En antistof fodring tilgang til at studere glutamat receptor handel i dissocierede primære hippocampus kulturer

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikel præsenterer en metode til at studere glutamat receptor (GluR) handel med dissocierede primære hippocampus kulturer. Ved hjælp af en antistof-fodring tilgang til at mærke endogene eller over udtrykte receptorer i kombination med farmakologiske tilgange, denne metode giver mulighed for identifikation af molekylære mekanismer regulerer GluR overflade ekspression ved at moduere internaliserings-eller genanvendelsesprocesser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cellulære reaktioner på eksterne stimuli er stærkt afhængige af det sæt af receptorer, der udtrykkes ved cellens overflade på et givet tidspunkt. Derfor er populationen af overflade-udtrykte receptorer konstant tilpasning og underlagt strenge reguleringsmekanismer. Det paradigmatiske eksempel og en af de mest studerede menneskehandel begivenheder i biologi er den regulerede kontrol af det synaptiske udtryk af glutamat receptorer (GluRs). GluRs mægle langt størstedelen af excitatoriske neurotransmission i det centrale nervesystem og kontrollere fysiologiske aktivitets afhængige funktionelle og strukturelle ændringer på den synaptiske og neuronal niveauer (f. eks, synaptisk plasticitet). Ændringer i antallet, placering, og underenhed sammensætning af overflade udtrykt glurs dybt påvirke neuronal funktion og, i virkeligheden, ændringer i disse faktorer er forbundet med forskellige neuropatier. Præsenteret her er en metode til at studere GluR handel i dissocierede hippocampus primære neuroner. En "antistof-fodring" tilgang anvendes til differentielt visualisere GluR populationer udtrykt ved overfladen og indre membraner. Ved at mærkning overflade receptorer på levende celler og fastsættelse dem på forskellige tidspunkter for at give mulighed for receptorer endokytose og/eller genanvendelse, disse menneskehandel processer kan evalueres og selektivt undersøgt. Dette er en alsidig protokol, der kan anvendes i kombination med farmakologiske tilgange eller over ekspression af ændrede receptorer for at få værdifuld information om stimuli og molekylære mekanismer, som påvirker GluR-handel. Tilsvarende kan det let tilpasses til at studere andre receptorer eller overflade udtrykte proteiner.

Introduction

Celler udnytter den aktive proces af menneskehandel til at mobilisere proteiner til specifikke subcellulære lokaliseringer og udøve streng spatiotemporale regulering over deres funktion1. Denne proces er især vigtigt for transmembran receptorer, som cellulære reaktioner på forskellige miljømæssige stimuli stole på intracellulære kaskader udløst af receptor aktivering. Celler er i stand til at ændre disse reaktioner ved at ændre tæthed, lokalisering, og underenhed sammensætning af receptorer udtrykt ved cellens overflade via receptor subcellulære handel regulation2. Indsættelse af nyligt syntetiserede receptorer i plasma membranen, sammen med endokytose og genanvendelse af eksisterende receptorer er eksempler på menneskehandel processer, der bestemmer netto puljen af overflade-udtrykte receptorer2. Mange molekylære mekanismer samarbejder om at regulere protein smugling, herunder protein-protein interaktioner og posttranslationelle modifikationer såsom fosforylering, allestedsnærværende eller palmitoylering2.

Regulering af receptor handel er især påkrævet i stærkt polariserede celler med højt specialiserede strukturer. Det paradigmatiske eksempel er kontrol af neuronal funktion af reguleret handel med glutamat receptorer (glurs)3,4. Glutamat, den vigtigste excitatoriske neurotransmitter, binder og aktiverer overflade-udtrykte glurs til at kontrollere grundlæggende fysiologiske neuronal funktioner såsom synaptisk neurotransmission og synaptisk plasticitet. Den kendsgerning, at ændret GluR-handel er blevet observeret i et bredt spektrum af neuropatier, der spænder fra neuroudviklingsmæssige lidelser til neurodegenerative sygdomme, fremhæver betydningen af denne proces5. Således forståelse af de molekylære begivenheder, der kontrollerer GluR handel er af interesse i mange områder af forskning.

I denne protokol anvendes en antistoffodrings baseret metode til at kvantificere niveauet af overflade-udtrykte GluRs i primær hippocampus neuroner samt evaluere, hvordan ændringer i internalisering og genanvendelse resulterer i den observerede netto overflade ekspression. Brugen af farmakologi og/eller overekspression af eksogene receptorer harkedeligt specifikke mutationer gør denne protokol en særlig kraftfuld tilgang til at studere molekylære mekanismer underliggende neuronal tilpasning til forskellige miljømæssige stimuli. Et sidste eksempel på nytten af denne protokol er at undersøge, hvordan multifaktorielle ændringer i miljøet (f. eks. i en sygdomsmodel) påvirker GluR-handel gennem undersøgelse af overflade ekspression i sådanne modeller.

Ved hjælp af specifikke eksempler, det er i første omgang demonstreret, hvordan en farmakologisk manipulation efterligner fysiologiske synaptisk stimulation [Chemical LTP (cltp)] øger overflade ekspression af den endogene GluA1 underenhed af AMPA-type af glurs (ampars) 6. ulovlig handel med overudtrykt phospho-mimetisk form af GluN2B underenhed af NMDA-type af GluRs (NMDARs) analyseres også for at eksemplificere, hvordan denne protokol kan anvendes til at studere reguleringen af GluR-handel ved specifikke posttranslationelle Ændringer. Selv om disse specifikke eksempler anvendes, denne protokol kan nemt anvendes til andre GluRs og andre receptorer og proteiner, der besidder antigene ekstracellulære domæner. I tilfælde af, at der ikke er antistoffer til rådighed for ekstracellulære domæner, over ekspression af ekstracellulære epitope-Tagged (f. eks flag-, MYC-, GFP-Tagged, etc.) proteiner kan hjælpe med protein mærkning.

Den nuværende protokol indeholder anvisninger til kvantificering af specifik GluR-subtype tæthed og handel med specifikke antistoffer. Denne protokol kan anvendes til at studere 1) total GluR overflade ekspression, 2) GluR internalisering, og 3) GluR genanvendelse. For at studere hver proces individuelt, anbefales det at begynde med afsnit 1 og 2 og fortsætte med enten afsnit 3, 4 eller 5. I alle tilfælde afsluttes med punkt 6 og 8 (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Arbejdet vedrørende hippocampus primær kultur forberedelse blev revideret og godkendt af det nordvestlige Universitets udvalg for dyrepasning og-anvendelse (protokol #IS00001151).

1. forberedelse før mærkning

  1. Klargøring og vedligeholdelse af primære hippocampus-kulturer
    1. Forbered primære hippocampus kulturer ved en tæthed på 150.000 celler belagt på poly-D-lysin-belagt (0,1 mg/mL) 18 mm Cover briller. Fremragende guider til dissocieret neuronal kultur forberedelse er tilgængelige7,8.
      Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan kulturerne behandles med cytosin arabinosid (ara-C, 10 mM fra DIV1) for at undgå gliaceller spredning i præparatet.
      Bemærk: Alternative belægning reagenser såsom fibronektin (1 mg/ml) eller Laminin (5 mg/ml) kan anvendes i stedet for poly-D-lysin.
    2. Vedligeholde kulturer i en celle inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i 2 ml/brønd af neurobasal medier suppleret med B27 og 2 mm L-glutamin.
      Bemærk: Erstatninger for L-glutamin (f. eks. Glutamax) kan anvendes, hvis det ønskes.
    3. På ugentlig basis, fjerne halvdelen af mængden af medier og erstatte med den samme volumen af suppleret neurobasal medier.
  2. Valgfrit: Transfection af muterede og/eller epitope-mærkede receptorer
    Bemærk:
    neuroner skal transfteres mindst 3 – 4 dage før analysetidspunktet for at tillade receptor ekspression. Brugen af unge neuroner [Days in vitro 6 – 9 (DIV6)] resulterer i bedre transfektering effektivitet end ældre (DIV15-20) neuroner, men et tilstrækkeligt antal transficeret celler (> 20) kan opnås uanset div ansat.
    1. For hver brønd af en 12-brønd plade, fortyndes 1,5 μg plasmid indeholdende konstruktionen af interesse i 100 μL af friske neurobasal medier uden B27 eller glutamin tilskud i en mikrocentrifuge tube og blandes ved vortexning hurtigt.
      Bemærk: For vellykket transfection er det afgørende, at de anvendte neurobasal medier er så friske som muligt, ideelt mindre end 1 uge efter flaske åbning.
    2. I et andet mikrocentrifuge glas blandes 1 μL af et passende lipofection reagens i 100 μL frisk neurobasal medie og blandes forsigtigt.
      Bemærk: Du må ikke vortex lipofection reagens blandingen. Brug af friske lipofection reagenser kan forbedre transfektering effektivitet.
    3. Inkubér rørene i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
    4. Tilsæt lipofection reagens blandingen dråbevis til DNA-blandingen, bland forsigtigt, og Inkuber i 20 minutter ved rt.
    5. Juster lydstyrken for mediet i hver brønd til 1 mL konditioneret medie.
    6. Tilsæt lipofection reagens-DNA-blandingen dråbevis til brønden.
    7. Returnere celler til inkubator og give mindst 3 – 4 dage for protein ekspression.
      Bemærk: Med henblik på internalisering og genbrug protokoller skitseret nedenfor, hippocampus neuroner blev transficeret på DIV11 med konstruktioner, der udtrykker GluN2B Tagged med gfp i det ekstracellulære domæne (gfp-GluN2B) og afbildet på DIV15 – 16.
  3. Valgfrit: inkubation af celler med lægemidler (kronisk eller akut) i konditionerede medier indtil fiksering.
    Bemærk:
    for akut behandling, begynde at behandle celler før mærkning. Afhængigt af den anvendte lægemiddel behandlingsprotokol kan cellerne vedligeholdes i stof-holdige medier under afsnit 2. I vores eksempel, DIV21 celler var omfattet af en cLTP protokol til at øge overflade-udtrykte AMPAR9.
    1. Exchange konditionerede medier til ekstracellulær opløsning (ECS).
    2. Behandl celler med 300 μM glycin i ECS i 3 minutter ved RT. Som en kontrol, behandle en søster dækglas med ECS (uden glycin).
    3. Vask cellerne 3x med 37 °C ECS og returner cellerne i ECS (uden glycin) til celle inkubatoren i 20 minutter før du fortsætter med afsnit 2.
      Bemærk: ECS (i mm): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCL, 10 Hepes, 30 glucose, 0,001 ttx, 0,01 stryknin og 0,03 Picrotoxin ved pH 7,4.

2. live mærkning af overflade-udtrykte receptorer

  1. Forbered dæksedler til mærkning
    1. For at spare reagenserne og lette manipulationen, skal du overføre en celle side til en paraffin filmbelagt bakke.
      Bemærk: Det er afgørende at aldrig lade prøverne tørre ud.
    2. Gem og vedligehold konditionerede medier ved 37 °C til inkubations-og vaske trin.
      Bemærk: Til en 18 mm dækseddel anbefales inkubation med 75 – 100 μL medier til antistof mærkning og 120 – 150 μL til internalisering/genanvendelse.
  2. Mærkning af overflade receptorer med primært antistof
    1. Inkubatceller med primært antistof fortyndet i konditionerede medier i 15 minutter ved RT.
      Bemærk: For GFP-mærkede receptorer blev der anvendt kanin-anti-GFP-antistoffer ved en fortynding på 1:1000. For endogene GluA1, mus anti-GluA1 ved en 1:200 fortynding blev anvendt.
    2. Aspirér forsigtigt de antistof-holdige medier ved hjælp af en vakuum pipette og vask cellerne tre gange med konditionerede medier.
      Bemærk: Hvis konditionerede medier ikke er tilgængelige, kan alle vaske trin udføres ved hjælp af PBS + [fosfat bufferet saltvand (PBS), der indeholder 1 mM MgCl2 og 0,1 mm CaCl2]. Manuel aspiration ved hjælp af en mikropipette kan udføres, hvis der ikke er mulighed for blid vakuum aspiration.

3. overflade udtryk (figur 2)

  1. Sekundær antistof mærkning af overflade-udtrykte receptorer
    1. Vask en gang med PBS +.
    2. Fastgør cellerne ved at inkube med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) og 4% saccharose i PBS i 7 – 8 min.
      Bemærk: I modsætning til andre fikserings metoder som methanol inkubation, PFA ikke permeabilize plasma membranen og er derfor egnet til overflade ekspression analyse. For optimale resultater, brug frisklavet PFA. Kort tids opbevaring af PFA ved 4 °C eller langvarig (op 30 dage) opbevaring ved-20 °C er eftergivende for tilstrækkelig fiksering.
      Forsigtig: PFA er et kendt carcinogen. Brug passende personlige værnemidler og en sikkerhedshætte ved håndtering.
    3. Vask cellerne tre gange med almindelig PBS.
      Bemærk: Alternativt kan 0,1 M Glycin bruges til vask af PFA i stedet for PBS, da glycin vil slukke enhver resterende fikativ, der kan øge baggrunden i præparatet.
    4. Bloker ikke-specifikke bindingssteder ved at inkube med 10% normalt gede serum (NGS) i PBS i 30 minutter ved RT.
      Bemærk: Blokering tid kan forlænges uden negative virkninger på mærkning.
    5. Inkuber med fluorescently-mærket sekundært antistof fortyndet i 3% NGS i PBS i 1 time ved RT for at mærke primære antistof mærkede receptorer (dvs. overflade-udtrykt).
      Bemærk: I disse eksempler, en 1:500 fortynding af Alexa 555-konjugeret sekundære antistoffer: ged anti-kanin til GFP-mærkede receptorer og ged anti-Mouse for GluA1 blev brugt.
    6. Vask cellerne med PBS 3x.
  2. Mærkning af intracellulære receptorer
    1. Permeabilize celler med 0,25% Triton X-100 i PBS i 5 – 10 minutter ved RT.
      Bemærk: For at kontrollere, at den første runde af antistof mærkning indtager alle overfladen epitoper, denne permeabilization trin kan springes over i en søster kultur. I dette tilfælde, ingen signal for intracellulære receptorer bør opnås. For at kontrollere, at ingen interne receptorer er blevet mærket i det foregående afsnit 2 (dvs. viser integriteten af plasma membranerne i kulturen), kan permeabiliserings trinnet springes over i en søster kultur, og et primært antistof mod en intracellulært protein (f. eks. PSD-95 eller MAP2) kan anvendes i trin 2.2.1. Der bør ikke opnås noget signal fra denne primære under disse forhold. I dette tilfælde blev et kanin anti-PSD-95 antistof (1:500) anvendt.
    2. Blok med 10% NGS i PBS i 30 min på RT.
    3. Etiketten intracellulære receptorer ved inkuberet permeabiliserede celler med det samme primære antistof, der anvendes i afsnit 2,2 fortyndet i 3% NGS i PBS for 1 h ved RT.
      Bemærk: Antistof fortynding til mærkning intracellulære receptorer kan være anderledes end det, der kræves til mærkning overflade-udtrykte receptorer. I eksemplet med GluA1 blev den samme antistof fortynding (1:200) anvendt.
    4. Vask cellerne 3x med PBS.
    5. Etiket med andet fluorescently-kodet sekundært antistof fortyndet i 3% NGS i PBS for 1 t ved RT.
      Bemærk: I disse eksempler blev der anvendt en 1:500 fortynding af ged anti-Mouse Alexa 647-konjugeret sekundært antistof (for GluA1).
    6. Vask cellerne 3x med PBS.

4. internalisering (figur 3)

  1. Internalisering af antistof-mærkede overflade receptorer
    1. Efter mærkning af overflade-udtrykte receptorer og antistof vask (afsnit 2,2), vedligeholde celler i konditionerede medier uden antistof og returnere dem til inkubator (37 °C) for at muliggøre internalisering.
      Bemærk: For NMDA-receptorer, 30 min for internalisering anbefales. Som kontrol kan en søster kultur vedligeholdes med konditionerede medier ved 4 °C under internaliserings processen. Minimal receptor internalisering bør ske under disse betingelser.
  2. Mærkning af overflade receptorer
    1. Vask cellerne én gang med PBS +.
    2. Fix celler med 4% PFA og 4% saccharose i PBS for 7 – 8 min.
      Forsigtig: Brug passende personlige værnemidler og en sikkerhedshætte ved håndtering af PFA.
    3. Vask cellerne 3x med almindelig PBS.
    4. Bloker med 10% NGS i PBS i 30 min ved RT for at forhindre uspecifik binding.
    5. Incubate prøver med fluorescently-Tagged sekundært antistof fortyndet i 3% NGS i PBS for 1 h ved RT at mærke primære antistof-mærkede receptorer (dvs., overflade-udtrykte receptorer, som ikke blev internaliseret).
      Bemærk: I dette eksempel blev Alexa 555-konjugeret ged anti-kanin sekundært antistof (1:500) anvendt til mærkning.
    6. Vask cellerne 3x med PBS.
  3. Mærkning af internaliserede receptorer
    1. Permeabilize celler med 0,25% Triton X-100 i PBS i 5 – 10 min.
    2. Bloker uspecifik binding ved inkubation med 10% NGS i PBS i 30 minutter ved RT.
    3. Incubate prøver med fluorescently Tagged sekundært antistof fortyndet i 3% NGS i PBS for 1 h ved RT at mærke internaliserede antistof-mærkede receptorer.
      Bemærk: I dette eksempel anvendes Alexa 647-konjugeret ged anti-kanin sekundært antistof (1:500) til mærkning.
    4. Vask cellerne 3x med PBS.

5. genbrug (figur 4)

  1. Internalisering af antistof-mærkede overflade receptorer
    1. Efter mærkning af overflade-udtrykte receptorer og antistof vask (afsnit 2,2), vedligeholde celler i konditionerede medier uden antistof og returnere dem til inkubator (37 °C) for at muliggøre internalisering.
      Bemærk: For NMDA-receptorer, 30 min for internalisering anbefales.
  2. Blokering af stabil overflade udtrykte receptorer
    1. For at blokere epitoper på det primære antistof, der er knyttet til overflade-udtrykte receptorer, som ikke er blevet internaliseret, inkubere celler med ukonjugeret Fab anti-IgG (H + L) antistof fragmenter (mod det primære, der anvendes i afsnit 2,2) fortyndet i konditionerede medier ( 20 μg/mL) i 20 minutter ved RT. Denne behandling forebygger fremtidig interaktion med sekundære antistoffer.
      Bemærk: Til dette eksempel, ged anti-kanin Fab fragmenter blev brugt.
      Bemærk: Kontrol eksperiment: for at sikre, at der er sket fuldstændig blokering af overflade-udtrykte receptorer, kan søster coverglider inkuberet med og uden fab. Kulturer bør fastsættes umiddelbart efter Fab behandling, og begge kulturer er inkuberet med Alexa 555-konjugeret sekundært antistof. Ingen Alexa 555-signal i de Fab-inkuberet celler indikerer korrekt antistof blokering.
    2. Vask cellerne 3x med konditionerede medier.
    3. Inkubér celler med konditionerede medier, der indeholder 80 μM dynasore, for at forhindre yderligere internalisering og tilbagevenden af celler til inkubator (37 °C) for at muliggøre genanvendelse af internaliserede receptorer. Dynasore er en GTPase-hæmmer, der hæmmer dynamin og derfor forhindrer internalisering.
      Bemærk: 45 min for nmdar genanvendelse anbefales. Bemærk, at Dynasore udelukkende blokerer dynamin-afhængige internalisering proces (f. eks NMDARs internalisering). Men, internalisering af andre synaptisk protein (dynamin-uafhængig) kan stadig forekomme i nærværelse af dynasore.
  3. Mærkning af genvundne receptorer
    1. Vask cellerne én gang med PBS +.
    2. Fix celler med 4% PFA og 4% saccharose i PBS for 7 – 8 min.
      Forsigtig: Brug passende personlige værnemidler og en sikkerhedshætte ved håndtering af PFA.
    3. Vask cellerne 3x med PBS.
    4. Bloker med 10% NGS i PBS i 30 min ved RT for at forhindre uspecifik binding.
    5. Mærk cellerne med det første fluorescently-mærkede sekundære antistof fortyndet i 3% NGS i PBS i 1 time ved RT.
      Bemærk: I dette eksempel blev Alexa 555-konjugeret ged anti-kanin antistof (1:500) anvendt til mærkning.
    6. Vask cellerne 3x med PBS.
      Bemærk: Længere vask med PBS (5 – 10 min) kan bidrage til at reducere baggrunden i præparatet.
  4. Mærkning af internaliserede receptorer
    1. Permeabilize celler med 0,25% Triton X-100 i PBS i 5 – 10 min.
    2. Blok med 10% NGS i PBS i 30 min på RT.
    3. Etiket med andet fluorescently-kodet sekundært antistof fortyndet i 3% NGS i PBS for 1 t ved RT.
      Bemærk: I dette eksempel blev Alexa 647-konjugeret ged anti-kanin antistof (1:500) anvendt til mærkning.
    4. Vask cellerne 3x med PBS.

6. montering og billeddannelse af prøver

  1. Monter cellerne ved forsigtigt at anbringe dækglidercellen side ned på 12 – 15 mL af de relevante monterings medier.
    Bemærk: Aspiration af overskydende monterings medier vil forbedre kvaliteten af billeder.
  2. Billed celler på et passende Konfokal mikroskop.
    Bemærk: Det anbefales at afbilde en z-stak ved 60x forstørrelse med 0,35 μm trin, der omfatter hele tykkelsen af neuron.

7. tids overvejelser

  1. Dette er en lang protokol, der kan stoppes på flere punkter. Hvis det ønskes, udføre blokering og primære antistof inkubations trin natten over ved 4 °C i et fugtigt kammer.
  2. Alternativt, hvis det ønskes, bruge en mikrobølgeovn væv processor til langt hurtigere efter fiksering inkubationstider. For alle trin skal du bruge 150 W ved 30 °C for "on"-indstillinger.
    1. For at blokere, køre processoren på 2 min "on," 1 min "off," og 2 min "på."
    2. For primære og sekundære antistof inkubations trin, køre processoren på 3 min "on," 2 min "off," og 3 min "på."
      Bemærk: Vi observerer ingen kvalitetsforskel ved at foretage ovenstående ændringer i protokollen.

8. billedanalyse

  1. Det anbefales at bruge FIJI < https:/Fiji.SC/> til at gennemføre billedanalyse, da det er kompatibelt med flere filformater. For vores data, billeder i Nikon ND2 filformat blev erhvervet.
  2. En makro script er fastsat for nem batch kvantificering af forskellige parametre præ-udvalgt af FIJI. Følgende trin er inkluderet i makroen:
    Bemærk: I disse eksempler blev "integreret intensitet" målt.
  3. Åbn billedfiler i FIJI og separate kanaler.
  4. Z-Projicer hver kanal stak som en maksimal intensitet projektion.
  5. Indstil en lavere tærskel for hver kanal.
    Bemærk: Tærskelværdier bør fastsættes empirisk for hvert forsøgs datasæt. Mens hver kanal kan have en separat nedre tærskelværdi, er det afgørende, at kanal tærskelværdierne konsekvent vedligeholdes for alle billeder af det samme datasæt.
  6. Vælg tre til fem sekundære eller tertiære dendritter og gem dem som områder af interesse (ROIs).
  7. Mål den integrerede tæthed af hver ROI i overflade og intracellulære kanaler.
  8. Normaliserer signalet for hvert ROI ved at dividere den integrerede tætheds værdi af overflade kanalen med den intracellulære kanal.
  9. Gentag målingerne for alle kontrol-og eksperimentelle billeder og Normaliser eksperimentelle værdier til kontrolværdier (f. eks. GluN2B WT eller no-glycin betingelser).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol til at studere glutamat receptor handel er baseret på differentiel mærkning af receptorer udtrykt ved cellens overflade og dem, der udtrykkes i indre membraner. Adskillelse opnås ved mærkning af receptorerne før og efter membran permeabilisering, ved hjælp af samme primære antistof, men et sekundært antistof konjugeret til en anden fluorophore. Som skitseret af de valgfrie trin inkluderet protokollen, dette er en meget alsidig metode til at forhør forskellige receptor handel processer, såsom internalisering og genanvendelse, og kan let tilpasses investigators behov (figur 1) .

For det første er der fastsat en metode til kvantificering af receptorer udtrykt ved neuronal overflade. Denne protokol giver mulighed for kvantificering af basal overflade ekspression samt studere de molekylære mekanismer, hvormed forskellige lægemidler eller mutationer ændrer basal niveauer af overflade-udtrykte receptorer. Overflade-udtrykte receptorer blev først mærket ved inkuberet med både primære og sekundære antistof før permeabilisering. Efter permeabilisering med 0,25% Triton X-100, den intracellulære pulje af receptorer er tilgængelig for antistof mærkning. For at illustrere denne protokol, overflade vs. intracellulær farvning af AMPA-receptorer (AMPARs) i kontrolkulturer og efter induktion af cLTP blev gennemført. Specifikt, levende celler blev mærket ved hjælp af et antistof mod en ekstracellulær epitop i GluA1 underenhed af ampar, og cellerne blev rettet derefter mærket med Alexa 555-konjugeret sekundær. Cellerne blev derefter permeabilized og mærket med samme anti-AMPAR antistof og inkuberet med et sekundært antistof konjugeret til Alexa 647. Denne dobbelte mærkning giver mulighed for klar visualisering af de to GluA1 populationer.

Efter erhvervelse af konfokale billeder kan det fluorescerende signal let kvantificeres for at vise en stigning i overflade ekspression i forhold til den intracellulære population, efter cLTP (figur 2a, B). Som kontrol blev permeabiliserings trinnet sprunget over (inkubation med 0,25% Triton X-100) i en søster Cover seddel, og et primært antistof blev brugt mod PSD-95, en standard intracellulær markør til excitatoriske synapser. Som vist i figur 2ckan der ikke opnås signal til PSD-95 i ikke-permeabiliserede celler, hvilket viser plasma membranens integritet. Dette indikerer, at det signal, der er opnået for "Surface GluA1", faktisk svarer til overflade-udtrykte receptorer (dvs. signal til overflade-udtrykte GluA1 omfatter ikke intracellulære receptorer). Vigtigere, et minimalt signal for "internaliseret GluA1" kan observeres under ikke-permeabilisering betingelser, viser, at alle overfladen epitoper er besat af den indledende runde af antistof mærkning (dvs. signal til intracellulære GluA1 ikke inkluderet overflade-udtrykte receptorer).

En anden proces, der kan undersøges ved hjælp af denne protokol er internalisering af overflade-udtrykte receptorer. Specifikt, overflade receptorer er mærket på en levende celle, og neuroner er vendt tilbage til inkubator for en given tid til at gennemgå receptoren internalisering af clathrin-medieret endokytose. Efter dette trin fastsættes cellerne for at bevare det rumlige udtryk for primære antistof mærkede receptorer (dvs. overflade-udtrykte og internaliserede receptorer). Derefter, overflade receptorer (dvs. dem, der ikke er blevet internaliseret i tidsrummet af interesse), er mærket med et sekundært antistof før permeabilization. Efter permeabilisering er receptorer, der er blevet internaliseret, mærket af et sekundært antistof med en anden fluorophore.

I denne protokol blev det undersøgt, hvordan en bestemt fosforylering inden for PDZ ligand af GluN2B underenhed af nmdars (på S1480) inducerer nmdar internalisering. For at gøre dette blev primære kulturer transficeret med en phospho-mimetisk receptor, hvor Serin (S1480) var blevet erstattet af glutamat (E). Den resulterende mutant, GluN2B S1480E, fungerer som en "konstitutivt-phosphorylated" form for GluN2B. For at lette mærkningen af GluN2B og identificere phospho-mimetic mutant, gfp blev brugt som en epitop tag på den ekstracellulære side af GluN2B (gfp-GluN2B S1480E). Overflade receptorer på levende celler blev mærket med anti-GFP-antistoffer i 15 minutter ved RT. Dernæst blev det overskydende antistof vasket med konditionerede medier og returnerede cellerne til 37 °C i 30 minutter for at give mulighed for endokytose. Derefter, celler blev fastfryse receptor bevægelse. Receptorer, der forblev på overfladen, blev derefter mærket med Alexa 555-konjugeret sekundært antistof før permeabilisering.

For at identificere receptorer, som var blevet internaliseret i løbet af 30 min inkubationsperiode, var cellerne permeabiliserede, og de internaliserede receptorer (allerede mærket med et primært antistof) blev derefter mærket med Alexa 647-konjugeret antistof. Igen, denne Dual-mærkning strategi tillader kvantificering af andelen af internaliserede receptorer. Dette eksempel fremhæver, at GluN2B fosforylering på S1480 fremmer receptor internalisering, da phospho-mimetisk mutant S1480E viste et meget højere internaliserings forhold sammenlignet med WT-receptorer (figur 3a, B). Som en kontrol, en søster kultur ved 4 °C blev opretholdt i konditioneret medier under internalisering til stærkt langsom processen. Som forventet blev der ikke opnået noget signal for "internaliserede" receptorer under disse forhold (figur 3c).

Endelig, denne protokol kan udnyttes til at undersøge genanvendelse af tidligere internaliserede receptorer. Denne protokol variation er en fortsættelse af internaliserings protokollen, ved at følge disse receptorer tilbage til cellens overflade. Der er to afgørende elementer i denne variation. For det første skal receptorer, der forblev stabilt udtrykt på overfladen under hele protokollen (dvs. receptorer, der ikke blev internaliseret eller genanvendt) være "blokeret", så de ikke forveksles med genvundne receptorer. For at gøre dette, før du udfører genvindings trinnet, inkuberet levende neuroner med høje koncentrationer af Fab, der interagerer med primære antistof-mærkede receptorer udtrykt ved overfladen for at forhindre yderligere binding af fluorophore-konjugeret sekundær Antistof. For det andet bør internalisering forhindres i genvindings fasen, således at genvundne receptorer ikke gentages internaliseret. Dette blev gjort ved at tilføje dynasore til medierne under genanvendelse, da dette stof blokerer processer, som er afhængige af dynamin såsom clathrin-medieret endokytose, såsom NMDAR internalisering. I denne protokol, undersøgelse af handel med phospho-mimetic mutant GluN2B S1480E blev udført såvel som overflade mærkning af GFP-GluN2B på levende celler, som tillod internalisering i løbet af en 30 min periode som forklaret før.

Efter dette blev overflade receptorer, der ikke blev internaliseret i denne periode, blokeret ved at inkubere cellerne med Fab i 20 minutter ved RT. Derefter blev cellerne igen inkuberet ved 37 °C i 45 min for at tillade tidligere internaliseret GluN2B at blive genanvendt tilbage til cellens overflade. Dynasore var til stede i medierne under genbrugs trinnet. Fiksering af cellerne efter dette trin giver mulighed for identifikation af genvundne receptorer (dvs. dem, der er blokeret og udtrykkes på cellens overflade) og internaliserede receptorer (dvs. dem, der er primære antistof mærket og intracellulære). Ved 1) mærkning genanvendte receptorer med en Alexa 555-konjugeret sekundært antistof før permeabilisering og 2) mærkning internaliseret, men ikke genanvendt, receptorer med Alexa 647-konjugeret sekundært antistof, et genvindings forhold blev genereret for at vise, at GluN2B S1480E har ingen effekt på NMDAR-genanvendelse (figur 4a, B). Som kontrol blev det sikret, at fuldstændig blokering af overflade-udtrykte receptorer fandt sted ved at inkuberet søster Cover glider i nærværelse af eller fravær af Fab, fulgt med PFA fiksering. Som vist i figur 4ckan der observeres et stærkt signal for overflade-udtrykte GluN2B i mangel af Fab blokering. Dette signal forsvinder i Fab-behandlede kulturer, hvilket viser, at blokerings protokollen er tilstrækkelig til helt at blokere overflade-udtrykte epitoper, og at overfladen signaler observeret efter genanvendelse faktisk svarer til receptorer handlet tilbage til plasma membranen.

Figure 1
Figur 1: skematisk af protokol variationer til at studere receptor overflade ekspression, receptor internalisering (endokytose), og receptor genanvendelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: cLTP øger overflade ekspression af GluA1. Primære hippocampale neuroner på DIV21 blev udsat for kemisk LTP (cLTP) ved at inkube med glycin-holdige ECS. Tydelig mærkning af overflade-udtrykt (rød) vs. intracellulære (blå) GluA1 populationer afslører den forventede stigning i overflade udtryk af AMPAR. (A) enkelt plan og (B) Z-stablet (maksimal intensitet projektion) confokale billeder. Skala stænger = 50 μm (hel celle) eller 5 μm (dendrit). Graf viser den forøgede overflade udtryk i GluA1 efter cLTP protokol. Overflade ekspressions indeks: overflade/intracellulære receptorer (n = 3; antal celler: CON = 7; cLTP = 7; værdier repræsenterer Mean ± SEM; * * * * p < 0,0001 ved brug af Mann-Whitney U test). C) kontrol eksperiment, hvor permeabiliserings trinnet blev sprunget over. Ud over overflade og interne GluA1, den intracellulære excitatoriske synaptisk markør PSD-95 blev evalueret. Skala stænger = 50 μm (hel celle) eller 5 μm (dendrit). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: fosforylering af GluN2B på S1480 fremmer NMDAR internalisering. Primære hippocampus neuroner blev transficeret med enten gfp-GluN2B WT eller phospho-mimetic mutant gfp-GluN2B S1480E på DIV11-12. Efter 3-4 dage med protein ekspression blev Surface GFP mærket på levende celler med et kanin anti-GFP-antistoffer, og cellerne blev derefter returneret til 37 °C for at muliggøre receptor internalisering ved endokytose. Overflade-udtrykte eksogene receptorer blev visualiseret med Alexa 555-konjugeret sekundært antistof, og den internaliserede population identificeret efter permeabilisering ved hjælp af Alexa 647-konjugeret antistof. For klarhedens skyld er Surface GFP-GluN2B pseudo farvet i grøn og internaliseret GFP-GluN2B er pseudo farvet i hvidt. (A) enkelt plan og (B) Z-stablet (maksimal intensitet projektion) confokale billeder. Skala stænger = 50 μm (hel celle) eller 5 μm (dendrit). Graf viser den forhøjede internalisering vises af phospho-mimetic mutant GluN2B S1480E. Internaliserings indeks: internaliserede receptorer/overflade-udtrykte receptorer (n = 6; antal celler: WT = 34; S1480E = 28; værdier repræsenterer gennemsnit ± SEM; p < 0,001 ved brug af Mann-Whitney U test). C) kontrol eksperiment, hvor internaliserings trinnet (Intenaliz.) blev udført ved 4 °c. Skala stænger = 50 μm (hel celle) eller 5 μm (dendrit). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: fosforylering af GluN2B på S1480 ændrer ikke NMDAR genbrug. Primære hippocampale neuroner blev transficeret med enten gfp-GluN2B WT eller phospho-mimetic mutant gfp-GluN2B S1480E på DIV11-12 som vist i figur 3. Efter 3-4 dage med protein ekspression blev Surface GFP mærket på levende celler med et kanin anti-GFP-antistoffer, og cellerne blev derefter returneret til 37 °C for at muliggøre receptor internalisering ved endokytose. Resterende overflade-udtrykte receptorer blev blokeret af Fab inkubation og genanvendelse var tilladt for 45 min. tilgængelig overflade udtrykte eksogene receptorer (genanvendt) blev visualiseret med Alexa 555-konjugeret sekundært antistof, og den internaliserede population identificeret efter permeabilisering ved brug af Alexa 647-konjugeret antistof. For klarhedens skyld er Surface GFP-GluN2B pseudo farvet i hvid og internaliseret GFP-GluN2B er pseudo farvet i grøn.  (A) enkelt plan og (B) Z-stablet (maksimal intensitet projektion) confokale billeder. Skala stænger = 50 μm (hel celle) eller 5 μm (dendrit). Grafen viser den manglende effekt, som GluN2B S1480 fosforylering har på genanvendelse. Genbrugs indeks: genanvendte receptorer/internaliserede receptorer (n = 5; antal celler: WT = 27; S1480E = 24; værdier repræsenterer gennemsnit ± SEM; n.s. = ikke signifikant ved brug af Mann-Whitney U test). C) kontrol eksperiment, hvor det fabelagtige inkubations trin til blokering af overflade udtrykte epitoper blev sprunget over. Skala stænger = 50 μm (hel celle) eller 5 μm (dendrit). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Interaktionen mellem en celle og dens omgivelser (f. eks. kommunikation med andre celler, respons på forskellige stimuli osv.) er stærkt afhængig af det korrekte udtryk af receptorer ved cellens overflade. Den hurtige og finjusterede regulering i overflade udtrykt receptor indhold muliggør korrekt cellulær respons på et miljø i konstant forandring. I det særlige tilfælde af neuroner, ændringer i antallet, lokalisering, og underenhed sammensætning af synaptisk udtrykte receptorer stærkt påvirker synaptisk kommunikation, synaptisk plasticitet, synaptogenesis, og synaptisk beskæring3, 5,10. Derfor er nøjagtig analyse af receptor overflade ekspression og den mekanisme, der ligger til grund for dens regulering, et vigtigt forskningsemne.

Der findes en række retningslinjer for, hvordan receptor overflade ekspression kan undersøgt. Generelt falder disse under tre hovedkategorier: (i) biokemisk isolering af overfladen udtrykte receptor population, (II) billeddiagnostiske teknikker til at visualisere receptorer på overfladen, og (III) funktionelle teknikker til at overvåge konsekvenserne af receptor Aktivering. Disse tilgange er komplementære og kan udnyttes i forbindelse med at besvare specifikke spørgsmål om overflade ekspression af receptorer.

Eksempler på biokemisk isolering af overflade udtrykte receptorer omfatter biotinylering protokoller i dyrkede celler eller hjerne skiver og subcellulære fraktionering af dyrkede celler eller væv11. Overflade biotinylering er baseret på mærkning af overflade-udtrykte receptorer med biotin ved at inkubere kulturerne med ester-aktiveret biotin. Ester gruppen reagerer med primære amino grupper (-NH2) til dannelse af stabile AMID obligationer. Fordi denne reagens er celle-uigennemtrængelig, kun overflade-udtrykte proteiner er mærket med biotin. Efter cellulær lysis ved hjælp af vaskemidler, mærket receptor kan inddrives ved inkuberet celle lysat med aganerede perler konjugeret til begærlighed eller dens varianter, som har en stærk affinitet for biotin, derefter evalueret af immunoblotting. Subcellulære fraktionering er en biokemisk protokol, der bruger flere Centrifugerings trin til at isolere forskellige cellulære membranøse rum baseret på deres forskellige tæthedsgrader12. Begge teknikker er nyttige til at kvantificere ændringer i overflade ekspression af endogene proteiner og kan anvendes sammen med farmakologiske tilgange (både in vivo og i kultur) til at bestemme, hvordan molekylære manipulationer påvirker overflade ekspression af receptorer. De er især nyttige, fordi ændringer i flere endogene receptorer, i forhold til en standard, kan kvantificeres samtidigt. Men i modsætning til billedbehandlings metoder, som beskrevet i denne protokol, går rumlig opløsning tabt gennem biokemisk behandling af prøver.

Den protokol, der er beskrevet her, tilhører kategorien billedteknik. Denne gruppe af tilgange (såsom overflade mærkning og levende celle billeder af fluorescently mærkede over udtrykte proteiner) er nyttige til at give spatiotemporale opløsning til overflade ekspression af receptorer. For eksempel, ved at undersøge overflade vs. intracellulære udtryk af AMPAR, som eksemplificeret tidligere, kan man undersøge, hvordan ændringer i udtryk udtales i dendritter (det biologiske rum af interesse for denne særlige anvendelse). Ligesom biokemiske fraktionering, lægemidler kan bruges med billeddannelse teknikker til at bestemme virkningerne af et lægemiddel på overfladen udtryk. Desuden, transfektering af neuroner med receptorer, der indeholder modifikationer (mutationer eller Tags) yderligere uddybes muligheder for billeddannelse. Transfection med mutant receptorer kan afgrænse virkningerne af en bestemt mutation på overflade ekspression.

En anden nyttig tilgang til at visualisere receptor handel er levende billeddannelse mikroskopi efter transfektering af primære kulturer med fluorescently mærkede konstruktioner, såsom superecliptic phluorin (Sep)-eller andre fluorophore-Tagged konstruktioner13. Sep-mærkede receptorer kan være særligt nyttige til at studere overflade udtrykte receptorer, da denne fluoroforet kun vil fluorescerer når de udsættes for det ekstracellulære medium. Ligesom tidligere eksempler, farmakologiske tilgange kan anvendes, eller mutationer foretaget på receptoren, at afgøre, om disse ændre overfladen udtryk karakteristika af receptoren. I tilfælde af narkotika kan levende celle billeder bruges til at overvåge ændringerne i overflade ekspression i realtid. En begrænsning til Live imaging er manglen på mekanistisk indsigt i ændringer i overflade udtryk. For eksempel kan et nedsat overflade udtryk være et resultat af enten øget receptor internalisering, reduceret receptor genanvendelse eller begge dele.

For at besvare dette spørgsmål kan den ovenfor beskrevne protokol anvendes. En anden vigtig menneskehandel begivenhed, der kan være overvågning ved hjælp af levende billeddannelse tilgange er den laterale diffusion af receptorer mellem forskellige rum i plasma membranen (f. eks mellem synaptisk og extrasynaptic sites). I dette tilfælde er den foretrukne teknik brugen af Single-partikel tracking tilgange, hvor en fluorescens halvleder med [dvs. Quantum dot (qd)] er knyttet til et antistof mod en ekstracellulær epitop på proteinet af interesse. Qd'er er karakteriseret ved bemærkelsesværdig stabilitet (tillader langt mindre foto blegning end traditionelle fluorescerende proteiner), stærk lysstyrke, og vekslen mellem on/off status ("blinkende"). Ved at bruge de relevante mikroskop indstillinger er det muligt at spore bevægelsen af en enkelt QD (og derfor et enkelt protein af interesse) gennem den cellulære plasma membran14.

Den nuværende protokol giver en undersøgelse af receptorer i overfladen befolkning, internaliseret befolkning, og genvundet befolkning, giver mulighed for beregning af nøgletal til at bestemme, hvordan disse processer kontrol total overflade udtryk. Desuden, stoppe internalisering eller genanvendelse processer på forskellige tidspunkter tilføjer tidsmæssig opløsning. Denne metode giver derfor mulighed for spatiotemporale overflade udtryks undersøgelser. I modsætning til de andre billedbehandlings teknikker kan niveauer af endogene overflade udtryk også undersøgt (f. eks. AMPAR), forudsat at der findes et antistof mod den ekstracellulære del af receptoren. Men fordi denne metode kræver fiksering af celler, er den ikke kompatibel med Live-Cell Imaging og kan derfor ikke give real-time information.

Endelig, funktionelle tilgange som Elektrofysiologi15 eller calcium Imaging16 er stærke, men ofte indirekte, manerer at studere overfladen udtryk for receptorer. Disse metoder er baseret på kvantificering af funktionelle ændringer i cellen efter receptor aktivering (f. eks. ændring i membran potentiale eller calciumkoncentration). Ved hjælp af Farmakologi til at isolere respons af en given receptor, disse metoder giver mulighed for vurdering af receptorerne udtrykt ved cellens overflade i en præcis, spatiotemporale måde. Disse metoder er alsidige og giver mulighed for undersøgelse af celler i kultur og i mere fysiologiske forhold ex vivo (f. eks. akutte hjerne skiver) og in vivo. Men som i tilfældet med Live imaging tilgange, er mekanistiske oplysninger ofte savnet, når du bruger funktionelle tilgange.

Sammenfattende kan en kombination af teknikker til at studere receptor overflade ekspression anvendes til fuldt ud at forstå, hvordan overflade ekspression styres. Den protokol, der præsenteres her, er særligt stærk, da den giver en mekanisk forståelse af det spatiotemporale overflade udtryk af receptorer i dissocierede primære kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker nordvestlige Center for avanceret mikroskopi til brug af Nikon a1 Confocal mikroskop og deres assistance i planlægning og analyse af eksperimenter. Denne forskning blev støttet af NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), og NIA (R00AG041225) og en NARSAD Young Investigator Grant fra hjernen & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100, (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290, (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62, (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22, (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29, (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19, (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics