagerar med primära aminogrupper (-NH2) för att bilda stabila amidbindningar. Eftersom denna reagens är cell-impermeable, endast yta-uttryckta proteiner är märkta med biotin. Efter cellulär Lys med hjälp av rengöringsmedel, märkt receptor kan återvinnas genom inkuberande cellen lysate med Aguppkom pärlor konjugerat till avidinen eller dess varianter som har en stark affinitet för biotin, sedan utvärderas genom Immunoblotting. Subcellulär fraktionering är ett biokemiskt protokoll som använder flera centrifugeringssteg för att isolera olika cellulära membranösa fack baserat på deras olika densiteter12. Båda teknikerna är användbara för att kvantifiera förändringar i ytan uttryck för endogena proteiner och kan användas i samband med farmakologiska metoder (både in vivo och i kulturen) för att avgöra hur molekylära manipulationer påverkar ytan uttryck av receptorer. De är särskilt användbara eftersom förändringar i flera endogena receptorer, i förhållande till en standard, kan kvantifieras samtidigt. Till skillnad från avbildningsmetoder, som det som beskrivs i detta protokoll, försvinner dock rumslig upplösning genom biokemisk bearbetning av prover.

Det protokoll som beskrivs här tillhör kategorin Imaging Techniques. Denna grupp av tillvägagångssätt (såsom ytmärkning och levande cell avbildning av fluorescerande märkta överuttryckta proteiner) är användbara för att ge spatiotemporal upplösning till ytan uttryck för receptorer. Till exempel genom att undersöka yta kontra intracellulära uttryck av AMPAR, som exemplifieras tidigare, kan man undersöka hur förändringar i uttrycket uttalas i dendriter (den biologiska fack av intresse för denna särskilda ansökan). Liksom biokemiska fraktionering, droger kan användas med avbildningstekniker för att bestämma effekterna av en drog på ytan uttryck. Dessutom, transfektion av nervceller med receptorer som innehåller modifieringar (mutationer eller taggar) ytterligare utvecklar possiblities för avbildning. Transfektion med muterade receptorer kan avgränsa effekterna av en viss mutation på ytan uttryck.

En annan användbar metod för att visualisera receptor trafficking är Live Imaging mikroskopi efter transfektion av primära kulturer med Fluorescent taggade konstruktioner, såsom superecliptic phluorin (Sep)-eller andra fluorophore-märkta konstruktioner13. SEP-märkta receptorer kan vara särskilt användbara för att studera ytan uttryckt receptorer, eftersom denna fluorophore bara fluorescerar när den utsätts för det extracellulära mediet. Liksom tidigare exempel kan farmakologiska metoder användas, eller mutationer som görs på receptorn, för att avgöra om dessa ändrar ytan uttrycks egenskaper hos receptorn. När det gäller droger, kan Live-cell Imaging användas för att övervaka ändringar i ytan uttryck i realtid. En begränsning till levande avbildning är avsaknaden av mekanistisk insikt i förändringar i ytuttryck. Till exempel, en minskad yta uttryck kan vara ett resultat av antingen ökad receptor internalisering, minskad receptor återvinning, eller båda.

För att besvara denna fråga kan det protokoll som beskrivs ovan användas. En annan viktig människohandel händelse som kan övervaka med levande avbildning metoder är den laterala spridningen av receptorer mellan olika fack i plasmamembranet (t. ex. mellan synaptiska och extrasynaptic platser). I detta fall, den teknik som val är användningen av Single-partikel tracking metoder där en fluorescens halvledare av [dvs, Quantum dot (QD)] är ansluten till en antikropp mot en extracellulär epitop på proteinet av intresse. QDs kännetecknas av anmärkningsvärd stabilitet (tillåter mycket mindre photoblekning än traditionella fluorescerande proteiner), stark ljusstyrka, och växlingen mellan on/off status ("blinkande"). Genom att använda lämpliga Mikroskop inställningar, är det möjligt att spåra förflyttning av en enda QD (och därför ett enda protein av intresse) genom cellulära plasmamembranet14.

Det nuvarande protokollet ger en undersökning av receptorer i ytan befolkningen, internaliserad befolkning, och återvunnen population, vilket möjliggör beräkning av nyckeltal för att avgöra hur dessa processer kontrollera totala ytan uttryck. Dessutom stoppar internalisering eller återvinning processer vid olika tidpunkter lägger till temporala upplösning. Den här metoden möjliggör därför spatiotemporal yta uttrycks studier. Till skillnad från andra avbildningstekniker, nivåer av endogena ytan uttryck kan också studeras (t. ex., AMPAR), förutsatt att det finns en antikropp mot den extracellulära delen av receptorn. Men eftersom den här metoden kräver fixering av celler är den inte kompatibel med levande cell avbildning och kan därför inte ge realtidsinformation.

Slutligen, funktionella metoder som elektrofysiologi15 eller kalcium avbildning16 är kraftfulla, men ofta indirekta, seder att studera ytan uttryck för receptorer. Dessa metoder är baserade på kvantifiering av funktionella förändringar i cellen efter receptor aktivering (t. ex. förändring i membranpotential eller kalciumkoncentration). Med hjälp av farmakologi för att isolera svaret från en given receptor, dessa metoder möjliggör uppskattning av de receptorer som uttrycks på cellytan i en exakt, spatiotemporal sätt. Dessa metoder är mångsidiga och möjliggör studiet av celler i kulturen och i mer fysiologiska tillstånd ex vivo (t. ex., akuta hjärn skivor) och in vivo. Men som i fallet med Live Imaging metoder, är mekanistisk information ofta missade när du använder funktionella metoder.

Sammanfattnings, en kombination av tekniker för att studera receptor yta uttryck kan användas för att fullt förstå hur ytan uttryck styrs. Det protokoll som presenteras här är särskilt kraftfullt eftersom det ger en mekanistisk förståelse av den spatiotemporal ytan uttryck för receptorer i dissocierade primära kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Northwestern Center för avancerad mikroskopi för användning av Nikon a1 konfokala Mikroskop och deras hjälp med att planera och analysera experimenten. Denna forskning stöddes av NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), och NIA (R00AG041225) och ett NARSAD Young Investigator Grant från hjärnan & beteende Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100, (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290, (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62, (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22, (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29, (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19, (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics