Et antistoff fôring tilnærming til studier glutamat reseptor smugling i dissosiert primær hippocampus kulturer

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikkelen presenterer en metode for å studere glutamat reseptor (GluR) smugling i dissosiert primære hippocampus kulturer. Ved hjelp av en antistoff-fôring tilnærming til etiketten endogene eller overexpressed reseptorer i kombinasjon med farmakologiske tilnærminger, gjør denne metoden for identifisering av molekylære mekanismer som regulerer GluR overflate uttrykk ved modulerende internalisering eller resirkulerings prosesser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cellular svar på eksterne stimuli tungt stole på settet av reseptorer uttrykt på celleoverflaten på et gitt tidspunkt. Følgelig er befolkningen i overflaten-uttrykt reseptorer stadig tilpasning og underlagt strenge mekanismer for regulering. Paradigmatiske eksempel og en av de mest studerte menneskehandel hendelser i biologi er regulert kontroll av Synaptic uttrykk for glutamat reseptorer (GluRs). GluRs megle det store flertallet av eksitatoriske neurotransmission i sentralnervesystemet og kontrollere fysiologiske aktivitets avhengige funksjonelle og strukturelle endringer på Synaptic og neuronal nivåer (f. eks Synaptic plastisitet). Modifikasjoner i antall, plassering, og delenhet sammensetning av overflaten uttrykt GluRs dypt påvirke neuronal funksjon og, faktisk, endringer i disse faktorene er forbundet med ulike nevropatier. Presentert her er en metode for å studere GluR smugling i dissosiert hippocampus primære neurons. En "antistoff-fôring" tilnærming brukes til å differensielt visualisere GluR populasjoner uttrykt på overflaten og interne membraner. Ved å merke overflaten reseptorer på levende celler og fikse dem på ulike tidspunkter for å tillate reseptorer endocytose og/eller resirkulering, disse menneskehandel prosesser kan evalueres og selektivt studert. Dette er en allsidig protokoll som kan brukes i kombinasjon med farmakologiske tilnærminger eller overuttrykte av endrede reseptorer for å få verdifull informasjon om stimuli og molekylære mekanismer som påvirker GluR smugling. På samme måte kan det lett tilpasses til å studere andre reseptorer eller overflate uttrykt proteiner.

Introduction

Celler utnytte den aktive prosessen med menneskehandel å mobilisere proteiner til bestemte subcellulære lokaliseringer og utøve streng spatiotemporal regulering over deres funksjon1. Denne prosessen er spesielt viktig for transmembrane reseptorer, som cellulære svar på ulike miljømessige stimuli stole på intracellulære kaskader utløst av reseptor aktivering. Celler er i stand til å endre disse svarene ved å endre tettheten, lokalisering, og delenhet sammensetning av reseptorer uttrykt på celleoverflaten via reseptor subcellulære smugling regulering2. Innsetting av nylig synthetized reseptorer i plasma membranen, sammen med endocytose og resirkulering av eksisterende reseptorer er eksempler på menneskehandel prosesser som bestemmer netto pool av overflate-uttrykt reseptorer2. Mange molekylære mekanismer samarbeider for å regulere protein smugling, inkludert protein-protein interaksjoner og posttranslational modifikasjoner som fosforylering, ubiqitinering, eller palmitoylation2.

Regulering av reseptor smugling er spesielt nødvendig i sterkt polarisert celler med høyt spesialiserte strukturer. Paradigmatiske eksempel er kontroll av neuronal funksjon av regulert smugling av glutamat reseptorer (GluRs)3,4. Glutamat, den viktigste eksitatoriske signalstoff, binder og aktiverer overflate-uttrykt GluRs å kontrollere fundamentale fysiologiske neuronal funksjoner som Synaptic neurotransmission og Synaptic plastisitet. Det faktum at endret GluR smugling har blitt observert i et bredt spekter av nevropatier, alt fra neurodevelopmental lidelser til nevrodegenerative sykdommer, fremhever viktigheten av denne prosessen5. Dermed forstå den molekylære hendelser som kontrollerer GluR smugling er av interesse i mange områder av forskningen.

I denne protokollen brukes et antistoff-basert metode for å kvantifisere nivået av overflaten-uttrykt GluRs i primære hippocampus neurons samt vurdere hvordan endringer i internalisering og resirkulering resultere i observert netto overflate uttrykk. Bruk av farmakologi og/eller overuttrykte av eksogene reseptorer harboring spesifikke mutasjoner gjør denne protokollen en spesielt kraftfull tilnærming for å studere molekylære mekanismer underliggende neuronal tilpasning til ulike miljømessige stimuli. Et siste eksempel på nytten av denne protokollen er å studere hvordan multifaktoriell endringer i miljøet (for eksempel i en sykdom modeller) påvirker GluR smugling gjennom undersøkelse av overflate uttrykk i slike modeller.

Ved hjelp av konkrete eksempler, er det i utgangspunktet demonstrert hvordan en Pharmacologic manipulasjon etterligne fysiologiske Synaptic stimulering [kjemiske LTP (cLTP)] øker overflaten uttrykk for den endogene GluA1 delenhet av AMPA-type GluRs (AMPARs) 6. smugling av en overexpressed fosfat-mimetisk form av GluN2B delenhet av NMDA-type GluRs (NMDARs) er også analysert for å eksempler på hvordan denne protokollen kan brukes til å studere regulering av GluR smugling av bestemte posttranslational Endringer. Selv om disse konkrete eksemplene brukes, kan denne protokollen enkelt brukes på andre GluRs og andre reseptorer og proteiner som besitter antigen ekstracellulære domener. I tilfelle at det ikke er antistoffer tilgjengelig for ekstracellulære domener, overuttrykte av ekstracellulære epitope-merket (for eksempel Flag-, myC-, GFP-Tagged, etc.) proteiner kan bistå i protein merking.

Den gjeldende protokollen gir instruksjoner for kvantifisere spesifikk GluR under type tetthet og smugling ved hjelp av spesifikke antistoffer. Denne protokollen kan benyttes til å studere 1) totalt GluR overflate uttrykk, 2) GluR internalisering, og 3) GluR resirkulering. For å studere hver enkelt prosess individuelt, anbefales det å begynne med avsnitt 1 og 2 og fortsette med enten del 3, 4 eller 5. I alle tilfeller, avslutt med avsnittene 6 og 8 (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Arbeidet knyttet til hippocampus primære kultur forberedelser ble gjennomgått og godkjent av Northwestern University Animal Care og use Committee (protokoll #IS00001151).

1. forberedelse før merking

  1. Forberedelse og vedlikehold av primære hippocampus kulturer
    1. Forbered primære hippocampus kulturer i en tetthet på 150 000 celler belagt på Poly-D-lysin-belagt (0,1 mg/mL) 18 mm deksel briller. Excellent guider for dissosiert neuronal kultur forberedelser er tilgjengelig7,8.
      Merk: Om nødvendig kan kulturene behandles med cytosin arabinoside (ARA-C, 10 mM fra DIV1) for å unngå gliacellene spredning i forberedelsene.
      Merk: Alternative belegg reagenser som fibronektin (1 mg/mL) eller laminin (5 mg/mL) kan brukes i stedet for Poly-D-lysin.
    2. Oppretthold kulturer i en celle inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 i 2 ml/brønn av neurobasal medier supplert med B27 og 2 mm L-glutamin.
      Merk: Erstatninger for L-glutamin (f. eks, Glutamax) kan brukes, hvis ønskelig.
    3. På ukentlig basis, fjerne halve volumet av media og erstatte med samme volum av supplert neurobasal Media.
  2. Valgfritt: Transfeksjoner av muterte og/eller epitope-merkede reseptorer
    Merk:
    neurons bør være transfekterte minst 3-4 dager før analysen tid punkt for å tillate reseptor uttrykk. Bruken av unge neurons [Days in vitro 6 – 9 (DIV6)] resulterer i bedre transfeksjoner effektivitet enn eldre (DIV15-20) neurons, men et tilstrekkelig antall transfekterte celler (> 20) kan oppnås uavhengig av DIV ansatt.
    1. For hver brønn av en 12-brønn plate, fortynne 1,5 μg av plasmider som inneholder konstruksjonen av interesse i 100 μL av ferske neurobasal medier uten B27 eller glutamin tilskudd i et mikrosentrifugen rør og bland med virvlingen raskt.
      Merk: For vellykket transfeksjoner, er det avgjørende at neurobasal mediene som brukes er så fersk som mulig, ideelt mindre enn 1 uke etter flaske åpning.
    2. I et annet mikrosentrifugen rør, bland 1 μL av en hensiktsmessig lipofection reagens i 100 av friskt neurobasal medium og bland forsiktig.
      Merk: Ikke Vortex den lipofection reagens blandingen. Bruk av friske lipofection reagenser kan forbedre transfeksjoner effektivitet.
    3. Ruge rørene i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
    4. Tilsett den lipofection reagens blandingen dråpevis til DNA-blandingen, bland forsiktig og ruge i 20 min ved RT.
    5. Juster volumet på mediene i hver brønn til 1 mL med conditioned Media.
    6. Tilsett den lipofection reagens-DNA-blandingen dråpevis i brønnen.
    7. Returner celler til inkubator og la minst 3-4 dager for protein uttrykk.
      Merk: I forbindelse med internalisering-og resirkulerings protokollene som er skissert nedenfor, ble hippocampus neurons transfekterte ved DIV11 med konstruksjoner som uttrykker GluN2B merket med GFP i ekstracellulære-domenet (GFP-GluN2B) og avbildet på DIV15.
  3. Valgfritt: Inkubasjons av celler med narkotika (kronisk eller akutt) i de conditioned Media til fiksering.
    Merk:
    for akutt behandling, begynne å behandle celler før merking. Avhengig av hvilken legemiddel behandlingsprotokoll som brukes, kan cellene vedlikeholdes i stoff som inneholder materiale i del 2. I vårt eksempel var DIV21 celler underlagt en cLTP protokoll for å øke overflaten-uttrykt AMPAR9.
    1. Exchange conditioned Media for ekstracellulære løsning (ECS).
    2. Behandle celler med 300 μM-Glycine i ECS for 3 min ved RT. Som en kontroll, behandle en søster dekkglass med ECS (uten Glycine).
    3. Vask cellene 3x med 37 ° c ECS og returner cellene i ECS (uten Glycine) til celle inkubator i 20 minutter før du fortsetter med avsnitt 2.
      Merk: ECS (i mm): 150 NaCl, 2 CaCl2,5KCl, 10 HEPES, 30 glukose, 0,001 TTX, 0,01 stryknin og 0,03 pikrotoksin ved pH-7,4.

2. live merking av Surface-uttrykte reseptorer

  1. Klargjøre coverslips for merking
    1. For å lagre reagenser og tilrettelegge for manipulasjon, Overfør coverslips celle side opp til en para fin film-dekket skuff.
      Merk: Det er viktig å aldri la prøvene tørke ut.
    2. Lagre og vedlikeholde conditioned Media ved 37 ° c for inkubasjons og vasketrinn.
      Merk: For en 18 mm dekkglass anbefales inkubasjons med 75 – 100 μL av medier for antistoff merking og 120 – 150 μL for internalisering/resirkulering.
  2. Merking av overflate reseptorer med primært antistoff
    1. Ruge celler med primær antistoff fortynnet i conditioned Media for 15 min ved RT.
      Merk: For GFP-kodede reseptorer ble kanin anti-GFP antistoff ved en fortynning av 1:1000 brukt. For endogene GluA1, mus anti-GluA1 på en 1:200 fortynning ble brukt.
    2. Nøye aspirer av antistoffer som inneholder medier ved hjelp av en vakuum pipette og vask celler tre ganger med conditioned Media.
      Merk: Hvis Media er utilgjengelig, kan alle vasketrinn utføres ved hjelp av PBS + [fosfat bufret saltvann (PBS) som inneholder 1 mM MgCl2 og 0,1 mm CaCl2]. Manuelle aspirasjon ved hjelp av en micropipette kan utføres hvis skånsom vakuum aspirasjon ikke er tilgjengelig.

3. overflate uttrykk (figur 2)

  1. Sekundær antistoff merking av overflate-uttrykt reseptorer
    1. Vask en gang med PBS +.
    2. Fix celler ved incubating med 4% paraformaldehyde (PFA) og 4% sukrose i PBS for 7-8 min.
      Merk: I motsetning til andre fiksering metoder som metanol inkubasjons, PFA ikke permeabilize plasma membranen og er derfor egnet for overflate-uttrykk analyse. For optimale resultater, bruk ferskt tilberedte PFA. Korttidslagring av PFA ved 4 ° c eller lang tids (opp til 30 dager) lagring ved-20 ° c er ettergivende for tilstrekkelig fiksering.
      Forsiktig: PFA er et kjent kreftfremkallende stoff. Bruk riktig personlig verneutstyr og en sikkerhets hette ved håndtering.
    3. Vask celler tre ganger med vanlig PBS.
      Merk: Alternativt kan 0,1 M Glycine brukes til vasking av PFA i stedet for PBS, da Glycine vil slukke eventuelle gjenværende bindemiddel som kan øke bakgrunnen i forberedelsene.
    4. Blokker ikke-spesifikke bindings områder ved incubating med 10% normal geit serum (NGS) i PBS for 30 min ved RT.
      Merk: Blokkerings tiden kan utvides uten bivirkninger på merking.
    5. Ruge med fluorescensmerkete-merket sekundært antistoff fortynnet i 3% NGS i PBS for 1 h ved RT å merke primære antistoff-merket reseptorer (dvs. overflate-uttrykt).
      Merk: I disse eksemplene, en 1:500 fortynning av Alexa 555-bøyd sekundære antistoffer: geit anti-kanin for GFP-merket reseptorer og geit anti-mus for GluA1 ble brukt.
    6. Vask celler med PBS 3x.
  2. Merking av intracellulære reseptorer
    1. Permeabilize celler med 0,25% Triton X-100 i PBS for 5 – 10 min ved RT.
      Merk: For å kontrollere at den første runden med antistoff merking opptar alle overflate epitopes, kan dette permeabilization trinnet hoppes over i en søster kultur. I dette tilfellet, ingen signal for intracellulære reseptorer skal innhentes. I tillegg, for å kontrollere at ingen interne reseptorer har blitt merket i forrige avsnitt 2 (dvs. viser integriteten til plasma membraner i kultur), kan det permeabilization trinnet hoppes over i en søster kultur, og en primær antistoff mot en intracellulære protein (for eksempel PSD-95 eller MAP2) kan utnyttes i trinn 2.2.1. Ingen signal bør innhentes fra denne primære under disse forholdene. I dette tilfellet ble en kanin anti-PSD-95 antistoff (1:500) brukt.
    2. Blokk med 10% NGS i PBS for 30 min ved RT.
    3. Label intracellulære reseptorer ved incubating permeabilized celler med samme primære antistoff som brukes i § 2,2 fortynnet i 3% NGS i PBS for 1 time ved RT.
      Merk: Antistoff fortynning for merking intracellulære reseptorer kan være annerledes enn det som kreves for merking overflate-uttrykt reseptorer. I eksempelet med GluA1 ble den samme antistoff fortynning (1:200) brukt.
    4. Vask cellene 3x med PBS.
    5. Etikett med andre fluorescensmerkete sekundært antistoff fortynnet i 3% NGS i PBS for 1 time ved RT.
      Merk: I disse eksemplene ble en 1:500 fortynning av geit anti-mus Alexa 647-bøyd sekundært antistoff (for GluA1) brukt.
    6. Vask cellene 3x med PBS.

4. internalisering (Figur 3)

  1. Internalisering av antistoff-merket overflate reseptorer
    1. Etter merking av overflate-uttrykte reseptorer og antistoff vasking (§ 2,2), opprettholde celler i conditioned media uten antistoff og returnere dem til inkubator (37 ° c) for å tillate internalisering.
      Merk: For NMDA-reseptorer anbefales 30 min for internalisering. Som en kontroll, kan en søster kultur opprettholdes med conditioned Media ved 4 ° c under internalisering prosessen. Minimal reseptor internalisering bør skje under disse forholdene.
  2. Merking av overflate reseptorer
    1. Vask celler én gang med PBS +.
    2. Fix celler med 4% PFA og 4% sukrose i PBS for 7-8 min.
      Forsiktig: Bruk riktig personlig verneutstyr og en sikkerhets hette ved håndtering av PFA.
    3. Vask celler 3x med vanlig PBS.
    4. Blokk med 10% NGS i PBS for 30 min ved RT å hindre ikke-spesifikk binding.
    5. Ruge prøver med fluorescensmerkete sekundært antistoff fortynnet i 3% NGS i PBS for 1 time ved RT å merke primære antistoff-merket reseptorer (dvs. overflate-uttrykt reseptorer som ikke var internalisert).
      Merk: For dette eksempelet, Alexa 555-bøyd geit anti-kanin sekundære antistoff (1:500) ble brukt for merking.
    6. Vask cellene 3x med PBS.
  3. Merking av internalisert reseptorer
    1. Permeabilize celler med 0,25% Triton X-100 i PBS for 5 – 10 min.
    2. Blokker ikke-spesifikk binding ved inkubasjons med 10% NGS i PBS i 30 minutter ved RT.
    3. Ruge prøver med fluorescensmerkete merket sekundært antistoff fortynnet i 3% NGS i PBS for 1 h ved RT å merke internalisert antistoff-merket reseptorer.
      Merk: For dette eksempelet, Alexa 647-bøyd geit anti-kanin sekundære antistoff (1:500) brukes for merking.
    4. Vask cellene 3x med PBS.

5. resirkulering (Figur 4)

  1. Internalisering av antistoff-merket overflate reseptorer
    1. Etter merking av overflate-uttrykte reseptorer og antistoff vasking (§ 2,2), opprettholde celler i conditioned media uten antistoff og returnere dem til inkubator (37 ° c) for å tillate internalisering.
      Merk: For NMDA-reseptorer anbefales 30 min for internalisering.
  2. Blokkering av stabil overflate uttrykt reseptorer
    1. For å blokkere epitopes på den primære antistoff festet til overflaten-uttrykt reseptorer som ikke er internalisert, ruge celler med unconjugated fab anti-IgG (H + L) antistoff fragmenter (mot den primære brukes i § 2,2) fortynnet i conditioned Media ( 20 μg/mL) i 20 minutter ved RT. Denne behandlingen forhindrer fremtidig interaksjon med sekundære antistoffer.
      Merk: For dette eksempelet, Goat anti-kanin fab fragmenter ble brukt.
      Merk: Kontroll eksperiment: å sikre at fullstendig blokkering av overflaten-uttrykt reseptorer har skjedd, søster coverslips kan være inkubert med og uten fab. Kulturer bør fikses umiddelbart etter fab behandling, og begge kulturer er inkubert med Alexa 555-bøyd sekundært antistoff. Ingen Alexa 555 signal i fab-inkubert celler indikerer riktig antistoff blokkering.
    2. Vask celler 3x med conditioned Media.
    3. Ruge celler med conditioned Media som inneholder 80 μM dynasore for å hindre ytterligere internalisering og returnere celler til inkubator (37 ° c) for å muliggjøre resirkulering av internalisert reseptorer. Dynasore er en GTPase-hemmer som hemmer dynamin og dermed hindrer internalisering.
      Merk: 45 min for NMDAR resirkulering anbefales. Merk at Dynasore utelukkende blokkerer den dynamin-avhengige internalisering prosessen (f.eks. NMDARs internalisering). Men internalisering av andre Synaptic protein (dynamin-uavhengig) kan fortsatt forekomme i nærvær av Dynasore.
  3. Merking av resirkulerte reseptorer
    1. Vask celler én gang med PBS +.
    2. Fix celler med 4% PFA og 4% sukrose i PBS for 7-8 min.
      Forsiktig: Bruk riktig personlig verneutstyr og en sikkerhets hette ved håndtering av PFA.
    3. Vask cellene 3x med PBS.
    4. Blokk med 10% NGS i PBS for 30 min ved RT å hindre ikke-spesifikk binding.
    5. Merk celler med første fluorescensmerkete sekundært antistoff fortynnet i 3% NGS i PBS for 1 time ved RT.
      Merk: For dette eksempelet, Alexa 555-bøyd geit anti-kanin antistoff (1:500) ble brukt for merking.
    6. Vask cellene 3x med PBS.
      Merk: Lengre vask med PBS (5 – 10 min) kan bidra til å redusere bakgrunnen i forberedelsene.
  4. Merking av internalisert reseptorer
    1. Permeabilize celler med 0,25% Triton X-100 i PBS for 5 – 10 min.
    2. Blokk med 10% NGS i PBS for 30 min ved RT.
    3. Etikett med andre fluorescensmerkete sekundært antistoff fortynnet i 3% NGS i PBS for 1 time ved RT.
      Merk: For dette eksempelet, Alexa 647-bøyd geit anti-kanin antistoff (1:500) ble brukt for merking.
    4. Vask cellene 3x med PBS.

6. montering og bildebehandling av prøver

  1. Monter celler ved forsiktig å plassere coverslips celle side ned på 12 – 15 mL av passende monterings medier.
    Merk: Aspirasjon av overflødig montering Media vil forbedre kvaliteten på bildene.
  2. Bilde celler på et passende konfokalmikroskopi mikroskop.
    Merk: Det anbefales å avbilde en z-stabel ved 60x forstørrelse med 0,35 μm trinn, som omfatter hele tykkelsen av Nevron.

7. tid betraktninger

  1. Dette er en lang protokoll som kan stoppes på flere punkter. Hvis ønskelig, utføre blokkering og primære antistoff inkubasjons skritt over natten ved 4 ° c i et fuktig kammer.
  2. Alternativt, hvis ønskelig, bruke en mikrobølgeovn vev prosessor til enormt fremskynde post-fiksering inkubasjons ganger. For alle trinn, bruk 150 W ved 30 ° c for "på"-innstillinger.
    1. For å blokkere, kjøre prosessoren på 2 min "på," 1 min "av," og 2 min "på."
    2. For primære og sekundære antistoff inkubasjons trinn, kjøre prosessoren på 3 min "på," 2 min "av" og 3 min "på."
      Merk: Vi observerer ingen forskjell i kvalitet ved å gjøre de ovennevnte endringer i protokollen.

8. image analyse

  1. Det anbefales å bruke FIJI < https://Fiji.SC/> å gjennomføre bildeanalyse, som det er kompatibelt med flere filformater. For våre data, bilder i Nikon ND2 filformatet ble anskaffet.
  2. Et makroskript er gitt for enkel batch kvantifisering av ulike parametre pre-valgt av FIJI. Følgende trinn er inkludert i makroen:
    Merk: For disse eksemplene ble "integrert intensitet" målt.
  3. Åpne bildefilene i FIJI og separate kanaler.
  4. Z-Project hver kanal stabel som en maksimal intensitet projeksjon.
  5. Angi en lavere terskel for hver kanal.
    Merk: Terskler skal empirisk fastsettes for hvert eksperimentdata sett. Selv om hver kanal kan ha en separat lavere terskelverdi, er det avgjørende at kanal terskelverdiene vedlikeholdes konsekvent for alle bilder av samme datasett.
  6. Velg tre til fem sekundære eller tertiær dendrites og lagre dem som områder av interesse (ROIs).
  7. Mål den integrerte tettheten av hver ROI i overflaten og intracellulære kanaler.
  8. Normalisere signalet for hver ROI ved å dele den integrerte tettheten verdien av overflaten kanalen av intracellulære kanalen.
  9. Gjenta målingene for alle kontroll-og eksperimentelle bilder og normalisere eksperimentelle verdier til kontrollverdier (f.eks. GluN2B WT eller ikke-Glycine forhold).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen for å studere glutamat reseptor smugling er basert på differensial merking av reseptorer uttrykt på celleoverflaten og de uttrykt i interne membraner. Segregering oppnås ved merking av reseptorer før og etter membran permeabilization, ved hjelp av samme primære antistoff men en sekundær antistoff bøyd til en annen fluoroforen. Som skissert av den valgfrie fremgangsmåten inkludert protokollen, er dette en svært allsidig metode for forhører ulike reseptor menneskehandel prosesser, slik som internalisering og resirkulering, og kan enkelt tilpasses til etterforsker behov (figur 1) .

Først, en metode er gitt for kvantifisering av reseptorer uttrykt på neuronal overflaten. Denne protokollen gjør det mulig for kvantifisering av basal overflate uttrykk samt studere den molekylære mekanismer som ulike medikamenter eller mutasjoner endre basal nivåer av overflate-uttrykt reseptorer. Overflate-uttrykte reseptorer ble først merket av incubating med både primære og sekundære antistoff før permeabilization. Etter permeabilization med 0,25% Triton X-100, er intracellulære pool av reseptorer tilgjengelig for antistoff merking. For å illustrere denne protokollen, ble overflate kontra intracellulære farging av AMPA-reseptorer (AMPARs) i kontroll kulturer og etter induksjon av cLTP gjennomført. Nærmere bestemt ble levende celler merket ved hjelp av et antistoff mot en ekstracellulære epitope i GluA1 delenhet av AMPAR, og cellene ble fikset deretter merket med Alexa 555-bøyd sekundært. Cellene ble deretter permeabilized og merket med samme anti-AMPAR antistoff og inkubert med et sekundært antistoff som ble bøyd til Alexa 647. Denne doble merkingen gir klar visualisering av de to GluA1 populasjoner.

Etter å ha innhentet konfokalmikroskopi bilder, kan fluorescerende signal enkelt kvantifisert å vise en økning i overflate uttrykk, i forhold til den intracellulære befolkningen, etter cLTP (figur 2a, B). Som en kontroll ble det permeabilization skrittet hoppet over (inkubasjons med 0,25% Triton X-100) i en søster dekkglass og en primær antistoff ble brukt mot PSD-95, en standard intracellulære markør for eksitatoriske synapser. Som vist i figur 2C, kan intet signal for PSD-95 fås i ikke-permeabilized celler, noe som viser integriteten til plasma membranen. Dette indikerer at signalet innhentet for "overflaten GluA1" faktisk tilsvarer overflaten-uttrykt reseptorer (dvs. signal for overflate-uttrykt GluA1 inkluderer ikke intracellulære reseptorer). Viktigere, et minimalt signal for "internalisert GluA1" kan observeres under ikke-permeabilization forhold, viser at alle overflate epitopes er okkupert av den første runden av antistoff merking (dvs. signal for intracellulære GluA1 ikke inkludert overflate-uttrykt reseptorer).

En annen prosess som kan undersøkes utnytte denne protokollen er internalisering av overflaten-uttrykt reseptorer. Nærmere bestemt, overflate reseptorer er merket på en levende celle, og neurons er returnert til inkubator for en gitt tid til å gjennomgå reseptor internalisering av clathrin-mediert endocytose. Etter dette trinnet, er celler fast for å bevare den romlige uttrykk for primære antistoff-merket reseptorer (dvs. overflate-uttrykt og internalisert reseptorer). Deretter er overflate reseptorer (dvs. de som ikke har blitt internalisert i tidsperioden av interesse), merket med et sekundært antistoff før permeabilization. Etter permeabilization er reseptorer som har blitt internalisert merket med et sekundært antistoff med en annen fluoroforen.

I denne protokollen, ble det undersøkt hvordan en bestemt fosforylering innenfor PDZ ligand av GluN2B delenhet av NMDARs (ved S1480) induserer NMDAR internalisering. For å gjøre dette, var primære kulturer transfekterte med en fosfat-mimetisk reseptor, der Serine (S1480) hadde blitt erstattet av glutamat (E). Den resulterende mutant, GluN2B S1480E, fungerer som en "constitutively-fosforylert" form av GluN2B. For å lette merkingen av GluN2B og identifisere fosfat-mimetisk mutant, GFP ble brukt som en epitope kode på ekstracellulære siden av GluN2B (GFP-GluN2B S1480E). Surface-reseptorer på aktive celler ble merket med et anti-GFP-antistoff i 15 minutter ved RT. Deretter ble det overskytende antistoff vasket med conditioned Media og returnerte cellene til 37 ° c i 30 min for å muliggjøre endocytose. Deretter ble celler fast å fryse reseptor bevegelse. Reseptorer som forble på overflaten ble deretter merket med Alexa 555-bøyd sekundært antistoff før permeabilization.

For å identifisere reseptorer som hadde blitt internalisert i løpet av 30 min inkubasjonsperioden, celler ble permeabilized, og internalisert reseptorer (allerede merket med en primær antistoff) ble deretter merket med Alexa 647-bøyd antistoff. Igjen, denne Dual-merking strategien tillater kvantifisering av andelen internalisert reseptorer. Dette eksempelet understreker at GluN2B-fosforylering på S1480 fremmer reseptor-internalisering, som fosfat-mimetisk mutant S1480E viste et mye høyere internalisering forhold sammenlignet med WT-reseptorer (figur 3a, B). Som en kontroll ble en søster kultur ved 4 ° c opprettholdt i Media under internalisering for å redusere prosessen sterkt. Som forventet, ingen signal ble innhentet for "internalisert" reseptorer under disse forholdene (figur 3c).

Endelig, denne protokollen kan utnyttes til å undersøke resirkulering av tidligere internalisert reseptorer. Denne protokoll variasjonen er en fortsettelse av internalisering-protokollen, ved å følge disse reseptorene tilbake til celleoverflaten. Det er to viktige komponenter til denne varianten. For det første, reseptorer som forble stabilt uttrykt på overflaten under hele protokollen (dvs. reseptorer som ikke var internalisert eller resirkulert) må være "blokkert" slik at de ikke forveksles med resirkulerte reseptorer. For å gjøre dette, før du utfører resirkulering trinn, levende neurons er inkubert med høye konsentrasjoner av fab som samhandler med primære antistoff-merket reseptorer uttrykt på overflaten for å hindre videre binding av fluoroforen-bøyd sekundære Antistoff. For det andre bør internalisering forebygges under gjenvinnings fasen, slik at resirkulerte reseptorer ikke gjentas internalisert. Dette ble gjort ved å legge dynasore til Media under resirkulering som dette stoffet blokkerer prosesser avhengige av dynamin som clathrin-mediert endocytose, for eksempel NMDAR internalisering. I denne protokollen, studere smugling av fosfat-mimetisk mutant GluN2B S1480E ble utført så vel som overflate merking av GFP-GluN2B på levende celler, som tillot internalisering i løpet av en 30 min periode som forklart før.

Etter dette, overflate reseptorer som ikke var internalisert i løpet av denne perioden ble blokkert av incubating cellene med fab for 20 min på RT. Neste, celler ble igjen inkubert ved 37 ° c for 45 min å tillate for tidligere internalisert GluN2B å bli resirkulert tilbake til cellen overflaten. Dynasore var til stede i Media under resirkulerings trinnet. Fiksering av cellene etter dette trinnet tillater identifisering av resirkulerte reseptorer (dvs. de som er blokkert og uttrykt på celleoverflaten) og internalisert reseptorer (dvs. de som er primære antistoff merket og intracellulære). Ved 1) merking resirkulert reseptorer med en Alexa 555-bøyd sekundært antistoff før permeabilization og 2) merking internalisert, men ikke resirkulert, reseptorer med Alexa 647-bøyd sekundært antistoff, en resirkulering ratio ble generert for å vise at GluN2B S1480E har ingen effekt på NMDAR-resirkulering (figur 4a, B). Som en kontroll, ble det sørget for at fullstendig blokkering av overflate-uttrykt reseptorer skjedde ved incubating søster coverslips i nærvær eller fravær av fab, etterfulgt med PFA fiksering. Som vist i figur 4c, kan et sterkt signal observeres for overflate-uttrykt GluN2B i fravær av fab blokkering. Dette signalet forsvinner i fab-behandlede kulturer, viser at blokkering protokollen er tilstrekkelig til å fullstendig blokkere overflaten-uttrykt epitopes og at overflaten signaler observert etter resirkulering faktisk tilsvarer reseptorer trafikkerte tilbake til plasma membranen.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av protokoll variasjoner for å studere reseptor overflate uttrykk, reseptor internalisering (endocytose) og reseptor resirkulering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: cLTP øker overflaten uttrykk for GluA1. Primære hippocampus neurons på DIV21 ble utsatt for kjemiske LTP (cLTP) ved incubating med Glycine-inneholdende ECS. Distinkt merking av overflate-uttrykt (rød) vs. intracellulære (blå) GluA1 populasjoner avslører den forventede økningen i overflaten uttrykk for AMPAR. (A) enkelt fly og (B) Z-stablet (maksimal intensitet projeksjon) konfokalmikroskopi bilder. Skala stolper = 50 μm (hele cellen) eller 5 μm (dendrit). Grafen viser den økte overflaten uttrykk for GluA1 etter cLTP protokollen. Overflate uttrykks indeks: overflate/intracellulære reseptorer (n = 3; antall celler: con = 7; cLTP = 7; verdier representerer gjennomsnittlig ± SEM; * * * * p < 0,0001 ved hjelp av mann-Whitney U-test). (C) kontroll eksperiment der permeabilization trinnet ble hoppet over. I tillegg til overflate og interne GluA1, den intracellulære eksitatoriske Synaptic markør PSD-95 ble evaluert. Skala stolper = 50 μm (hele cellen) eller 5 μm (dendrit). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: fosforylering av GluN2B på S1480 FREMMER NMDAR internalisering. Primære hippocampus neurons ble transfekterte med enten GFP-GluN2B WT eller fosfat-mimetisk mutant GFP-GluN2B S1480E på DIV11-12. Etter 3-4 dager med protein uttrykk ble overflaten GFP merket på levende celler med en kanin anti-GFP antistoff og celler ble deretter returnert til 37 ° c for å tillate reseptor internalisering av endocytose. Overflate-uttrykte eksogene reseptorer ble vist med Alexa 555-bøyd sekundært antistoff, og den internalisert befolkningen identifisert etter permeabilization bruker Alexa 647-bøyd antistoff. For klarhet, overflate GFP-GluN2B er pseudocolored i grønt og internalisert GFP-GluN2B er pseudocolored i hvitt. (A) enkelt fly og (B) Z-stablet (maksimal intensitet projeksjon) konfokalmikroskopi bilder. Skala stolper = 50 μm (hele cellen) eller 5 μm (dendrit). Grafen viser den forhøyede internalisering som vises av den fosfat-mimetisk mutant GluN2B S1480E. Internalisering index: internalisert reseptorer/overflate-uttrykte reseptorer (n = 6; antall celler: WT = 34; S1480E = 28; verdier representerer gjennomsnittlig ± SEM; p < 0,001 ved hjelp av mann-Whitney U-test). (C) kontroll eksperiment der internalisering trinnet (Intenaliz.) ble utført ved 4 ° c. Skala stolper = 50 μm (hele cellen) eller 5 μm (dendrit). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: fosforylering av GluN2B på S1480 endrer ikke NMDAR resirkulering. Primære hippocampus neurons ble transfekterte med enten GFP-GluN2B WT eller fosfat-mimetisk mutant GFP-GluN2B S1480E på DIV11-12 som vist i Figur 3. Etter 3-4 dager med protein uttrykk ble overflaten GFP merket på levende celler med en kanin anti-GFP antistoff og celler ble deretter returnert til 37 ° c for å tillate reseptor internalisering av endocytose. Resterende overflate-uttrykte reseptorer ble blokkert av fab inkubasjons og resirkulering var tillatt for 45 min. tilgjengelig overflate uttrykt eksogene reseptorer (resirkulert) ble vist med Alexa 555-bøyd sekundært antistoff, og internalisert befolkning identifisert etter permeabilization med Alexa 647-bøyd antistoff. For klarhet, overflate GFP-GluN2B er pseudocolored i hvitt og internalisert GFP-GluN2B er pseudocolored i grønt.  (A) single Plane og (B) Z-stablet (maksimal intensitet projeksjon) konfokalmikroskopi bilder. Skala stolper = 50 μm (hele cellen) eller 5 μm (dendrit). Grafen viser mangelen på effekten GluN2B S1480-fosforylering har på resirkulering. Resirkulering indeks: resirkulert reseptorer/internalisert reseptorer (n = 5; antall celler: WT = 27; S1480E = 24; verdier representerer gjennomsnittlig ± SEM; n.s. = ikke-signifikant ved bruk av mann-Whitney U-test). (C) kontroll eksperiment der fab inkubasjons trinn for å blokkere overflaten-uttrykt epitopes ble hoppet over. Skala stolper = 50 μm (hele cellen) eller 5 μm (dendrit). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Samspillet mellom en celle og dens miljø (f. eks, kommunikasjon med andre celler, respons på ulike stimuli, etc.), tungt avhengig av riktig uttrykk for reseptorer på celleoverflaten. Den raske og finjusterte reguleringen i overflate-uttrykt reseptor innhold muliggjør riktig cellulær respons på et stadig skiftende miljø. I det spesielle tilfelle av neurons, endringer i antall, lokalisering, og delenhet sammensetning av synaptically uttrykt reseptorer sterkt påvirkninger Synaptic kommunikasjon, Synaptic plastisitet, synaptogenesis, og Synaptic beskjæring3, 5,10. Derfor er nøyaktig analyse av reseptoren overflate uttrykk og mekanismen underliggende dens regulering et viktig tema for forskning.

Det finnes en rekke modaliteter der reseptor overflate uttrykk kan bli studert. Generelt, disse faller under tre hovedkategorier: (i) biokjemiske isolering av overflaten uttrykt reseptoren befolkningen, (II) Imaging teknikker for å visualisere reseptorer på overflaten, og (III) funksjonelle teknikker for å overvåke konsekvensene av reseptoren Aktivisering. Disse tilnærmingene er komplementære og kan utnyttes sammen for å svare på konkrete spørsmål om overflaten uttrykk for reseptorer.

Eksempler på biokjemiske isolering av overflaten uttrykt reseptorer inkluderer biotinylation protokoller i kulturperler celler eller hjerne skiver og subcellulære fraksjonering av kulturperler celler eller vev11. Surface biotinylation er basert på merking av overflaten-uttrykt reseptorer med biotin ved incubating kulturer med Ester-aktivert biotin. Ester gruppen reagerer med primære aminosyrer (-NH2) for å danne stabile amid obligasjoner. Fordi dette reagens er celle-ugjennomtrengelig, bare overflate-uttrykt proteiner er merket med biotin. Etter mobiltelefon lyse med vaskemidler, merket reseptor kan gjenopprettes ved incubating cellen lysat med Agarose perler bøyd til avidin eller dens varianter som har en sterk affinitet for biotin, deretter evalueres av proteinimmunoblotting. Subcellulære fraksjonering er en biokjemiske protokoll som bruker flere sentrifugering trinn for å isolere forskjellige cellulære membranous rom basert på deres ulike tetthet12. Begge teknikkene er nyttige for å kvantifisere endringer i overflaten uttrykk for endogene proteiner og kan brukes i forbindelse med farmakologiske tilnærminger (både in vivo og i kultur) for å bestemme hvordan molekylær manipulasjoner påvirker overflate uttrykk av reseptorer. De er spesielt nyttige fordi endringer i flere endogene reseptorer, i forhold til en standard, kan kvantifisert samtidig. Men i motsetning til bilde metoder, slik som det som er beskrevet i denne protokollen, går romlig oppløsning tapt gjennom biokjemiske behandling av prøver.

Protokollen er beskrevet her tilhører Imaging teknikker kategori. Denne gruppen av tilnærminger (for eksempel overflate merking og live-celle Imaging av fluorescensmerkete merket overexpressed proteiner) er nyttige for å gi spatiotemporal oppløsning til overflaten uttrykk for reseptorer. For eksempel, ved å undersøke overflaten vs intracellulære uttrykk for AMPAR, som vist tidligere, kan man undersøke hvordan endringer i uttrykket uttales i dendrites (den biologiske kupeen av interesse for dette programmet). Som biokjemiske fraksjonering, kan narkotika brukes med Imaging teknikker for å bestemme virkningene av et stoff på overflaten uttrykk. I tillegg transfeksjoner av neurons med reseptorer som inneholder modifikasjoner (mutasjoner eller koder) videre utdyper muligheter for Imaging. Transfeksjoner med mutant reseptorer kan avgrense virkningene av en bestemt mutasjon på overflaten uttrykk.

En annen nyttig tilnærming til å visualisere reseptor smugling er live Imaging mikroskopi etter transfeksjoner av primære kulturer med fluorescensmerkete merkede konstruksjoner, for eksempel Superecliptic pHluorin (SEP)-eller andre fluoroforen-merkede konstruksjoner13. SEP-Tagged reseptorer kan være spesielt nyttig for å studere overflaten uttrykt reseptorer, da dette fluoroforen vil bare fluorescerer når de utsettes for ekstracellulære medium. Som tidligere eksempler, kan farmakologiske tilnærminger brukes, eller mutasjoner gjort på reseptoren, for å avgjøre om disse endrer overflate uttrykk egenskapene til reseptoren. I tilfelle av narkotika, kan Live-celle Imaging brukes til å overvåke endringer i overflaten uttrykk i sanntid. En begrensning til live Imaging er mangelen på mekanistisk innsikt i endringer i overflaten uttrykk. Et redusert overflate uttrykk kan for eksempel være et resultat av enten økt reseptor internalisering, redusert reseptor resirkulering eller begge deler.

For å besvare dette spørsmålet, kan protokollen beskrevet ovenfor brukes. En annen viktig menneskehandel hendelse som kan overvåkes ved hjelp av Live Imaging tilnærminger er lateral diffusjon av reseptorer mellom ulike rom i plasma membranen (f. eks, mellom Synaptic og extrasynaptic nettsteder). I dette tilfellet er teknikken av valget bruk av enkelt-partikkel-sporing tilnærminger der en fluorescens halvleder nanocrystal [dvs., Quantum dot (QD)] er festet til et antistoff mot en ekstracellulære epitope på protein av interesse. QDs er preget av bemerkelsesverdig stabilitet (slik at mye mindre photobleaching enn tradisjonelle fluorescerende proteiner), sterk lysstyrke, og veksling mellom på/av-status ("blinker"). Ved å bruke de riktige mikroskop innstillingene, er det mulig å spore bevegelsen av en enkelt QD (og derfor et enkelt protein av interesse) gjennom mobilnettet plasma membranen14.

Den nåværende protokollen gir en undersøkelse av reseptorer i overflaten befolkningen, internalisert befolkning, og resirkulert befolkning, slik at for beregning av prosenter for å bestemme hvordan disse prosessene kontroll totalt overflate uttrykk. Videre vil det å stoppe internalisering-eller resirkulerings prosessene på ulike tidspunkter legge til Temporal oppløsning. Denne metoden tillater derfor for spatiotemporal overflate uttrykk studier. I motsetning til andre tenkelig teknikker, kan nivåer av endogene overflaten uttrykk også bli studert (f. eks, AMPAR), forutsatt at det finnes et antistoff mot den ekstracellulære delen av reseptoren. Men fordi denne metoden krever fiksering av celler, er den ikke kompatibel med live-celle bildebehandling og kan dermed ikke gi sanntidsinformasjon.

Endelig funksjonelle tilnærminger som elektrofysiologi15 eller kalsium Imaging16 er kraftige, men ofte indirekte, manerer å studere overflaten uttrykk for reseptorer. Disse metodene er basert på kvantifisering av funksjonelle endringer i cellen etter reseptor aktivering (f. eks, endring i membran potensial eller kalsium konsentrasjon). Ved hjelp av farmakologi å isolere responsen av en gitt reseptor, disse metodene gir mulighet for estimering av reseptorene uttrykt på celleoverflaten i en presis, spatiotemporal måte. Disse metodene er allsidige og tillater studiet av celler i kultur og i mer fysiologiske forhold ex vivo (f. eks, akutte hjerne skiver) og in vivo. Imidlertid, idet når det dreier seg om det bo tenkelig tilnærmelser, mekanistisk beskjed er ofte savnet når benytter funksjonell tilnærmelser.

Oppsummert kan en kombinasjon av teknikker for å studere reseptor overflate uttrykk anvendes for å fullt ut forstå hvordan overflate uttrykk styres. Protokollen som presenteres her er spesielt kraftig som det gir en mekanistisk forståelse av spatiotemporal overflate uttrykk for reseptorer i dissosiert primære kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Northwestern Center for Advanced mikroskopi for bruk av Nikon a1 Konfokalmikroskopi mikroskop og deres bistand i planlegging og analyse av eksperimenter. Denne forskningen ble støttet av NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), og NIA (R00AG041225) og en NARSAD unge etterforsker Grant fra Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100, (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290, (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62, (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22, (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29, (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19, (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics